Restricción y modificación controlada por el host.

La restricción y modificación controlada por el huésped se observan más fácilmente cuando los

bacteriófagos se transfieren de una cepa bacteriana del huésped a otra. Si una preparación de stock de fago X, por ejemplo, se realiza por crecimiento

sobre E. coli cepa C y esta stock se titula sobre E. coli C y E. coli K, los títulos observados en estas dos cepas diferirán en varios órdenes de magnitud,

siendo el título de E. coli K el más bajo. Se dice que el fago está restringido por la segunda cepa huésped (E. coli K). Cuando los fagos que resultan de

la infección de E. coli K ahora se reemplazan en E. coli K, ya no están restringidos; pero si primero se reciclan a través de E. coli C, una vez más se

restringen cuando se colocan en placa sobre E. coli K (Fig. 2.1). Por lo tanto, la eficiencia con la que el fago X se aplica sobre una cepa huésped

particular depende de la cepa sobre la que se propagó por última vez. Este cambio no heredable conferido al fago por la segunda cepa huésped (E. coli

K) que le permite ser reemplazado en esa cepa sin restricción adicional se llama modificación

Los fagos restringidos adsorben a los huéspedes restrictivos e inyectan su ADN normalmente. Cuando los fagos están marcados con 32 P, es evidente
que su ADN se degrada poco después de la inyección (Dussoix y Arber 1962) y la endonucleasa que es la principal responsable de esta degradación se
llama enzima de restricción (Lederberg y Meselson 1964).

El huésped restrictivo debe, por supuesto, proteger su propio ADN de los efectos potencialmente letales de la endonucleasa de restricción y, por lo

tanto, su ADN debe modificarse adecuadamente. La modificación implica la metilación de ciertas bases en un número muy limitado de secuencias

dentro del ADN que constituyen las secuencias de reconocimiento para la endonucleasa de restricción. Esto explica por qué los fagos que sobreviven

a un ciclo de crecimiento sobre el huésped restrictivo pueden posteriormente reinfectar ese huésped eficientemente; su ADN se ha replicado en

presencia de la metilasa modificadora y, por lo tanto, al igual que el ADN del huésped, se convierte en metilado y protegido del sistema de restricción.

Aunque la infección por fagos se ha elegido como nuestro ejemplo para ilustrar la restricción y la modificación, estos procesos pueden ocurrir sin que

el ADN se transfiera de una cepa bacteriana a otra. La conjugación, la transducción, la transformación y la transfección están sujetas a la restricción

de la restricción controlada por el huésped. Los genes que especifican los sistemas de restricción y modificación controlados por el huésped pueden

residir en el cromosoma bacteriano en sí mismo o pueden estar ubicados en un plásmido o profágico como Pl. •

Después de la incubación, la mezcla de ADN se analizó por sedimentación a través de un gradiente de sacarosa, donde la aparición de ADN

degradado no modificado en presencia de ADN modificado no degradado indicó la actividad de la endonucleasa de restricción. La enzima de E. coli

K, y similares
Se descubrió que la enzima de E. coli K y la similar de E. coli B. tienen propiedades inusuales Además de los iones de magnesio, requieren los

cofactores ATP y S-adenosimimelhionina, y la degradación del ADN in vitro, se acompaña de la hidrólisis del ATP en 'cantidades' que exceden en

gran medida la estequiometría de la rotura del ADN (Bickle et al. 1978). Además, ahora se sabe que las enzimas interactúan con una secuencia de

reconocimiento no modificada, que es asimétrica. Después de viajar por una distancia correspondiente a entre 1000 y 5000 nucleótidos, escinde una

cadena solo del ADN en un sitio aparentemente aleatorio, y deja un espacio de aproximadamente 75 nucleótidos de longitud al liberar

oligonucleótidos solubles en ácido. No hay evidencia de que la enzima sea realmente catalítica, y habiendo actuado una vez de esta manera, se

requiere una segunda molécula de enzima para completar la ruptura de doble cadena (Rosamond et al. 1979). Las enzimas con estas propiedades

ahora se conocen como endonucleasas de restricción de tipo 1. . Su bioquímica aún presenta muchos acertijos: por ejemplo, el papel preciso de la S-

adenosilmetionina sigue sin estar claro

Mientras estas extrañas propiedades de las enzimas de restricción tipo I se estaban desenredando, se descubrió una endonucleasa de restricción de

