PRÁCTICA Nº 3

MORFOLOGÍA BACTERIANA Y MÉTODOS DE

COLORACIÓN.
I: INTRODUCCIÓN:

Conociendo que el protoplasma bacteriano tiene el mismo índice de refracción que el agua, es indispensable
emplear procedimientos de tinción que permitan visualizarlo.
En ésta práctica empezaremos recién a tener contacto con las bacterias, se hace pues necesario utilizar
colorantes a fin de hacerlas más visibles y que permitan estudiar su morfología, cuya información constituye
a la caracterización, identificación y diagnóstico de géneros bacterianos.

II: OBJETIVOS:

1. Conocer la morfología bacteriana y los métodos de coloración.

2. Realizar coloraciones de Gram y diferenciar los microorganismos Gram positivos y Gram negativos.
3. Realizar la coloración Zielh- Nielsen y visualizar los bacilos acido-alcohol resistentes.

III: FUNDAMENTO TEÓRICO:

Las bacterias son difíciles de observarse al microscopio, por eso es indispensable emplear procedimientos
de coloraciones o tinciones biológicas para visualizarlos adecuadamente y demostrar los detalles finos de
su estructura, tales como: flagelos, esporas, cápsula, gránulos meta cromáticos, etc.; sin embargo los
colorantes deben emplearse en solución generalmente acuosa; los cuales previamente han sido disueltos
empleando alcohol. También es necesario el empleo de mordientes, los cuales son sustancias que actúan
entre el tejido y el colorante formando sales, permitiendo que la coloración quede fuertemente fijada. El
mordiente puede ser colocado sobre el preparado antes o después de la acción del colorante principal: como
fenol, oxalato de amonio, se mezclan con el cristal de violeta en el método Gram, las estructuras bacterianas
se colorean por diversos procedimientos con colorantes propios para cada componente celular.

La morfología de las bacterias se puede examinar de dos maneras:

1.Observando los microorganismos vivos en suspensión: Coloración simple.

Este tipo de montaje hace posible la observación de microorganismos vivos. Es la llamada observación
vital, este examen se realiza con la finalidad de observar características de movilidad, morfología.
2. Observando las células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes procedimientos de coloración:
Coloración Compleja.
IV: PARTE EXPERIMENTAL:

A. EXPERIMENTO 1: COLORACIÓN SIMPLE (FROTIS SECO).

Procedimiento:
a) Tome una lámina porta objetos limpia, coloque tres gotas de agua destilada para hacer tres
frotices, con tres gérmenes diferentes.
b) Con el asa tome una pequeña porción de cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de agua
(cuando el cultivo es medio líquido no necesita de agua) los frotices que se obtengan no deben
ser ni muy gruesos ni muy finos.
c) Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama muy suavemente para obtener la
fijación del frotis.
d) Cubra la preparación, con dos o tres gotas de azul de metileno de Loeffler´s, dejando que el
colorante actúe por un minuto, luego lave la preparación con agua corriente, evitando que el
chorro de agua caiga directamente sobre el frotis.
e) Seque y observe al microscopio usando el lente de inmersión (100X con aceite de inmersión).
f) Observación, interpretación y conclusiones.
 Material
➢ Set colorante Azul de metileno (solución acuosa 1%)
➢ Tubo de caldo de cultivo del microorganismo elegido-

B. EXPERIMENTO 2: PREPARACIONES HÚMEDAS (EXAMEN EN FRESCO)

Las muestras como sedimento urinario, esputo o exudados pueden utilizar directamente mientras que
si el material es demasiado espeso puede diluirse con solución salina.
a) Colocar la muestra de orina en un tubo de ensayo de 13 x 100 y centrifugar por 5’ a 3000
r.p.m.
b) Eliminar el sobrenadante.
c) Colocar el sedimento en un portaobjetos y colocar un cubreobjeto.
d) Observar al microscopio con el objetivo de 40X.
e) Observación: células epiteliales, leucocitos, microorganismos (bacterias, hongos).
f) Interpretación y conclusiones.

