INDICE

I. ENZIMAS ALIMENTICIAS ............................................................................................................................... 4

1.1. Los alimentos, las células y las enzimas ..................................................................................... 4
1.2. Las enzimas y la conservación de alimentos .............................................................................. 5
1.3. La respuesta biotecnológica a las necesidades cambiantes de la sociedad ............................... 5
II. LAS LIPASAS - AROMAS Y SABORES ...................................................................................................... 7
2.1. Conclusión................................................................................................................................. 10
III. ASPARTASA .............................................................................................................................................. 10
3.1. Desarrollo de un método rápido para la obtención de un extracto enzimático de bacillus cereus
con actividad aspartasa .......................................................................................................................... 10
3.1.1. Introducción: .................................................................................................................................. 10
3.2. Metodología............................................................................................................................... 10
3.3. Resultados. ............................................................................................................................... 10
3.4. Conclusiones ............................................................................................................................. 11
IV. FUMARASA ................................................................................................................................................ 11
4.1. estudios de enfoque de modelado de homología y acoplamiento fumarase de corazón de cerdo
11
4.2. Resultados y Discusión ............................................................................................................. 12
4.3. Conclusión................................................................................................................................. 17
V. ALANINA .......................................................................................................................................................... 17
5.1. Efectos de la suplementación con ß-alanina sobre el rendimiento deportivo. ........................... 17
5.2. Introducción ............................................................................................................................... 18
5.3. Metodología............................................................................................................................... 18
5.4. Conclusiones ............................................................................................................................. 19
VI. ÁCIDO ASPÁRTICO .................................................................................................................................. 20
6.1. estudio preliminar de la produccion de acido l-aspàrtico con pseudomonas fluorescens ......... 20
6.2. Introducción ............................................................................................................................... 21
6.3. Materiales y Métodos ...................................................................................................................... 22
6.3.1. Selección del Microorganismo ............................................................................................................ 22
6.3.2. Adaptación del microorganismo al medio de cultivo........................................................................ 22
6.4. Resultados y Análisis ...................................................................................................................... 23
6.5. Conclusiones ................................................................................................................................... 26
VII. CORYNEBACTERIUM SP ........................................................................................................................ 26
7.1. parámetros fisicoquímicos para la síntesis de ácido láctico o etanol de la bacteria
(corynebacterium glutamicum) ............................................................................................................... 26
7.2. Introducción ............................................................................................................................... 27
7.3. Materiales y métodos ................................................................................................................ 28
7.4. Resultados ................................................................................................................................ 32
7.5. Discusión ................................................................................................................................... 39
7.6. Conclusiones ............................................................................................................................. 41

1
 RESUMEN
Los procesos enzimáticos en alimentos son comunes en lo que respecta a productos frescos,
procesados e incluso en prácticas culinarias. El uso empírico de enzimas en alimentos data de
tiempos muy antiguos, desde siglos antes de que se supiera que se trataba de proteínas con
actividad catalítica. No es sino hasta los años sesenta del siglo pasado que florece el área de
investigación y aplicación industrial de las enzimas. La diversidad, especificidad y capacidad
catalítica de estas biomoléculas en ambientes diversos, las hacen una herramienta bioquímica
importante en el procesamiento, conservación y desarrollo de alimentos.

Asimismo, tienen un papel relevante en la manufactura de materias primas de la industria

alimentaria. La tecnología enzimática forma una parte esencial de la biotecnología de alimentos,
como se constata en su aplicación en las industrias de panificación, productos lácteos, cárnicos
y en la producción de edulcorantes, por mencionar sólo unos ejemplos. Prestaremos particular
atención en la aplicación de lipasas en procesos que generan materiales de mayor valor
agregado a partir de materias primas baratas y en la biosíntesis de aditivos alimentarios
novedosos.

2
 Introducción
Los alimentos son parte de nuestra vida diaria y es muy común que los consideremos
principalmente desde un punto de vista culinario, o quizá, de repente, algunos de nosotros les
lancemos una fugaz mirada desde una óptica nutricional. Esta vez, los invitamos a observarlos
desde un enfoque más profundo, ya que todo lo que constituye nuestra alimentación está
formado por compuestos químicos más o menos complejos. Ya sea que estemos saboreando
una fruta fresca, un mole poblano, un jugo de manzana o un vaso de leche, ahí está presente la
química, y la bioquímica también.

En efecto, los alimentos se pueden observar desde el punto de visto químico como una mezcla
de moléculas entre las que se encuentran principalmente proteínas, carbohidratos, lípidos y
agua; así como el resultado de reacciones que se dan entre dichos componentes para generar
otras moléculas que aportan características sensoriales al alimento, como ocurre con el
oscurecimiento de la costra del pan al ser horneado. Mientras que la bioquímica, por otro lado,
permite explicar algunos cambios que ocurren cuando hay alguna actividad biológica implicada,
por ejemplo, cuando se oscurece un plátano o una manzana al quitarles la cáscara y exponerlos
al aire.

Es normal que no seamos conscientes de que nuestra alimentación comprende el consumo de

tejidos vegetales y animales (crudos o procesados), así como productos relacionados con el
metabolismo de microorganismos sobre sustratos animales o vegetales, tales como los
alimentos fermentados, por ejemplo, el yogurt, la cerveza o el pan. Cuando cambiamos nuestra
perspectiva de observación de los alimentos surgen varias preguntas: ¿esas moléculas y
compuestos químicos, las comemos tal cual como están en la naturaleza?, ¿sufren algún cambio
para poder ser consumidas?, ¿es ese cambio necesario?, ¿es éste un proceso natural o se trata
de algo que el hombre ha desarrollado?, ¿es seguro su consumo? Los invitamos a hacer un
recorrido en nuestra relación diaria con las enzimas y los alimentos que consumimos.

3
 I. ENZIMAS ALIMENTICIAS
1.1. Los alimentos, las células y las enzimas
Antes de que el gran científico alemán Eduard Buchner se ofreciera como voluntario para el
servicio militar durante la Primera Guerra Mundial y muriera finalmente ametrallado a los 57
años, justo 10 años después de ser galardonado con el premio Nobel, este gran químico
desarrolló trabajos en la Universidad de Tübingen en los que demostró que el proceso de
fermentación, descubierto por Pasteur, se podía llevar a cabo en la ausencia de células. Por estas
observaciones Buchner recibió el premio Nobel de Química en 1907,1 después de publicar el
trabajo titulado Fermentación alcohólica sin células de levadura (Alkoholische Gährung ohne
Hefezellen) (BUCHNER, 1897). El químico supuso que la fermentación era resultado de la
actividad de un complejo enzimático, que él llamó zimasa. Su texto inicia: “Hasta ahora no se
había conseguido separar la acción fermentativa de las células de levadura, a continuación se
describe un procedimiento que resuelve el problema 2” (Figura 1).

Actualmente se sabe que la primera etapa de la fermentación alcohólica se lleva a cabo por 10
enzimas y se llama glucólisis, del griego glycos (azúcar) y lysis (ruptura). Como producto de la
glucólisis se obtiene piruvato, el que transforma en etanol debido a la acción de dos enzimas
más. Buchner nunca imaginó la importancia que las enzimas tendrían décadas después de sus
descubrimientos, ya que en la actualidad muchos de los procesos industriales se llevan a cabo
en presencia de estas proteínas catalizadoras (aceleradoras) de reacciones químicas.
Adicionalmente, ahora sabemos que virtualmente todas las reacciones en los seres vivos son
catalizadas por enzimas.

Las enzimas son proteínas que forman parte de las células de todos los seres vivos. Debido a que
son capaces de acelerar la velocidad de reacciones químicas es que se les considera catalizadores
biológicos y son esenciales para que la célula esté metabólicamente activa. Sin ellas, muchas de
las reacciones químicas dentro de la célula serían muy lentas, tanto, que no serían compatibles
con la vida (VOET et al., 2013). En el área de alimentos, las enzimas juegan un papel destacado,
dado que muchas reacciones catalizadas por éstas se llevan a cabo en los alimentos o en
procesos alimentarios, tanto que el 30% de las enzimas que se producen industrialmente se
utilizan en el área de alimentos y bebidas.

Estas proteínas se clasifican de acuerdo con las reacciones que catalizan en: oxidoreductasas
(aceleran reacciones de óxido-reducción), transferasas (transfieren grupos químicos entre
moléculas), hidrolasas (rompen o sintetizan enlaces covalentes de las moléculas), liasas (rompen
enlaces formando a su vez dobles ligaduras), isomerasas (catalizan un rearreglo espacial de
grupos químicos en la molécula sin modificar su composición química) y ligasas (promueven
unión covalente de dos moléculas acopladas con la ruptura de un enlace pirofosfato como
fuente de energía). En la Tabla 1 se muestran algunos ejemplos de enzimas y sus aplicaciones en
alimentos.

Las enzimas pueden estar relacionadas directamente con las reacciones metabólicas de las
células que constituyen un alimento. Por ejemplo, el que un fruto madure depende
directamente de un grupo de enzimas que se expresan diferencialmente de acuerdo con la etapa
de maduración. Este es el caso de las pectinasas del jitomate, manzanas y peras, entre otras,
que son responsables del ablandamiento que sufren los frutos al madurar (QUIRASCO & LÓPEZ-
MUNGUÍA, 2013). De igual forma, el proceso de germinación de una semilla depende de que
ésta se hidrate y de que enzimas hidrolicen (degraden) el almidón –polisacárido de reserva–,

4
haciendo disponible la glucosa que el embrión requiere para desarrollarse. En dicho proceso se
basa la producción de malta dentro de la semilla de cebada (por acción concertada de las

enzimas α y β-amilasas), que posteriormente se utilizará para la producción de cerveza

(MATHEWSON, 1998). Los ejemplos anteriores muestran actividades propias del metabolismo
de las plantas que dan como resultado un alimento listo para consumir o un sustrato o materia
prima (la malta) apropiado para ser transformado. Particularmente, en el caso de la cerveza y
otras bebidas alcohólicas obtenidas a partir de un proceso fermentativo, existe además el efecto
de la actividad metabólica de las levaduras –del género Saccharomyces– para la producción de
etanol a partir de los azúcares del mosto (VOET, 2013)

1.2. Las enzimas y la conservación de alimentos

Las enzimas también tienen un papel importante en la conservación de las características
químicas y sensoriales del alimento durante su proceso y almacenamiento. A nivel industrial es
una práctica común manejar el huevo en polvo, con el fin de tener un producto más estable y
más fácil de manejar. Para este fin, el huevo se debe secar después de haberle eliminado la
glucosa (presente en la yema, principalmente), utilizando una enzima llamada glucosa oxidasa.
De no hacerlo, durante el secado se llevaría a cabo una reacción entre la glucosa y las proteínas
del huevo, dando como resultado un polvo de color oscuro. La glucosa oxidasa también consume
oxígeno, por lo que se utiliza para evitar que productos con alto contenido de grasas se oxiden.
Se han desarrollado empaques para alimentos donde la enzima se encuentra “atrapada” en el
material de empaque de tal forma que consume el oxígeno, evitando así que el producto se
enrancie. Este tipo de empaques se ha utilizado para mantener las propiedades sensoriales de
quesos y mayonesa durante su almacenamiento (BANKAR et al., 2009).

Durante siglos se han utilizado bacterias ácido lácticas para la conservación de alimentos. Por
mucho tiempo se consideró que el ácido láctico producido por estos microorganismos era el
único responsable de evitar que otras bacterias se desarrollaran en el alimento. Recientemente,
se ha encontrado que algunas bacterias lácticas como Pediococcus y Enterococcus, aisladas de
productos cárnicos y quesos, que además producen enzimas que tienen un efecto inhibitorio
contra bacterias patógenas como Salmonella enterica, Staphylococcus aureus y Listeria
monocytogenes (GARCÍA-CANO et al., 2014). Dichas enzimas se llaman peptidoglucán hidrolasas
y se encargan de eliminar a los patógenos, debido a la ruptura de su envoltura celular, con lo
que la utilización de estas enzimas en alimentos podría tener un efecto de bioconservación.

1.3. La respuesta biotecnológica a las necesidades cambiantes de

la sociedad
Quizá la aplicación más importante de enzimas en la industria de alimentos es la relacionada
con la hidrólisis del almidón para obtener edulcorantes: glucosa y fructosa. El maíz tiene como
principal azúcar de reserva al almidón, el cual, al ser hidrolizado exhaustivamente con las
enzimas α-amilasa (de la bacteria Bacillus licheniformis) y amiloglucosidasa (del hongo
Aspergillus niger) (Figura 5), da como resultado un jarabe con un 97% de glucosa, que se utiliza
ampliamente como agente espesante, edulcorante y humectante en la producción de dulces.
Los jarabes glucosados pueden ser tratados con otra enzima, la glucosa isomerasa, con el fin de
convertirla en fructosa, aumentando así su poder endulzante. Los jarabes fructosados, muy
utilizados en la elaboración de bebidas azucaradas como jugos y refrescos, se producen en el
mundo en una cantidad de 15 millones de toneladas por año (ADRIO & DEMAIN A, 2014).

5
Figura 5. Hidrólisis enzimática del almidón. Uhlig H., 1998.

Hablando de jugos, existe otra aplicación importante de enzimas en dichos productos.

Cualquiera que haya hecho jugo de manzana en casa habrá observado que éste es turbio, sin
embargo, el comercial es translúcido. ¿Cuál es la razón de esa diferencia? Si piensas que es
debido a la adición de una enzima, ¡estás en lo correcto! Se hace un tratamiento enzimático con
pectinasas para clarificar el jugo (QUIRASCO & LÓPEZ-MUNGUÍA, 2013).

Un problema común en la población mexicana es que existen problemas digestivos al consumir

leche, sobre todo en la edad adulta. Esto se puede deber a que no tengamos la capacidad de
hidrolizar la lactosa de la leche, lo que se conoce como intolerancia a la lactosa. Si la lactosa llega
al intestino grueso, es metabolizada por los microorganismos que ahí habitan con la generación
de gas, que es el causante del malestar abdominal que sentimos. Actualmente tenemos a la
mano la solución a ese problema. Comercialmente ya está disponible la leche deslactosada, la
cual se obtiene al poner la enzima β-galactosidasa (de levaduras del género Kluyveromyces) en
contacto con la leche. Quizá han notado que la leche deslactosada es más dulce que la regular,
esto se debe a que los azúcares producto de la hidrólisis de la lactosa (glucosa y galactosa) son
más dulces.

