GENETICA BACTERIANA

Dr. Cerasella Dragomirescu

28.10-01.11.2019
Suportul material al eredităţii este reprezentat de ADN
(acidul dezoxiribonucleic).

Molecula de ADN conţine codificată informaţia

ereditară, care se exprimă prin sinteza unor proteine şi
se transmite prin replicare şi diviziune la descendenţi.
• Nucleul: Masa nucleară vine în contact direct cu
citoplasma.
• Este localizată în partea centrală a celulei. Conţine
ADN, nu are nucleoli.
• Unicul cromozom bacterian este alcătuit dintr-o
singură moleculă de ADN dublu catenar, cu
aspectul unui fir lung (1000-2000 μm), închis într-un
inel şi replicat pe el însuşi.
• Nucleul deţine informaţia genetică necesară
proceselor vitale de creştere şi multiplicare.
 Structura ADN
• ADN-ul este un macropolimer de
dezoxirbonucleotide
• ADN-ul apare ca o macromoleculă formată
din două catene polinucleotidice
antiparalele şi complementare răsucite în
dublu helix.
Elemente Componente (1)
Baze azotate
Elemente Componente (2)
(Deoxi)Ribonucleotide
Perechi de baze
 Cromozomul bacterian

Ioanna Pagani et al. Complete genome sequence of Marivirga tractuosa type strain (H-43T). Stand
Microscopie

Electronica

Cromozomul

bacterian
• ADN-ul apare ca o macromoleculă formată din două
catene polinucleotidice antiparalele şi complementare
răsucite în dublu helix.
• Cele două catene sunt unite prin punţi de hidrogen
formate între bazele azotate opuse (A=T şi G≡C).
• Modelul structural al ADN-ului a fost propus de către
Watson şi Crick în anul 1953 – Premiul NOBEL pt
Medicina in 1962.
• Complementaritatea bazelor azotate este cea mai
importantă proprietate a acizilor nucleici şi
condiţionează toate proprietăţile ADN-ului, mai ales
cea de autoreplicare şi cea de transfer al informaţiei
genetice.
Bazele
istorice ale
geneticii
bacteriene

Griffith
1930
• Replicarea ADN se face printr-un
mecanism semiconservativ (fiecare
moleculă nou formată conține un lanț
polinucleotidic din molecula parentală și
un lanț polinucleotidic nou format)

• Nucleoidul deține informația genetică

necesară proceselor metabolice ce
asigură creșterea și multiplicarea
bacteriană.
• Replicarea semiconservativa
 Denaturarea si Renaturarea
termica
65 °C
Legaturile ionice incep sa
slabeasca

90 °C
Denaturarea este
completa

Doar in cazul prezentei

unei concentratii
corespunzatoare de
ioni (taria ionica)
 PCR (1)
Polymerase Chain Reaction
PCR (2)
PCR (3)
Protocol
PCR
• Gena reprezintă unitatea funcţională a
eredităţii

• noţiunea de genă este cunoscută încă din anul

1909.

• Dacă nu au loc modificări genetice, toţi

descendenţii unei bacterii vor fi identici cu
bacteria „mamă” şi identici între ei.
• Genomul reprezintă suma genelor unui
organism.
• Genotip = totalitatea informaţiei genetice a
unui organism.
• Fenotip = suma caracterelor observabile,
specifice unui organism, produse de genotip în
interacţiune cu mediul ambiant.
• Funcţiile ADN-ului ca material genetic sunt:

 conservarea informaţiei genetice;

 replicarea;

 transcrierea şi traducerea materialului genetic;

 protejarea materialului genetic propriu („self”);

 reglarea şi controlul activităţii celulare.

• Transmiterea mesajului genetic se face prin
dublarea cantităţii de material genetic urmată
de diviziune.
• Replicarea ADN constă în sinteza unor noi
molecule de ADN, identice cu molecula
parentală şi identice între ele, pe bază de
complementaritate (replicare
semiconservativă).
• Repliconul bacterian este bicatenar şi circular,
caracterizat prin:
- o secvenţă nucleotidică specifică marcând
începerea replicării;
- gene care codifică sinteza unor proteine
specifice numite iniţiatori;
- o secvenţă nucleotidică semnal pentru
terminarea replicării.
 Organizarea genomului bacterian
• Genomul bacterian este alcătuit din două categorii
de determinanţi genetici:
1. genele esenţiale, localizate în structura
cromozomului bacterian şi
2. genele accesorii extracromozomale prezente în
structura:
- plasmidelor şi
- elementelor genetice transpozabile.
• Plasmidele sunt elemente genetice
extracromozomiale, capabile de replicare fizic
independentă de cromozom (replicon), dar
depinzând de factori codificaţi de nucleul
bacterian.

