TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA GUTIÉRREZ

Determinación de parámetros cinéticos mediante el cultivo por lote en matraz y
biorreactor Air-lift de Rhodotorula Mucilaginosa y R. Glutinis para la producción de
carotenoides
1 1 1
Briones Domínguez Luis Beltrán : Hernández Vidal Leonardo Daniel ; Méndez Morales Lizbeth ; Ramírez
1 1
Hernández Maribi del Rosario ; Ruiz Matus Kevin Antonio .
1
Integrantes del equipo 1
RESUMEN

Se realizó la determinación de parámetros cinéticos de Rhodotorula Mucilaginosa y Rhodotorula

Glutinis mediante cultivo por lote a nivel matraz con la finalidad de conocer la actividad
fermentativa de la levadura a utilizar, posteriormente se realizó la fermentación en el biorreactor air-
lift de la levadura Rhodotorula Glutinis inoculada en plena fase log para la producción de
carotenoides, se hizo crecer en un medio de cultivo rico en glucosa, extracto de levadura y sales
minerales en diferentes concentraciones. Se evaluó la cinética de crecimiento mediante la técnica
de peso seco, centrifugación, espectrofotometría y el método de DNS.
Palabras clave: Carotenoides, fermentación microbiana, cinética de crecimiento.
ABSTRACT

The determination of kinetic parameters of Rhodotorula Mucilaginosa and Rhodotorula Glutinis was
carried out by batch culture at the flask level in order to know the fermentative activity of the yeast
to be used, then the fermentation was carried out in the air-lift bioreactor of the Rhodotorula Glutinis
yeast Inoculated in full log phase for the production of carotenoids, it was grown in a culture
medium rich in glucose, yeast extract and mineral sales in different proteins. Growth kinetics was
evaluated by dry weight technique, centrifugation, spectrophotometry and the DNS method.

Keywords: Carotenoids, microbial fermentation, growth kinetics.

