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Université Saad Dahleb-Blida

Faculté de Médecine
Département de Pharmacie

TECHNIQUES D’IDENTIFICATION
DES
CHAMPIGNONS FILAMENTEUX

Dr L.Rezkallah
Laboratoire de Parasitologie-Mycologie
Introduction

Mycoses

Champignons Champignons Champignons


levuriformes filamenteux dimorphiques
Champignons
filamenteux

Septomycètes
Siphomycètes
(Septés,
(Non septés)
cloisonnés)

Phaéohyphomycètes
Hyalohyphomycètes Zygomycètes
(Dématiés)
(Hyalin) Mucorales
(Bruns, Noirs)

Pathogènes vrais:
Dermatophytes Alternaria

Opportunistes:
Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Acremonium
Geotrichum, …
Identification des champignons filamenteux après
isolement sur ½ de culture (SC, SAC)

Critères macroscopiques et microscopiques des cultures

Caractères culturaux et critères


macroscopiques: Caractères (critères)
microscopiques:
Vitesse et T° de croissance; texture
(duveteuse, poudreuse, plâtreuse, Thalle « hyphes » (filaments mycéliens
laineuse, cotonneuse,…); allure « FM » septés ou non, taille, régulier
(glabre, humide, cérébriforme); relief ou irrégulier, hyalins ou noirs);
(plane, surélevée); taille; odeur; arthrospores; forme des spores
couleur des colonies au recto et verso (endogène ou exogène); têtes
(revers); présence ou non de pigment aspergillaires; pinceau;…
diffusant dans la gélose

Critères physiologiques, biochimiques


Critères moléculaires (Biologie moléculaire)
Spectrométrie de masse (MALDI-TOF)
Milieux d’identification
Pour la plupart des champignons filamenteux:
les ½ d’isolement sont des ½ d’identification

Pour les levures  il faut des ½ d’identification


Milieux d’identification
Souche stréile sur ½ Sabouraud

Sporulation
(conidiogenèse, fructification)

Production de pigment

Identification d’un champignon


filamenteux
Identification des dermatophytes
Champignons filamenteux septés hyalins
Kératinophiles, kératinolytiques
Résistants à l’Actidione
SC et SAC:
Filaments mycéliens et/ou des conidies (macroconidies,
microconidies, chlamydospores )
en « régime de bananes »

piriformes

piriformes, arrondies,
allongée
solitaires ou en groupes

Genre Microsporum Genre Trichophyton Genre Epidermophyton


Hyphes:
Ornementations:
Pectinés
En spirale
En raquette
Chandelier et Tête
de clou faviques
Corps nodulaire
Identification des dermatophytes:
Préciser l’origine de la contamination
 Faite habituellement directement sur ½ d’isolement incubés
20-25° C (32° C (37°C) : T. verrucosum) pdt 4 semaines
(jamais de réponse négative avant 4 semaines d’incubation)
Cultures examinées au (-) 2 x/semaine: certains aspects
caractéristiques→ transitoires
T° et vitesse de croissance, aspects macroscopiques et
microscopiques, production ou non d’un pigment…

Autres techniques
Mais parfois, d’identification:
Dermatophyte non Repiquage sur ½
identifiable: d’identification→
stérile, pléiomorphisé Sporulation
ou présente des critères Caractères physiologiques
et biochimiques
atypiques
Milieux d’identification
½ de Borelli
(milieu au ½ eau ½ Agar tween ½ au Bromocrésol
gélosée à 2% 80 (AT) pourpre (BCP caséine)
Lactrimel) ( EG)
Fructification de la
plupart des Gris au départ, vire au
dermatophytes Fructification Pigmentation de bleu-violacé en présence
Production de du T. rubrum de T. mentagrophytes.
pigments (rouge T. rubrum La coloration n’est en
vineux pour T. rubrum revanche pas modifiée
et jaune-orangé pour avec T. rubrum
M. canis)

Exigences nutritives :
½ gélosé BHI (Brain Heart Infusion): MEE:
T. verrucosum (ochraceum) T° d’incubation↗: 32° C (37°C)
T. violaceum, T. schoenleinii
Milieu enrichi à la thiamine:
T. violaceum (microconidies et macroconidies)
T. verrucosum a besoin de thiamine et d’inositol→Labo spécialisés
Recherche de l’uréase:
≠cier T. rubrum (uréase négative) de T. mentagrophytes
(uréase positive)