• Conţin informaţie genetică neesenţială pentru

viaţa celulei bacteriene.

• Sunt transmise stabil de-a lungul generaţiilor.

 Clasificarea plasmidelor:
1. plasmide care codifică rezistenţa la agenţi antibacterieni:
- factorii R;
- plasmidele de rezistenţă la UV etc.
2. plasmide care codifică sinteza unor agenţi antimicrobieni:
- factorii Col etc.
3. plasmide de patogenitate care codifică sinteza de:
- hemolizine;
- factorii de colonizare;
- enterotoxine etc.
4. plasmide care codifică enzime ale unor căi metabolice particulare;
5. plasmide care permit transferul genelor cromozomiale de la o celulă care
deţine respectivul plasmid (F) la alta, putând fi transmis inclusiv plasmidul
(factorul) F;
6. plasmide criptice, pentru care nu se cunosc caracterele fenotipice
exprimate.
 Plasmidele R

• Plasmidele R (de rezistenţă la antibiotice)

conferă celulei purtătoare rezistenţa la unul
sau la mai multe antibiotice.
• Plasmidele R au o structură genetică
complexă, fiind alcătuite din:
- gene care asigură proprietatea de rezistenţă
la antibiotice;
- gene care formează „factorul de transfer al
rezistenţei” (RTF).
 Plasmidele „Col”
• Plasmidele „Col” codifică proprietatea unor
bacterii de a elabora substanţe antibiotice de
tip special, numite bacteriocine (colicine,
pesticine, vibriocine, piocine etc).
• Plasmidele „Col” sunt transferabile de la
tulpinile Col+ la tulpini Col- prin transformare
genetică, transducţie fagică sau prin conjugare.
• Bacteriocinele sunt bactericide, au un spectru
de activitate limitat (faţă de specia omologă),
iar biosinteza lor nu are efect letal pentru
specia producătoare.
Factorul F (factorul de „sex”, factorul de „fertilitate”)

• Factorul F controlează capacitatea unor bacterii de

a acţiona ca donoare de material genetic în procesul
de conjugare. Factorul F codifică structurile (de
exemplu pilul „F”) şi enzimele necesare transferului
de ADN.
• În funcţie de prezenţa plasmidelor F, bacteriile pot fi:
 Bacteriile F- sunt lipsite de factorul F. Sunt echivalente unor
celule „femele” care se comportă ca receptoare de material
genetic.
 Bacteriile F+ deţin factorul F autonom în citoplasmă. Sunt
echivalente unor celule „masculine”, donoare de material
genetic, capabile să transmită factorul F.
 Bacteriile Hfr (High frequency of recombination) deţin factorul F
integrat în cromozomul bacterian. Se comportă ca donoare de
material genetic, au o mare frecvenţă de conjugare şi
recombinare.
 Bacteriile F’ deţin o structură plasmidică de tip special (factor
de fertilitate recombinant) care a fost anterior integrată în
structura unui cromozom şi s-a desprins din acesta, încorporând
în structura sa unele gene cromozomale. Aceste bacterii au
caracter de „mascul” şi se comportă ca donoare de material
genetic (factorul F’).
 Elemente genetice transpozabile

• O anumită secvenţă specifică de ADN constituie un

element genetic transpozabil dacă îşi menţine
integritatea fizică, structurală şi genetică,
funcţională în cursul translocaţiei de la o poziţie la
alta în acelaşi genom, replicon (intramolecular) sau
în genomuri diferite (intermolecular).
 Elemente genetice transpozabile

• - secvenţe de inserţie (IS);

• - transpozoni (Tn);
• - bacteriofagi.
 Secvenţele de inserţie
• nu conţin nici o genă şi nu au nici o altă
funcţie (cunoscută) în afară de cea de inserţie.
Sunt cele mai simple elemente transpozabile.
• După inserţia lor pot apărea modificări în
expresia unor gene sau modificări în rata
incidenţei deleţiilor în regiunile adiacente
situsului lor de inserţie.
 Transpozonii (Tn)
• Transpozonii diferă de secvenţele de inserţie prin
complexitate şi prin faptul că poartă gene care
conferă bacteriilor funcţii noi, detectabile, de
exemplu:
- rezistenţa la antibiotice;
- capacitatea de sinteză a unor enzime;
- producerea de enterotoxine;
- sinteza antigenelor bacteriene de suprafaţă (de
exemplu K88 la E. coli);
- sinteza unor factori de colonizare intestinală etc.
 Bacteriofagii
• bacteriofagul Mu (numele rezultă prin prescurtarea
„mutator”, pentru că a fost identificat ca factor
mutagen la tulpini de E. coli) are un genom de 30kb şi o
structură lineară.
• După infectarea celulei bacteriene, bacteriofagul Mu se
inseră în cromozom la „întâmplare” şi ulterior în diferite
poziţii ale cromozomului bacterian apar copii ale
acidului nucleic Mu.
• Atunci când structura genetică Mu va părăsi genomul
bacterian va prelua o parte din structura genetică
bacteriană (circa 100-150 pb).
 Mecanismele de variabilitate bacteriană