INTRODUCCIÓN

Los pigmentos carotenoides están Debido a sus propiedades específicas, existe

ampliamente distribuidos en la naturaleza,
con más de 600 tipos de moléculas ya
identificadas (Fraser y Bramley, 2004). Estas
moléculas se encuentran a menudo en las
algas, hongos filamentosos, levaduras,
bacterias, y plantas. Sin embargo, los
animales no son capaces de sintetizarlos.
Sus principales funciones biológicas son las
propiedades anticancerígenos y provitamina,
así como los efectos contra elementos
reactivas de oxígeno, los carotenoides se
encuentran presentes en todo el reino animal
y han sido frecuentemente examinados como
fuentes potenciales de colorantes de
alimentos e industrias relacionadas. Algunos
carotenoides, además de ser
extremadamente útiles como colorantes, son
convertidos en el cuerpo en Vit. A y de ahí
que tengan propiedades provitamina A
(Young y Lowe, 2001).
una demanda creciente para el medio más
adecuado para producir estos pigmentos
naturales, especialmente para colorear
alimentos y suplementos nutricionales.
(Downham y Collins, 2000). Los pigmentos
carotenoides se pueden utilizar para el color
amarillo, naranja y rojo deseado de muchos
alimentos, por ejemplo, las frutas, los
vegetales, yema de huevo, un poco de
pescado como el salmón y la trucha, y los
crustáceos. En los vegetales verdes se
encuentran en los cloroplastos, formando
parte del sistema de biosíntesis a partir de la
energía de la luz,(ASTORG, 1997).
El género Rhodotorula forma parte de los
hongos levaduriformes; es simbionte normal
de la piel, tracto respiratorio superior y heces;
se distinguen por la producción de pigmentos
carotenoides, los cuales confieren a las
colonias una coloración rosada o rojiza.
Pertenecen a este género las especies R.
mucilaginosa y R. glutinis (García Martos
P.,2004).
Rhodotorula glutinis es una levadura
aeróbica caracterizada por colonias rosadas
y lisas con una apariencia húmeda. La
reproducción es típicamente por gemación
multipolar, aunque ocasionalmente se
producen seudohifas. La reproducción sexual
es por basidiosporas que surgen de una
teliospora desarrollada a partir de una
conexión de pinza micelial. Una característica
distintiva de la especie y sus parientes
cercanos son los intensos pigmentos
amarillos y rojos producidos durante el
crecimiento en la mayoría de los sustratos.
Normalmente crece a 37 ° C a una velocidad
rápida y requiere una actividad mínima de
agua de 0.92, pH de 2.2 y ácidos orgánicos o
HCl. (Hernández-Almanza A,2014).
Rhodotorula mucilaginosa (nombre antiguo
Rhodotorula rubra). En el medio de cultivo las
colonias son rosas o rojas, brillantes o mates,
mucosas, lisas o rugosas.
Microscópicamente se observan
blastoconidias. En algunos casos, producen
un seudomicelio rudimentario. Para
diferenciar las especies se utiliza la prueba
de asimilación de Maltosa. R. mucilaginosa la
asimila solo en algunas veces, R. glutinis,
siempre la asimila (Larone, 2011).
El objetivo de la práctica es determinar los
parámetros cinéticos
( 𝜇𝑚𝑎𝑥, 𝑡𝑑, 𝑦𝑥 , 𝑦𝑝 , 𝑦𝑝 , 𝜌, etc.) a partir de la cepa
𝑠 𝑠 𝑥
Rhodotorula glutinis, evaluando la producción
de carotenoides y el consumo del sustrato
limitante (glucosa), comparando su
comportamiento en la fermentación a nivel
matraz y en el biorreactor Air-lift.
METODOLOGIA
Preparación del inoculo
Se preparó 100 mL a partir de un medio de
cultivo con una composición de 2 g/L de
glucosa, 0.2 g/L de (NH4) SO4, 0.25 g/L de
extracto de levadura, 0.2 g/L de extracto de
malta, 0.1g/L de KH2 (PO4) y 0.025 g/L de Mg
SO4 * 7H2O . Se ajustó a un pH de 7 con
soluciones de HCl y NaOH ( Bauernfeind, J.
C. ,1981), donde se esterilizo en autoclave a
condición de 121°C y 15 lb/in2 por 15 min y
se dejó en prueba de esterilidad por 24 hrs.
posteriormente se inoculó con la cepa
Rhodotorula mucilaginosa y se dejó crecer
por 24 hrs a temperatura ambiente, en
condiciones de oscuridad y con una agitación
de 110 rpm.
Fermentación en matraces
Se preparó 900 mL de medio de cultivo que
contenía un composición de 18 g/L de
glucosa, 1.8 g/L de (NH4) SO4, 2.25 g/L de
extracto de levadura, 1.8 g/L de extracto de
malta, 0.9 g/L KH2 (PO4) y 0.225 g/L de Mg
SO4 * 7 H2O en las mismas condiciones que
el inoculo. El volumen de 900 mL se
distribuyó uniformemente en 18 matraces,
por lo que se inoculó 5 mL del inoculo de
Rhodotorula mucilaginosa a 17 matraces
incubándose a 110 rpm y condiciones de
oscuridad , dejando un matraz en blanco en
función de testigo, posteriormente se
monitoreó por 3 días y 6 hrs tomándose
muestra cada 3 hrs.
