 Los biosurfactantes fueron producidos por tres cepas bacterianas .

 Bacillus cereus cultivado en desechos industriales fue el mejor biosurfactante

 La biomolécula es un lipopéptido con una tensión superficial de 26 mN / m y baja
toxicidad.
 Se obtuvieron altas tasas de eliminación de petróleo adsorbido en roca y dispersión en
agua de mar.
 El biosurfactante formulado se puede aplicar con éxito en la industria del petróleo.

El objetivo del presente estudio fue producir biosurfactantes utilizando tres cepas bacterianas
(Pseudomonas cepacia CCT6659, Bacillus methylotrophicus UCP 1616 y Bacillus cereus UCP 1615)
cultivado en medio mineral que contiene diferentes tipos de carbono (glucosa, sacarosa, melaza y
aceite para freír) y nitrógeno [NH 4 NO3, (NH4)2ASI QUE4, peptona, extracto de levadura y licor
fuerte de maíz]. B. cereusSe destacó como el mejor productor de biosurfactantes cuando se inoculó
con una suspensión celular al 1.5% y se cultivó a 28 ° C y 200 rpm en melaza al 2.0% y licor de maíz
al 1.0% durante 48 h. En estas condiciones, la tensión superficial media se redujo a 26,2 ± 0,2 mN /
m, y la concentración de biosurfactante alcanzó 2,05 ± 0,32 g / L. El biosurfactante mostró una
concentración micelar crítica de 0.90 ± 0.05 g / L, demostró ser altamente estable en amplios rangos
de pH, concentración de sal y temperatura de calentamiento, y ejerció baja toxicidad para las larvas
deArtemia salinacomo bioindicador ambiental marino. La caracterización estructural del
biosurfactante sugirió una composición de lipopéptidos. Se demostró que el agente biotensioactivo
elimina eficazmente el aceite de motor adsorbido en roca marina (91.0 ± 0.4%) y lo dispersa en agua
de mar (70.0 ± 0.4%). El biosurfactante formulado con sorbato de potasio al 0.2% demostró un
potencial considerable para su aplicación en la industria del petróleo, donde podría usarse con éxito
como un producto comercial para movilizar petróleo en ambientes marinos.

La búsqueda de una mejor calidad de vida y la competencia entre empresas / industrias son
cuestiones de la insostenibilidad del crecimiento desenfrenado de la sociedad, la escasez de una
gestión competente en los servicios públicos básicos y la falta de atención a los problemas
ambientales, que han estado afectando nuestra naturaleza. recursos (Rocha e Silva et al., 2018a).
Entre los numerosos impactos ambientales que enfrenta el mundo hoy en día, los derrames de
petróleo ocurren con bastante frecuencia, causando efectos devastadores principalmente en el
medio marino (Almeida et al., 2016; Gomes et al., 2018).

Los avances en biotecnología han impulsado la búsqueda de nuevos compuestos biodegradables

naturales que puedan utilizarse para remediar sitios contaminados con hidrocarburos. Los
biosurfactantes son compuestos naturales producidos por organismos vivos que consisten en
subproductos metabólicos de bacterias, hongos filamentosos y levaduras (Rocha e Silva et al.,
2018b; Silva et al., 2014b). Son moléculas anfipáticas con porciones hidrofóbicas e hidrofílicas que
actúan entre fluidos con diferentes polaridades (por ejemplo, aceite y agua), permitiendo el acceso
a sustratos hidrofóbicos, reduciendo las tensiones superficiales e interfaciales, y aumentando el
área de contacto con el compuesto insoluble, así como sus movilidad, biodisponibilidad y
biodegradación (Bezerra et al., 2018; Joy et al., 2017). Los biosurfactantes también permiten la
formación de microemulsiones, en las cuales los hidrocarburos se solubilizan en agua o el agua se
solubiliza en hidrocarburos (Vijayakuma y Saravanan, 2015), y puede ayudar en diferentes etapas
de la cadena de producción de petróleo, como la recuperación mejorada del petróleo, la eliminación
del petróleo adherido a los tanques de almacenamiento, etc. (Bezerra et al., 2018; Chaprão et al.,
2015).
Entre las bacterias que se sabe que producen compuestos tensioactivos, las especies del género
Bacillus son productores eficientes de un lipopéptido con actividad superficial denominada
surfactina (Chandran y Das, 2011;

Henkel et al., 2017), mientras que otras especies pertenecientes al género Pseudomonas producen
glucolípidos conocidos como ramnolípidos (Santos et al., 2016).