C. EXPERIMENTO 3: COLORACIÓN COMPLEJA.

a) Coloración de Gram.
Fundamento:
El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana
luego de un tratamiento con una solución débil de yodo (mordiente). Algunas bacterias debido
a su naturaleza química de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el cristal
violeta, aun luego del tratamiento con un decolorante orgánico, tal como una mezcla de alcohol
y acetona. Tales bacterias se denominan Gram positivas. Las bacterias Gram negativas debido
a su mayor contenido lipídico en su pared celular, pierden la coloración primaria del cristal
violeta cuando son tratadas con el decolorante. El colorante secundario o de contraste utilizado
es la safranina. Las bacterias Gram negativas que han perdido el cristal violeta, aparecen rojas
o rosadas al microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a sus paredes
celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante por los
diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el
colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables.

Procedimiento:
a. Prepara el frotis, coloque una asada de caldo cultivo que contienen una mezcla de
bacterias gram positivas y gram negativas sobre una lámina portaobjetos limpia.
b. Fijar a la llama.
c. Colorear: colocando una gota suficiente del colorante cristal de violeta o violeta de
genciana sobre la muestra dejándola actuar por 1 minuto.
d. Lavar con agua corriente.
e. Cubrir el portaobjetos con lugol por 30 a 60 segundos.
f. Decolorar: eliminar el lugol y lavar la lámina con alcohol-acetona hasta observar que ya
no sale más colorante.
g. Lavar la lámina con agua corriente.
h. Coloración de contraste: colocar unas gotas de safranina por 30 a 60 segundos.
i. Lavar la lámina; luego observar al microscopio con la lente de inmersión.
j. Observación, interpretación y conclusiones.

Material:
➢ Microscopio.
➢ Láminas portaobjetos.
➢ Set de coloración de Gram (sol. de cristal violeta, lugol, alcohol-acetona,
safranina).
➢ Tubo de caldo cultivo de la mezcla de E. coli, Staphylococcus, Streptococcus.

b) Coloración Ziehl-Neelsen:
Fundamento: Las mico bacterias poseen una cápsula gruesa y cerosa y una pared celular
compuesta con una serie de ácidos micólicos y ácidos grasos de cadena larga resistente a la
tinción, sin embargo una vez teñida, esta cápsula resiste la decoloración cuando es tratada con
potentes solventes orgánicos tales como el alcohol-ácido. Por ésta razón los microorganismos
que tienen esta propiedad se llaman acidorresistentes.
A fin de que el colorante primario, la carbofucsina, penetre a través de las cápsulas cerosas de
los bacilos acidorresistentes, se requiere de cierto tipo de tratamiento físico, se emplea calor.
El fenol parece ayudar a ala penetración del colorante a través de los lípidos. Se emplea el azul
de metileno como colorante de contraste.
Esta coloración se emplea principalmente para el diagnóstico de la tuberculosis y la lepra.

Procedimiento:
a. Hacer el frotis y fijar a la llama de un mechero.
b. Colorear con fucsina fenicada por 5 minutos.
c. Calentar a la llama hasta desprender humitos, evitando ebullir o secar.
d. Dejar enfriar, luego lavar con agua corriente.
e. Decolorar con alcohol-ácido hasta retirar todo el colorante.
f. Coloración de contraste: vertiendo el azul de metileno dejar por 30 seg. (puede emplearse
ácido pícrico).
g. Lavar con agua corriente, secar y observar al microscopio con lente de inmersión en aceite
de inmersión.
h. Observación, interpretación y conclusiones.
RESULTADOS

Fig.1: Cultivos utilizadas para la tinción

Fig.2: esterilización de asa bacteriológica

 Fig. 3: Toma de muestra de cultivos de bacterias

Fig. 4: Exparsimiento de la colonia de bacterias con una gota de agua y con la ayuda del asa
bacteriológica
Fig. 5: Aplicación de cristal violeta