Los grupos de enzimas más importantes de aplicación en alimentos son:

Las carbohidrasas (hidrolasas que rompen o sintetizan los enlaces glicosídicos en los car-
bohidratos) son uno de los grupos más utilizados en alimentos, sobre todo en la producción de
edulcorantes derivados de almidón que confieren un sabor dulce al alimento enmascarando
gustos amargos o desagradables, en la producción de derivados de panificación y como aditivos
para evitar el endurecimiento de pan y tortilla y en la producción de caramelos de centro suave,
entre otros usos.

Las proteasas (hidrolasas que rompen en enlace peptídico que une a los aminoácidos de las
proteínas) constituyen también un grupo muy usado a nivel industrial, algunos ejemplos de uso
son en el desarrollo de cuerpo y sabor en la cerveza, mientras que en panificación aumentan
textura y volumen del pan, en la producción de quesos generan sabores en la maduración, e
incluso se emplea para mejorar las propiedades de secado del huevo.

6
Las lipasas (que catalizan la ruptura de enlaces éster de las grasas y aceites presentes en los
alimentos) se utilizan principalmente para la generación de sabores.

Las oxidoreductasas están involucradas en las reacciones oxidativas en alimentos, como son el
oscurecimiento de frutas, la oxidación de ácidos grasos de origen animal o la degradación de
vitaminas.

Las transferasas son enzimas muy importantes para la generación de alimentos funcionales
(aquellos que contribuyen a la salud del consumidor más allá de su beneficio puramente
nutricional). Tanto transferasas como las levansacarasas, dextransacarasas e inulosacarasas
generan azúcares que tienen utilidad como prebióticos –es decir, que favorecen el desarrollo de
microorganismos benéficos en el intestino– entre otras aplicaciones.

Por último, las isomerasas, que fueron las primeras que se usaron industrialmente, con el fin de
producir jarabes fructosados.

Es interesante saber que el mercado de producción de enzimas para la industria de alimentos

es un negocio muy redituable, pues en 2011 representó ganancias de 1.2 mil millones de dólares,
y tiene un crecimiento anual compuesto del 10.4 % (ADRIO & DEMAIN, 2014). Cada vez es mayor
la demanda de enzimas con características catalíticas y de producción más adecuadas para los
requerimientos industriales, por lo que desde hace varias décadas se han desarrollado enzimas
recombinantes. Éstas se llaman así porque se obtienen de otro organismo diferente al que lo
produce originalmente, a través de la utilización de una metodología bioquímica denominada
ingeniería genética, que involucra la transferencia de material genético del organismo original
al nuevo o recombinante. Uno de los ejemplos más importantes es la producción de quimosina
bovina en un organismo diferente al ternero. La industria quesera requiere cada vez más
cantidad de esta enzima tan particular y su obtención a partir de tejido animal es insuficiente.
Entonces, una opción viable y segura fue la introducción del gen que codifica para la quimosina
en una bacteria, de tal forma que actualmente se puede obtener una mayor cantidad de dicha
enzima en menor tiempo, con la certeza de que la especificidad es la misma y que es seguro su
consumo (MOHANTY et al., 1999).

II. LAS LIPASAS - AROMAS Y SABORES

Las lipasas son un grupo importante dentro de las enzimas que se producen industrialmente
debido a que pueden ser utilizadas en la obtención de una amplia variedad de productos (Tabla
2). Éstas son enzimas ubicuas, ya que se encuentran en los animales, plantas, hongos y bacterias,
sin embargo, las que se producen industrialmente provienen de microorganismos,
principalmente de hongos. Poseen una característica única, la capacidad de actuar en la interfaz
entre una fase acuosa y una no acuosa, su estructura característica presenta una tapa o cubierta
que cubre al sitio activo (que es el lugar donde se lleva a cabo la hidrólisis). Cuando la enzima se
encuentra en la interfaz, la tapa se abre, dejando expuesto el sitio activo (DEREWENDA et al.,
1992). La función biológica de estas enzimas es catalizar la hidrólisis de lípidos (triacilgliceroles,
grasas, aceites). En la Figura 6 se puede observar la reacción característica de estas enzimas,
donde el triglicérido (a) (que es una molécula que tiene unidos 3 ácidos grasos al glicerol por un
enlace químico de tipo éster) es hidrolizado por acción de la lipasa para generar los ácidos grasos
libres (b) y el glicerol (c) cuando se trata de una hidrólisis total. También las lipasas pueden
sintetizar ésteres (compuestos que tienen aroma) cuando la actividad acuosa (cantidad de agua

7
disponible para reaccionar) es baja, por lo que el crecimiento de la aplicación comercial de
lipasas es muy significativo y prometedor (DEREWENDA, 1994).

Figura 6. Reacción catalizada por lipasas.

En esta liga puedes observar la estructura de la lipasa del hongo Thermomyces lanuginosa (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=15025), y en esta otra la
estructura de la lipasa B de la levadura Candida antarctica (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=50085), la cual es una de las pocas lipasas
que no contiene una tapa. Ambas son las más utilizadas en la industria (Figuras 7 y 8
respectivamente)

Figura 7. Modelo tridimensional de la lipasa de Thermomyces lanuginosa.

Figura 8. Modelo tridimensional de la lipasa de Candida antárctica.

Actualmente se produce un gran número de lipasas a escala industrial, y la mayoría se utiliza en

reacciones de hidrólisis para el desarrollo de sabor y aromas en los productos lácteos y el
procesamiento de otros alimentos, como la carne, verduras, fruta, alimentos horneados y

8
cerveza. Sin embargo, como se mencionó arriba, las lipasas se han empleado con éxito como un
catalizador para la síntesis de ésteres, los cuales se producen a partir de ácidos grasos de cadena
corta y se utilizan como agentes aromatizantes en la industria alimentaria.

Es importante mencionar que las moléculas de ácidos grasos que contienen los triglicéridos
pueden ser todas iguales (oleico) o pueden ser diferentes. Además, los ácidos grasos tienen un
nombre de acuerdo con su tamaño y estructura, por ejemplo: el conocido ácido oleico es una
molécula que contiene 18 carbonos en su estructura y presenta la unión de dos carbonos por
un doble enlace, y el ácido butírico (del cual está constituida en su mayoría la grasa de la leche)
es una molécula con sólo 4 carbonos. En este contexto, las lipasas también se han utilizado
atrapadas en soportes inertes para la generación de varios lípidos modificados como:

a) Lípidos estructurados. Son moléculas de lípidos cuya composición de ácidos grasos ha sido
determinada por un proceso de laboratorio para mejorar o disminuir la capacidad de ser
utilizada por el humano (biodisponibilidad) de uno o de los tres ácidos grasos que lo componen.
En sentido coloquial, es un lípido hecho a la medida para una función nutricional o tecnológica
específica. Un ejemplo de estos lípidos es el triacilglicérido OPO (oleico-palmítico-oleico), con la
misma estructura al de la leche humana, el cual se obtiene de la interesterifiación (intercambio
de moléculas de ácidos grasos en el lípido) de triplamitina con ácido oleico. Otro ejemplo es la
producción de sustituto de manteca de cacao para chocolate, en este caso se utiliza una grasa
proveniente de una materia prima barata como el aceite de palma, la cual por interesterificación
enzimática es modificada intercambiando sus ácidos grasos por los que contiene la manteca de
cacao (VALENZUELA et al., 2002).

b) Sustitutos de grasa bajos en calorías. Estructuralmente tienen similitud con las grasas de
origen en sus propiedades físicas, químicas, y organolépticas, pero no constituyen sustrato para
las lipasas digestivas humanas y, por tanto, el aporte calórico es menor. Éstas se obtienen por
modificación enzimática con lipasas (VALENZUELA et al., 2002).

c) Antioxidantes lipofilizados. Muchos de los antioxidantes utilizados en alimentos limitan su

aplicación debido a que son hidrosolubles (solubles únicamente en agua). En este contexto, las
lipasas son una solución ya que se utilizan para catalizar la reacción de síntesis de ésteres
adicionando al antioxidante una molécula lipofílica, como puede ser un ácido graso de cadena
larga, aumentando así su solubilidad en grasas y aceites (liposolubilidad). De esta forma, se han
modificado antioxidantes como los flavonoides, ácido kójico, vitamina E, vitamina C y
compuestos fenólicos, para poderlos adicionar en alimentos como aceites, aderezos de
ensalada, mayonesa, etc. (VILLENEUVE, 2007)

d) Nutraceúticos. Son moléculas presentes en los alimentos que aportan un beneficio a la salud
del consumidor (bioactivos). Algunos tienen problemas de solubilidad en grasas, estabilidad e
incluso disponibilidad; las lipasas pueden llevar a cabo reacciones bioquímicas en moléculas
como el mentol, saponinas o fitoesteroles, que permiten la adición de ácidos grasos de cadena
larga para aumentar su liposolubilidad o su hidrólisis para aumentar su biodisponibilidad
(FERREIRA-DIAS et al., 2013).

9
2.1. Conclusión
Las enzimas están involucradas en diversos aspectos de la producción de alimentos. Se pueden
agregar a un proceso, pero también pueden ser elaboradas por microorganismos presentes en
fermentaciones, lo que da como resultado un alimento con características de composición y
sensoriales deseables para su aceptación por el consumidor. Por otro lado, no se debe olvidar
que forman parte del metabolismo de las células que consumimos como parte de nuestra
alimentación: frutas, verduras y de tejidos animales. Adicionalmente, su utilización para la
producción de materias primas en la industria alimentaria es muy relevante. Por lo anterior,
nuestra relación diaria con las enzimas (y la bioquímica de los alimentos) es un hecho que no se
puede soslayar.

III. ASPARTASA
3.1. Desarrollo de un método rápido para la obtención de un
extracto enzimático de bacillus cereus con actividad aspartasa
3.1.1. Introducción:
La L-aspartasa (L-aspartatoamoniacoliasa E.C. 4.3.1.1) cataliza la aminación reversible del ácido
fumárico y a excepción de iones metálicos divalentes, no requiere la presencia de otros
cofactores (1). La Enzima aspartasa de Bacillus cereus es una proteína intracelular por lo que
requiere de un método eficaz para la obtención de extractos libres de células. La elección de
este método depende del microorganismo que se esté utilizando y la cantidad de proteína
requerida y del tipo de análisis que se va a llevar a cabo (2). El objetivo de esta investigación fue
desarrollar un método rápido y simple para la obtención de un extracto enzimático con actividad
aspartasa de Bacillus cereus utilizada para la biosíntesis del aminoácido L-aspártico, empleando
la técnica de ultracentrifugación sin el uso de enzímas líticas.

3.2. Metodología.
El cultivo de las células de Bacillus cereus y la obtención del paquete celular fueron realizadas
de acuerdo a técnicas previamente establecidas (3). El paquete celular obtenido se resuspendó
en solución amortiguadora de fosfatos y sometido a ultracentrifugación a 127,127Xg por un
tiempo de 30 minutos (metodología 1) y 60 minutos (metodología 2) a una temperatura de 0°C.
Posteriormente se determinó la actividad enzimática aspartasa del extracto y el debris celular
obtenidos así como de células completas que sirvieron como control. El estudio cinético se llevó
a cabo, en reactores tipo batch. La reacción se monitoreo espectrofotométricamente por el
consumo de sustrato (fumarato de amonio) a 240 nm, bajo agitación constante a 250 rpm a
37°C. Se tomaron alícuotas de 250μL a determinados intervalos de tiempo. Se realizó la
determinación de proteína por el método de Peterson y PAGE-SDS para monitorear y determinar
la presencia de la aspartasa derivada de la extracción.

3.3. Resultados.
En las figura 1 y 2 se muestran los resultados comparativos de las metodologías probadas (1 y
2) que muestra valores semejantes de consumo de sustrato tanto para extracto celular como
para debris, pero con una pequeña ventaja en la metodología 1 que muestra valores mayores
de biotransformación del ácido fumárico en ácido aspártico. Los resultados de la electroforesis

10
también fueron satisfactorios ya que se observa la presencia de la banda correspondiente a peso
molecular 76 Kd semejante a los reportados en la literatura (1).

3.4. Conclusiones
El extracto enzimático con actividad aspartasa obtenido por ultracentrifugación a 127,127Xg,
por 30 minutos, presento una actividad enzimática de 2.6E-05 M.mg/ml equivalente al 68.4%,
la actividad para debris fue 1.07E-05 M.mg/ml equivalente al 28.15% comparadas con la
actividad presentada por las células completas de 3.8E-05 M.mg/ml.

IV. FUMARASA
4.1. estudios de enfoque de modelado de homología y
acoplamiento fumarase de corazón de cerdo
Resumen
La fumarasa es un enzima que podría ser usada como blanco en el diseño de drogas para el
tratamiento de infecciones por Helicobacter pylori y Trypanosoma brucei. En este trabajo, se
creó la estructura en tercera dimensión (3D) de la fumarasa de corazón de cerdo (FUM P) usando
modelado por homología tomando como templete a la fumarasa de Saccharomyces cerevisiae
(FUM Y). Después, se usó el programa Q-Site Finder para identificar los posibles sitios de unión
de FUM P y FUM Y. Posteriormente, se efectuaron estudios de acoplamiento molecular de un
grupo de derivados aril monosustituidos con grupos electrodonadores y electroatractores, sobre
la FUM P y la FUM Y, con el fin de validar el modelo por homología. La estructura en 3D de la
FUM P mostró alta semejanza estructural

(70.33 %) con la estructura cristalina de la FUM Y. Algunos sitios de unión de FUM P identificados
con el programa Q-Site Finder corresponden a los sitios A y B de FUM Y. Los resultados de
docking mostraron que algunos compuestos interactúan en el sitio A de FUM PFUM Y,siendo los
de mayor afinidad aquellos que tienen electroatractores sobre FUM P,lo que sugiere que los
efectos electrónicos son los más importantes durante el proceso de reconocimiento para FUM
P.