½ liquide:
Gélose à l’urée de Christensen
½ à l’urée-indole

Lecture se fera dans ce cas au


6 à7 jours d’incubation à 27° C
bout de 2 jours

Recherche d’organes perforateurs in vitro (Perforation du cheveu):


Différencier (≠cier) T. rubrum de T. mentagrophytes var. interdigitale:
Pas formation d’organes perforateurs avec T. rubrum
T. mentagrophytes en produit après 8 à 15 jours d’incubation en présence de
cheveux préalablement stérilisés avec fragment de culture à étudier → présence
de cônes de perforation perpendiculaires à l'axe du cheveu
Epidermophyton floccosum: anthropophile strict

Caractères culturaux et
Aspect microscopique
macroscopiques

Croissance : rapide FM hyalins septés


Colonie disque étoilé (rayonnée) Macroconidies en massue, solitaires
finement duveteux ou poudreux ou groupées en bouquets « régime de
bananes »
Recto: jaune kaki (jaune moutarde) ou
vert olive Microconidies : absentes
Revers : chamois (jaunâtre)
Il se distingue des autres
dermatophytes par:

 Croissance rapide
Couleur jaune kaki de ses
colonies
Absence de microconidies
Nombreuses Macroconidies
en « régime de bananes »
Epidermophyton floccosum
Nombreuses macroconidies en massues ou en raquettes,
isolées ou groupées par 2 ou 3 en « régime de banane »
Microconidies = 0
Trichophyton rubrum: anthropophile strict
Caractères Aspect
culturaux et microscopique
macroscopiques
FM hyalins septés
Croissance : lente à modérément Macroconidies à paroi lisse et
rapide mince: rares, voire absente en forme
Colonie: duveteuse, blanche de cigare «en saucisse»
surélevée en son centre (en dôme ou Microconidies: piriformes en
en coupole), poudreuse, rose, jaune acladium, solitaires
Verso: incolore, brun, jaune, rouge Excroissances triangulaires
vineux à noir pigment diffusible (du
rouge violet au noir)
Microconidies piriforme en acladium
Pigment

Culture jeune lisse se hérissant de FM


dressés en « brosse »

Uréase : négative
Perforation du cheveu in vitro :
négative
Culture sur gélose pomme de terre
glucose : pigment rouge
Sporulation, pigments : ½ de Borelli
Trichophyton mentagrophytes:
2 variétés indifférenciables en pratique (culture):
Var mentagrophytes (Géophile et Zoophile)
Var interdigitale (Anthropophile)
Caractères culturaux et
Aspect microscopique
macroscopiques
Croissance: rapide
Colonie plâtreuse, duveteuse à FM: hyalins, septés, s’articulent svt à
poudreuse, blanchâtres à crème au angle droit (en croix de Lorraine)
recto Macroconidies à paroi lisse et mince :
Verso : jaune à brun en massue, souvent absentes
Microconidies rondes solitaires, très
nombreuses et disposées en buissons
Vrilles (filaments spiralés) fréquents+++
Plâtreuse

Macroconidie: en massue
Microconidies: Piriforme en grappe (buisson)
Trichophyton mentagrophytes:
Ornementations: Vrilles nombreuses, organes en bois de cerf
Uréase : positive
Perforation du cheveu : positive
Culture sur PDA ou Cornmeal :
absence de pigment rouge
Trichophyton violaceum: anthropophile strict

Caractères culturaux Aspect


et macroscopiques microscopique
FM hyalins, septés, grossiers,
irréguliers, d’aspect tortueux, voire
toruloïdes
Croissance : lente Chlamydospores intercalaires
Colonies: petites (qq mm de Absence de macro et microconidies
diamètre), bombées, glabres et
humides. D’abord blanches puis roses
et enfin violettes au recto et au ½ enrichis en thiamine
verso→ Colonies violettes
Quelque fois blanches: Var glabrum
Trichophyton verrucosum (ochraceum): Zoophile (bovins)

Caractères culturaux et Aspect


macroscopiques microscopique
Croissance : très lente, nécessite de
thiamine, inositol, T°↗:32°C (37°C) *FM hyalins, irréguliers, toruloïdes
Colonies: verruqueuses, glabres ou Pas de sporulation
finement duveteuses, mais parfois
cireuses ou cérébriforme. * ½ Lactrimel de Borelli→ qq
microconidies piriformes,
Recto: blanc ou brun clair, parfois plus macroconidies en fuseau ou en
ocre (T.ochraceum). massue
Revers : incolore, brun