Para fermentación con Rhodotorula glutinis
se implementó las mismas condiciones de
esterilización y prueba de esterilidad, así
como el tiempo idóneo de monitoreo
empleando con anterioridad utilizando un
inoculo 100 mL, donde se requirió de 850 mL
de medio de cultivo que incluía las
concentraciones de 34 g/L de glucosa, 2.26
g/L de extracto de levadura, 1.27g/L de Mg
SO4 * 7H2O, 0.17 g/L de CaCl 2*6H2O,0.26 de
KH2(PO)4 *3 H2O, 0.84 g/L de (NH4)2SO4,
Regulándose a un pH de 5.5 (González
K.1972), donde se asignó en volúmenes
equitativos en 16 matraces para la
inoculación de 5mL a partir de los 100 mL
previamente adaptado.
Fermentación en biorreactor air-lift
Se estableció las condiciones de operación,
determinándose un volumen de operación de
1542 mL.
A partir del volumen de operación se
consideró la medición de un 10% para el
inoculo, por tanto se preparó con
previamente prueba de esterilidad 154 mL de
medio de cultivo para un inoculo de 36 hrs de
Rhodotorula glutinis, se preparó 1542 mL de
medio de cultivo que contenía 38 g/L de
glucosa, 4.117 g/L de extracto de levadura,
2.313 g/L de Mg SO4 * 7H2O, 0.308 g/L de
CaCl2* 6H2O,0.478 g/L de KH2 (PO4)*3 H2O y
1.526 g/L de (NH4) SO4 a un pH de 5.5 ,
donde se esterilizo a 14 lb/in2 a 24 hrs de
prueba de esterilidad, inoculado con los 154
mL de inoculo, donde se muestreó 10 mL del
cultivo durante 3 días cada 3 Hrs en
biorreactor.
Determinación de los parámetros
cinéticos
Se elaboró una previa curva patrón de
azúcares reductores (glucosa) de 0 – 1 por el
método de DNS (MILLER, G.,1959).
obteniéndose la siguiente ecuación.
Y=1.471x-0.0775 R2=0.9912
Utilizado para evaluación de consumo de
sustrato en función a dilución 1:50
Se cuantificó la biomasa por medio del
método de peso seco empleando la siguiente
formula. (Scragg,A.,1999)
𝑷𝒎𝒔 − 𝑷𝒕𝒕
𝐏. 𝐒. =
𝒎𝑳 𝒅𝒆 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂
Pm= peso de la muestra seca (g)
Ptt= peo del tubo tarado (g)
Para la cuantificación de carotenoides se
utilizó la siguiente ecuación, un método
espectrofotométrico (ABU-REZQ, T., 2010),.
𝐀𝐛𝐬 ∗ 𝐕𝐅 ∗ 𝟏𝟎^𝟒
𝛍𝐠 =
𝛆 ∗ 𝐏𝐌
Abs a λ=449nm (Burgos J.T.& Calderón
F.R.Marzo 2009)
ε= 2592
VF=volumen final (mL)
104=constante de unidad μ/μg
PM=peso de la muestra (g)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Fermentación en matraz agitado
Rhodotorula mucilaginosa nivel matraz
Rhodotorula mucilaginosa fue inoculada en
fase log (previa adaptación en un medio con
las condiciones a las del medio utilizado, esto
para evitar la fase lag), el crecimiento del
microorganismo fue constante y acorde al
consumo del sustrato de la 0 a 72 horas
como se observa en la figura 1.
Figura 1.-Curva de crecimiento, consumo de sustrato y
producción de carotenoides de Rhodotorula mucilaginosa en
la fermentación en matraz agitado.
En la hora 35 se observa que el
microorganismo entra en fase estacionaria
debido a que se agota los nutrientes
necesarios para continuar su crecimiento, en
cuanto al producto se multiplico por un factor
de 10 para visualizar con mayor claridad la
producción de carotenoides, el cual es un
metabolito parcialmente asociado al
crecimiento al llegar a presentarse durante la
fase log, durante el transcurso de la
fermentación se observó que la variación en
la producción de carotenoides fue mínima,
hasta la hora 48 posteriormente se observó
que la producción de carotenoides ascendió.
Otro parámetro establecido fue la eficiencia
de conversión de sustrato, el cual se obtuvo
un 94.5% del sustrato consumido . Los
resultados van acorde a las condiciones
establecidas por Asku et al.(2004), donde
establecieron las condiciones óptimas para la
obtención de carotenoides.
Rhodotorula glutinis a nivel matraz Cuadro 1- Comparación de los parámetros cineticos de
Rhodotorula mucilaginosa y Rhodotorula glutinis.
Las condiciones de inoculación para R.
glutinis fueron las mismas del
Parámetros Matraz Matraz Unidad
microorganismo R. mucilaginosa. Para el cinéticos R. R. es
caso del crecimiento del microorganismo, se Mucilag glutinis
mantuvo constante acorde al consumo del inosa
sustrato. En cuanto a la producción de µmáx.= 0,025 0,035 h-1
carotenoides por esta levadura, se puede Yx/s= 0,181 1,68
observar que inicialmente existe una Yp/s= 0,051 0,0048
producción durante 6 horas, posteriormente Y p/x= 0,279 0,0028
se mantuvo constante hasta la hora 48. td= 27,72 19,8 H
0
Transcurrido este tiempo se reanudó la N generaciones= 2,60 3,64 Genera
producción del metabolito hasta la hora 72. ciones
Biomasa(max)= 5,10 26,72 g/L
Carotenoides(max) 0,24 0,11 g/L
=
ρ= 94,5 49 %