Palabras clave: Homología, acoplamiento, arilderivados, fumarasa

11
Un modelo estructural tridimensional para FUM P es actualmente indisponible. Por lo tanto, un
modelo de homología de esta enzima fue construido en base a la estructura tridimensional de
FUM Y (código PDB: 1yfm). BLAST y Protein Data Bank (PDB) se utilizaron para buscar la
secuencia de FUM P, que tiene una alta similitud de secuencia con FUM Y. Se generó el modelo
de homología de FUM P utilizando el servidor SWISS MODEL [6-8]. Entonces, los hidrógenos a ~
pH 7,4 de FUM Y y FUM P se agregaron y luego minimizado en 500 pasos utilizando el protocolo
descendente más empinado empleando parámetros GROMOS96 43B1 que se implementan en
el Swiss-PDBViewer versión 3.7. Finalmente FUM Y y FUM P fueron evaluados a partir de sus
diagramas de Ramachandran utilizando el programa Swiss-PDBViewer [6]. La estructura
tridimensional de los ligandos en su La conformación de energía mínima se obtuvo mediante el
Software Gaussian 98 utilizando el nivel HF / 6-31G * [9]. Para identificar los sitios de unión de
reconocimiento de ligando, acoplamiento las simulaciones se realizaron en base a la estructura
de ambas enzimas probado Primero, todos los enlaces rotativos posibles, el torsional grados y
las cargas parciales atómicas (Gasteiger) de los ligandos fueron asignados utilizando la
herramienta AutoDock. El kollman se asignaron cargas para todos los átomos de la enzima
usando la herramienta AutoDock, un programa incluido en AutoDock 3.0.5. Luego, los ligandos
fueron atracados debajo del muelle ciego (un rectangular Se construyó una cuadrícula sobre
todas las proteínas (126 × 126 × 126 Å3) con los puntos de la cuadrícula separados por 0.375A)
procedimiento en ambas enzimas utilizando el software AutoDock bajo el Algoritmo genético
lamarckiano híbrido, con una población inicial de 100 individuos ubicados al azar y un número
máximo de evaluaciones de energía de 1.0 × 107. Orientaciones acopladas resultantes dentro
de una desviación cuadrática media de raíz de 0.5 Å se agruparon juntos. El grupo de energía
más bajo devuelto por AutoDock para cada compuesto se utilizó para su posterior análisis. Todos
los otros parámetros se mantuvieron en su configuración predeterminada [10].

Finalmente, los efectos electrónicos de los ligandos estaban tomando arriba de la literatura [11],
mientras que su coeficiente de partición y se calcularon los efectos estéricos. El primero fue
calculado en línea utilizando el sitio molinspiration (Molinspiration, Bratislava, República
Eslovaca) [12]. Entonces, el efecto estérico fue calculado usando el potencial electrostático
como se informó por Suresh [13]. Además, se utilizó el servidor Q-Site Finder para identificar los
posibles sitios activos; este programa está disponible en línea [14] Todas las visualizaciones de
proteínas se lograron usando Visual Programa de Dinámica Molecular (VMD) [15].

4.2. Resultados y Discusión

El modelo de homología de FUM P tiene una gran similitud con varios estructuras cristalinas
reportadas previamente para otras fumarasas (Figura 1). Comparte una similitud del 70% con
FUM Y y por lo tanto ambas enzimas fueron evaluadas por mapas de Ramachandran que mostró
regiones muy similares (datos no mostrados). La figura 2 muestra que FUM P (B) tiene la misma
forma que FUM Y (A) cuando estaban alineados (C). Como se puede ver en la misma figura, cada
El monómero de fumarasa tiene tres dominios (D): D1 en la parte inferior, D2 en el núcleo de la
enzima tetramérica formando un único paquete de cinco hélices y D3 en la parte superior de la
enzima [3]. Los Los resultados del servidor Q-site Finder mostraron que FUM P tiene varios sitios
muy similares a FUM Y (ver Fig. 3). Es bién sabido que entre dominios hay sitios donde pueden
estar los ligandos equipado. Por lo tanto, decidimos usar el programa Q-site Finder en para
explorar los sitios A y B para FUM P y FUM Y [4].

12
Sin embargo, para confirmar esta hipótesis, uno necesita más teoría y los experimentos
biológicos son deseables. El atraque Los estudios han sido una de las herramientas más utilizadas
para identificar activos sitios en proteínas.

Por lo tanto, para identificar los sitios A y B [2,4] en estos enzimas, los estudios de acoplamiento
se realizaron utilizando varios derivados de arilo como ligandos, que tienen relaciones
estructurales con el fumarato. Dichos arilderivados tienen extracción de electrones o electrones.
donar sustituyentes en el anillo aromático (ver Tabla 1).

Dependiendo del sitio de reconocimiento, estas moléculas podrían funcionar como inhibidores
de la fumarasa en enfermedades microbianas causadas por H. pylori [16,17]. Un ejemplo clásico
es el tratamiento con H. pylori, donde varias combinaciones de varias drogas (furazolidona,
amoxicilina, subcitrato de bismuto, omeprazol) han sido empleados, pero con malos resultados
[18]. Esto podría ser porque H. pylori tiene resistencia farmacológica desarrollada [19], debido
a estos objetivos de drogas muestran polimorfismo [20]. Mientras que la fumarasa es una
enzima muy importante que apenas puede modificarse debido a su importancia en ciclo del
ácido tricarboxílico de H. pylori [21]. Además, es importante identificar el tratamiento para
erradicar el H. pylori dado que está asociado con varias enfermedades gástricas, como cáncer,
gastritis y úlcera péptica, entre otros [22]. Adicionalmente, es bien sabido que esta enzima es
esencial para Trypanosoma brucei (un protista parasitario responsable de dormir enfermedad
en humanos) para convertir la mayor parte de la glucosa consumida en succinato excretado, por

13
fermentación succínica [23]. Los estudios de acoplamiento mostraron que los ligandos probados
se unen a sitio activo A de FUM P que se encuentra cerca del segundo dominio, la misma región
que para FUM Y y FUM C (Fig. 4).

Esto puede explicarse por el hecho de que las enzimas fumarasa tienen tres regiones con mayor
identidad que marcan la ubicación de El sitio activo. Estas regiones están integradas por 129-
146, 181- 200, y 312-331 residuos caracterizados por tener ciertos propiedades químicas para
adaptarse a los ligandos [2,4].

Los estudios cristalográficos muestran que FUM C tiene residuos de Asn326, Lys324 y Asp331 en
el sitio A, mientras que FUM Y tiene Asn351, Lys349 y Glu356 donde varios ligando fueron
equipados con alta afinidad por la enzima posterior (Tabla 1). Estudios de acoplamiento con
derivados de arilo en FUM P muestran que estos compuestos fueron reconocidos en el sitio A
(Lys327, Glu334, Glu318, Glu316, Asn317) como se puede ver en Fig. 4 y 5. Este sitio tiene los
mismos residuos que el de FUM Y y FUM C.

14
 Además, los resultados de acoplamiento
demuestran que los derivados de arilo con
sustituyentes en las posiciones orto o para
se unen en el sitio A de FUM P haciendo
varias interacciones con Ans329 y Glu318
(Fig. 6). Estos resultados demostraron que
la interacción de los derivados de arilo en
el sitio A se ve afectado por el tipo de
sustituyente ubicado en el anillo, ya se
trate de extracción de electrones (1b, 1d,
1e, 1g) o donación de electrones (1h, 1j,
1k, 1m). Por ejemplo, los compuestos con
grupos Cl u OCH3 ubicados en posición
orto (1d, 1m) o para (1b, 1k) genera un
negativo o carga positiva,
respectivamente, al carbono ipso unido a
la amida (tabla 2). Dichos cargos pueden
ser estabilizados por el átomo de
nitrógeno del grupo amida y a través de
una extensión de La conjugación por el
sistema π de los arilderivados. Los átomo
de hidrógeno del grupo amida del
derivado arilderivado formar un enlace de
hidrógeno (b1) (ver Fig. 6) con el átomo de oxígeno (que actúa como un aceptor) del grupo
amida carbonilo del reserva del residuo Glu318. Cuando la carga se estabiliza por el átomo de
nitrógeno de la amida, los efectos de resonancia de este enlace podría ayudar a formar un
segundo enlace de hidrógeno (b2) (ver Fig. 6) entre el átomo de oxígeno del grupo carbonilo de
derivados de arilo y el protón de la columna vertebral amida de Asn329. También, la formación
de un tercer enlace de hidrógeno (b3) (ver Fig. 6) fue observado entre el átomo de oxígeno del
grupo carbonilo de el ácido carboxílico y el grupo amino de Lys327 o con Asp329 en algunos
casos. A pesar de que los compuestos con retirada de electrones (1b, 1d, 1e, 1g) y grupos
donadores de electrones (1h, 1j, 1k, 1m) en posiciones orto o para en el anillo aromático se
reconocieron en el sitio A, la longitud del enlace de hidrógeno entre el oxígeno átomo del grupo
amida de los derivados de arilo y el hidrógeno de la columna vertebral de Asn329 (ver Fig. 6) fue
más corto con grupos donadores de electrones que con la extracción de electrones grupos
(datos no mostrados).

Los valores de Kd y ΔG obtenidos por los estudios de acoplamiento muestran que los derivados
de arilo tienen más afinidad por FUM P (en el sitio A) cuando tienen un electrón retirando más
bien un electrón sustituyente donante (Tabla 1). Además, es importante reconocer que los
efectos electrónicos podrían ser significativos en uniendo los ligandos por fumarasa como se
menciona aquí. Los los compuestos con sustitución en posición para y orto fueron reconocido
en el sitio A; Sin embargo, vale la pena señalar que el la afinidad fue mayor cuando el anillo tenía
un sustituyente en para posición, como se puede ver para los compuestos 1b, 1e, 1h y 1k.

También es importante mencionar que la sustitución del anillo mejora la afinidad entre la
enzima y el compuesto porque el compuesto sin dicho sustituyente tiene menos afinidad (10

15
mM) que el compuesto con Cl (1,7 mM). Como se puede ver en la Tabla 2, a pesar de que es bien
sabido que los otros parámetros (π y efectos de obstáculos) juegan un papel muy papel
interesante en el reconocimiento de ligando [24], en este caso, aparentemente los derivados de
arilo no podrían afectar la afinidad por ambos proteínas Esto significa que este tipo de enzimas
reconocen el ligando independientemente de los efectos de obstáculo debido a su sitio es cerca
de la superficie, contrario a otras enzimas como clorooperoxidasa [25]. Además, los efectos
lipofílicos aparentemente no interfieren en el reconocimiento del ligando en fumarasa que
podría deberse a que estos sitios no son hidrófobos como ocurre con otras enzimas como la
glutatión S-tranferasa familia [26].

Los derivados de arilo con un sustituyente en la posición meta (1i, 1l, 1f) se unieron en un lugar
diferente (datos no mostrados) en comparación con los derivados de arilo que tienen un
sustituyente en posiciones orto o para del anillo aromático, posiblemente porque los antiguos
derivados de arilo no originaron un cargo en el átomo de carbono ipso unido al grupo amida.
Por lo tanto, puede se diga que los efectos de resonancia son más importantes que los efectos
inductivos, porque el OCH3 en posición meta no enlazar en el mismo sitio.

Según este estudio, los efectos electrónicos podrían jugar un papel muy importante en el
proceso de reconocimiento de drogas. En esto sentido, algunos descriptores de química cuántica
como HOMO y las energías LUMO podrían usarse para explorar la electrónica propiedades más
cuidadosamente y también produce datos más seguros como han sido explorados para otros
sistemas [27,28]. El HOMO y Se evaluaron las energías de LUMO para todos los derivados de
arilo (ver Tabla 2). Como se puede ver en esta tabla, los ligandos tienen altos Energías HOMO
que confirman que la alta densidad de electrones aumentarlos se reconocerá en el sitio A. Esto
significa que el sitio A podría ser electrónicamente pobre. Por otro lado, el otro principales
parámetros fisicoquímicos moleculares involucrados en reconocimiento de ligandos como el
coeficiente de partición y el Los efectos estéricos no pudieron participar de esta enzima, según
estos resultados. Por lo tanto, lo que sugiere que las cargas atómicas regulan El reconocimiento
del ligando. Entonces, estudiamos las cargas atómicas de algunos átomos conservados para
todos los compuestos, identificando que el los átomos de nitrógeno e ipso de carbono juegan
un papel muy importante en El reconocimiento de ligando de FUM P, lo tenemos de la
optimización resultados de geometría que identifican que su carga es mantenido negativamente
y aumenta con electro donación grupo (1k) que se reflejó en los valores de Kd. El sitio B se ha
encontrado en FUM C y FUM Y y ha sido postulado como un sitio alostérico [29]. En FUM C, el El
sitio alostérico está integrado por Asn131, Glu132, Arg126, Residuos Hys129 y Ser137 que se
encuentran en la misma subunidad cerca del primer dominio. Aunque este sitio ha sido
identificado en FUM C y FUM Y [2,4], su papel durante la catálisis es poco claro [2]. Los resultados
obtenidos con el servidor Q-site Finder mostró varios sitios activos para FUM Y, (Fig. 3). Algunos
de han sido identificados como dos sitios activos importantes, A y B. Sin embargo, al usar el
procedimiento de acoplamiento, solo un compuesto estaba en forma en el sitio B en esta
enzima. Podría deberse a los compuestos tienen una estructura muy diferente al malato L que
es el ligando reconocido en el sitio B [5]. Además, a identificar y estudiar este sitio podría
probarse algunos compuestos con estas propiedades químicas Aunque FUM P ha sido
ampliamente estudiado mediante métodos cinéticos con varios ligandos [5], su sitio B no se ha
identificado claramente. El atraque los resultados muestran que cualquier derivado de arilo
estaba unido cerca del primer dominio donde podría ser posible que FUM P tenga un sitio B. De
esta manera, se podrían lograr otros estudios usando L-malato derivados para explorar el sitio
B. Por lo tanto, se debe a que Al utilizar el servidor Q-site Finder, hay un sitio que podría

16
Estar en el sitio B (Fig. 3) debido a sus cercanías al Met 107 donde este el sitio está ubicado [5].
Y también, este programa muestra que el sitio A el radio de FUM Y es mayor que el de FUM P.
Esto podría explicar la mayor afinidad de los compuestos por FUM Y. Estos datos sugiera que, a
pesar de su alta similitud, podría ser posible Diseñar medicamentos con más selectividad.