Haemophilus influenza Rd (Kelly & Smith 1970, Smith & Wilcox 1970) que se convertiría en el prototipo de una gran cantidad de endonucleasas de

restricción, ahora conocidas como enzimas tipo II: que no tienen ninguna de las propiedades inusuales que muestran las enzimas tipo I y que son

fundamentalmente importantes en la manipulación del ADN. Las enzimas tipo 2 reconocen una secuencia diana particular en una molécula de ADN

dúplex y rompen las cadenas de polinucleótidos dentro o cerca de esa secuencia para dar lugar a fragmentos de ADN discretos de longitud y secuencia

definidas. De hecho, la actividad de estas enzimas a menudo se analiza y estudia mediante electroforesis en gel de los fragmentos de ADN que

generan (ver Fig. 1.2). Como era de esperar, los resúmenes de pequeños plásmidos o ADN viral dan patrones de banda de ADN simples

característicos. Ahora se han aislado muchas endonucleasas de restricción de tipo II de una amplia variedad de bacterias. Se han identificado varios

cientos de enzimas de restricción y se han caracterizado al menos parcialmente (Kessler et al. 1985), y el número continúa creciendo a medida que se

analizan más géneros de bacterias para determinar su presencia. Vale la pena señalar que muchas de las llamadas endo nucleasas de restricción no se

han demostrado formalmente que se correspondan con ningún sistema de restricción y modificación genéticamente identificado de las bacterias de las

que se han preparado: por lo general, se supone que una endo nucleasa específica del sitio que es inactivo sobre el ADN del huésped y activo sobre el

ADN exógeno es, de hecho, una endonucleasa de restricción.

Sitios objetivo

La gran mayoría de las endonucleasas de restricción tipo II, pero no todas, reconocen

y romper el ADN dentro de secuencias particulares de tetra, penta, hexa o

Hepta-nucleótidos, que tienen un eje doble de simetría rotacional; para

ejemplo, Eco RI corta en las posiciones indicadas por flechas en las secuencias

dando lugar a terminales que llevan grupos 5'-fosfato y 3'-hidroxilo. Tal

a veces se dice que las secuencias son palindrómicas por analogía con palabras

que leen por igual hacia adelante y hacia atrás. (Sin embargo, este término también tiene

se ha aplicado a secuencias como las que son palíndromos dentro de una cadena, pero no tienen un eje de

simetría rotacional )

La estructura del complejo enzima-ADN ha sido determinada por

Cristalografía de rayos X (McClarin et al. 1986). Es evidente que la endonucleasa actúa como un dímero de subunidades idénticas, y que el

palindrómico

Notas

1. 2 Los nombres de estas dos enzimas son anómalos. Los genes que especifican las enzimas.

se basan en dos factores de transferencia de resistencia que se han clasificado por separado. Por lo tanto

RI y RU.

3 Hga I es una endonucleasa de restricción de tipo 2, que se divide como se indica:

donde N es cualquier nucleótido.

4 Bajo ciertas condiciones (baja fuerza iónica, pH alcalino o glicerol al 50%) el Eco RI

la especificidad se reduce de modo que solo la secuencia interna de tetranucleótidos del hexanucleótido canónico es necesaria para el reconocimiento

y la escisión. Esto se llama Eco Ri

actividad. Es inhibido por el paracloromercuribenzoato, mientras que la actividad Eco RI es

insensible (Tikchonenko et al. 1978). Muchas otras enzimas exhiben actividad estelar, es decir

especificidad reducida, bajo condiciones subóptimas

La naturaleza de la secuencia objetivo refleja la doble simetría rotacional de la proteína dimérica. Si la secuencia diana se modifica por metilación de

modo que se encuentren residuos de 6-metiladenina en una o ambas posiciones indicadas por asteriscos, entonces la secuencia es resistente a la

endonucleasa R. Eco RI. La resistencia del sitio semimetilado protege el propio ADN dúplex del huésped bacteriano del ataque inmediatamente