Besoins en vitamines : thiamine + inositol


Croissance plus rapide à 32°C (37°C) qu'à 25°C
Colonies → Odeur de « nid de souris »

(1 à 2 mois)

Cérébriforme

Colonie: masse cireuse jaunâtre posée sur la gélose (aspect en morille)


ou « bois de cerf »

Ornementations (chandeliers ou clous faviques) :


Structures caractéristiques, se révèleront plus volontiers
à partir d’une subculture sur gélose au malt.
Cérébriforme
Microsporum canis: Zoophile
Caractères culturaux et
macroscopiques Aspect microscopique

Macroconidies à paroi épaisse


échinulée: en forme de fuseau avec
Croissance : rapide des extrémités pointues (en
Colonie duveteuse, laineuse, quenouille (navette)) et
étoilée présentent une paroi et des
Blanches au recto cloisons épaisses.
Jaune-orangé ou chamois au verso Microconidies : piriformes, sont
inconstantes (peu abondantes –
absentes)
Étoilée

Examen
microscopique
½ de Borelli
(milieu au Lactrimel):
Fructification
Production de pigment
jaune-orangé

Macroconidies en quenouille à paroi très


épaisse avec des échinulations grossières
et , pourvues de nombreuses logettes et
de deux extrémités pointues
Microsporum audouinii: anthropophile strict

Caractères culturaux Aspect microscopique


et macroscopiques
Macroconidies ≈ de M. canis, mais
Croissance : modérément rapide déformées avec un étranglement au
Colonie duveteuse, légèrement centre « aspect en bissac »
poudreuse Microconidies piriformes
Chlamydospores intercalaires ou
Blanchâtre ou grisâtre au recto terminales, Organes pectinés.
Beige à saumon au verso.
Microsporum gypseum: Géophile (Tellurique)

Caractères culturaux et Aspect microscopique


macroscopiques

Croissance : rapide Nbreuses macroconidies en cocon, à


paroi mince et échinulée (au maximum
Colonie: plane poudreuse ou 6 logettes)
granuleuse («en éclaboussure de
plâtre») Microconidies: piriformes plus rares
Recto est chamois clair ou beige
(«café au lait clair»)
Revers : brun chamois ou beige sans
pigment diffusible

Recherche d’organes perforateurs in


vitro est positive
Identification impossible (morphologique « caractères macroscopiques
et microscopiques », tests biochimiques et physiologiques):
souches pléomorphisées, souches stériles, caractères atypiques

Biologie moléculaire « outils complémentaires »:


(PCR, séquençage de gènes)→Objet de nombreux travaux

Limitée aux Augmente la sensibilité


laboratoires de Typage : intérêt épidémiologique
référence (coûteuse Diagnostic rapide
et lourde) Identification précise (genre et espèce)

Heureusement, dans la plupart des cas, l’œil Spectrométrie de


et l’expérience du biologiste lui permettent de masse (MALDI-TOF):
simplicité de mise
mener à terme l’identification ! en œuvre, rapidité
et faible coût.
Utilité des épreuves physiologiques et biochimiques pour
l’identification des dermatophytes
Identification des moisissures:
Aspergillus.sp
Penicillium.sp
Identification des
Aspergillus
• Moisissures, champignons à filaments hyalins, septés
(cloisonnés), saprophytes sol, exogènes, cosmopolites
Aspergillus • Peu virulents mais très opportunistes

• Services hébergeant patients ID (Sce d’Hématologie):


Aspergillus
neutropéniques++++

• Atteintes invasives, profondes gravissimes (API,..)


Aspergillus • Formes localisées et manifestations immuno-allergiques
Genre Aspergillus se caractérise par:
Conidiophores (stipes) non cloisonnés dressés et renflés en vésicule
Vésicules portant des phialides (cellules conidiogenèse) en bouteille
 Spores (conidies, Phialospores): unicellulaires groupées en chaînes,
formées à partir des phialides
Phialides directement insérées sur la vésicule → Tête unisériée
Phialides portées par des cellules intercalaires (métules)
insérées sur vésicule→ Tête bisériée

Organes de
fructifications du
genre Aspergillus
Tête bisériée
Disposition
en colonne

Tête unisériée
Fructification (Sporulation):
Aspergillus
Tête aspergillaire

*Se développe bien sur ½ Identification
classiques de mycologie
*Gélose de Sabouraud avec et Difficulté d’identification →Repiquage
sans cycloheximide
(Actidione®)
*À 25°C, 37°C
½ de Czapek