4.3. Conclusión
El modelo de homología mostró que FUM P tiene una alta similitud estructural con FUM Y, como
se esperaba de su identidad de secuencia Los estudios de acoplamiento demostraron que FUM
P tiene un sitio A en el mismo lugar que FUM C y FUM Y, cerca al segundo dominio. Los derivados
de arilo con un sustituyente en posiciones ortho o para fueron ajustadas a este sitio en la
evaluación de FUM P mediante estudios de acoplamiento, formando enlaces de hidrógeno
principalmente con los residuos Asn329 y Glu318. Por lo tanto, estos compuestos podría actuar
como inhibidores competitivos. Por otra parte, cualquier arylderivative estaba unido cerca del
primer dominio donde el sitio B ha sido identificado en FUM C y FUM Y. Los resultados muestran
que es posible obtener buenos resultados al Estudios de acoplamiento con monómeros de la
enzima tetramérica. Sin embargo, se podrían realizar más estudios en relación con la unión de
los mismos compuestos en la enzima tetramérica. Finalmente, Es importante mencionar que un
sitio en FUM P fue identificado como equivalente al sitio B informado en otras fumarasas.
Agradecimientos

V. ALANINA
5.1. Efectos de la suplementación con ß-alanina sobre el
rendimiento deportivo.
Resumen
La carnosina, dipéptido formado por los aminoácidos ß-alanina y L-histidina, tiene importantes
funciones fisiológicas entre las que destaca su función antioxidante y las relacionadas con la
memoria y el aprendizaje. Sin embargo, en relación con el ejercicio, las funciones más
importantes serían las relacionadas con la contractilidad muscular, al mejorar la sensibilidad al
calcio en las fibras musculares, y la función reguladora del pH. De este modo, se ha propuesto

17
que la carnosina es el principal tampón intracelular, pudiendo llegar a contribuir hasta un 7-10%
en la capacidad buffer o tampón. Dado que la síntesis de carnosina parece estar limitada por la
disponibilidad de ß-alanina, la suplementación con este compuesto ha ido ganando cada vez
más popularidad entre la población deportista. Por ello, el objetivo del presente estudio de
revisión bibliográfica ha sido el de estudiar todos aquellos trabajos de investigación que han
comprobado el efecto de la suplementación con ß-alanina sobre el rendimiento deportivo. Por
otra parte, también, se ha intentado establecer una posología específica que, maximizando los
posibles efectos beneficiosos, reduzca al mínimo la parestesia, el principal efecto secundario
presentado como respuesta a la suplementación.

5.2. Introducción
La ß-alanina es un aminoácido no esencial sintetizado en el hígado1 que puede ingerirse a través
de la dieta (en fuentes de origen animal) o mediante suplementos . El estudio de la ß-alanina ha
cobrado un gran interés debido a su relación directa con la síntesis de carnosina. La carnosina
es un dipéptido, compuesto por los aminoácidos ß-alanina y L-histidina3 , siendo la enzima
carnosina sintetasa la encargada de mediar en los procesos de síntesis4 . Dicha actividad
enzimática es tan importante que se ha llegado a identificar que el principal factor limitante en
la velocidad de síntesis de carnosina es la actividad de la enzima carnosina sintetasa5,6,7. A
pesar de que la mayor parte de carnosina se encuentra en el músculo esquelético, también,
existen pequeñas cantidades en el sistema nervioso central3 , fundamentalmente en el lóbulo
olfativo8,9. El organismo no es capaz de absorber directamente carnosina desde el torrente
sanguíneo1 y, dado que las concentraciones de ß-alanina en el músculo son relativamente
pequeñas en comparación con las de histidina y de la carnosina sintetasa10,11 y que la síntesis
endógena de ß-alanina se limita a una pequeña producción en un grupo de células hepáticas1 ,
se ha propuesto que la síntesis de carnosina en el músculo esquelético viene limitada por la
disponibilidad de ß-alanina de la dieta3,12. La suplementación con ß-alanina está englobada en
el grupo B, según la clasificación que realiza el Instituto Australiano del Deporte en cuanto al
grado de efectividad y seguridad de los suplementos deportivos. El número de estudios y el
aumento en la utilización de dicho suplemento cobran cada día una mayor importancia, debido
a la posible influencia de la carnosina sobre distintas funciones fisiológicas. Por ello, el presente
trabajo de revisión bibliográfica tiene por objeto exponer los principales estudios que han
relacionado directamente los efectos de la suplementación con ß-alanina sobre el rendimiento
deportivo, así como establecer pautas adecuadas para llevar a cabo una posología que se
beneficiase de los efectos positivos de la suplementación minimizando al máximo los posibles
efectos secundarios.

5.3. Metodología
Se trata de un estudio descriptivo sobre los posibles efectos beneficiosos que pudiera tener la
suplementación con ß-alanina sobre el rendimiento deportivo. La búsqueda bibliográfica
englobó artículos publicados en inglés o español como idioma, en unas fechas comprendidas
entre el día 1 de enero de 2000 hasta el 6 de diciembre de 2013. Las bases de datos que se
utilizaron fueron Dialnet, Elsevier, Medline, Pubmed, Scopus, Sportdiscus y Web of Science. Las
palabras clave empleadas coincidían con términos incluidos en el Thesaurus Medical Subject
Headings (MeSH) desarrollado por la U.S. National Library of Medicine. Las palabras clave y la

18
estrategia de búsqueda empleada fue “Beta alanine AND supplementation AND (exercise OR
strength OR resistance OR endurance OR performance)”. De los 149 artículos que respondían a
los criterios de la búsqueda, leímos todos los resúmenes y aplicamos unos criterios de
inclusión/exclusión. Los criterios de exclusión propuestos fueron los siguientes: – Artículos
escritos en un idioma distinto al inglés o español. – Revisiones bibliográficas y/o metaanálisis. –
Artículos realizados con animales. – Artículos en los que no se siguió un protocolo de
suplementación con ß-alanina. – Artículos que no incluyesen una intervención de ejercicio físico.
– Artículos que no midiesen ninguna variable relacionada con el rendimiento deportivo.
Finalmente, de los 44 artículos que cumplieron los criterios de inclusión exigidos para formar
parte del estudio, utilizamos 18, al no tener acceso al texto completo de las otras 26 referencias.
La figura 1 resume el proceso seguido en la selección de artículos.

Limitaciones del estudio

La principal limitación del presente trabajo ha estado relacionado con el número de artículos
seleccionados. Tras analizar todos los resúmenes que se encontraron una vez aplicada la
estrategia de búsqueda, se obtuvo un total de 44 artículos de intervención que cumplían con los
criterios de inclusión marcados. Sin embargo, no se pudo acceder al texto completo de 26
investigaciones, motivo por el cuál se incorporaron 18 artículos al presente trabajo.

5.4. Conclusiones
Las funciones de la carnosina en el organismo son fundamentales y están relacionadas con su
acción antioxidante y antiinflamatoria, así como un posible efecto neuroprotector y antiaging.
Es por ello, que situaciones de déficit se han observado tanto en sujetos con diabetes tipo II,
Alzheimer o autismo. Sin embargo, las funciones más importantes relacionadas con el

19
rendimiento deportivo podrán ser las relacionadas con la capacidad de actuar como un potente
tampón a nivel muscular, así cómo por la mejora en la sensibilidad del calcio a nivel de la fibra
muscular. La disponibilidad de ß-alanina se ha identificado como el factor limitante de la síntesis
de carnosina. Por ello, la suplementación nutricional con ß-alanina es efectiva para aumentar
las reservas musculares de carnosina. No obstante, hay que destacar a otros factores como el
género, entrenamiento, entorno hormonal y, sobre todo, tipo de fibras musculares, que también
determinarán el contenido de carnosina muscular. Por cualquiera de sus funciones, la
suplementación con ß-alanina puede tener un efecto beneficioso sobre la capacidad anaeróbica
láctica, especialmente en protocolos intermitentes de alta intensidad, o en aquellos donde el
desarrollo de la fuerza sea un componente importante en relación al rendimiento. De este
modo, aquellas modalidades deportivas de muy corta duración, también podrían verse
favorecidas seguramente por una mejora en la capacidad de realizar un mayor volumen de
entrenamiento a una mayor intensidad. Los deportistas de resistencia aeróbica, también
podrían ver incrementado su rendimiento y beneficiarse de una suplementación a este nivel, ya
que, además de un posible efecto beneficioso sobre el umbral anaeróbico, podría mejorar la
capacidad anaeróbica láctica, la clave del éxito en la mayoría de competiciones. La
suplementación con ß-alanina es una práctica segura. En cuanto a la posología se debería
recomendar una dosis de 6,4 g/d espaciada en 4-8 tomas diarias de 0,8-1,6 g a intervalos de 3
horas, con objeto de minimizar los síntomas de parestesia. En cuanto a futuras investigaciones,
todos los diseños cruzados deberían de tener en cuenta el tiempo de lavado, siendo preciso
esperar, al menos, 9 o 10 semanas. También, destacar que sería interesante realizar

VI. ÁCIDO ASPÁRTICO

6.1. estudio preliminar de la produccion de acido l-aspàrtico con
pseudomonas fluorescens

Juan C. Oviedo L*†, Patricia Castrillón H*, Margarita E. Ramírez C.*,

Diana M. Vanegas H. *

*
Universidad Pontificia Bolivariana, Cq. 1 #70-01, of.
11-259, Medellín, Colombia, Centro de Estudios e
Investigación en Biotecnología, CIBIOT, Facultad de
Ingeniería Química,

Recibido 09 Junio 2009; aceptado 18 Junio 2009

Disponible en línea: 30 Junio 2009

Resumen
El ácido L-aspártico es un aminoácido no esencial con aplicaciones en las industrias química,
farmacéutica y de alimentos. Se puede producir por síntesis química o biológica, sin embargo la
primera tiene inconvenientes, siendo el más destacado la mezcla racémica producida. En este
trabajo se empleo la cepa nativa de Pseudomonas fluorescens y ácido fumárico como fuente de
carbono y energía. La primera etapa consistió en adaptar el microorganismo en medio sólido
propio, sustituyendo parcialmente la fuente de carbono y energía desde el 20 %hasta el 80

% en las que presento crecimiento destacado. La segunda etapa se realizo en fermentación

liquida, en la cual se hicieron adaptaciones desde un 1% al 8%, mostrando turbidez hasta el 7 %.
Posteriormente se realizaron las curvas de biomasa, consumo de sustrato y formación de

20
producto y se ajustaron al modelo de Monod. La concentración máxima obtenida de ácido L-
aspártico fue aproximadamente de 1.5mM. Copyright © 2007 UPB

6.2. Introducción
El ácido L-aspártico es un aminoácido no esencial empleado como material de partida para una
amplia variedad de aditivos para la industria farmacéutica y alimenticia por lo que varios
procesos químicos y enzimáticos han sido descritos para su preparación (Giselbrecht et al, 2001).

Dentro de sus aplicaciones se destacan la producción del edulcorante aspartame (L-aspartil- L-

fenilalaninametil ester). Es útil en la industria como material inicial o intermediario para la
formación de surfactantes, secuestrante de iones metálicos, detergentes, cosméticos, síntesis
de péptidos, productos farmacéuticos y coberturas y para la formación del polímero
biodegradable de ácido poliaspártico (PAA). Este último puede ser utilizado como co-constructor
o como secuestrante en detergentes y como polímero superabsorbente además de otras
aplicaciones (Eyal et al, 2001; Sakano et al, 1999; Stair et al, 2005; Waller, 2001)

Desde el punto de vista bioquímico, en el metabolismo de los monómeros, la conversión

biológica del ácido fumárico a ácido aspártico es un proceso de transaminación no oxidativa,
catalizado por un tipo de enzima amonioliasa; más específicamente por una enzima llamada
aspartasa. Esta reacción se realiza en presencia de nitrógeno inorgánico en forma de alguna sal
o NH3. La reacción es reversible por lo que se considera también un proceso de desaminación
no oxidativa realizado por una enzima α-desaminasa (Linden, 2004). Tsuchida, se refiere al
proceso como una transaminación (Tshuida, 1986). Ver Fig. 1

Fig. 1. Transaminación del ácido fumárico

Fuente: CONN, Eric E. and STUMPF P.R. Bioquímica fundamental. 3ºedición. Limusa, 1996. p.
433.

Aunque el ácido L-aspártico se produce por síntesis química, el costo de su producción industrial
es alto debido a la separación de la mezcla racémica. Sin embargo, la naturaleza provee
catalizadores quirales en forma de enzimas o métodos enzimáticos útiles para producción de
ácido L- aspártico (Kato et al, 1999).

El método para obtener ácido L-aspártico más conocido es cuando el ácido es obtenido de
acuerdo a un proceso enzimático empleando ácido fumárico como material original en presencia
de amonio y con la acción de la enzima aspartasa o un microorganismo productor de aspartasa
(Burn et al, 1998).

Los sustratos empleados para bioconversión han sido, azúcares, hidrocarburos sin embargo, los
más destacados son el ácido maleico y el ácido fumárico, tanto para la síntesis química como
por la vía biológica. (Giselbrecht et al, 2001; Duc, Tshuida, 1986; Eyal et al, 2001; Sakano et al,
1999; Stair et al, 2005; Waller, 2001)

21
El objetivo de este trabajo, consistió en determinar los parámetros cinéticos para la producción
de ácido L aspártico empleando como sustrato el ácido fumárico, un acido orgánico
abundantemente producido en la ciudad de Medellín, además económicamente accesible. El
microorganismo seleccionado fue la cepa nativa de Pseudomonas fluorescens, debido a que se
adapto al acido fumárico y llevo a cabo la biotransformación del acido fumárico. De otro lado
este microorganismo se ha empleado en aplicaciones de biosíntesis, incluida la producción del
ácido L-aspártico.

6.3. Materiales y Métodos

6.3.1. Selección del Microorganismo
Por Para la bioconversión del ácido fumárico a ácido L-aspártico a través de microorganismos
se realizó una preselección de estos de acuerdo a los reportes bibliográficos (Tshuida, 1986;
Mukouyama et al, 2001) y a la disponibilidad de estos en el cepario del Centro de Estudios e
Investigación en biotecnología (CIBIOT) el cual pertenece a la Universidad Pontificia
Bolivariana. El microorganismo seleccionados fue la Pseudomona fluorescens, la cual se han
empleado para la biosíntesis de ácido L- aspártico.