después de la replicación semiconservadora del sitio totalmente metilado hasta que la metilasa de modificación pueda restaurar nuevamente los

dúplex hijos al estado totalmente metilado. Podemos ver que Eco RI hace que las cadenas simples separen cuatro pares de nucleótidos en las cadenas

opuestas de su secuencia objetivo, y así generan fragmentos con extremos 5 'sobresalientes. Estos fragmentos de ADN pueden asociarse mediante

enlaces de hidrógeno entre los extremos 5 'superpuestos, o los fragmentos pueden circularizarse por reacción intramolecular, y por esta razón se dice

que los fragmentos tienen extremos adhesivos o cohesivos. (Fig. 2.2). En principio, los fragmentos de ADN de diversas fuentes pueden unirse por

medio de los extremos cohesivos, y es posible, como veremos más adelante, sellar los cortes restantes en las dos cadenas para formar una molécula de

ADN dúplex recombinante artificialmente intacta.

Está claro en la Tabla 2.1 que no todas las enzimas tipo II escinden sus sitios objetivo como Eco RI. Algunas enzimas (por ejemplo, Pst I) producen

fragmentos con extremos cohesivos 3 '. Otros (por ejemplo, Hae HI) realizan cortes uniformes que dan lugar a fragmentos unipolares al ras o sin final

cohesivo. Algunas enzimas reconocen secuencias de tetranucleótidos, otras reconocen secuencias más largas, y esto, por supuesto, determina la

longitud promedio del fragmento producido. Esperaríamos que cualquier objetivo de tetranucieótido particular ocurra aproximadamente una vez cada

4 4 (es decir, 256) pares de nucleótidos en una secuencia de ADN aleatoria larga, suponiendo que todas las bases sean igualmente frecuentes. Se

esperaría que cualquier objetivo de hexanucieótido particular ocurra una vez cada 4 6 (es decir, 4096) pares de nucleótidos. Algunas enzimas (por

ejemplo, Sau 3AI) reconocen una secuencia de tetranucieótidos incluida, la secuencia de hexanucleótidos reconocida por una enzima diferente (por

ejemplo, Bam HI). Los términos cohesivos producidos por estas enzimas son tales que los fragmentos producidos por Sau 3AI serán coherentes con

los producidos por Bam HI. Si los fragmentos se unen covalentemente, el 'sitio híbrido' así producido será

una vez más sensible a Sau 3AI, pero puede no constituir un objetivo para Bam HI; esto dependerá de los nucleótidos adyacentes al sitio Sau 3AI

original (Fig. 2.3). Varias otras combinaciones de enzimas tienen esta propiedad. De la tabla 2.1 también podemos ver que Hind II, la primera enzima

tipo 2 que se descubre, es un ejemplo de una enzima que reconoce una secuencia con cierta ambigüedad; en este caso las tres secuencias

correspondientes a la estructura dada en la Tabla 2.1 son sustratos. También hay varios ejemplos conocidos de enzimas de diferentes fuentes que

reconocen el mismo objetivo. Son isoschizomers. Algunos pares de isoschizomers cortan su objetivo en diferentes lugares (por ejemplo, Sma I, Xma

I). En nuestra discusión de los fenómenos de restricción y modificación del fago X por E. coli K, vimos que la metilación era la base de la

modificación en ese sistema. En la amplia variedad de enzimas de restricción de tipo II ahora conocidas, hay algunos ejemplos curiosos y útiles de la
influencia de los grupos metilo en los sitios de restricción. Las enzimas Hpa II y Msp I son isoschizomers con la secuencia objetivo CCGG. Hpa II no

cortará el objetivo cuando contiene 5-metilcitosina como lo indica el asterisco CCGG (de hecho, este es el producto de M. Hpa H). Sin embargo, se

sabe que Msp I es indiferente a la metilación en este nucleótido: escinde si este residuo C está metilado o no. Ahora se ha descubierto que más del

90% de los grupos metilo en el ADN genómico de muchos animales, incluidos vertebrados y equinodermos, se presentan como 5-metilcitosina en la

secuencia CG. Muchos de estos grupos metilo se producen en los sitios de Msp I, y su presencia se puede detectar comparando digeridos del ADN

generado por Hpa II y Msp I. De hecho, la metilación en los sitios de Msp I alrededor de un solo gen se puede investigar en detalle combinando El

uso de estas dos enzimas con la técnica Southern-blot (Bird & Southern 1978, Razin & Riggs 1980).

