Développement et Applications d'un Micro-alignement par
oligonucléotides BRAF
Article: Development and Applications of a BRAF
Oligonucleotide Microarray
Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 1, February 2007
Auteurs: Il-Jin Kim, Hio Chung Kang, Sang Geun Jang,Sun-A
Ahn, Hyun-Ju Yoon, and Jae-Gahb Park
Résumé :
La technique suivante décrit le développement d’un
microalignement par oligonucléotide couplée à
l’hybridation compétitive de l’ADN (CDH), de la mutation
du gène BRAF responsable de nombreux cancer humain. Le
principe de cette approche consiste en l’hybridation
compétitive des échantillons marqués avec des séquences
de type sauvage ; et ce dans le but de réduire les résultats
non spécifiques en identifiant les signaux positifs par
marquage fluorescent. Son application s’effectue par la
conception d’un microalignement d’oligonucléotide BRAF
contenant 65 types de mutation qui seront hybridés avec
des tissus de cancer colorectal/lignées de cellules
cancéreuses. Ce criblage se fait sur une puce en silicone
unique.
Introduction :
Diverse technique de détection des mutations ont été mise à
contribution, mais leurs utilisations étaient freinées par leur coût
et la lourdeur de leur réalisation. La technique des puces à ADN
fut très prometteuse, mais elle dut subir des améliorations pour
augmenter sa précision et réduire son temps et le coût. Par
l’association d’une méthode d’hybridation compétitive de l’ADN a
été, est basée sur l’hybridation de plusieurs échantillons avec 3
couleurs. L’analyse mutationnelle du gène BRAF a révélé 2 points
chauds sur les exons 11 et 15. Ce gène tient un rôle crucial dans
les voies de la signalisation. La production d’un inhibiteur de ce
gène présente un potentiel clinique et thérapeutique important.
Pour cela, il est impératif d’innover une méthode de détection des
mutations, à la fois rapide, efficace et de très haute précision.
Matériels & Méthodes :
➢ Prélèvement de tissus cancéreux
○ Tissus de cancer colorectal 16 tissus, mutations BRAF
60 tissus BRAF-négatifs
○ 4 Lignées de cellulaires Cancéreuses utilisées comme
témoins pour la sélection des mutations BRAF
○ Lignée cellulaire de mélanome et lignée de cellules thyroïde,
portant différents types de mutations BRAF.
➢ Conception et synthèse d’un microalignement
d’oligonucléotides du gène BRAF
○ Identification de versions mutées et normales du gène BRAF
à partir des bases de données et littérature.
○ Conception des oligonucléotides, porteur de la mutation sur
le 11ème nucléotide, en 23-mères. Puis synthèse par une
entretoise 12-carbone à l’extrémité 5’-, modifié par résidu
aminés et confirmé par HPLC.
○ Les Oligonucléotides sont marqués par un colorant
fluorescent.
○ Pour éviter l’évaporation des oligonucléotides des conditions
d’humidité et un nid de froid ont été mis en œuvre.
○ Les groupements aldéhyde sont réduits en alcool primaire
non réactifs.
 ○ Ce microalignement a été répété trois fois sur la lame, ce qui
permet l’hybridation de 3 échantillons par Puces en Silicone.
➢ Traitements du microalignement : lavage avant et
après hybridation
➢ Préparation d'échantillon pour l'hybridation
conventionnelle du microalignement (non-CDH)
L’ADN génomique prélevé a été amplifié par PCR, en utilisant des
amorces d’amplification de l’exon 11 et 15. Les conditions de PCR
étaient composées de 40 cycles avec une élongation finale.
L’échantillon a été digéré par la DNase I. Les produits de PCR ont
été hybridés sur la puce à ADN. Les échantillons hybrides ont
été lavés et balayés par un laser d'excitation 632,8 nm rouge.
➢ Hybridation compétitive de l’ADN (CDH)
Les amorces de PCR et les conditions sont identiques à celles
utilisées pour l'hybridation classique, sauf que deux tissus
cancéreux supplémentaires ou prélèvements de lignée cellulaire
ont été amplifiés. Les amplicons marquées aux Cy5-, Cy3 et
Alexa-594 ont été mélangés avant l'étape de purification, puis
hybridés. Un ScanArray équipé de lasers rouge, vert et jaune de
façon séquentielle, pour l’analyse des microalignements afin de
détecter les signaux Cy5, Cy3, et Alexa-594.

➢ Séquençage automatique Didésoxy

Le séquençage bidirectionnel de l'ADN génomique fut réalisé en
utilisant les amorces d'amplification d'origine, un kit de Taq
didésoxy terminateur de cycle séquençage, et un séquenceur
d'ADN.

➢ Hybridation compétitive de l’ADN (CDH) de 10

échantillons différents
Un microalignement BRAF fut hybridé avec un mélange de 10
échantillons différents. L’ADN de la lignée de cellules cancéreuses
a été amplifié avec Cy5 et mélangé avec des échantillons
amplifiés à partir de neuf sources normales différentes avant
purification. L’Hybridation compétitive d’ADN a été effectuée de
la même façon, sauf que la digestion par la DNase a durée plus
longtemps.