Rhododotula glutinis en biorreactor Air-lift

Figura 2.-Curva de crecimiento, consumo de sustrato y

producción de carotenoides de Rhodotorula glutinis en la
fermentación en matraz agitado.

Se puede observar en el cuadro 1 que

existen diferencias en los parámetros
cinéticos entre las dos levaduras estudiadas.
Figura 3.-Curva de crecimiento, consumo de sustrato y
Principalmente, en la comparación de la
generación de biomasa de Rhodotorula glutinis en biorreactor
producción de carotenoides, es mayor por R. Air-lift.2
mucilaginosa (0.24 g/L) que por R. glutinis
(0.11 g/L), esto se debe a que la primera Cuadro 2. Parámetros cinéticos de Rhodotorula glutinis a nivel
matraz y biorreactor air-lift
obtuvo una eficiencia de conversión de
sustrato del 94.5%, comparado contra un
Matraz Biorrea Unidad
49% de la segunda. Además, esto puede ser
Parámetros R.glutini ctor es
comprobado también por el rendimiento de cinéticos s R.gluti
producto/sustrato (YP/S), el cual se cuantificó nis
en 0.051 y 0.0048, respectivamente. Sin µmax= 0,035 0,099 h-1
embargo, actualmente la información Yx/s= 1,68 0,075
existente de R. mucilaginosa con respecto a Yp/s= 0,0048 -
R. glutinis es menor (1510 y 3850 artículos, Y p/x= 0,0028 -
respectivamente). Por ello, y debido a que el td= 19,8 2,99 h
tiempo con el que se contaba para realizar el 0 Genera
N generaciones= 3,64 7,001
escalamiento a nivel biorreactor era limitado, ciones
permitiéndose realizar por ocasión única, se Biomasa(max)= 26,72 1,50 g/L
optó por trabajar con la levadura R. glutinis. Carotenoides(max) = 0,11 - g/L
ρ= 49 21 %
La velocidad máxima especifica de
crecimiento de R. glutinis del biorreactor con
respecto al matraz, es mayor debido a la
disminución de la concentración de sustrato
en el biorreactor, pues en la cinética a nivel
matraz no se consumió todo el sustrato.
La variación de los parámetros cinéticos del
biorreactor con respecto al matraz, se debe
principalmente a que la formación de
burbujas ocasiono la expulsión de la biomasa
fuera del biorreactor, interrumpiendo el
consumo de sustrato y la producción de
carotinoides.
CONCLUSIÓN
En base a los datos obtenidos, se concluye
que la R. mucilaginosa es la mejor opción
para trabajar a nivel biorreactor, en el debido
caso que la producción de carotenoides sea
el objetivo de la fermentación, pues los
parámetros cinéticos como yp/s, yp/x y la
eficiencia del consumo de sustrato es mayor,
a los parámetros cinéticos de la R. glutinis,
por lo que la R. mucilaginosa es mas
eficiente para la producción de carotenoides.
Sin embargo la R. glutinis es la mejor opción
para trabajar a nivel biorreactor si el objetivo
de la fermentación es la producción de
biomasa, pues la producción máxima de
biomasa es de 26.72 g/l para R. glutinis y
5.10g/l para R. mucilaginosa.
Con respecto al biorreactor air-lift no se
obtuvo los rendimientos esperados en base a
la cinética elaborada a nivel matraz, pues la
formación de grandes cantidades de espuma
producidas en el cultivo, provocaron la
expulsión de la biomasa fuera del biorreactor,
interrumpiendo el consumo de sustrato y la
producción de carotenoides, concluyéndose
que el medio de cultivo para R. glutini, debido
a su alto contenido de sales, extracto de
levadura el cual contiene el 63-76% de
proteínas y a la aireación constante,
contribuye a la formación de grandes
cantidades de espuma, por lo que no es
recomendable el empleo del biorreactor air-
lift para este microorganismo.
REFERENCIAS
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Burgos J.T.& Calderón F.R.(Marzo 2009)

Determinación del contenido de carotenoides
totales en ocho especies de frutas y verduras
comercializadas en la zona metropolitana de
san salvador, universidad de el salvador
facultad de química y farmacia.

Anexos

Cinética en matraces (Rhodotorula

mucilaginosa) Cinética en biorreactor air-lift
(Rhodotorula glutinis) Método azucares
reductores por DNS

Método azucares reductores por DNS

(Rhodotorula mucilaginosa)

Método de peso seco por centrifugación

(Rhodotorula mucilaginosa)
Método de peso seco por filtración
(Rhodotorula glutinis)