Un efecto potencialmente problemático de la metilación del ADN se refiere a las actividades de metilación de la presa y el dan de muchas cepas de E.

coli. La actividad de la presa (DNA idenine methylase) metila la adenina, creando 6-metiladenina, en la secuencia GATC. La actividad dcm (ADN

citosina metilasa) metila la citosina interna, creando 5-metilcitosina, en la secuencia CC (A / T) GG. La metilación de la presa parece desempeñar un

papel en la discriminación de los filamentos para la reparación de desajustes (Lu et al. 1983, Radman y Wagner 1984). Otras funciones postuladas

para la metilación de adenina y citosina en el inicio de la replicación o recombinación de ADN son menos conocidas. Desde el punto de vista del

manipulador genético, la importancia principal de estas funciones de metilación es su efecto de limitar la capacidad de ciertas endonucleasas de

restricción para actuar sobre los ADN de las cepas dam * y dcm + E. coli: a continuación se presentan dos ejemplos. La metilación de la presa de la

secuencia GATC la hace resistente a la restricción por Mbo I. Este problema se supera mediante la disponibilidad del isosquizómero Sau 3AI, que

corta la secuencia tanto si el residuo de adenina está metilado como si no. Es principalmente por esta razón que Sau 3AI ha reemplazado a Mbo I en

los catálogos de endonucleasas de restricción disponibles comercialmente. La metilación Dcm de la secuencia CC (A / T) GG evita la restricción por

Eco RD. En este ejemplo también hay isosquizómero disponible, BstN I, que es indiferente a la metilación dcm. Una solución alternativa al problema

en este caso, y en varios otros ejemplos en los que no hay disponible un isosquizómero indiferente a la metilación, es producir el ADN que se

restringirá en un dique o dcm ~ huésped de E. coli. De hecho, las cepas mutantes dobles dcm ~ dam ~ están disponibles para esta aplicación (Marinus

et al. 1983). (Consulte el Capítulo 7 para ver la participación de la metilación de presas en la escisión por Dpn I.)

-4 Se ha identificado un tipo adicional de endonucleasa de restricción de tipo II. Las enzimas de este tipo hacen rupturas en los dos filamentos a

distancias medidas a un lado de su secuencia objetivo asimétrica (por ejemplo, Hga I; ver Tabla 2.1). Finalmente, las enzimas de restricción tipo 2 se

han clasificado como aquellas que escinden el ADN en sitios bien definidos, requieren ATP y Mg, pero que tienen un requerimiento parcial de (es

decir, son estimuladas por) S-adenosilmetionina. En estos aspectos, tienen propiedades intermedias entre las enzimas tipo I y tipo ll (Tabla 2.2). La
amplia variedad de propiedades exhibidas por las endonucleasas de restricción descritas en los párrafos anteriores ha proporcionado un gran margen

para manipuladores genéticos ingeniosos y con recursos limitados. Esto será evidente a partir de ejemplos en los siguientes capítulos

¿Cuál es la función de las endonucleasas de restricción in vivo? Claramente, la restricción controlada por el huésped actúa como un mecanismo por el

cual las bacterias se distinguen de lo que no lo son. Es análogo a un sistema de inmunidad. ¡La restricción es moderadamente efectiva para prevenir la

infección de algunos! bacteriófagos Puede ser por esta razón que los fagos T-pares (T2, T4 y T6) han evolucionado con residuos de

hidroximetilcitosina glucosilada que reemplazan a la citosina en su ADN, lo que la hace resistente a muchas endonucleasas de restricción. La

restricción y modificación de la glucosilación del ADN del fago T-incluso está más allá del alcance de este libro. Para una discusión detallada, se

remite al lector a Kornberg (1980). Sin embargo, vale la pena señalar que hay disponible una cepa mutante de T4 que tiene residuos de citosina en su