Los desechos agroindustriales baratos con alto valor nutricional son ingredientes necesarios para
producir biosurfactantes, entre los que se encuentran el licor de maíz (Durval et al., 2018), la vinaza
(Oliveira et al., 2013), las aguas residuales de yuca (Barros et al., 2008) , aceite de soja residual (Silva
et al., 2018), aceite de canola residual (Silva et al., 2014a; Soares da Silva et al., 2018), grasa animal
(Santos et al., 2013; 2017) y melaza (Chaprão et al., 2018) han despertado el interés de los
investigadores.

En base a estos antecedentes, el objetivo del presente estudio fue seleccionar un biosurfactante
bacteriano con potencial como adyuvante comercial en la biorremediación de ambientes marinos
contaminados por derrames de petróleo.

Solo se utilizaron reactivos de grado analítico. Se emplearon tres tipos de desechos industriales
como sustratos para la producción de biosurfactantes. La melaza de caña de azúcar (SCM) se obtuvo
de la planta de azúcar de São José (Igarassu, PE, Brasil), licor de maíz (CSL) de Corn Products do Brasil
(Cabo de Santo, PE, Brasil) y aceite de freír de soja de un restaurante local en La ciudad de Recife,
PE, Brasil. El aceite residual de motor se adquirió de un taller automotriz local y se utilizó como
producto de petróleo contaminante. El aceite lubricante (aceite de motor tipo SAE20 W-50 sin usar
con protector sintético, Petrobras, Brasilia, DF, Brasil), que está disponible comercialmente para su
uso en motores flexibles (gasolina, gas natural y alcohol), es una mezcla compleja de hidrocarburos
que contiene aditivos que mejoran el rendimiento

Entre las bacterias que se sabe que producen compuestos tensioactivos, las especies del género
Bacillus son productores eficientes de un lipopéptido con actividad superficial denominada
surfactina (Chandran y Das, 2011; Henkel et al., 2017), mientras que otras especies que pertenecen
al género Pseudomonas producen glucolípidos. conocidos como rhamnolípidos (Santos et al., 2016).

Los desechos agroindustriales baratos con alto valor nutricional son ingredientes necesarios para
producir biosurfactantes, entre los que se encuentran el licor de maíz (Durval et al., 2018), la vinaza
(Oliveira et al., 2013), las aguas residuales de yuca (Barros et al., 2008) , aceite de soja residual (Silva
et al., 2018), aceite de canola residual (Silva et al., 2014a; Soares da Silva et al., 2018), grasa animal
(Santos et al., 2013; 2017) y melaza (Chaprão et al., 2018) han despertado el interés de los
investigadores.

En base a estos antecedentes, el objetivo del presente estudio fue seleccionar un biosurfactante
bacteriano con potencial como adyuvante comercial en la biorremediación de ambientes marinos
contaminados por derrames de petróleo.

2.2 Microorganismos

Se investigaron tres cepas bacterianas como productores de biosurfactantes. Pseudomonas cepacia

CCT6659 se obtuvo de la colección de cultivos de André Tosello Research and Technology
Foundation (Campinas, SP, Brasil). Bacillus methylotrophicus UCP 1616 y Bacillus cereus UCP 1615
se obtuvieron del cultivo Colección de la Universidad Católica de Pernambuco en Recife, PE, Brasil.
2.3 Medios para la preparación del inóculo y la producción de biosurfactantes.

Los cultivos bacterianos jóvenes obtenidos después de cultivos de 24 h en medio de agar nutritivo
se transfirieron a un matraz Erlenmeyer que contenía 50 ml de caldo nutritivo de agar (pH 7,0) y se
mantuvieron bajo agitación orbital a 150 rpm durante 10 a 14 ha 28 ° C para lograr un densidad
óptica a 600 nm de 0.7, correspondiente a un inóculo de 107 unidades formadoras de colonias / ml.
Esta lectura se utilizó como inóculo a una concentración de 2.0% (v / v).

Para producir el biosurfactante, se cultivaron bacterias en un medio mineral con la siguiente

composición: 0,87 g / l de K2HPO4, 0,6 g / l de MgSO4.7H2O, 0,1 g / l de NaCl, 0,2 g / l de KCl, 6,5 g
/ lTris (hidroximetil) aminometano, 0,05 g / L de extracto de levadura (YE) más diferentes fuentes
de carbono a niveles variables (sección 2.5). El pH se ajustó luego a 7,0 y el medio se esterilizó en
autoclave a 121 ° C durante 20 min.

2.4.Producción de biosurfactantes

Las fermentaciones para la producción de biosurfactantes se realizaron en 100 ml de medio mineral

incubado con 2,0% del inóculo. Los matraces se mantuvieron bajo agitación orbital a 200 rpm
durante 120 ha 28 ° C. Después de la fermentación, el caldo se centrifugó a 5000 × g durante 30
minutos para eliminar las células y determinar la tensión superficial.