6.3.2. Adaptación del microorganismo al medio de cultivo

Buscando la tolerancia y adaptación de la bacteria para que crecieran en medio del ácido
fumárico y transformaran a ácido aspártico se realizó un proceso de adaptación cualitativo con
las diferentes bacterias, al disminuir la concentración de la fuente de carbono en el medio de
cultivo tradicional en una cantidad dada y suministrando dicha cantidad en ácido fumárico.
Cuando la Pseudomona fluorescens presentó crecimiento en su medio tradicional, el Agar
Pseudomonas (Merck) y en presencia de diferentes concentraciones de ácido fumárico, se
cultivó en cajas de petri, en el medio reportado por Mukouyama y Yasuda (2001) el cual contiene
Acido fumárico (Andercol), Sulfato de amonio (Montedision), KH2PO4 (Merck) K2HPO4
(Montedison), MgSO4.7H2O (Merck), NaOH (Merck), Urea y se ajusto pH con una solución de
NaOH al 50%. Una vez adaptado el microorganismo, se hacían repiques en medio sólido y liquido
para mantener su viabilidad.

6.3.3. Montaje del bioproceso

En Una vez adaptado el microorganismo, es cultivado en uel medio Mukouyama & Yasuda (2001)
con algunas modificaciones (Zangrandi et al 1976). El procedimiento se llevo a cabo en un
earlenmeyer 500 mL que contenía 300 mL del medio de cultivo en agitación en el agitador orbital
Unimax 1010 DT a 150 rpm. La aireación se suministró por una bomba de aire Elite799 TM. El
aire de la bomba pasaba a través de un filtro MFS 25 syringe; el montaje contaba además con
una salida de aire a una solución de Sulfato de Cobre. Todo se esterilizo en una autoclave vertical
a 15 psi durante 15 minutos.

6.3.4. Cuantificación del Sustrato

Se empleó un polarografo 746 VA Trace Analyzer Metrohom. Para la lectura del ácido fumárico
en el polarógrafo, en cada muestra, se utilizaron 25 mL de solución soporte de ácido

maléico, igual a la utilizada en la medición del consumo de sustrato para los reactores de
cuatro litros; 25 µL del sobrenadante del medio de cultivo y 25 µL de la solución del estándar
de ácido fumárico preparada con una concentración de 70 g/L.

22
6.3.5. Cuantificación del producto

Para la determinación de la formación de producto, el acido L-aspártico, inicialmente se planteó

el empleo de un método en el que el reactivo de ninhidrina sugerido por Nam Sun Wang (2006)
para la determinación de aminoácidos adicionando 1 mL de la solución de ninhidrina a 5 mL de
muestra en un tubo de ensayo, cubrirlo con plástico o con su tapa para agitar, dejar reaccionar
entre 80-100º C durante 4 a 7 minutos, dejar enfriar a temperatura ambiente en un baño de
agua fría; permitiendo la formación del complejo de ninhidrina de color púrpura que absorbe la
mayor cantidad de luz en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 570 nm. El equipo
empleado fue Shimadzu UV 1606 PC. De otro lado, se procedió a la recuperación de éste y
evaluar su composición en un espectrofotómetro infrarrojo, Protégé 460 spectrometer ESP
Nicolet. La muestra tomada se centrifugó a 6000 rpm 15 minutos, separando el sobrenadante y
mezclarlo con una solución de ácido fumárico en agua hasta un pH de 3 y 4. Esta mezcla, se dejó
en agitación magnética durante una hora hasta que la temperatura bajó a 28º C y se llevaron al
proceso de obtención del cristales. El ácido L-aspártico de referencia que se utilizo fue grado
analítico marca Merck

6.3.6 Crecimiento de Biomasa

El método empleado fue el de peso seco. El sobrenadante se separó para ser centrifugado por
segunda vez como se mencionó anteriormente y se almacenó para la determinación de consumo
de sustrato y formación de producto. El botón, se empleó para la determinación del crecimiento
de biomasa en base al peso seco. En consecuencia; el botón se resuspendió en 6mL de agua
destilada y se agitó en un vortex Heidolph Reax control, esta nueva suspensión, se vertió en un
tubo de vidrio; pesado previamente en la balanza analítica Sartorius BP 221 S; se centrifugó a
4500 rpm durante 15minutos, después de los cuales, en el tubo de ensayo quedaron, un
sobrenadante, que se descartó y un nuevo botón, que se llevó al horno a 65º C hasta el día
siguiente cuando se determinó el peso del tubo con el botón seco.

Una vez se obtuvieron los parámetros cinéticos de consumo de sustrato, crecimiento de

biomasa y formación de producto, se elaboró un análisis cinético aplicando la cinética de
Monod para establecer una relación funcional entre la velocidad específica de crecimiento (µ)
y la concentración de sustrato (S)

6.4. Resultados y Análisis

A continuación en la tabla 1 se muestran los
resultados de adaptación del microorganismo a
los cambios de concentración de fuente de
carbono y energía. dos días de cultivo en estas
condiciones, se utilizó cada uno para inocular
cajas de petri con el mismo medio sólido y con el
ácido fumárico al 4% y 5% respectivamente. Sin
embargo, a pesar del medio líquido presentar
turbidez leve y llevar dos días en agitación, no se
presentó crecimiento en las cajas de petri. Debido
a que en los medios sólidos con concentraciones de ácido fumárico de 4% y 5% no se presentó
fácilmente el crecimiento bacterial, se evaluó la viabilidad de la bacteria en el respectivo medio
de cultivo y se preparó agar y se inocularon con la Pseudomona fluorescens del medio líquido
con el 4% de ácido fumárico. Como resultado de esto, al día siguiente, la bacteria presentó

23
crecimiento en el agar, mientras que en el medio sólido con el 4 % de ácido fumárico, el
crecimiento fue tenue y solamente se visualizó dos días después.

Puesto que al inicio del proyecto; se esperaba que se

presentaría un comportamiento clásico de un
proceso de fermentación, en el que a medida que se
consume el sustrato, se forma el producto y al final
del proceso, cuando el sustrato se agota, se obtiene
la mayor cantidad de producto; no se realizó un
estudio previo de consumo de sustrato y formación
de producto en un medio de cultivo con una baja
concentración de ácido fumárico (1%), sino que se
pasó directamente a adaptar las bacterias a
aumentos en la concentración de este ácido desde 1
hasta 7%. Cuando se logró la adaptación de la Pseudomona fluorescens al medio de cultivo con
el ácido fumárico al 7 % se dejaron desarrollar las fermentaciones, esperando encontrar el ácido
L-aspártico al final del desarrollo del cultivo para aplicarle la prueba de ninhidrina.

Considerando la posibilidad de la inhibición por sustrato y teniendo en cuenta que en el proceso

de adaptación de las bacterias a aumentos sucesivos en la concentración de sustrato, no se
evaluó la formación del ácido L-aspártico ni en los medios de cultivo con bajas concentraciones
de ácido fumárico ni en los días iniciales del desarrollo de las fermentaciones, se realizaron
repiques de a la bacteria a un medio liquido con
una concentración de ácido fumárico de 3%
aproximadamente. Adicionalmente, para
confirmar la inhibición del microorganismo por
acido fumárico, ser realizaron cultivos al 3% y 7 %
observándose un desarrollo de turbidez más
rápido que en el medio de cultivo al 7%, puesto
que, mientras después de cinco días de cultivo, el
medio al 3% ya presentaba turbidez, el medio al
7% no presentaba aumento en el desarrollo de ésta. Este repique al 3% se consideró un paso
intermedio, puesto que el propósito en la disminución en la concentración de sustrato fue
regresar al medio de cultivo establecido por Mukouyama y colaboradores (2001) con el ácido
fumárico al 1% para realizar el cultivo bajo condiciones aeróbicas y cuantificar a esta
concentración, el consumo de sustrato y la formación de producto desde el momento de la
inoculación, antes de someter los microorganismos a altas concentraciones del ácido fumárico.
Y de esta manera, determinar, si el ácido L-aspártico se forma en algún momento dado del
desarrollo del cultivo, aunque no permanezca hasta el final, cuando se consume el ácido
fumárico. Con estos ajustes, se llevaron a cabo los perfiles de sustrato, producto y biomasa,
además de la determinación de los parámetros cinéticos, como se dijo anteriormente a partir
del modelo de Monod. Las curvas del comportamiento cinético para el consumo de sustrato
(Acido Fumárico), Biomasa y producto (Acido L- Aspártico) se muestra en la Fig. 2. En la Fig. 2, se
observa claramente la disminución del ácido fumárico a través de los días y de forma más lineal,
pudiéndose decir que al tercer día, se acaba el ácido fumárico. En el segundo día, la
concentración se redujo a menos de la mitad. En el caso de la biomasa se tomaron muestras
hasta el quinto día de desarrollo del cultivo y después se tomó otra muestra con éste propósito

24
el día ocho, los datos obtenidos permiten confirmar lo obtenido en la primera repetición cuando,
después del quinto día, se observa un aumento de biomasa aun cuando el ácido fumárico está
prácticamente agotado.

De acuerdo a la Fig. 2 se diría que el microorganismo alcanza la fase estacionaria alrededor del
día cinco. Sin embargo, esto difiere de los resultados obtenidos por Zagrandi y Peri (1977)
cuando trabajando con Bacillus ATCC 31177 observaron que el microorganismo alcanzaba la fase
estacionaria en 18 a 20 horas. Se cree que el microorganismo sigue creciendo después del
agotamiento del ácido fumárico porque emplea el ácido L-aspártico como sustrato (Mukouyama
et al, 2001). Aunque se esperaba el proceso convencional en el que la formación de producto
aumenta con el transcurso de los días, en la medida que la concentración del ácido fumárico
disminuye. A partir de los datos de la Fig. 2, se establece que el primer día, en el momento de la
inoculación, es cuando se forma más aminoácido (Aproximadamente 1,5mM) y que durante el
primer día se sigue formando aunque en menor cantidad, por lo que se vé en la muestra tomada
seis horas después. En el segundo día, todavía se presenta alguna formación de aminoácido,
correspondiente a una concentración aproximada de 0,6 mM del aminoácido. Una probable
explicación de lo anterior, podría ser debido a que el inóculo, durante su desarrollo, produce
enzima y más aún, si lleva tres a cinco días en crecimiento; hay lisis celular, se aumenta la
concentración de enzima en el inóculo, que al ser vertido en el reactor, de donde se toman las
muestras para la determinación de consumo de sustrato y formación de producto, se forma el
aminoácido, especialmente en el primer día de desarrollo del cultivo para la toma de muestras,
como se observó con la prueba de ninhidrina.

Sonawane y colaboradores (2003) encontraron que la especie de Pseudomona fluorescens

ATCC21973 transforma fumarato de diamonio a aspartato de amonio en 35 horas a 58º C con
un rendimiento molecular mayor de 95%. Tshuida (1986) encontró que Bacillus subtilis
NRRLB15536, como productor de la enzima aspartasa puede lograr la máxima producción del
enzima y el mayor crecimiento microbiológico en 7-8 horas comparado con un período de 3 días
cuando se emplea E. coli . Zangrandi y colaboradores (1977), encontraron que Bacillus ATCC
31177 tuvo un periódo de incubación de 18 horas en un medio de cultivo acuoso que contenía
fumarato de amonio 60 g/L, K2HPO4 2 g/L, MgSO2.7H2O 0,5 g/L y extracto de levadura 2 g/L y
que al inocularla a un caldo con ácido fumárico creció rapidamente y alcanzó la fase estacionaria
en 18-20 horas, la concentración de ácido L-aspártico en ese momento fué de 0,5 %p/v hasta
alcanzar la concentración de 41 g/L en 56 a 60 horas. Por lo anterior sería razonable que el ácido
fumárico se reduzca en forma drástica en los dos primeros días del cultivo y que en las primeras
24 horas se forme el aminoácido. Si se tiene en cuenta que estequiométricamente, por cada mol
de ácido fúmarico se forma una mol de ácido Laspártico. La formación del aminoácido es poca
con respecto al ácido fumárico consumido. En consecuencia, el ácido fumárico probablemente
está siendo consumido para producir biomasa o CO2. Por otro lado, para la obtención del ácido
Laspárico es importante tener en cuenta el comportamiento del amonio durante el desarrollo
del cultivo puesto que según Duc (1976) a pH alcalino el amonio se vuelve gaseoso. Además, con
el sistema de aireación trabajado pudo haber pérdidas de ésta molécula, alterando su
proporción recomendada con respecto al ácido fumárico, para la formación del ácido L-aspártico
(Eyal et al, 2001). Esto es importante, porque si bien se consideró el ácido fumárico, como el
sustrato limitante, la falta de amonio, también limita la formación del aminoácido. Y según los
resultados obtenidos, aun habiendo ácido fumárico en el medio, no se formaba del aminoácido.

25
Con los datos experimentales obtenidos se ajustó al modelo de Monod a durante el crecimiento
de Pseudomona fluorescens en el medio de cultivo con ácido fumárico al 1%. El modelo de
Monod está indicado en la Ecuación 1

Donde μ,μmax, Ks y S representan,

respectivamente, velocidad Especifica de
crecimiento, velocidad máxima especifica de
crecimiento, constante de Monod y
concentración de sustrato. La ecuación 2 indica
el ajuste obtenido.

Los datos experimentales muestran que el crecimiento del microorganismo se ajustó al modelo
de Monod puesto que el error obtenido fue de
5,92 x10-5. Para la cinética de formación de
producto se empleó el modelo exponencial
decreciente ilustrado en la ecuación 3

Los datos experimentales se ajustaron al

modelo cinético propuesto en la Ecuación 3
empleando el método numérico de mínimos
cuadrados. La cinética de formación de
producto obtenida se muestra en la Ecuación 4.