ADN y, por lo tanto, es susceptible a la metodología de restricción convencional (Velten et al. 1976, Murray et al. 1979, Krisch & Selzer 1981). Como

alternativa a la estructura de ADN inusual de los fagos T-pares, otros mecanismos parecen haber evolucionado en T3 y T7 para superar la restricción

in vivo (Spoerel et al. 1979, Bandyopadhyay et al. 1985, Kruger et al. 1985). A pesar de esta evidencia, podemos estar equivocados al concluir que la

inmunidad a la infección por fagos es la única o principal función de todas las endonucleasas de restricción en la naturaleza.

La importancia de eliminar los sistemas de restricción en cepas de E. coli utilizadas como hospedantes para moléculas recombinantes

Si se introduce ADN extraño en un huésped de E. coli, puede ser atacado por sistemas de restricción activos en la célula huésped. Una característica
importante de estos sistemas es que el destino del ADN entrante en el huésped restrictivo depende no solo de la secuencia del ADN sino también de su
historial: la secuencia de ADN puede estar restringida o no, dependiendo de su fuente inmediatamente anterior a transformando la cepa huésped de E.
coli. Como hemos visto, las modificaciones posteriores a la replicación del ADN, generalmente en forma de metilación de residuos particulares de
adenina o citosina en la secuencia diana, protegen contra "sistemas de restricción asociados" pero no, en general, contra diferentes sistemas de
restricción. Tal es el caso con el sistema de restricción y modificación E. coli K ', donde la metilación de la secuencia 5'-AAC- (N 6) -GTGC3' o 5'-
GCAC- (N 6) -GTT3 'en el segundo o Las primeras adeninas protegen respectivamente contra la restricción K

Debido a que la restricción proporciona una defensa natural contra la invasión de ADN extraño, es habitual emplear una cepa de E. coli K12
deficiente en restricción de K como huésped en transformación con moléculas recombinantes recién creadas. Por lo tanto, donde, por ejemplo, el
ADN de mamíferos se ha ligado en un vector plasmídico, la transformación del huésped deficiente en restricción Eco K elimina la posibilidad de que
la secuencia entrante esté restringida, incluso si la secuencia de mamífero contiene un sitio objetivo Eco K. no modificado . Si el huésped resulta ser
deficiente en restricción Eco K pero competente en modificación Eco K, la propagación en el huésped conferirá metilación de modificación y, por lo
tanto, permitirá la propagación posterior del recombinante en cepas competentes en restricción Eco K, si se desea. Recientemente se ha descubierto
que Eco K no es la única restricción como la actividad en cepas de E. coli K12. Se han encontrado dos nuevas actividades en muchas cepas de
laboratorio de E. coli K12. En contraste con los ejemplos anteriores, los objetivos para la restricción de estas actividades son los ADN metilados. En
particular, el ADN que contiene 5-metilcitosina está restringido por estas cepas. La restricción se debe a dos sistemas genéticamente distintos, que
difieren en sus especificidades de secuencia y se denominan McrA y McrB (para restricción de citosina modificada) (Raleigh y Wilson 1986, Raleigh
et al. 1988). Se sabía desde hace muchos años que E. coli restringe el ADN con una modificación inusual de la citosina (5-hidroximetilación de
residuos de citosina, como en la restricción de fagos T-even sin glucosa, lo que confiere sensibilidad a los sistemas E. coli RglA y RgIB). La
restricción recién descubierta de ADN que contiene 5-metilcitosina, una modificación mucho más común, por los sistemas McrA y McrB está
controlada por los loci genéticos, mcrA y mcrB, que parecen ser los mismos que gobiernan la restricción de Rgi previamente conocida ( Raleigh y
otros, 1988).