2.5. Selección de microorganismos y fuentes de carbono y nitrógeno.

La glucosa, sacarosa, SCM y aceite de fritura se probaron a una concentración de 2.0% como fuentes
de carbono para la producción de biosurfactantes por las tres cepas bacterianas seleccionadas.
Después de seleccionar el mejor microorganismo y sustrato, se investigó la influencia de la
concentración de la fuente de carbono (1.0, 2.0, 3.0, 5.0 y 7.0%) en la producción de biosurfactantes.
Los matraces se mantuvieron a 28 ° C bajo agitación orbital a 200 rpm durante 120 h. Luego se
analizaron diferentes fuentes de nitrógeno, a saber, NH4NO3, (NH4) 2SO4, peptona, YE y CSL a una
concentración del 2,0% durante 96 y 120 h. Luego se probó la fuente de nitrógeno con el mejor
rendimiento a diferentes concentraciones (1.0, 2.0, 3.0, 5.0 y 7.0%) y en las mismas condiciones que
la fuente de carbono.

Al final de los cultivos, se extrajeron muestras y se centrifugaron a 5000 × g durante 30 minutos. Se

usó caldo sin células para determinar la tensión superficial (sección 2.8).

2.6 Influencia de las condiciones de cultivo en la producción de biosurfactantes.

El biosurfactante se produjo en el medio de cultivo previamente establecido a diferentes tiempos

de fermentación (48, 72 y 96 h), velocidades de rotación (150 y 200 rpm) y tamaños de inóculo (1.0,
1.5 y 3.0%). Al final de los cultivos, las muestras se centrifugaron para eliminar las células y
determinar la tensión superficial.

2.7 Extracción de biosurfactante

Se probaron cuatro métodos de extracción para extraer el biosurfactante del caldo libre de células
después de los cultivos: (1) extracción con cloroformo / metanol (2: 1, v / v); (2) extracción con
acetato de etilo; (3) precipitación ácida con metanol; y (4) precipitación ácida con HCl. Para
extracciones ácidas, el caldo sin células se acidificó a pH 2,0 usando HCl 6,0 M. Los materiales
obtenidos se dejaron reposar durante 24 ha 4 ° C.
2.8 Determinaciones analíticas

Para determinar la concentración de células secas, se centrifugaron muestras de 50 ml a 5000 × g

durante 30 minutos, y el sedimento celular se secó en un horno a 105 ° C durante 24 h.

La tensión superficial se midió en caldo libre de células que contenía el biosurfactante bruto usando
un tensiómetro Sigma 700 (KSV Instruments, Helsinki, Finlandia) y el anillo Du Nuöy. También se
midió la tensión superficial inicial del medio de cultivo antes de la inoculación (55 mN / m). La
concentración crítica de micelas (CMC) del biosurfactante aislado se determinó automáticamente
midiendo la tensión superficial de una muestra de agua con la adición gradual.

2.9 Determinación de la estabilidad del biosurfactante.

Los efectos de la exposición a diferentes temperaturas (5, 70, 100 y 120 ° C) durante 60 min,
concentraciones de NaCl (2, 4, 6, 8 y 10%) a 28 ° C y pH (2.0, 4.0, 6.0, 8.0 , 10.0 y 12.0) después del
ajuste con HCl 6.0 M o NaOH a 28ºC, se evaluó la estabilidad del biosurfactante a través de
determinaciones de la tensión superficial y la actividad de emulsión del caldo sin células.

2.10. Determinación de la toxicidad del biosurfactante.

La toxicidad del biosurfactante se probó contra las larvas del microcrustáceo Artemia salina como
bioindicador.

Los huevos de camarones de salmuera se adquirieron en una tienda local y las larvas se usaron
después de 24 h de incubación. Los ensayos se realizaron en matraces de 10 ml que contenían 10
larvas de camarones de salmuera en 5,0 ml de agua de mar por matraz.

Las larvas se expusieron a 5,0 ml de caldo libre de células y el biosurfactante aislado a la mitad de la
CMC, CMC y 2 CMC. La mortalidad se determinó después de 24 h. Se usó agua de mar sin
biosurfactante como control (Silva et al., 2010).

2.11. Caracterización estructural de biosurfactantes.

El biosurfactante extraído se redisolvió en dimetilsulfóxido (DMSO), y su espectro de RMN 1H se

registró a 25 ° C utilizando un espectrómetro de 300 Mhz (Agilent, Billerica, MA, EE. UU.) Que
funcionaba a 300,13 MHz.