Sensible à
l’Actidione
Vérification tous les ½ à l’extrait de malt
jours Eau gélosée à 2%
 Thermophiles ou thermotolérants et Corn-meal –agar
aptitude de se développer à 37°C

Caractère important en pathologie
Pas de sporulation: T° et vitesse de
Repiquage sur ½ pousse
d’Identification : ½ Czapek Caractères Sensibilité au
culturaux et cycloheximide
macroscopiques
Aspect
Identification macroscopique des
colonies

Tête aspergillaire
Aspect
microscopique (organe fructification
Biologie asexuée)
moléculaire
(coûteuse et
lourde)
Spectrométrie
de masse Dg du genre:
(MALDI-TOF)
Aspergillus.sp
*Conidiophores (taille, forme,
*T° et vitesse de pousse présence ou non de pigmentation
*Aspect des colonies, leur couleur ou d’échinulations)
au recto et verso à maturité *Vésicule (taille et forme)
*Présence ou non de métules.

Dg
d’espèce
*Conidies (taille, surface et
Aspect de tête aspergillaire pigmentation)
(lié à l’implantation des phialides *Existence ou non d’1
sur la vésicule): reproduction sexuée (présence ou
tête en colonne; tête ronde radiée non de cléistothèces, et de cellules
en noisette ou « Hülle cells »)
Aspergillus fumigatus: 80 à 90%
Caractères culturaux et macroscopiques
T° de devpt 37 à 50°C.
Croissance Très rapide à 37°C (24 à 48 h)
Aspect Poudreux
Couleur (Recto ) Blanche puis bleu-vert virant au vert foncé à gris noirâtre.
Revers (Verso) Incolore, jaune, vert ou brun- rouge.

Aspect microscopique: Tête aspergillaire


Conidiophore court, 300 µm, lisse, incolore, évasement progressif au
sommet
Vésicule Hémisphérique, 20-30µm
Phialides Directement portées par vésicule, dressées,
densément groupées
Tête Unisériée, en colonne compacte (Phialides distribuées
uniquement sur la partie supérieure de la surface de la
vésicule)
Conidies Globuleuse, vertes, échinulées, petites 2,5 à 3µm de Ø
Pas de reproduction
sexuée connue
Pas de « Hülle cells »
A.flavus
Caractères culturaux et macroscopiques
T° de dev 25 à 37°C
Croissance rapide (2 à 3 jours)
Aspect Duveteux à poudreux
Couleur (Recto) D’abord blanches, puis jaunes, puis vert jaune
Revers (Verso) incolore, rosé ou brun-rouge foncé

Aspect microscopique
Conidiophore 1mm de long, hyalin, à paroi verruqueuse (st près de l’apex)
Vésicule Sphérique, 25 à 45µm
Phialides directement insérées sur vésicule ou portées par des
métules
Tête unisériée ou bisériée, 300 à 400µm de long, radiée
(Phialides insérées sur tout le pourtour de la vésicule),
puis se scindant en plusieurs colonnes
Conidies globuleuses à subglobuleuses, vert pâle, échinulées,
3,5 à 4,5µm de Ø
Pas de reproduction
sexuée connue
Pas de « Hülle cells »
A.niger
Caractères culturaux et macroscopiques
T° de dev 25- 30°C (peut pousser jusqu’à 42°C)
Croissance rapide (2 à 3 jours)
Aspect Granuleux
Couleur (Recto) d’abord blanches, puis jaunes, et enfin noires
Revers (Verso) incolore à jaune pâle

Aspect microscopique
Conidiophore lisse, hyalin ou brunâtre dans sa moitié supérieure, très
long (1,5 à 3mm)
Vésicule globuleuse, 30 à 100µm
Phialides insérées sur la vésicule par l’intermédiaire de métules
disposées sur tout le pourtour de la vésicule
Tête Large ,radiée, bisériée noire à maturité
Conidies globuleuses (3,5 à 5µm de Ø), brunes, échinulées
à très verruqueuse, souvent en chaines
Pas de reproduction
sexuée connue
Pas de « Hülle cells »
A.terreus
Caractères culturaux et macroscopiques
T° de dev 25-30°C (pousse aussi à 37°C)
Croissance rapide (3 à 5 jours)
Aspect Duveteux à poudreux
Couleur (Recto) teinte beige à brun noisette ou cannelle
Revers (Verso) jaune à brun orange