Los datos experimentales y el modelo propuesto muestran que la concentración de producto

disminuye en forma exponencial, el error del modelo obtenido es de 3,32 x 10-4 lo que muestra
la validez del mismo. El modelo cinético muestra que para un tiempo de fermentación infinito,
la concentración de producto se acerca a 0,0065 g/L, esto se evidencia en los datos
experimentales entre 72 a 144 horas de fermentación. La constante b en el modelo representa
la velocidad de desaparición del producto formado, para el modelo esta constante cinética fue
de 27,97 h-1. Esto indica que a las 27,97 horas de fermentación la concentración de producto
disminuye hasta alcanzar un valor estable

6.5. Conclusiones
Las La cepa de Pseudomona fluorescens del laboratorio de microbiología de la Universidad
Pontificia Bolivariana, si produce el aminoácido ácido L-aspártico en una concentración
aproximada de 1,5mM. El ácido L-aspártico se forma en los dos primeros días de desarrollo del
cultivo cuando es inoculado con un pre-inóculo de cinco días de desarrollo. Bajo las condiciones
de laboratorio estudiadas, en un medio de cultivo con el ácido fumárico al 1%, el crecimiento de
la cepa nativa de Pseudomona fluorescens de la UPB obedece a los parámetros cinéticos µmax
= 0,0097h-1 y Ks= 0,013g/L

VII. CORYNEBACTERIUM SP
7.1. parámetros fisicoquímicos para la síntesis de ácido láctico o etanol de la
bacteria (corynebacterium glutamicum)
ANGÉLICA CASTELLANOS1,4, cPh. D. Biomedicina; LINA MARCELA GARCIA2,4, Ingeniera
Química; MYRIAM ASTUDILLO1,4, MSc. Microbiología; JORGE ENRIQUE LÓPEZ GALÁN2,4, Pos
Doc. Ingeniería Química; LUZ MARINA FLOREZ PARDO3,4, Pos Doc Ingeniería Química 1

26
Universidad del Valle, Facultad de Salud, Departamento de Microbiología, Laboratorio de
Bacteriología. Calle 4B # 36 - 00, edificio de Microbiología, oficina 316. Cali, Colombia. 2
Universidad del Valle, Facultad de Ingeniería Química. Cali, Colombia. 3 Universidad Autónoma
de Occidente, Facultad de Ingenierías, Laboratorio de Bioprocesos. Calle 25 # 115-85, km 2, vía
Cali - Jamundí, Colombia. 4 Grupo Interinstitucional en Investigaciones en Biocombustibles
GRUBIOC. Cali, Colombia. Correspondencia: Angélica Castellanos, ancastellanosan@gmail.com,
Carrera 97 # 45-100. Cali, Colombia. Presentado 25 de julio de 2010, aceptado 17 de febrero de
2011, correcciones 9 de junio de 2011

Resumen
El interés por obtener productos para la industria de biocombustibles a partir de desechos
agrícolas, conduce a la búsqueda de nuevos sistemas biotecnológicos resistentes y costo-
efectivos. Corynebacterium glutamicum, es un microorganismo usado para producir amino-
ácidos que crece en gran variedad de sustratos y es resistente durante la fermentación, a
variaciones de pH, temperatura, presión osmótica y acumulación de alcohol, características que
lo hacen candidato a ser mejorado para la síntesis de ácido láctico y etanol. Aún se desconocen
aspectos de su fisiología que aumenten su eficiencia en convertir azúcares (C5 y C6) en estos dos
metabolitos. Por tanto, este trabajo buscó identificar los parámetros fisicoquímicos que tuvieron
un mayor efecto sobre crecimiento bacteriano y síntesis de ácido láctico o etanol en un sistema
por lotes. Para lograr este objetivo, ocho variables fueron evaluadas en un modelo estadístico
producido en erlenmeyer; con los resultados obtenidos, se hallaron las mejores condiciones que
fueron puestas a prueba en un cultivo en biorreactor. La temperatura, concentración de biotina
y azúcar fueron las variables de mayor impacto (p< 0,05). Usando las mejores condiciones, 36
°C; 6,1 mg/L de biotina y 50 g/L de glucosa, se obtiene una µmax de 0,394 h-1, 16 g/L de ácido
láctico a las 15 h del proceso con un rendimiento del 32%; observándose un mayor consumo de
sustrato durante el crecimiento y poca disponibilidad para la fermentación, sugiriendo una
alimentación del cultivo al final de la fase exponencial que aumente los rendimientos de
producción. Palabras clave: fermentación; Corynebacterium glutamicum; cultivo discontinuo;
ácido láctico.

7.2. Introducción
El incremento en el consumo de productos derivados del petróleo para atender las necesidades
energéticas de la humanidad ha conducido a la industria e investigadores a unir esfuerzos en
busca de alternativas de obtención industrial que sean innovadoras y amigables con el medio
ambiente. El uso de la energía solar en forma de biomasa, representada en residuos agrícolas,
permitirá hallar parte de la solución. Aunque se ha acentuado la discusión mundial por el
impacto de los biocombustibles de primera generación por su efecto sobre bosques, el uso del
suelo y el precio de los alimentos (IEA, 2007); la comunidad científica, entidades
gubernamentales y la sociedad civil están enfocadas en buscar fuentes alternativas de
biocombustibles que disminuyan dichos impactos y la dependencia de los recursos fósiles a
partir de desechos agroindustriales (Moore, 2008). En Colombia líneas de investigación en
producción de biocombustibles de segunda generación, son apoyadas por entidades mixtas
como Corpoica, Ministerio de Agricultura, Colciencias, programas como el de Ecopetrol-ICP y a
través de convocatorias de investigación y esfuerzos internos de las universidades.

Una de las alternativas es la producción biotecnológica costo-efectiva de productos químicos en

masa a partir de recursos renovables. En particular el Valle del Cauca enfoca sus investigaciones

27
en la recuperación de productos químicos de interés para la industria de bio-refinerías a partir
de residuos de cosecha de la caña de azúcar. El ácido láctico es un químico con una amplia
aplicación en nutrición, cosmética, farmacéutica, industria de cueros y textil. Tiene además una
reciente atención en la fabricación de plásticos biodegradables a partir de poli-lactiácidos, con
propiedades similares a las del polietileno, con ventajas para su uso en biomedicina, por su
biocompatibilidad, baja citotoxicidad y fácil bio-reabsorción permitiendo su aplicación en
ortopedia, odontología, cirugía cardiovascular y gastrointestinal. Otro metabolito bacteriano, el
etanol es una de las alternativas para aliviar la dependencia a recursos fósiles; su ventaja radica
en que el CO2 generado en su combustión constituye alimento para plantas sin comprometer el
ciclo natural de CO2 atmosférico y recientemente, planteado como recurso para la producción
de biocombustibles de tercera generación como otra alternativa de energía del futuro (Brennan
et al., 2010). La síntesis de metabolitos de interés se puede hacer por procesos químicos;
teniendo la fermentación ventajas como la reducción de subprocesos adicionales que
incrementan los costos de producción, los impactos negativos sobre el medio ambiente y la
eficiencia encontrada con el empleo de microorganismos. Tradicionalmente las fermentaciones
han sido utilizadas en el campo de la nutrición y la farmacología para la producción de ácidos
orgánicos, alcoholes, vitaminas y medicamentos. La síntesis de etanol y ácido láctico, es posible
gracias a la acción de microorganismos como levaduras y lacto bacterias (Sacharomices
cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia stipidis, Z. mobilis, E. coli, Klebsiella oxytoca,
Lactobacillus, etc.; Bauban et al., 2010). Sin embargo, las propiedades metabólicas de estos
microorganismos, como periodos largos de crecimiento, baja viabilidad y fragilidad a
condiciones rústicas de cultivo, han conducido a la búsqueda de microorganismos que
produzcan grandes cantidades de etanol o ácido láctico en corto tiempo y a bajo costo de
producción. Este trabajo aborda en principio, la búsqueda de los mejores parámetros físico-
químicos de crecimiento en Corynebacterium glutamicum para la síntesis de ácido láctico o
etanol bajo el sistema de cultivo en lote; que a futuro puedan ser aplicados a nivel industrial con
desechos agrícolas provenientes de la caña de azúcar.

7.3. Materiales y métodos

ESTRUCTURA METODOLOGICA Y DISEÑO DE EXPERIMENTOS

Pruebas para la identificación de las condiciones del cultivo. Ocho condiciones o variables de
cultivo, con sus respectivos rangos de trabajo fueron seleccionadas teniendo en cuenta la
revisión bibliográfica (Delaunay et al., 2002; Dominguez et al., 1993; Dominguez et al., 1997,
Okino et al., 2008), enfocada al estudio metabólico de C. glutamicum para la síntesis de
glutamato y lisina, con el objetivo de escoger tres que tuvieran los impactos más significativos
sobre síntesis de biomasa, ácido láctico y etanol. Al rango de trabajo de cada una de las variables
en estudio se les asignó un valor alto, medio y bajo (Tabla 1). Mientras una variable asumió su
valor alto o bajo, las demás se mantuvieron en su valor medio. Cada una de las variables fue
evaluada en un sistema Acta biol. Colomb., Vol. 16 N.º 2, 2011 17 de fermentación dividido en
dos fases, de reproducción y síntesis en donde la bacteria creció a una máxima velocidad
específica (µmáx) con un rendimiento de biomasa (YX/S; gramos de biomasa producidos por
gramos de sustrato consumidos) propio de cada ensayo y seguido de una fase de producción.
Adicionalmente, se hicieron cinco ensayos en donde todas las variables tomaron su valor medio
(Tabla 1). Para cada cultivo, se hizo un seguimiento durante la fase de reproducción (aerobiosis)
de 8 h. Luego, los erlenmeyers fueron sellados para continuar la fermentación por 40 h más.

28
Una vez realizadas las pruebas, se graficaron los datos de concentración de biomasa y ácido
láctico en el tiempo.

Búsqueda de las mejores condiciones de crecimiento bacterial. Este estudio se hizo para
determinar las mejores condiciones de cultivo que rindieran en una alta cantidad y velocidad de
síntesis de biomasa durante la fase de crecimiento antes de la fase de producción. Se tomó como
criterio para desarrollar esta metodología el buscar una dosis de microorganismos en el menor
tiempo posible durante la fase de reproducción, para garantizar disminución en costos
energéticos por tiempo, en el uso de equipos y de nutrientes, que incrementen la eficiencia en
la obtención del producto en un sistema por lotes. Las tres variables escogidas en las pruebas
de identificación, fueron evaluadas aplicando un diseño factorial 23 con cinco puntos centrales
y puntos estrella para determinar su influencia sobre las variables de respuesta (máxima
velocidad de crecimiento y máxima biomasa obtenida al final de la fase exponencial). De acuerdo
con los resultados de identificación de variables de cultivo se eligieron los siguientes factores
con sus respectivos niveles, para desarrollar el diseño factorial de experimentos: temperatura a
30,0 y 36,0 ± 0,1 °C, concentración inicial de glucosa: 20 g/L y 50 g/L y concentración inicial de
biotina: 0,02 mg/L y 4 mg/L; con valores para punto central de 33,0 °C, 34 g/L de glucosa y 2,01
mg/L de biotina. Luego de aplicar el análisis del diseño factorial, la superficie de respuesta
encontrada, condujo un rango de valores más estrecho para la aplicación de un diseño Box-
Behnken (BBD) para aproximar las mejores condiciones de las variables de respuesta.

Los resultados del diseño factorial, determinaron que las tres variables tenían un fuerte impacto
sobre el cultivo y se halló una superficie aproximada para encontrar las mejores condiciones de
crecimiento bacteriano. A partir de éstos resultados, se realizó una estimación del error y
verificación de los efectos cuadráticos. Posteriormente, fue aplicado el BBD, obteniendo una
superficie de respuesta de segundo orden. Para verificar la curvatura de los efectos de segundo
orden, cinco puntos centrales se agregaron al BBD. Las variables de respuesta de BBD fueron, µ
y D.O al final de la fase exponencial. El BBD fue aleatorizado y cada prueba se hizo por triplicado.
Los valores máximos y mínimos para cada factor del diseño fueron ajustados según los datos
obtenidos del diseño factorial. Luego, se construyó un modelo de superficie de respuesta y se
determinaron las condiciones óptimas para maximizarlas. Seguidamente, las condiciones fueron
ensayadas en un biorreactor y ajustadas a las ecuaciones de cinética más adecuadas. Dado que
el diseño BBD no contiene ningún punto en los vértices de la región cúbica creada por los límites

29
superiores e inferiores de cada variable, resulta en un diseño económico y más eficiente que el
diseño rotacional central compuesto por lo que fue seleccionado para encontrar las mejores
condiciones de las variables (Ferreira et al., 2007).

CEPA BACTERIAL Y COMPOSICIÓN DEL MEDIO

La cepa usada en este estudio fue C. glutamicum 2262, proveída por el Laboratorio de Ciencias
Genéticas y Químicas, Escuela Nacional Superior de Agronomía y de Industrias Alimentarias,
Universidad de Nancy. El medio empleado para mantener la cepa fue MCGC (Medium
Corynebacterium glutamicum culture) descrito previamente por Delaunay et al., 1999a. En este
estudio, la glucosa fue usada como fuente de carbono para los inóculos a una concentración de
34 g/L y xilosa, sacarosa o glucosa para cada uno de los ensayos a desarrollar a una
concentración que osciló entre 20-80 g/L.

VALIDACIÓN DEL PROCESO DE FERMENTACIÓN EN ERLENMEYER

Previo a la identificación de variables, se realizó una validación del proceso, usando un

multímetro detector de oxígeno (HACH HQd), para constatar la saturación y consumo durante
la fase de reproducción de C. glutamicum, en un erlenmeyer bafleado de tres aristas marca
Kimble® y servido con 10% de su capacidad volumétrica con medio de cultivo MCGC modificado
(Delaunay et al., 1999a). Posteriormente el recipiente fue sellado con un tapón de algodón,
cubierto con papel aluminio y papel parafilm para asegurar anaerobiosis durante la fase de
producción. Para está validación, se consideró una velocidad de agitación de 200 rpm en un
incubador de agitación orbital (ShelLab, Alemania) a 33 ºC.