Los cambios químicos (δ) se dieron en la escala de ppm con respecto al tetrametilsilano. El
biosurfactante aislado se caracterizó usando un espectroscopio infrarrojo por transformada de
Fourier (FT-IR), modelo 400 (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE. UU.). Los espectros FT-IR con una
resolución de 4 cm − 1 se leyeron en el rango de números de onda de 400 a 4000 cm − 1.

2.12 Lavado de compuestos hidrofóbicos adsorbidos en roca marina y dispersión en agua de mar.

El aceite de motor se seleccionó como un compuesto hidrófobo adsorbido en roca marina. Su

eliminación de la roca se realizó sumergiendo el material en el contaminante hasta su cobertura
completa y registrando el volumen gastado. El material se colocó cuidadosamente en un vaso de
precipitados de 100 ml con la ayuda de pinzas y se sometió a tratamientos con biosurfactante crudo
(caldo libre de células) o biosurfactante aislado a concentraciones de ½ CMC y CMC. Se registraron
los volúmenes gastados y se calcularon los porcentajes obtenidos durante el lavado. La cantidad de
aceite restante se determinó en el sólido lavado por gravimetría después de la extracción con
hexano (Rocha e Silva et al., 2014)
La dispersión o agregación de una mancha de aceite se simuló en el laboratorio contaminando
muestras de agua de mar con aceite de motor. La prueba de desplazamiento de aceite se llevó a
cabo dejando caer lentamente 20 μL de aceite de motor sobre la superficie de 40 ml de agua de mar
en una placa de Petri (15 cm de diámetro) hasta cubrir toda el área de la superficie del agua. Después
de la adición de 10 μL de solución de biosurfactante cruda o aislada a ½ CMC o CMC sobre la
superficie de la capa de aceite, se midió el diámetro medio de las zonas claras resultantes de los
experimentos por triplicado y se expresó como porcentaje del diámetro de la placa de Petri (Rocha
e Silva et al. , 2014).

2.13. Formulación de biosurfactantes

Después de la adición de sorbato de potasio al 0,2% como conservante, el biosurfactante crudo

(caldo libre de células) se almacenó a 28 ° C durante 0, 15, 30 y 45 días, y luego se tomaron muestras
para analizar la tensión superficial, la capacidad de emulsificación y Capacidad de dispersión de
aceite de motor. Se probaron diferentes valores de pH (5.0, 7.0 y 9.0), concentraciones de NaCl (1,
3 y 4%) y calentamiento a 40 o 50 ° C durante 60 minutos. Se usó una muestra de biosurfactante
crudo mantenido a 28 ° C y pH 7 como control (Freitas et al., 2016).

2.14.

Todas las determinaciones de tensión superficial, concentración de biosurfactantes y actividad de

emulsificación se realizaron por triplicado. Las medias y las desviaciones estándar se calcularon con
Microsoft Office Excel 2016.

3. Resultados y discusión

3.1. Selección de microorganismos, fuentes de carbono y nitrógeno y sus niveles.

La figura 1A muestra los resultados de la tensión superficial media libre de células después de
cultivos de Bacillus cereus UCP 1615, Pseudomonas cepacia CCT6659 y Bacillus methylotrophicus
UCP 1616 usando glucosa al 2.0%, sacarosa, aceite para freír o melaza de caña de azúcar (SCM)
como fuentes de carbono. Los biosurfactantes producidos por P. cepacia CCT6659 y B.
methylotrophicus UCP 1616 no pudo reducir apreciablemente la tensión superficial de todos los
medios (43.1 ± 0.3 a 56.3 ± 0.5 mN / m) en comparación con el agua (72 mN / m), pero la de B.
cereus UCP 1615 cultivada en SCM , sacarosa o glucosa fue (27 ± 0.3 a 29 ± 0.1 mN / m); por lo tanto,
esta cepa fue seleccionada como el mejor productor de biosurfactantes.

Siendo ingredientes de desechos agroindustriales, SCM y sacarosa se usaron como sustratos en las
pruebas para seleccionar la mejor concentración de fuente de carbono en el medio. La figura 1B
muestra que una concentración de 2,0% de cualquiera de las fuentes de carbono permitió garantizar
la mayor capacidad para reducir la tensión superficial media (<30 mN / m), lo que es indicativo de
la mayor producción de biosurfactantes, por lo tanto, ambos se seleccionaron para experimentos
de optimización adicionales. Bueno y col. (2010), quienes probaron diferentes fuentes de carbono
a niveles variables, informaron que 2.0% de sacarosa era ideal para la producción de biosurfactantes
por Bacillus pumilus, mientras que Joshi et al. (2008) obtuvieron los mejores resultados utilizando
concentraciones de melaza en diferentes medios en el rango de 1-3% por cepas de Bacillus.

