Cuantificación de ADN

Abigail Galarza

Introducción

El ADN y el ARN son una macromolécula, encargadas de almacenar y expresar información génica de
todos los seres vivos. La estructura de estos ácidos nucleicos, en el caso de ADN, es una larga cadena de
monómeros en forma de doble hélice, la cual contiene una secuencia de 4 bases nitrogenadas, tales como;
Adenina, Timina, Citosina, y Guanina. Debido a la complejidad de la estructura y su secuencia, esta se
considera esencial al momento de realizar una práctica de biología molecular. Previamente, terminada su
extracción es necesario determinar la calidad y la concentración de ADN obtenida para determinar el uso
que a esta muestra se le da. Los métodos más utilizados son la espectrofotometría y la fluorometría. La
técnica más común para cuantificar ADN es la espectrofotometría que evalúa la pureza es por la medición
de la densidad óptica o conocida como absorción de luz UV la cual se realiza solamente es
sustancias/muestras puras, es decir que no contiene cantidades de impurezas tales, como proteínas, fenol,
agarosa, etc. (Rivera, C., et all. 2005). Warburg y Christian demostraron que a A260/A280 son indicadores
de impurezas y se da en un rango 1.8 y 2.0. En cambio, la medición de la calidad de pureza tiene un
indicador de A260/A230 debido que a esa longitud absorbida por sales de guanidina, iones fenólicos,
tiocianatos, entre otros, que sirven para el aislamiento de ácidos nucleicos, y se mide en un rango de 2.0 y
2.2, e estos valores, es suficientemente puro ser utilizado. Por otro lado, tenemos la fluorometría en donde
se utilizan tintes que enlazan con el ADN, los tintes más utilizados son; bromuro de etidio, SYBR Green,
SYBR Gold y Picogreen. Para el proceso de este método se emplea la electroforesis en agarosa. (Lakowicz,
J. R. 2013).

Metodología

Se tomó las muestras de ADN que se contenían en el refrigerador de la practica N °2, se colocó el blanco y
se realizó un spin-down. Seguido se tomó 2 μL de solución sobre el pedestal del Nanodrop este
espectrofotómetro fue desarrollado para medir la absorbancia de volúmenes pequeños de soluciones de
ARN, ADN y proteínas. Por último, se registran los valores que obtuvieron.

Resultados

Muestras Ng/μL A260/A280 A260/A230

Papa 726,2 1,87 1,62
Hongo-0 23,6 2,13 2,46
Hongo-1 196,4 2,17 2,31
Hongo-2 326,0 2,67 1,67
Tabla 1. Resultados del grupo 1 con el Nanodrop

Discusión

La pureza del ADN es un factor clave para los siguientes análisis moleculares que se desee realizar, debido
a esto se realiza espectrofotometría en Nanodrop la cual arrojo los siguientes resultados (Tabla 1). Se logra
evidenciar que los valores entre la papa y el hongo son diferentes entre sí, siendo la papa la muestra con
más cantidad de contaminantes que de ADN extraído según los rangos establecidos para cuantificación,
esto debe a que en la práctica se tomó solamente el brote de papa el cual contiene una alta concentración
de metabolitos que resultan contaminantes para una práctica de biología molecular.

Por otro lado, en el caso del Hongo-0 tenemos que se obtuvo un ADN de buena calidad ya que no supera
por mucho los rangos, sin embargo, posee una baja concentración de ADN, la muestra se puede utilizar
para análisis subyacentes, pero puede llegar a afectar a los resultados de PCR (Sánchez Escudero, L. 2016).
La siguiente muestra Hongo-1, es una muestra perfecta y se puede utilizar para cualquier tipo de análisis
molecular que se requiera debido a que tiene una alta concentración de ADN, y los valores de A260/A80 y
de A260/230 superan por 0,1 a los rangos, debido a esto la muestra tendrá resultados evidentes y claros.
Por último, tenemos la muestra del Hongo-2, esta muestra posee una gran cantidad de ADN, sin embargo,
no posee valores adecuados para una práctica subyacente, debido a que supera por mucho al rango de
A260/A280 y no alcanza el rango de A260/A230, es decir, tiene mucha cantidad de proteínas y poca
cantidad ADN purificado. Es importante recalcar que el contenido bioquímico entre células vegetales varía
entre sí, por ende, la cantidad de ADN cambia entre especies dependiendo del tamaño del genoma, número
de células, edad del tejido y ploidia (Anandika Dhaliwal, 2013).

Para finalizar, en cuanto al mecanismo que utiliza el espectrofotómetro Nanodrop se pudo haber realizado
algunos errores durante la colocación de muestra que afectaría el resultado final. En un estudio dirigido por
Songcheng Yu, recomienda que la muestra sea homogenizada con una pipeta antes de cargarla debido a
que la volatilización del solvente aumenta la concentración de la muestra, esto pudo a ver sucedido en la
muestra de Hongo-0 debido a que se obtuvo poca concentración de ADN (Yu, S.,et all, 2017).. El Nanodrop
utiliza la tensión superficial para sostener la pequeña solución puesta en el pedestal, es por ello que, si los
resultados resultan ambiguos, lo más probable es que sea resultado de la heterogeneidad de la muestra o a
su vez, la rotura de la columna de líquido, ya que el detergente o el alcohol isopropilico no son agentes de
limpieza correctos para estas prácticas ya que puedes desacondicionar la tensión del pedestal, lo que pudo
afectar a la muestra Hongo-2. (Desjardins, P., & Conklin, D. 2010).

Literatura Citada

Rivera, C., Zapata, Á., Pinilla, G., Donato, J., Chaparro, B., & Jiménez, P. (2005). Comparación de la
estimación de la clorofila-a mediante los métodos espectrofotométrico y fluorométrico. Acta
Biológica Colombiana, 10(2), 95-103.

Lakowicz, J. R. (Ed.). (2013). Principles of fluorescence spectroscopy. Springer Science & Business
Media.

Sánchez Escudero, L. (2016). Identificación y caracterización de hongos de interés para su uso industrial
y, en especial, en la industria alimentaria mediante el uso de métodos moleculares.

Anandika Dhaliwal, (2013). Extraccion y purificación de ADN.

Yu, S., Wang, Y., Li, X., Yu, F., & Li, W. (2017). The factors affecting the reproducibility of micro-volume
DNA mass quantification in Nanodrop 2000 spectrophotometer. Optik, 145, 555-560.

Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. JoVE (Journal
of Visualized Experiments), (45), e2565.