CONDICIONES DE FERMENTACIÓN

Para la preparación de inóculos, crioviales con 1,5 mL de la cepa se descongelaron y pusieron en

25 mL de medio MCGC en erlenmeyer bafleado de 250 mL a 33 ºC, 200 rpm y 7,5 de pH inicial,
por 6, 18 o 30 h. Para las pruebas de identificación de condiciones de cultivo; fue necesario
primero elegir entre glucosa, sacarosa o xilosa, la fuente de carbono que produjera el mayor
rendimiento de biomasa; siendo la glucosa el azúcar seleccionado. Después, las ocho variables
fueron ensayadas con sus respectivas réplicas para un valor mínimo, medio y máximo en
erlenmeyers de 500 mL con 50 mL de medio (Tabla 1). Cada cultivo, fue inoculado con 10% v/v
de bacterias provenientes del precultivo; con seguimiento cada 2 h en las primeras 8 h de cultivo
y al final de la fermen tación (48 h). Una vez identificadas las tres variables con mayor impacto
sobre el cultivo, se realizaron fermentaciones para las mejores condiciones de las variables de
respuesta, siguiendo un diseño factorial 23 y BBD. Posteriormente, fueron confirmadas las
mejores condiciones obtenidas en el modelo estadístico en un escalamiento a 1,5 L de medio en
biorreactor, (INFORS HT, Minifors Benchtop) alimentado con 5 L/h de aire, mezclado a 1.200
rpm durante las primeras 8 h para µ y 12 h para la máxima D.O. y a 300 rpm, después de la
suspensión de aire, durante la fase de producción a un pH de 7,5. DETERMINACIÓN DE BIOMASA
Y PRODUCTOS EXTRACELULARES Durante el seguimiento de los cultivos en erlenmeyer, se
tomaron muestras cada 2 h durante la fase de reproducción y una al final de la fermentación.
Para el caso de los cultivos en biorreactor se realizó seguimiento al inicio del cultivo, previo a la
suspensión de aire e inicio de la fermentación y cada 2 h durante la fase de producción; para
determinar la concentración de biomasa, ácido láctico y azúcar residual. Cuantificación de
biomasa celular. La biomasa fue determinada por espectrofotometría a 570 nm
(ThermoSpectronic modelo Génesis 20). La absorbancia obtenida dentro del rango de la curva
de calibración, fue ajustada en g/L usando un factor de conversión, previamente establecido por
gravimetría celular o peso seco/mL de medio después de una filtración con membrana de 0,45

30
m. (Delaunay et al., 1999b). Además, al inicio de cada cultivo se realizó un recuento de células
viables en agar BHI (Brain Heart Infusion) al 2,5%, después de 48 h de incubación a 33 °C
(Madigan et al., 2004). Cuantificación de azúcares, ácido láctico y etanol. 3 mL de cultivo se
centrifugaron a 4.000 x g (micro centrífuga Beckman®) por diez minutos; los sobrenadantes
obtenidos fueron congelados a -20 ºC previo a su análisis. Luego, cada sobrenadante
descongelado fue tratado para retirar las impurezas de las muestras antes de su análisis por
cromatografía líquida o HPLC (High Performance Liquid Cromatography) usando un
cromatógrafo Shimadzu; LC Solution; Kioto-Japón y una columna de exclusión iónica (Shodex SH
1011), operada a 60 ºC con H2SO4 (0,01 N) como fase móvil a 0,6 mL por minuto. Los azúcares
fueron leídos por una celda de índice de refracción y el ácido láctico a 190 nm. La integración
para detección y la cuantificación de los azúcares y ácido láctico se realizó mediante la
comparación de curvas estándar que fueron analizadas en el software LC Solution de Shimadzu.
Para detectar el alcohol en el sobrenadante, se utilizó el método de Winnick (Winnick, 1942). La
reacción de óxido-reducción de etanol con dicromato de potasio, fue determinada por titulación
con tiosulfato de sodio 0,1 N y almidón usado como indicador. Los mililitros gastados de solución
de titulación se compararon con la curva de calibración, donde muestras de concentración
conocida de etanol fueron tituladas con la misma solución. ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN
Previo al análisis de la concentración de biomasa, consumo de azúcar y síntesis de ácido láctico
durante la fermentación; y con el fin de observar la reproducibilidad de los experimentos, se
evaluaron las diferencias estadísticas entre los datos de réplicas y ensayos mediante una prueba
t-Student. Posteriormente, se realizó un análisis de regresión lineal a cada una de las curvas de
concentración de biomasa, para determinar la pendient o velocidad específica de crecimiento
(µ). Se calcularon los rendimientos de biomasa (YX/S) y de síntesis de ácido láctico (YP/S) durante
la fermentación; usando las ecuaciones descritas por Aiba et al., 1973. Un análisis de varianza
(ANOVA) fue realizado usando una base de datos que fue corrida en el paquete estadístico
STATGRAPHICS Centurion XV.II de StatPoint Technologies, Inc., 2008; a fin de determinar las
diferencias significativas entre cada uno de los valores con un intervalo de confianza de 95%.
Para esto, se compararon los valores medios para los tres niveles de la variable a analizar. La
prueba F en el ANOVA determinó si había diferencias significativas entre las medias con un
intervalo de confianza de 95%. En los casos en los que se encontraron diferencias, se usó una
prueba de rango múltiple para decidir cuáles medidas eran significativamente diferentes de
otras. Para este análisis, se establecieron como variables independientes temperatura, pH
inicial, edad del precultivo, velocidad de agitación y concentración de: sales, sustrato, biotina y
tiamina. Como variables de respuesta se establecieron, µ y los rendimientos para producción de
biomasa y ácido láctico. En los diseños experimentales (factorial 23 y Box Behnken) se
establecieron en el ANOVA como variables independientes temperatura, concentración de
biotina y glucosa. Y como variables de respuesta, la µ, y D.O. obtenida al final de la fase
exponencial de crecimiento (Tabla 2).

31
7.4. Resultados
Identificación de las condiciones del cultivo

Con el fin de realizar un tamizaje de las variables que afectaran el crecimiento bacteriano y su
velocidad de formación y que repercutieran en un efecto sobre la producción de ácido láctico
en cultivos en lote; se realizaron un serie de ensayos que se resumen en la tabla 3, en donde se
registran los valores promedio de réplicas por triplicado de velocidad específica de crecimiento
(µ), concentración final de ácido láctico, el rendimiento de síntesis de ácido láctico y biomasa.
Aunque se hizo la determinación de etanol por el método de Winnick, no se detectaron
concentraciones dentro del rango de sensibilidad de la prueba (2% etanol) por tanto no fueron
reportadas. La concentración de células al inicio de los cultivos (t = 0 h) osciló entre 2,8 g/L (1,92
x 109 unidades formadoras de cultivo por mL o UFC mL), excepto para el precultivo a 6 h de
crecimiento que contó con 0,40 g/L de biomasa (2,1 x 107 UFC/mL). Los coeficientes de
correlación para las velocidades de crecimiento específicas variaron entre 0,96 y 0,99. Como
resultados importantes se encontró que cuando C. glutamicum creció en medio con glucosa a
80 g/L, se incrementó más la µ que cuando creció en glucosa a 20 g/L. Sin embargo, a 80 g/L se
observaron 2 h de latencia y una disminución de la cantidad de biomasa al final de la fase
exponencial. La baja síntesis de ácido láctico en el cultivo de menor concentración de glucosa,
fue atribuida a una limitación de sustrato durante la fase de producción. De otro lado, en cultivos
con inóculos jóvenes (6 h); aunque la µ fue una de las más altas (0,35 h-1) la biomasa obtenida
al final de la fase exponencial fue mínima (6,5 g/L), y a pesar que la bacteria siguió creciendo
durante la fase anaeróbica, esto no fue suficiente para superar la biomasa obtenida en los otros
ensayos (16,4 g/L a las 48 h de fermentación), la baja cantidad de biomasa, producto de una baja
concentración de células inoculadas al inicio de cultivo, no afectó la síntesis de ácido láctico, que
fue una de las mayores en esta fase de la investigación y casi igual al obtenido en la prueba que
usó un inóculo de 30 h de cultivo; en donde se invirtió casi la mitad de glucosa, para la
reproducción y mantenimiento celular. A temperaturas bajas (26-29 ºC), el tiempo de latencia
del cultivo fue más largo (8 a 6 h respectivamente) con una baja síntesis de biomasa. De otro
lado, a 33 ºC (pruebas en el punto medio) y 37 °C, las bacterias crecieron con una µ adecuada
(0,26 h-1) y sin latencia, lo que condujo a una alta concentración de biomasa. La síntesis de ácido
láctico fue mayor a temperaturas bajas (26- 29 ºC), con una disminución del consumo de glucosa
para producción de biomasa, contando con más cantidad de sustrato para la fase de producción.
Un pH inicial bajo o alto parece no tener impacto sobre la síntesis de ácido láctico de C.
glutamicum (Tabla 3). En tanto que la velocidad específica de crecimiento, mostró una tendencia
a aumentar a medida que el pH inicial del cultivo se incrementa. Cuando el pH inicial fue seis,
las bacterias estuvieron 2 h en fase de latencia, mientras que cuando el cultivo inició con un pH
de 7,56 o de 9, la fase exponencial comenzó inmediatamente se hizo el inóculo. Como era de
esperarse, una velocidad de agitación mayor aumentó la saturación y disponibilidad de oxígeno
en el medio de cultivo, lo que aceleró el crecimiento y provocó una mayor cantidad de biomasa,
con una menor disponibilidad de sustrato en la fase productiva y muy poca síntesis de ácido
láctico. Los cambios en la concentración de biotina, afectaron tanto la concentración y velocidad
específica de formación de biomasa como la síntesis de ácido láctico. Algo similar se observó en
el caso de tiamina, en donde a una concentración alta o baja se obtuvo mayor velocidad
específica de crecimiento y mayor cantidad de biomasa, que la obtenida con una concentración
intermedia. Sin embargo, la concentración baja de tiamina disminuyó la síntesis de ácido láctico
y favoreció la síntesis de otros subproductos, los cuales fueron evidenciados en el análisis de
perfiles cromatográficos. Aunque estos no fueron cuantificados, se compararon los tiempos de
retención con los datos teóricos de fermentación obtenidos en la columna Shodex 1011 y

32
reportados por la casa comercial los cuales sugieren tiempos de retención para ácido succínico
y ácido acético. Para determinar cuáles variables afectan más el crecimiento de C. glutamicum,
se hizo primero un análisis de correlación entre las variables de respuesta, indicando que cada
una de ellas eran independientes, con un grado de asociación

Variaciones en temperatura y concentración de biotina mostraron cambios significativos en la

mayoría de las variables de respuesta. Debido a que la velocidad de agitación afecta
positivamente la velocidad de crecimiento y cantidad de biomasa, se optó por dejarla constante
en un valor máximo de 250 rpm para los siguientes experimentos, valor que permite una
estabilidad en el rotor del equipo de incubación (ShelLab, Alemania). De igual manera, se decidió
tomar la concentración inicial de glucosa como otra variable influyente; porque, al realizar
cultivos en lotes, de ésta depende la cantidad de sustrato disponible para ser convertido en el
producto de interés. Las demás variables se consideraron de menor influencia; por tanto, se
dejaron constantes en su valor medio para los experimentos siguientes. Estas variables
seleccionadas fueron tomadas para realizar un diseño factorial y luego un BBD que evaluara la
posible influencia sobre el crecimiento con impacto sobre la producción de ácido láctico en el
establecimiento de los mejores parámetros físicoquimicos en el cultivo.

ESTABLECIMIENTO DE LAS MEJORES PARÁMETROS FSICOQUÍMICOS DE CRECIMIENTO EN

CULTIVO POR LOTES

La figura 1 muestra los efectos de las tres variables analizadas. La temperatura indicó que tiene
un efecto positivo sobre la velocidad específica de crecimiento; a medida que se incrementa la
temperatura se obtienen velocidades de crecimiento más altas pero de corta duración (de 4 a 8

33
h), resultando en concentraciones de biomasa menores que los cultivos que se realizaron a baja
temperatura y que crecieron a velocidades menores pero con tiempos de cultivo más largos (de
10 a 12 h). Lo contrario fue observado con densidad óptica (D.O.), al final de la fase exponencial,
donde la temperatura tiene un efecto negativo sin ser significativo por sí solo; sin embargo
cuando se analiza su interacción con concentración de glucosa y biotina, éstos actúan
negativamente sobre la respuesta. La principal influencia sobre la concentración de bacterias o
D.O., se encuentra dada por la
concentración de glucosa,
porque a un valor mayor se
obtuvo mayor cantidad de
biomasa, pero con una
velocidad de formación más
lenta resultando en fases
exponenciales largas
(aproximadamente 12 h). De
otro lado, el efecto de la
concentración de glucosa
sobre la velocidad de
crecimiento no es significativo
sobre esta respuesta; pero
cobra importancia su
significancia con efecto
positivo en su interacción con
la concentración de biotina
(Fig. 1)

Para determinar los mejores valores de las variables de respuesta, se hizo un diseño de
experimentos cuadrático, tomando los mismos factores del diseño factorial, pero con diferentes
valores para cada una de las variables de respuesta (Tabla 3). Según los resultados del diseño
factorial 23, la producción de biomasa se favorece a temperaturas cercanas a 30 ºC y
concentraciones de biotina de 0,02 mg/L y la µ aumenta a temperaturas un poco más altas (36
ºC) con mayores concentraciones de biotina (4 mg/L). Por esto, se decidió tomar intervalos
diferentes de temperatura y concentración de biotina para cada una de las variables de
respuesta. Los resultados promedio, de ANOVA, se ajustaron a un modelo cuadrático o BBD
basado en la ecuación 1, donde i representa la variable de respuesta en unidades de h-1 para la
velocidad específica de crecimiento y absorbancia para la densidad óptica, A la temperatura en
°C, B la concentración de glucosa en g/L y C la concentración de biotina en mg/L. Los coeficientes
de regresión y de correlación se consignan en la tabla 4.