Todas las fuentes de nitrógeno probadas, a saber, el licor de maíz (CSL), el extracto de levadura (YE)
y la peptona, añadidas al medio mineral enriquecido con 2,0% de SCM, permitieron disminuir
satisfactoriamente las tensiones superficiales de los medios fermentados sin células (Fig. 1C),
mientras enriquecido con sacarosa al 2.0% dio los mejores resultados usando CSL e YE como fuentes
de nitrógeno. El tiempo de fermentación (96 o 120 h) no ejerció ningún efecto significativo sobre la
tensión superficial; por lo tanto, se seleccionó el más corto para reducir los costos de producción.

Luego se analizaron las mismas fuentes de nitrógeno a diferentes concentraciones en medios

complementados con SCM o sacarosa (Fig. 1D). Todas las fuentes de nitrógeno permitieron obtener
valores satisfactorios de tensión superficial. En particular, se destacó el medio con 2.0% SCM como
fuente de carbono y 1.0% CSL como nitrógeno, porque proporcionó resultados comparables a los
de los demás, pero tenía la ventaja adicional de emplear dos desechos agroindustriales de bajo costo.

De acuerdo con Santos et al. (2017), los desechos industriales pueden usarse con éxito para producir
agentes tensioactivos con posible aplicación en la remediación de ambientes contaminados por
contaminantes orgánicos o inorgánicos. Fernandes y col. (2016) obtuvieron la mayor concentración
de biosurfactante Bacillus subtilis RI4914 (200 mg / L) cuando esta cepa se cultivó en un medio
mineral enriquecido con sacarosa y nitrato de amonio, mientras que, al contrario de lo observado
en el presente estudio, YE actuó como un inhibidor . Asimismo, Medeot et al. (2017) observaron la
concentración más alta de biosurfactantes (1,7 mg / ml) cuando se cultivó Bacillus amyloliquefaciens
MEP218 en un medio que contenía glucosa y NH4NO3.

3.2. Selección de condiciones de cultivo para la producción de biosurfactantes.

Después de la selección del medio, se investigaron las condiciones de fermentación variando la

velocidad de rotación (150 o 200 rpm), la concentración de inóculo (1.0, 1.5 o 2.0%) y el tiempo de
fermentación (48, 96 o 120 h). El valor de tensión superficial más bajo (26.2 ± 0.2 mN / m) se logró
después de 48 h de cultivo con agitación a 200 rpm y un inóculo de 1.5%

concentración. Por lo tanto, estas condiciones fueron consideradas las mejores para la producción
de biosurfactantes por B. cereus UCP 1615 (Fig. 1E).

Es probable que cuanto mayor sea la velocidad de rotación (200 rpm), mayor será la velocidad de
transferencia de oxígeno y, en consecuencia, más rápida será la producción de biosurfactantes. El
tamaño del inóculo también jugó un papel importante en la producción de biosurfactantes, ya que
un aumento del 1.0 al 1.5% mejoró el crecimiento celular y la formación del producto, mientras que
un aumento adicional al 2.0% condujo a una reducción en la actividad microbiana probablemente
debido a limitaciones de nutrientes.

Cuanto menor es el tamaño del inóculo (1,0%), menor es la concentración celular y, en consecuencia,
más lenta es la transformación del sustrato en biosurfactante (Nalini y Parthasarathi, 2014). Martins
& Martins (2018) informaron que la selección de un tiempo de fermentación adecuado (48 h) fue
esencial para obtener una reducción satisfactoria de la tensión superficial y la producción de
biosurfactantes por Corynebacterium aquaticum.

3.3 Extracción de biosurfactante.

Como se muestra en la Tabla 1, el mejor método de extracción, entre los cuatro probados para
recuperar el biosurfactante, fue la precipitación ácida simple con HCl, que no solo aseguró la mayor
concentración de biosurfactante extraído y la tensión superficial más baja, sino que también tuvo la
tensión superficial adicional ventaja de no requerir ningún solvente orgánico. Cooper y Goldenberg
(1987) informaron una tensión superficial cercana a la obtenida en el presente estudio luego de la
extracción de un biosurfactante producido por B. cereus.
3.4. Crecimiento celular y producción de biosurfactantes.