El mejor estudiado de estos sistemas es McrB. Si el ADN se metila en la citosina de las secuencias de dinucleótidos 5'-GC 3 ', estará sujeto a
restricción por el sistema McrB, y el grado de restricción es función del número de sitios metilados. Muchas especies bacterianas contienen metilasas
que producen ADN que será un sustrato para McrB si ese ADN se transforma en una cepa McrB + E. coli. Las metilasas de modificación M. Pun 0
(C-A-G- m C-T-G) y M.Hac HI (G-G- m C-C) son ejemplos de tales metilasas. Por supuesto, las bacterias no son los únicos organismos que
contienen 5- metilcitosina en su ADN. En las plantas, hasta el 40-50% de todo el C puede estar metilado, incluida la mayoría de las secuencias C-G,
C-A-G y C-T-G. En los vertebrados, la cantidad total de metilación es menor (aproximadamente el 10% de todos los residuos de C en mamíferos), la
gran mayoría está en la secuencia de dinucleótidos C-G, y la metilación específica del tipo de célula parece estar involucrada en la regulación génica.
La metilación de C en el ADN de tales fuentes puede dar lugar a un dinucleótido de G-C metilado (por ejemplo, en mamíferos donde se produce la
secuencia Gm C-G) y, por lo tanto, hace que el ADN sea susceptible de restricción por la actividad de McrB. La actividad de McrA se entiende menos
actualmente, pero se sabe que restringe el ADN con la siguiente secuencia metilada, C-m CGG, como la producida por M.Hpa H. La importancia
principal de estos sistemas recientemente descubiertos, para el gen manipu Lator, es su posible influencia para conducir a la subrepresentación de
ciertas secuencias genómicas durante la creación de bibliotecas genómicas. Por lo tanto, es aconsejable usar para tal clonación una cepa huésped de E.
coli que no solo carece de los tres sistemas de restricción familiares (Eco K, Eco B y el sistema de Pl Fago específico de Pl fago) encontrados en
muchas cepas de laboratorio de E. coli, pero que también carece de los sistemas Mcr. La tabla 2.3 muestra las propiedades de restricción de algunas
cepas huésped comúnmente utilizadas. Tenga en cuenta que el patrón de metilación extraño se perderá tras la replicación del ADN clonado en E. coli,
de modo que después de la transformación crítica, los ADN clonados se pueden mover libremente a las cepas Mcr +

Cizallamiento mecánico del ADN Además de digerir el ADN con endonucleasas de restricción para producir fragmentos discretos, hay una variedad
de tratamientos que provocan roturas no específicas. Se pueden usar endonucleasas no específicas y degradación química, pero el único método que
se ha aplicado mucho a la manipulación de genes implica el corte mecánico. Los hilos largos y delgados que constituyen las moléculas de ADN
dúplex son lo suficientemente rígidos como para romperse muy fácilmente por las fuerzas de corte en solución. La sonicación intensa con ultrasonido
puede reducir la longitud a aproximadamente 300 pares de nucleótidos. Se puede lograr un cizallamiento más controlado mediante agitación a alta
velocidad en una licuadora. Típicamente, alto mol. El ADN se cizalla a una población de moléculas con un tamaño medio de aproximadamente 8 kb
pares agitando a 1500 rev / min durante 30 minutos (Wensink et al. 1974). La rotura ocurre esencialmente al azar con respecto a la secuencia de ADN.
Los términos consisten en regiones cortas de una sola cadena que deben tenerse en cuenta en los procedimientos de unión posteriores

UNIRSE A LAS MOLECULAS DE ADN. Habiendo descrito los métodos disponibles para cortar las moléculas de ADN, debemos considerar las
formas en que los fragmentos de ADN pueden unirse para crear moléculas recombinantes artificialmente. Actualmente hay tres métodos para unir
fragmentos de ADN in vitro. El primero de ellos aprovecha la capacidad de la ADN ligasa para unirse covalentemente a los extremos cohesivos
recocidos producidos por ciertas enzimas de restricción. El segundo depende de la capacidad de la ADN ligasa de E. coli infectada con fago T4 para
catalizar la formación de enlaces de fosfodiéster entre fragmentos de extremos romos. El tercero utiliza la desoxinucleotidiltransferasa terminal
enzimática para sintetizar colas homopoliméricas de 3 'de cadena sencilla en los extremos de los fragmentos. Ahora podemos ver estos tres métodos
un poco más profundamente.