• Bacteriile sunt microorganisme haploide, au un

singur cromozom iar pentru remanierea prin
recombinare a genomului este necesară
transferarea de material genetic de la o tulpină
(„donoare”) la tulpina receptor („acceptoare”).
• Variabilitatea bacteriană presupune
modificarea la un moment dat a
comportamentului celulei bacteriene sau a
descendenţilor ei şi pot exista în principiu
două variante:
• - variabilitatea fenotipică şi
• - variabilitatea genotipică;
 Variabilitatea bacteriană
• Variaţiile fenotipice reprezintă modificări
morfologice sau fiziologice de tip adaptativ,
care nu se transmit ereditar. Genomul nu este
afectat.
• Variaţiile genotipice reprezintă modificări
definitive ale materialului genetic
(cromozomial sau extracromozomial) care se
transmit descendenţilor.
 Variaţiile genotipice

• Mecanisme:
• - mutaţie;
• - transfer genetic urmat de recombinare
genetică.
 Mutaţia
• Mutaţia reprezintă o modificare accidentală în
secvenţa nucleotidică a unei gene, ducând la
modificări ale mesajului genetic.
• Mutaţiile pot apărea la nivelul materialului genetic
prin:
- substituţii;
- inversii;
- inserţii;
- deleţii.
 MUTATIILE
• Mutaţia spontană – mutatia care apare în
condiţii de mediu obişnuite şi fără intervenţia
unui factor decelabil.
• Mutaţia indusă - mutaţiile care se produc sub
acţiunea unor factori fizici (de exemplu raze
UV, radiaţii ionizante etc.) sau chimici (de
exemplu agenţii alchilanţi), care acţionează ca
agenţi mutageni.
• Rata mutaţiilor induse este semnificativ mai
mare decât rata mutaţiilor spontane.
 MUTATIILE

• Mutaţia punctiformă are ca substrat alterarea

unui singur nucleotid, respectiv a unui singur
codon.
• Mutaţiile extinse reprezintă alterări care depăşesc
limitele unui codon, putând afecta secvenţe mai
mari ale uneia sau mai multor gene (mutaţie
poligenică).
 MUTATIILE
• Mutaţiile regresive (retromutaţii) afectează
celule mutante, determinând revenirea
acestora la tipul iniţial, restabilind secvenţa
nucleotidică originară.
• Mutaţiile supresoare permit exprimarea
funcţiei anterioare a genei, deşi o modificare a
secvenţei bazelor nucleotidice persistă.
 Transferul materialului genetic

• Principalele mecanisme de transfer al materialului

genetic de la o bacterie donor la o bacterie receptor
sunt:
- transformarea;
- transferul mediat de bacteriofagi (transducţia);
- conjugarea.
 Transformarea
• un transfer genetic realizat atunci când bacteria
acceptă ADN liber provenit de la o bacterie donor
sau din alte surse.
• Bacteria receptor trebuie să fie „competentă” în a
accepta ADN-ul de la bacteria donor.
• Transferul genetic mediat de
bacteriofagi se poate realiza prin:
• - transducţie;
• - conversie lizogenică.
• Transducţia reprezintă transferul unui
fragment genetic (cromozomial sau
extracromozomial) de la o bacterie la alta prin
intermediul unui bacteriofag (de obicei un fag
temperat).
• Fagul se numeşte transductor.
• Bacteria receptoare se numeşte transductant.
• Conversia lizogenică reprezintă apariţia unui
caracter nou la bacteriile care găzduiesc un
profag,
• de exemplu producerea toxinei difterice este
realizată numai de către C. diphtheriae purtător
al fagului temperat (profagul β care deţine
gena tox) iar
• producerea toxinei scarlatinoase este posibilă
numai în cazul în care Streptococcus pyogenes de
grup A este lizogenizat.
• Conjugarea bacteriană reprezintă un proces
de transfer de material genetic (cromozomial
sau extracromozomial) realizat prin
intermediul unei legături intercelulare directe.
Este condiţionată de prezenţa factorului F în
celula donoare.
 BACTERIOFAGUL

• virus capabil sa paraziteze celulele bacteriene

• pot avea asupra bacteriei 2 tipuri de efecte:
– Efect litic sau productiv
– Efect lizogen sau de tip reductiv

• Relaţiile sunt strict specifice şi sunt mediate de receptori.