La figura 2 ilustra las curvas de crecimiento de B. cereus y la producción de biosurfactantes durante

las fermentaciones. El pH del medio varió de 6.2 a 7.3 durante todo el proceso. El microorganismo
no exhibió ninguna fase de retraso evidente, creció exponencialmente durante las primeras 8 h de
cultivo, y luego sufrió una disminución transitoria en la tasa de crecimiento de aproximadamente 4
h. Después de un nuevo aumento en el crecimiento a una tasa comparable a la inicial, las células
entraron en la fase de crecimiento estacionaria después de 48 h de cultivo y alcanzaron el nivel más
alto de biomasa

(3.0 ± 0.3 g / L) después de 60 h. Este valor está dentro del rango descrito para las especies de
Bacillus (Chandankere et al., 2013; Ismail et al., 2013). Se puede ver en la misma figura que la tensión
superficial del caldo libre de células disminuyó de 55.0 ± 0.1 a 27.5 ± 0.2 mN / m dentro de las
primeras 8 h, simultáneamente con la fase de crecimiento exponencial y el aumento de la
concentración de biosurfactante, que luego se comportó como un metabolito primario típico
asociado al crecimiento. En este punto, el biosurfactante alcanzó la concentración crítica de micelas
(CMC) y comenzó a formar micelas. Asimismo, Cooper y Goldenberg (1987) informaron para un
caldo que contiene sacarosa fermentado por B. cereus una reducción de la tensión superficial a
alrededor de 28.0 mN / m.

La concentración más alta de biosurfactantes obtenida después de 48 h en la fase estacionaria (2.05

± 0.32 g / L) estuvo dentro del rango de concentración descrito en la literatura para las especies de
Bacillus. Para proporcionar algunos ejemplos, Paraszkiewicz et al. (2018) obtuvieron entre 0.1 y 0.4
g / L de lipopéptidos de dos cepas de B. subtilis (KP7 e I0-1a) cultivadas en diferentes medios
utilizando recursos naturales renovables como SCM y CSL empleados en este estudio. Durval y col.
(2018) reportaron una producción de biosurfactantes de 3.5 g / L por B. cereus BCS0 cultivado en
un medio mineral con 2.0% de aceite para freír y 0.12% de peptona, mientras que Datta et al. (2018)
observaron una producción de 6.3 g / L y una tensión superficial de 29.85 mN / m usando B. subtilis
MG495086 en un medio con aceite de parafina ligero como la única fuente de carbono.

3.5 Capacidad de biosurfactantes para emulsionar diferentes sustratos hidrófobos

También se probó la capacidad del biosurfactante para emulsionar diferentes sustratos hidrófobos
(Fig. 3), ya que no siempre está relacionado con eso para reducir la tensión superficial. Además, la
estabilidad de una emulsión está estrechamente relacionada con la compatibilidad estructural entre
el tensioactivo y el compuesto hidrófobo a emulsionar y debe evaluarse caso por caso (Bezerra et
al., 2018). Los índices de emulsificación más altos se encontraron para el aceite de canola, aceite de
pequi, biodiesel, aceite lubricante y aceite de motor. Estos hallazgos indican la aplicabilidad
potencial del biosurfactante como emulsionante en procesos de remediación ambiental como los
hidrocarburos.

biodegradación así como en la industria alimentaria como emulsionante en aderezos para ensaladas.
Nalini y col. (2016) reportaron una buena capacidad de un biosurfactante producido por B. cereus
para emulsionar aceites vegetales.

3.6 Estabilidad bioactivante

La estabilidad del biosurfactante de B. cereus se probó en un amplio rango de temperatura. Resultó

ser estable a todas las temperaturas probadas, a saber, 5, 70, 100 y 120 ° C, ya que la tensión
superficial media se mantuvo bastante baja (<30 mN / m) durante 60 minutos de incubación (Fig.
4A). Por el contrario, la actividad de emulsificación de biosurfactantes cambió

con temperatura contra diferentes tipos de aceite (Fig. 5A).

Cuando se sometió a cambios en la salinidad, la tensión superficial permaneció estable en todas las
condiciones probadas (Fig. 4B). Por otro lado, la actividad de emulsificación de biosurfactantes
contra el biodiesel, el aceite lubricante o el aceite de motor no se vio afectada incluso a alta salinidad,
la del aceite de canola disminuyó a una concentración de sal de 6.0% o más, mientras que la del
aceite de pequi se mejoró (Fig. . 5B).

Se encontró estabilidad en términos de tensión superficial en el amplio rango de pH probado (2-10),

con la tensión superficial más baja a pH 6 (Fig. 4C). Por otro lado, la Fig. 5C muestra una alta
estabilidad de biosurfactantes en términos de índice de emulsificación contra diferentes sustancias
hidrófobas en un amplio rango de pH. En particular, su capacidad para emulsionar aceite de canola
y aceite de motor se redujo a valores de pH extremos, especialmente 2 y 12, mientras que para
emulsionar el aceite de pequi incluso aumentó en condiciones alcalinas.

Todos estos resultados tomados en conjunto son prometedores para la posible aplicación del
biosurfactante en procesos que involucran altas temperaturas, como ocurre a menudo en la
recuperación mejorada de petróleo o en ambientes marinos.