Fig.6: Aplicación de Lugol

 Fig.7: Decoloración alcohol- acetona

Fig.8: Coloración de contraste-safranina

 Gram +

Gram -

Fig. 9 coloración de bacterias gram positivas y negativas

Fig. 10 coloración de bacterias gram positivas y negativas

DISCUSIONES
Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de las bacterias,
la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. La pared celular de las bacterias
Gram negativas está constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa,
mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano,
pero no cuentan con membrana celular externa; así pues, la composición química y el contenido de
peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina
las características tintoriales (Lopez et al. 2015) No todas las bacterias se pueden teñir por esta técnica, ya
que carecen de pared celular (micoplasma) o su pared celular tiene una composición química diferente
(micobacterias, que cuentan con una gran cantidad de ácidos micólicos) (Murray 2007). Las bacterias Gram
positivas se observan de color azul obscuro a morado, mientras que las Gram negativas se observan de color
rosa a rojo
CONCLUSIONES
Se reconoció la morfología bacteriana y los métodos de coloración.
Se realizo coloraciones de Gram y se diferencio los microorganismos Gram positivos (coloracion asulada)
y Gram negativos (coloración rosada).
REFERENCIAS
López-Jácome, L., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C., Ortega-Peña, S., Cerón-González, G., &
Franco-Cendejas, R. (2015). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología.
Murray P. Manual of clinical microbiology. 9th ed. USA: American Society for Microbiology; 2007.
 CUESTIONARIO

1. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos gram positivos

y explique: ¿Qué función cumple cada uno de ellos?
Peptidoglicano es la determinante de que estas bacterias retengan el cristal violeta de la
coloración de Gram.
ácido teicoico(ácido lipoteicoico): polisacáridos que se unen al ácido N-acetilmurámico
o a los lípidos de la membrana plasmática.Tienen la función de estabilizar la pared
celular. Además los ácidos teicoicos tienen un rol en la virulencia de estos
microorganismos, porque actúan como antígenos desuperficie que se unen a receptores
específicos en las células del huésped.
Membrana plasmática: presenta las características habituales de todas las bacterias.
Proteínas: son ricas en uno o dos aminoácidos, tienen dominios con secuencias
repetidas y están glicosiladas en mayor o menor grado.

1-membrana citoplasmática, 2-peptidoglicano, 3-fosfolípidos, 4-proteínas, 5-ácido

lipoteicoico.

2. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos gram negativos

y explique la función que cumple cada uno de ellos.
Membrana plasmática: presenta las características habituales de todas las bacterias.
Periplasma: Es un espacio entre la membrana citoplasmática y la superficie interna de la
membrana externa, tiene una consistencia gelatinosa probablemente debido a la presencia de
abundantes proteínas periplásmicas.
Peptidoglicano
Está formado por dos polímeros, n-acetil-glucosamina y ácido N-acetilmuránico, ambos se
unen para formar largos polímeros no ramificados en los que se alternan, estos polímeros a
su vez interaccionan entre sí, formando una sola macromolécula enorme que se denomina
red de mureína, y es la que otorga a la pared bacteriana sus propiedades físicas.
Porinas
La membrana externa de las Bacterias Gram negativas es permeable a pequeñas moléculas,
esto se debe a la presencia de unas proteínas transmembranales denominadas porinas, que
actúan como canales de entrada y salida de sustancias hidrofílicas de bajo peso molecular.
lipopolisacáridos (LPS), que están formados por tres regiones: el polisacárido O (antígeno),
una estructura polisacárida central (KDO) y el lípido A (endotoxina). El lipopolisacárido
contiene una toxina termoestable que se libera al romperse la bacteria gram-negativa,
pudiendo resistir a la esterilización en autoclave.
1-membrana citoplasmática (membrana interna), 2-espacio periplasmático, 3-membrana
externa, 4-fosfolípidos, 5-peptidoglicano, 6-lipoproteína, 7-proteínas, 8-lipopolisacáridos, 9-
porinas.
3. Explique el fundamento de la coloración de Gram y esquematice.
Esta es una técnica que presenta 4 pasos fundamentales: tinción, fijación con el mordiente,
decoloración y contratinción. Por tanto, esta técnica además de colorear a las bacterias, también
permite diferenciarlas.
El cristal violeta es el primer colorante utilizado. El mismo tiene afinidad por el peptidoglicano y
teñirá de morado a todas las bacterias presentes, posteriormente se coloca el lugol, que actúa como
mordiente, es decir, inducirá a la formación de complejos insolubles de cristal violeta-yodo –
proteínas ribonucleares dentro de la célula.
Las bacterias Gram positivas, al tener una pared gruesa de peptidoglicano, forman más complejos
(cristal violeta-yodo), por tanto retienen el colorante.
Además también influye que la pared de las bacterias Gram positivas contienen mayor cantidad de
ácidos no saturados, los cuales muestran gran afinidad por los agentes oxidantes (Lugol).
Mientras, las bacterias Gram negativas poseen una capa delgada de peptidoglicano, lo que hace que
las bacterias formen menos complejos que las Gram positivas.
Posteriormente viene el paso de la decoloración, donde las bacterias Gram positivas y Gram
negativas se comportan de manera diferente.
Las bacterias Gram negativas contienen una membrana externa rica en lipopolisacáridos que forma
parte de su pared celular. Las grasas son destruidas por el contacto con el alcohol acetona, por lo
que la membrana externa se desestabiliza, siendo liberado el cristal violeta.
Es así como luego es contrateñida con la safranina o fucsina básica, tomando el color rojo.
En el caso de las bacterias Gram positivas, resisten la decoloración porque el decolorante actúa
cerrando los poros, lo que impide que el complejo cristal violeta/yodo pueda salirse.
Por tanto, se mantiene estable la coloración con el cristal violeta, y no hay cabida para la safranina
o la fucsina. Por esto estas bacterias se tiñen de azul intenso o morado.