La ADN ligasa E. coli y el fago T4 codifican una enzima, la ADN ligasa, que sella las hebras monocatenarias entre nucleótidos adyacentes en una
cadena de ADN dúplex (Olivera et al. 1968, Gumport y Lehman 1971). Aunque las reacciones catalizadas por las enzimas de E. coli y E. coli
infectada con T4 son muy similares, difieren en sus requisitos de cofactor. La enzima T4 requiere ATP, mientras que la enzima E. coli requiere NAD
+. En cada caso, el cofactor se divide y forma un complejo enzima-AMP. El complejo se une al nick, que debe exponer un grupo 5'-fosfato y 3'-OH, y
crea un enlace coviilente en la cadena de fosfodiéster como se muestra en la figura 2.4.

Cuando los términos creados por una endonucleasa de restricción que crea extremos cohesivos asociados, la articulación tiene muescas a unos pocos
pares de bases separadas en hilos opuestos. La ADN ligasa puede reparar estos cortes para formar un dúplex intacto. Esta reacción, realizada in vitro
con ADN ligasa purificada, es fundamental para muchos procedimientos de manipulación de genes, como el que se muestra en la figura 2.5. La
temperatura óptima para la ligadura del ADN cortado es de 37 ° C, pero a esta temperatura la unión unida por hidrógeno entre los extremos adhesivos
es inestable. Los términos generados por Eco R1 se asocian a través de solo cuatro pares de bases AT y estos no son suficientes para resistir la
interrupción térmica a una temperatura tan alta. La temperatura óptima para ligar los términos cohesivos es, por lo tanto, un compromiso entre la tasa
de acción enzimática y la asociación de los términos, y los experimentos han encontrado que están en el rango de 4-15 ° C (Dugaicyzk et al. 1975,
Ferretti & Sgaramella 1981). La reacción de ligadura se puede realizar para favorecer la formación de recombinantes. Los abetos pueden aumentar la
población de recombinantes realizando la reacción a una alta concentración de ADN; en soluciones diluidas, la circularización de fragmentos lineales
es relativamente favorecida "debido a la" frecuencia reducida de reacciones intermoleculares. En segundo lugar, tratando el ADN del vector
plasmídico linealizado con fosfatasa alcalina para eliminar los grupos fosfato 5'-terminales, tanto la recircularización como el dímero plasmídico

se previenen formaciones (Fig. 2.6). En este caso, la circularización del vector solo puede ocurrir mediante la inserción de ADN extraño no tratado
con fosfatasa que proporciona un fosfato 5'-terminal en cada unión. Una muesca en cada unión permanece sin ligar, pero después de la transformación
de la bacteria huésped, los mecanismos de reparación celular reconstituyen el dúplex intacto. Unir fragmentos de ADN con extremos cohesivos
mediante ADN ligasa es un proceso relativamente eficiente que se ha utilizado ampliamente para crear recombinantes artificiales. Una modificación
de este procedimiento depende de la capacidad de la ADN ligasa T4 para unir moléculas de ADN de extremos romos (Sgaramella 1972). La ADN
ligasa de E. coli no catalizará la ligadura roma, excepto en condiciones especiales de reacción de hacinamiento macromolecular (Zimmerman y
Pheiffer 1983). La ligadura roma se aplica más útilmente para unir fragmentos de extremos romos a través de moléculas enlazadoras; En un ejemplo
temprano de esto, Scheller et al. (1977) sintetizaron oligonucleótidos decaméricos autocomplementarios, que contienen sitios para una o más
endonucleasas de restricción. Una de esas moléculas se muestra en la figura 2.7. La molécula se puede ligar a ambos extremos del ADN extraño para
ser clonada, y luego tratarse con endonucleasa de restricción para Una modificación de este procedimiento depende de la capacidad de la ADN ligasa
T4 para unir moléculas de ADN de extremos romos (Sgaramella 1972). La ADN ligasa de E. coli no catalizará la ligadura roma, excepto en
condiciones especiales de reacción de hacinamiento macromolecular (Zimmerman y Pheiffer 1983). La ligadura roma se aplica más útilmente para
unir fragmentos de extremos romos a través de moléculas enlazadoras; En un ejemplo temprano de esto, Scheller et al. (1977) sintetizaron
oligonucleótidos decaméricos autocomplementarios, que contienen sitios para una o más endonucleasas de restricción. Una de esas moléculas se
muestra en la figura 2.7. La molécula se puede ligar a ambos extremos del ADN extraño que se va a clonar, y luego se puede tratar con endonucleasa
de restricción para producir un fragmento de extremo adhesivo que se puede incorporar en una molécula de vector que se ha cortado con la misma
endonucleasa de restricción. La inserción por medio del enlazador crea sitios objetivo de enzimas de restricción en cada extremo del ADN extraño y,
por lo tanto, permite que el ADN extraño se elimine y recupere después de la clonación y amplificación en la bacteria huésped