3.7 Concentración crítica de micelas

La concentración crítica de micelas (CMC) del biosurfactante de B. cereus fue de 0.90 ± 0.05 g / L,
correspondiente a una tensión superficial de 28 ± 0.2 mN / m, un valor dentro del rango considerado
prometedor para un biosurfactante (28 a 35 mN / m ) (Santos et al., 2016). Las tensiones
superficiales de los medios en presencia de biosurfactantes de B. subtilis CN2 (30 mN / m) (Bezza y
Chirwa, 2015) y BS5 (36 mN / m) (Abdel-Mawgoud et al. 2010) en sus respectivos CMC estaban cerca
al valor obtenido en el presente estudio. A diferencia de la tensión superficial, la CMC varía
considerablemente entre los biosurfactantes con una estructura similar. Por ejemplo, se informaron
CMC de 0.06, 0.1 y 0.5 g / L para biosurfactantes producidos por B. subtilis MJ01 (Veshareh et al.,
2018), Bacillus mojavensis I4 (Ghazala et al., 2017) y B. cereus BCS0 (Durval et al., 2018),
respectivamente.

3.8 Toxicidad por biosurfactantes

Después de la exposición al biosurfactante crudo durante 24 h, las larvas de Artemia salina,

seleccionadas como bioindicador de microcrustáceos, exhibieron una tasa de supervivencia de 90.0
± 0.5%. Asimismo, el biosurfactante aislado a ½ CMC, CMC y 2 CMC condujo a tasas de mortalidad
de solo 5.0 ± 0.1, 10.0 ± 0.2 y 10.0 ± 0.4%, respectivamente. Estos resultados, que denotan baja
toxicidad en las condiciones probadas, concuerdan con la menor toxicidad de los biosurfactantes de
bacilos en comparación con los tensioactivos sintéticos (Datta et al., 2018).

3.9. Análisis estructural de biosurfactantes.

El análisis FT-IR del biosurfactante extraído (Fig. 6) muestra estiramientos de NH y C = O en los rangos
3500- 3300 cm-1 y 1720-1708 cm-1, probablemente debido a aminas secundarias vinculadas a
grupos alifáticos y cetonas alifáticas. , respectivamente. La presencia del grupo funcional carboxilo
se puede inferir de la observación de absorciones de CH que se superponen a un estiramiento
amplio de OH, un estiramiento amplio de C = O y un estiramiento de CO de intensidad media en los
rangos 3400-2400 cm-1, 1730-1700 cm-1 y 1320- 1210 cm-1, respectivamente. Por otro lado, la
vibración C-H a 2926 cm-1 se puede asignar a los grupos CH3 y -CH2-. En base a estas observaciones,
podemos suponer la presencia de un dominio hidrofóbico alifático y un dominio hidrofílico peptídico
en la molécula biosurfactante (Vera, 2017), como los reportados para biosurfactantes de tipo
lipopéptido como la surfactina (Al-Wahaibi et al.2014 ; Bezza y Chirwa 2015; Jemil et al., 2017;
Veshareh et al., 2018).

Algunos de estos grupos funcionales también se identificaron en el espectro de RMN biosurfactante

(Fig. 7). De acuerdo con Pavia et al. (2012), los picos entre 0.7 y 1.7 ppm corresponden a
hidrocarburos alifáticos, confirmando las vibraciones C-H de metilo y metileno en el espectro FT-IR,
mientras que los picos entre 2.1 y 2.5 ppm pueden asignarse a átomos de hidrógeno adyacentes al
grupo carbonilo. Los picos amplios y amplios a 2.5 ppm probablemente se debieron al DMSO
utilizado como solvente para solubilizar muestras para RMN, y aquellos entre 3 y 4 ppm a H2O-
DMSO, con posible solapamiento con otros picos como los de grupos halogenados. Las aminas se
pueden identificar a 4 y 5 ppm, las insaturaciones como los enlaces dobles entre 5.5 y 6.5 ppm y los
ácidos carboxílicos entre 11 y 12.5 ppm, mientras que los picos de 7 a 8 ppm y 9 a 10 ppm indican
compuestos aromáticos y aldehídos en cantidades más pequeñas en comparación a los
hidrocarburos (Pavia et al., 2012; Vera, 2017).

Con base en estos análisis espectrales, se puede inferir que el biosurfactante de B. cereus tiene una
cadena larga que involucra diversos grupos funcionales tales como ácidos carboxílicos cargados
negativamente y aminas cargadas positivamente. Durante el proceso de purificación se observó
precipitación durante la adición de ácido, y durante la filtración al vacío, el biosurfactante mostró
propiedades espumantes. En conjunto, estas características indican un posible tensioactivo
anfótero que presenta características proteicas y, al mismo tiempo, propiedades emulsionantes.