34
El mayor valor absoluto de coeficientes de regresión para µ es el obtenido por el intercepto, lo
cual explica que otros factores o condiciones no incluidas en el diseño podrían tener mayor
impacto sobre esta respuesta. A pesar de esto, en términos de valores absolutos, el coeficiente
que acompaña a la variable temperatura (A), podría indicar que los cambios en temperatura
tuvieron alguna influencia y pudieran ser más representativos sobre µ que las otras dos variables
o sus interacciones. Para la densidad óptica, la variable que mayor efecto tuvo fue la
concentración de glucosa. Al graficar las superficies de respuesta que representan la ecuación 1
(Fig. 2), se observa que los planos tienen diferentes ángulos de inclinación, esto es consistente
con lo observado experimentalmente, donde a medida que se variaban condiciones para
aumentar velocidad de crecimiento, la biomasa al final de la fase de reproducción iba
disminuyendo, pues la duración de dicha fase se hacía más corta. Adicionalmente, los
coeficientes de correlación de cada modelo estadístico cercanos al 0,98 explican que los efectos
en las variables de respuesta, en particular para la concentración de microorganismos, están
explicadas experimentalmente por la concentración de glucosa y que para el caso de la velocidad
específica de crecimiento, podrían otras variables no estudiadas en el modelo tener un impacto
sobre esta respuesta, considerando a la temperatura con sus interacciones como un parámetro
de cultivo a tener en cuenta. Usando el paquete estadístico Statgraphics Centurion XV, se halló
un conjunto de mejores condiciones para cada variable de respuesta. Condiciones uno: se
obtiene el máximo valor de velocidad específica de crecimiento (µ = 0,396 h-1). Condiciones dos:
se obtiene el máximo valor de densidad óptica al final de la fase exponencial (D.O = 45,18).
Comparando los resultados máximos de µ y D.O obtenidos en las mejores condiciones de las
variables con los resultados esperados según las pruebas preliminares y el diseño factorial (Tabla
5), se observó que son similares, lo que permite afirmar que el diseño estadístico es una buena
aproximación matemática de los datos reales.

velocidad específica de crecimiento, podrían otras variables no estudiadas en el modelo tener

un impacto sobre esta respuesta, considerando a la temperatura con sus interacciones como un
parámetro de cultivo a tener en cuenta. Usando el paquete estadístico Statgraphics Centurion

35
XV, se halló un conjunto de mejores condiciones para cada variable de respuesta. Condiciones
uno: se obtiene el máximo valor de velocidad específica de crecimiento (µ = 0,396 h-1).
Condiciones dos: se obtiene el máximo valor de densidad óptica al final de la fase exponencial
(D.O = 45,18). Comparando los resultados máximos de µ y D.O obtenidos en las mejores
condiciones de las variables con los resultados esperados según las pruebas preliminares y el
diseño factorial (Tabla 5), se observó que son similares, lo que permite afirmar que el diseño
estadístico es una buena aproximación matemática de los datos reales.

ESTUDIO DE LA CINÉTICA DE FERMENTACIÓN

Con las condiciones de cultivo encontradas en el análisis de los diseños estadísticos se hicieron
cultivos en lotes a dos condiciones de trabajo (condiciones uno: 35°C, 50 g/L de glucosa y 6,1
mg/L de biotina y condiciones dos: 30 °C, 65 g/L de glucosa y 0,02m mg/L de biotina) en un
biorreactor de 5 L con 1,5 L de volumen de trabajo. Las variaciones en la concentración de:
glucosa, biomasa, oxígeno y ácido láctico, se observan en las figura 3 y figura 4 y los valores de
algunos parámetros cinéticos se encuentran resumidos en la tabla 6.

36
Para las condiciones de cultivo 1 (Fig. 3), la entrada de oxígeno se interrumpió a las 7,1 h de
cultivo y en aproximadamente 0,3 h adicionales, la saturación de oxígeno llegó al 0%.
Inmediatamente fue suspendido el oxígeno, se inició la síntesis de ácido láctico hasta las 15 h de
cultivo, tiempo en el cual se agotó la glucosa. A pesar de la limitación de sustrato, no hubo un
reconsumo del producto. En el cultivo realizado bajo las condiciones 2 (Fig. 4), la alimentación
de oxígeno se mantuvo hasta las 12 h, sin embargo una concentración alta de bacterias reflejó
un elevado consumo de oxígeno durante las primeras 8 h de cultivo disminuyendo su saturación
a un 6,4% y hasta un 0% en las 10 h de cultivo, previo a la suspensión de aire programada (12
h); tiempo en el cual se observó un pico de síntesis de ácido láctico.

Pese al inicio de producción, éste fue afectado por el consumo absoluto del sustrato durante la
fase reproductiva frenando la actividad bacteriana y por ende la fase de producción del cultivo.
Para las condiciones de cultivo 1 (Fig. 3), la entrada de oxígeno se interrumpió a las 7,1 h de
cultivo y en aproximadamente 0,3 h adicionales, la saturación de oxígeno llegó al 0%.
Inmediatamente fue suspendido el oxígeno, se inició la síntesis de ácido láctico hasta las 15 h de
cultivo, tiempo en el cual se agotó la glucosa. A pesar de la limitación de sustrato, no hubo un
reconsumo del producto. En el cultivo realizado bajo las condiciones 2 (Fig. 4), la alimentación
de oxígeno se mantuvo hasta las 12 h, sin embargo una concentración alta de bacterias reflejó
un elevado consumo de oxígeno durante las primeras 8 h de cultivo disminuyendo su saturación
a un 6,4% y hasta un 0% en las 10 h de cultivo, previo a la suspensión de aire programada (12
h); tiempo en el cual se observó un pico de síntesis de ácido láctico. Pese al inicio de producción,
éste fue afectado por el consumo absoluto del sustrato durante la fase reproductiva frenando
la actividad bacteriana y por ende la fase de producción del cultivo. Para las condiciones de
cultivo 1 (Fig. 3), la entrada de oxígeno se interrumpió a las 7,1 h de cultivo y en
aproximadamente 0,3 h adicionales, la saturación de oxígeno llegó al 0%.

Inmediatamente fue suspendido el oxígeno, se inició la síntesis de ácido láctico hasta las 15 h de
cultivo, tiempo en el cual se agotó la glucosa. A pesar de la limitación de sustrato, no hubo un
reconsumo del producto. En el cultivo realizado bajo las condiciones 2 (Fig. 4), la alimentación
de oxígeno se mantuvo hasta las 12 h, sin embargo una concentración alta de bacterias reflejó
un elevado consumo de oxígeno durante las primeras 8 h de cultivo disminuyendo su saturación
a un 6,4% y hasta un 0% en las 10 h de cultivo, previo a la suspensión de aire programada (12
h); tiempo en el cual se observó un pico de síntesis de ácido láctico. Pese al inicio de producción,
éste fue afectado por el consumo absoluto del sustrato durante la fase reproductiva frenando

37
la actividad bacteriana y por ende la fase de producción del cultivo.

Para las condiciones de cultivo 1 (Fig. 3), la entrada de oxígeno se interrumpió a las 7,1 h de
cultivo y en aproximadamente 0,3 h adicionales, la saturación de oxígeno llegó al 0%.
Inmediatamente fue suspendido el oxígeno, se inició la síntesis de ácido láctico hasta las 15 h de
cultivo, tiempo en el cual se agotó la glucosa. A pesar de la limitación de sustrato, no hubo un
reconsumo del producto. En el cultivo realizado bajo las condiciones 2 (Fig. 4), la alimentación
de oxígeno se mantuvo hasta las 12 h, sin embargo una concentración alta de bacterias reflejó
un elevado consumo de oxígeno durante las primeras 8 h de cultivo disminuyendo su saturación
a un 6,4% y hasta un 0% en las 10 h de cultivo, previo a la suspensión de aire programada (12
h); tiempo en el cual se observó un pico de síntesis de ácido láctico. Pese al inicio de producción,
éste fue afectado por el consumo absoluto del sustrato durante la fase reproductiva frenando
la actividad bacteriana y por ende la fase de producción del cultivo.

38
7.5. Discusión
Aunque, cinéticamente se ha descrito el crecimiento de C. glutamicum en un medio definido;
éstos estudios han sido orientados a mejorar la síntesis de glutamato y lisina (Khana et al., 2005;
Bona y Moser, 1997; Dominguez et al., 1997) y aun no se han reportado los efectos de las
variaciones en el microambiente bacteriano, que mejoren la síntesis de ácido láctico o etanol de
C. glutamicum. En este estudio, estamos reportando los mejores valores para crecimiento o fase
de reproducción en cultivo en lote hallados mediante un método estadístico a pequeña escala y
experimentalmente ensayado en biorreactor para la síntesis de ácido láctico. Variaciones en
temperatura, concentración de glucosa y biotina mostraron cambios significativos en las
variables de respuesta, encontrando que, el cultivo de C. glutamicum 2262 a valores óptimos
de: 36 °C, 50 g/L, de glucosa inicial y 6,1 mg/L de biotina, se logra la mayor µ (0,394 h-1) con la
mayor concentración de ácido láctico (16 g/L) en 15 h del cultivo y sin reconsumo de metabolito.
Investigaciones realizadas con C. glutamicum 2.262 recombinante para ldhA/pCRB201 de
Lactobacillus delbruekii (Okino et al., 2008) alcanzaron los 120 g/L de ácido láctico obtenidos en
100 mL de medio; sin establecer los valores de cultivo para biorreactor que aseguren estabilidad
genética y crecimiento de la bacteria. Valores cercanos a los obtenidos por nosotros con la
misma cepa fueron obtenido por choque térmico a 40 ºC, pero con un re-consumo del
metabolito en el tiempo (Delaunay et al., 2002).

Aunque la identificación de las variables para este estudio fue obtenida en un diseño
experimental a pequeña escala, las aproximaciones estadísticas y los resultados obtenidos en
erlenmeyer fueron similares a los encontrados en el biorreactor, a pesar que el tipo de agitación
y el control de pH fueron diferentes. Menor síntesis de ácido láctico se obtuvo en erlenmeyer

39
atribuida probablemente a disminución de pH en el tiempo, propia de la fermentación y que no
pudo ser controlada bajo este sistema. Por otra parte, parece existir un efecto de la dosis
bacteriana sobre el rendimiento del producto relacionado con la disponibilidad de sustrato y
saturación de oxígeno en el medio. Debido en parte a la velocidad de agitación del cultivo
durante la fase de reproducción que tuvo un efecto positivo sobre la velocidad de crecimiento
y la cantidad de biomasa obtenida previa a la fermentación. No obstante, un aumento en la
velocidad de crecimiento o una alta densidad bacteriana disminuyen considerablemente la
disponibilidad de azúcar para el proceso de fermentación impactando negativamente sobre la
producción. La concentración inicial de glucosa juega un papel importante al realizar cultivos en
lotes, de esta depende la cantidad de sustrato disponible para ser convertido en producto. A
pesar de obtenerse una cantidad suficiente de ácido láctico a concentraciones de 80 g/L, los
valores óptimos que condujeron a una mayor producción se encontraron entre 60 y 50 g/L. Tal
vez, por un aumento en osmolaridad del medio cuando se incrementa la concentración y a una
limitación en el sustrato a medida que la concentración disminuye. A 34 ºC las corinebacterias
empezaron síntesis de ácido láctico 2 h después de haber iniciado fermentación. Una reducción
importante en la producción se vio comprometida con incremento de temperatura, contrario a
lo reportado por Delaunay et al., 2002, con la misma cepa; que logró obtener ácido láctico a
temperaturas superiores de 40 ºC. Lo que sugiere una bipartición del proceso en reproducción
(34 a 37 ºC) y de síntesis de ácido láctico (menores a 34 ºC). La temperatura adecuada para el
crecimiento de bacterias mesófilas está entre 30 y 37 ºC. A una temperatura de 40 °C se perturba
la actividad de las enzimas de C. glutamicum en un 40%, principalmente de aquellas que
intervienen en la síntesis de biomasa, ocasionando daños en la pared celular y desviando su
actividad a la reparación, disminuyendo notablemente la producción de biomasa y productos de
la fermentación (Delaunay et al., 2002). A una temperatura inferior a 34 ºC se aumenta la
latencia, se retarda la fase exponencial, pero se logra mantener velocidad de crecimiento y
obtener buena cantidad de bacterias para la producción. De otro lado, aumento en la
concentración de biotina parece favorecer el flujo de carbono que incrementa síntesis de
biopolímeros importantes en crecimiento celular. Aunque fueron estudiadas algunas de las
variables que pudieran tener mayor impacto sobre el cultivo, se encontró que los mejores
valores para maximizar las dos variables de respuesta fueron distintos y podrían ser explicadas
por otros factores. A medida que se variaban las condiciones para aumentar la velocidad de
crecimiento, se iba disminuyendo la biomasa al final de la fase de reproducción y dicha fase se
hacía más corta (8 horas). En tanto que para alcanzar una máxima densidad de biomasa fue
necesario aumentar la concentración de glucosa, disminuir temperatura y concentración de
biotina; aumentando la duración de la fase exponencial (12 h). Aunque es importante identificar
de los factores con mayor impacto sobre el cultivo de C. glutamicum para producción de
metabolitos; lo es aún más el estudio de sus interacciones. Estas interacciones ha permitido
comprender fenómenos fisiológicos bacterianos como el uso de vías anapleuróticas para la
obtención de subproductos, que llevarán al desarrollo del plano metabólico de la cepa para el
establecimiento de condiciones de cultivo que puedan ser utilizadas con sustratos como
hidrolizados provenientes de residuos agrícolas o de mayor oferta industrial como melaza, jugo
de caña o jugos de proceso, ya sea en sus concentraciones originales o diluidas. En donde sea
posible determinarse si existe el efecto de elementos presentes en el sustrato que resulten
inhibidores de crecimiento. Así mismo continuar con aproximaciones metodológicas que
permitan utilizar pentosas en mezclas con diferentes proporciones de hexosas, porque por
transporte facilitado es posible la asimilación de este tipo de sustratos. Durante este estudio no
se logró establecer los parámetros físicoqumicos o condiciones de cultivo para la síntesis de
alcohol. Lo cual depende de estudios bioquímicos y moleculares que logren identificar la

40
expresión enzimas como alcohol deshidrogenasa (ADH), aldolasas y acetolasas y den cuenta de
su actividad.

7.6. Conclusiones
La conclusión o aporte más importante de este trabajo, lo constituye la herramienta
metodológica que permitió evaluar y reportar los mejores parámetros fisicoquímicos del cultivo
para aumentar el rendimiento en la concentración de bacterias que tienen un efecto sobre la
síntesis de ácido láctico a través de la explicación de datos experimentales en biorreactor para
la síntesis de ácido láctico en un cultivo por lotes. Se concluyó además que, un pH inicial bajo o
alto parece no tener un impacto sobre la síntesis de ácido láctico por parte de C. glutamicum; lo
que significa que, en futuras fermentaciones ácido-lácticas, donde el pH tiende a disminuir, no
se verá afectada la producción por acidificación del medio. Encontramos que las condiciones
que más influyen en el crecimiento y la síntesis de ácido láctico en un cultivo por lote son: la
temperatura y la concentración de glucosa.

41