4. ¿A que se denomina mordiente y mencione tres ejemplos?

Los mordientes intensifican la tinción porque aumentan la afinidad de la célula por el colorante.
También se pueden utilizar para producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas,
como los flagelos, que debido a su delgadez no podrían ser visualizados de otra forma.Ejm : Lugol
, yodo, acido tánico, fenol.
5. Mencione tres microorganismos (género) que sean:
• Cocos Gram positivos
Staphylococcus
Streptococcus pyogenes
Streptococcus agalactiae
Enterococcus.
• Bacilos Gram positivos
Bacillus antracis
Clostridium tetani
Clostridium botullinum
• Cocos Gram negativos
Neisseria meningitidis
Neisseria gonorrhoeae
Branhamella
 • Bacilos Gram negativos.
Eschericha coli
Salmonella typhi
Haemophilus influenzae
6. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos ácido alcohol
resistentes y explique la función que cumple cada uno de ellos.

1-lípidos externos, 2-ácido micólico, 3-polisacáridos (arabinogalactano), 4-

peptidoglicano, 5-membrana plasmática, 6-lipoarabinomanano (LAM), 7-
fosfatidilinositol manosido, 8-esquema de la pared celular.

7. ¿Cuál es el fundamento de la coloración de Ziehl Neelsen y esquematice?

El fundamento de esta técnica de tinción se basa en las propiedades de la pared celular de estos
microorganismos. La pared está formada por un tipo de ácidos grasos llamados ácidos micólicos; estos se
caracterizan por presentar cadenas muy largas.
Cuando los ácidos grasos presentan estructuras muy largas, estos pueden retener los colorantes con mayor
facilidad. Algunos géneros de bacterias son muy difíciles de teñir mediante tinción de Gram, debido al alto
contenido de ácidos micólicos de la pared celular.
En la tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico carbol fucsina, un colorante básico. Este
tiene la capacidad de interactuar con los ácidos grasos de la pared celular, la cual es de textura cerosa a
temperatura ambiente.
La tinción con carbol fucsina es mejorada en presencia de calor, debido a que la cera se derrite y las
moléculas de colorante se mueven con mayor rapidez hacia el interior de la pared celular.
El ácido que se usa posteriormente sirve para decolorar las células que no fueron teñidas porque su pared
no era lo suficientemente afín al colorante; por lo tanto, la fuerza del decolorante ácido es capaz de eliminar
el colorante ácido. Las células que resisten esta decoloración se llaman ácido-resistentes.
8. Mencione cuatro líquidos biológicos en los cuales se encuentre el Mycobacterium
tuberculosis.
Las muestras mas comúnmente utilizadas dentro de un laboratorio clínico son:
• MUESTRAS RESPIRATORIAS.
a) Expectoración natural.
b) Expectoración inducida.
• HEMOCULTIVOS.
• MUESTRAS ESTERILES.
a) Muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR).
b) Biopsias
• MUESTRAS DE ORINA
• MUESTRAS DE MATERIA FECAL.