3.10. Lavado y dispersión de aceite de motor.

El uso de agentes biotensioactivos con propiedades dispersantes es atractivo cuando un ecosistema

está amenazado por contaminantes hidrofóbicos (Freitas et al., 2016). Las pruebas de lavado del
aceite de motor adsorbido en roca marina se realizaron con el caldo sin células que contiene
biosurfactante crudo o el biosurfactante aislado a ½ CMC y CMC. El mayor porcentaje de eliminación
de aceite (91.0 ± 0.4%) se obtuvo con el biosurfactante crudo, mientras que el aislado produjo solo
35.0 ± 0.5 y 60.0 ± 0.5% a ½ CMC y CMC, respectivamente, lo que sugiere que otras sustancias
presentes en el caldo puede haber contribuido a esta propiedad. También se realizó un estudio
comparativo sobre la actividad dispersante del biosurfactante crudo (caldo libre de células) y el
biosurfactante aislado hacia el aceite de motor. La capacidad de dispersión del caldo libre de células
fue de aproximadamente 70.0 ± 0.4%, mientras que las del biosurfactante aislado a ½ CMC, CMC y
2 CMC fueron 33.0 ± 1.2, 53.0 ± 1.0 y 65.0 ± 0.7%, respectivamente. Una vez más, es probable que
otras sustancias presentes en el caldo hayan contribuido a una mayor capacidad de dispersión del
caldo libre de células. Rocha e Silva y col. (2014), quienes realizaron un estudio comparativo entre
las formas crudas y aisladas de un biosurfactante producido por Pseudomonas cepacea CCT6659,
observaron una mayor capacidad de dispersión para el primero (80%). En otro estudio, un
biosurfactante producido por B. mojavensis I4 logró una capacidad de desplazamiento de aceite de
hasta el 89% (Ghazala et al., 2017).
Las buenas capacidades de lavado y dispersión del biosurfactante crudo constituyen una ventaja
económica considerable en el caso de aplicaciones ambientales, ya que no requerirían costosos
procedimientos de aislamiento y purificación.

3.11. Formulación de biosurfactante

El biosurfactante bruto se formuló con la adición de sorbato de potasio al 0,2% para evaluar su
estabilidad como producto comercial durante el almacenamiento de 45 días a temperatura
ambiente. Como se muestra en la Fig. 8A, no se produjeron cambios significativos en la tensión
superficial (28-32 mN / m) en las diferentes condiciones a las que se sometió el biosurfactante. Se
observaron variaciones considerables en el índice de emulsificación (Fig. 8B) después de diferentes
tiempos de almacenamiento, lo que no nos permitió establecer ninguna hipótesis sobre la acción
emulsionante de biosurfactantes. Después de 45 días, se observaron los mejores resultados (índice
de emulsificación> 90 ± 0,5%) en el control y la prueba se realizó a pH 7,0 y NaCl al 1,0%. Estos
resultados están cualitativamente de acuerdo con las variaciones significativas en el índice de
emulsificación observadas por Santos et al. (2017) después del almacenamiento del biosurfactante
Candida lipolytica formulado con 0.2%

sorbato de potasio. Por otro lado, se encontró estabilidad a lo largo de los diferentes tiempos de
almacenamiento durante las pruebas de dispersión (Fig. 8C). Además, la adición de sorbato de
potasio como conservante condujo a un aumento en la capacidad de dispersión del biosurfactante
después de 15 días de almacenamiento. Después de 45 días, la capacidad de dispersar el motor.

aceite mantenido satisfactoriamente alto (entre 65.0 ± 0.4 y 70.0 ± 0.6%) independientemente del
pH, temperatura y salinidad. Como observación final, el biosurfactante formulado exhibió
propiedades adecuadas para un agente tensioactivo comercial con aplicaciones potenciales en
diferentes sectores industriales.

4. Conclusiones

Los resultados de este estudio demuestran la capacidad de B. cereus UCP1615 cultivada en melaza
de caña de azúcar y licor de maíz para producir un biosurfactante con un potencial considerable en
aplicaciones ambientales, particularmente la recuperación de contaminantes a base de aceite
liberados accidentalmente por la industria petrolera.

El biosurfactante demostró propiedades prometedoras en términos de capacidad para reducir la

tensión superficial, la capacidad emulsionante, la acción dispersante y la capacidad espumante. El
biosurfactante también exhibió baja toxicidad para un bioindicador marino como las larvas de
Artemia salina, así como estabilidad en diferentes condiciones de pH, temperatura y salinidad, lo
que indica una acción eficiente en condiciones ambientales específicas. El tratamiento con sorbato
de potasio como conservante permitió preparar una formulación eficiente y estable para
aplicaciones industriales.