Aspect microscopique
Conidiophore lisse, incolore, de 100 à 250µm de long
Vésicule globuleuse
Phialides portées par des métules insérées surtout sur la
partie supérieure de la vésicule
Tête en colonne, bisériée
(en colonne évasée « aspect d’éventail »)
Conidies de petite taille (1,5 à 2,5µm), lisses, globuleuses à
légèrement elliptiques
Pas de reproduction
sexuée connue
Pas de « Hülle cells »
A.nidulans
Caractères culturaux et macroscopiques
T° de dev 25 à 30°C (pousse aussi à 37°C)
Croissance rapide (3 à 5 jours)
Aspect Duveteux à poudreux
Couleur (Recto) vert foncé ou vert cresson, jaunâtre pour
les souches productrices de cléistothèces
Revers (Verso) rougeâtre, pourpre

Aspect microscopique
Conidiophore brun, lisse, sinueux, très petit (courts )
Vésicule sphérique
Phialides portées par des métules insérées sur la partie
supérieure de la vésicule
Tête bisériée en colonne, courte et compacte
Conidies rondes, vertes, échinulées, 3 à 3,5µm de Ø, souvent
disposées en chaines
Reproduction sexuée:
Emericella nidulans

Présence de
« Hülle cells »:
Arrondies
(10 à 20µm de Ø)
Fructification sexuée:
100 à 300µm de Ø
cléistothèce
Identification de
Penicillium.sp
Penicillium.sp
Contaminants de Labo Industrie agro-alimentaire et
Saprophytes très répandus pharmaceutique.

Penicillium.sp
Rarement incriminé en pathologie humaine

Penicillim marneffei: Champignon dimorphique


Réservoir : sol, rats de bambou
Redoutable pour l’ID (VIH+)
Exclusivement d’Asie du Sud-est
Infections systémiques:
peau et organes profonds
Penicillium.sp
 Pinceau
 Pousse facilement sur ½ Sabouraud-chloramphénicol sans Actidione (SC),
½ à l’extrait de malt, corn-meal agar
 Sensible à l’Actidione
 T° de croissance entre 25 et 30° C, croissance est rapide
 ½ d’identification : ½ de Czapek
Aspect macroscopique de la culture :
Colonie duveteuse, poudreuse, couleur
variable, le plus souvent verte, mais
parfois grise, jaune ou rose.
Revers incolore ou foncé.
NB: Pigment diffuse parfois dans la
gélose (P.marneffei : pigment rouge vif
diffusant dans toute la gélose)

Macroscopie: P.marneffei

Verso: un pigment rouge vif+++


diffuse dans toute la gélose

Recto P.purpurogenum (conidies rugueuses)


Aspect microscopique de la culture :
 Hyphes septés, hyalins, portent des conidiophores simples ou ramifiés
Phialides disposées en verticilles à l’extrémité des conidiophores.
Phialides serrées les unes contre les autres, l’ensemble donne l’image de pinceau
(ou pénicille)
Phialides donnent spores (conidies, phialospores): unicellulaires disposées en
chaine
Pinceau
Identification du
Geotrichum
• Champignons à filament septé hyalin arthrosporés
• Cosmopolites, opportunistes
Geotrichum

• G.capitatum et G.clavatum commensaux de tube digestif et voie


aériennes de l’homme et de Nbreux mammifères
• G.candidum: fromage, produits laitiers (lait, crème, beurre), ½
Geotrichum extérieur (air, sol, eau), colonise voies digestives, voies
respiratoires et peau de l’homme

• Atteintes digestives (muguet buccal, colites, entérites),


respiratoires (infections bronchiques, pneumopathies), kératites
ou onychomycoses
Géotrichoses: • Atteintes profondes, disséminées et septicémies (ID sévère),
rares exceptionnelles: hépatospléniques, cardiaques, rénales
→Pronostic est sombre
Caractères culturaux et
Aspect microscopique
aspect macroscopique

Croissance: lente Filaments mycéliens


hyalins, septés,
Colonies plates,
plâtreuses à
réguliers, se
muqueuses, glabres à désarticulent
finement duveteuses →Arthrospores
La galerie « Auxacolor »

Pas de
blastospores

Dg d’espèce:
Caractères Identification du genre Geotrichum
auxanographiques (filaments mycéliens et des arthrospores)