 Ciclul litic; etape

1. Adsorbţia: specifică (există receptori)

2. Penetrarea: fagul eliberează muramidaza …

3. Multiplicarea: 4 minute, ADN-ul bacteriei este blocat, funcţia fiind

preluată de ADN-ul fagic ce coordonează sinteza componentelor
proprii;

4. Maturarea (ansamblarea) fagului;

5. Liza bacteriei şi eliberarea bacteriofagului matur, virulent.

 Evidenţierea ciclului litic la nivelul culturilor
bacteriene

- în mediu lichid ( tulbure ) inocularea fagului litic duce la

limpezirea mediului

- În mediu solid, insamantat uniform, inocularea fagului litic

duce la o zona de liza bine delimitata ( plaja )
Lizotipia
 Ciclul de lizogenizare; rezultate

Pot apărea fenomene importante din punct de vedere genetic:

- transducţia;
- conversia;
- recombinarea genetică (atunci când o bacterie parazitată de
doi fagi diferiţi, dar înrudiţi, eliberează la sfârşitul ciclului litic pe
lângă tipurile parentale şi tipuri de fagi care însumează unele
din proprietăţile celor doi fagi parentali) etc.;
- inducţia fagică
Aplicatii ale geneticii bacteriene in
microbiologia moderna
 Biologia moleculara

• - identificarea bacteriana – direct din produs

patologic
• - evidentierea unor factori de patogenitate
• - tipizarea tulpinilor bacteriene
• - evidentierea rezistentei la antibiotice
 Identificarea bacteriana
• - direct din produs patologic – RAPID
• - in situatia in care pacientul a luat antibiotice
= cultura este negativa
• - prin tehnici de secventiere a ADN-ului
• - prin reatii tip PCR amplificam o gena
specifica pentru o anumita specie bacteriana
Secventierea unor gene inalt conservate:
ARN 16 S, rpoB, etc
• Etape:
• PCR pt gena respectiva
• Purificarea ampliconului obtinut prin PCR
• Reactia de secventiere
• Purificarea ampliconului
• Incarcarea ampliconului pe secventiator
 Electroforeză în gel de agaroză a ampliconilor
genei rrs (1510 pb)

ELECTROFOREGRAMA - succesiunea de baze azotate – gena ARN 16 S –

Tulpina Corynebacterium striatum
 Evidentierea unor factori de patogenitate

• - gene pt enterotoxinele stafilococice: sea-see

• - gena pentru coagulaza stafilococica: coa
• - gena pentru toxina difterica: tox+
Verificarea prin electroforeză în gel de agaroză a ampliconilor sea,
seb, sec, sed, see
Electroforeză în gel de agaroză a ampliconilor genei tox (246
pb) şi a fragmentului C (891 pb)
 Tipizarea tulpinilor bacteriene
• - prin reactii de secventiere: MLST, spa typing
• - prin PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis)
= determinarea profilului de macrorestricție al
ADN-ului cromozomal cu ajutorul
electroforezei în câmp pulsator
PFGE
 490
1
der spa
t 22

n
t521 4 no founder
31

no fou
CC
sp

005
aC
t6

t044 4
34

C
6

00
1

5
sp

72
a
C
C

t 12
00
5

3
t89

64
11

t1
sp
aC
C 7
00 80
5
t47

t44
91
spa 06
CC
005 t 55 6
C 321
aC
3 sp
t4 001

t005 1
spa C
C 005
16
a CC 32
t3216 3 sp

t902 1 spa CC 005

t116 3 spa CC 321
6

nder
no fou t067
t304 7 2 spa
CC 0
53

r t05
nde 32
o f ou spa
7n CC
t 024 053
t 43
21
2s
15 pa
t35 CC
05
3
r
de
un
fo

t2
no

7t099
5

er

41 8
93

nd
t0

fou

no
t902

f
no

ou
38n

n
85

de
t056
t31

r
o fou
r
o founde

nder
er
t1534 6 no found
t3576 6 n

Arborele filogenetic în funcţie de tipul spa al tulpinilor de S. aureus