enlaces dobles

Se han derivado vectores plasmídicos que contienen un conjunto de sitios de clonación estrechamente agrupados. Un ejemplo de tal vector es pUC8,

que se describe con más detalle en la página 58. Este vector se ha utilizado para clonar moléculas de ADNc dúplex mediante el enfoque de doble

enlace (Kurtz y Nicodemus 1981, Helfman et al. 1983), en el que Se añaden diferentes moléculas de enlace a los extremos opuestos del ADNc (Fig.
2.8). Esto tiene las siguientes ventajas. 1 Se supera el problema de la redosificación de vectores sin inserción de ADN extraño. En parte por esta

razón, el método es eficiente, es decir, se han clonado ADNc que se derivaron de moléculas de ARNm raras en la población inicial

2 El uso de enlazadores, en lugar de homopolímeros, es deseable cuando se busca la expresión de un promotor vector-bome (véase el Capítulo 7). 3
La orientación del ADN insertado es fija.

Adaptadores Puede darse el caso de que la enzima de restricción utilizada para generar los extremos cohesivos en el conector también corte el ADN
extraño en los sitios internos. En esta situación, el ADN extraño se clonará como dos o más subfragmentos. Una solución a este problema es elegir
otra enzima de restricción, pero puede que no haya una elección adecuada si el ADN extraño es grande y tiene sitios para varias enzimas de
restricción. Otra solución es metilar los sitios de restricción interna con la modificación apropiada de metilasa. Un ejemplo de esto se describe en el
Capítulo 7. Alternativamente, las moléculas adaptadoras sintetizadas químicamente que tienen un extremo cohesivo preformado proporcionan una
solución general al problema (Wu et al. 1978). Considere un ADN extraño con extremos romos que contiene un sitio interno Bam HI (Fig. 2.9), que
debe clonarse en un vector Bam Hi-cut. La molécula adaptadora de Bam tiene un extremo romo, con un grupo 5'-fosfato, y un extremo cohesivo de
Bam que no está fosforilado. El adaptador se puede ligar a los extremos extraños del ADN, sin ningún riesgo de autopolimerización del adaptador. El
ADN extraño más los adaptadores añadidos se fosforilan en los extremos 5 'y se ligan al sitio Bam HI del vector. Si el ADN extraño se recuperara del
recombinante con Bam HI, se obtendría en dos fragmentos. Sin embargo, el adaptador está diseñado para contener otros dos sitios de restricción (Sma
I, Hpa II) que pueden permitir que el ADN extraño se recupere intacto

Colas de homopolímero

Un método general para unir moléculas de ADN hace uso del recocido de secuencias de homopolímero complementarias. Por lo tanto, al agregar

secuencias de oligo (dA) a los extremos 3 'de una población de moléculas de ADN, y bloques de oligo (dT) a los extremos 3' de otra población, los

dos tipos de molécula pueden hibridarse para formar círculos diméricos mixtos (Fig. 2.10). Una enzima purificada a partir de timo de ternero, la

desoxinucleotidil transferasa terminal, proporciona los medios por los cuales se pueden sintetizar las extensiones homopoliméricas, ya que si se

presenta con un solo trifosfato de desoxinucleótido, agregará repetidamente nucleótidos al término 3'-OH de una población de ADN moléculas

(Chang y Bollum 1971). El ADN con grupos 3'-OH expuestos, como el que surge del pretratamiento con fago X exonucleasa o la restricción con una

enzima como Pst I, es un sustrato muy bueno para la transferasa. Sin embargo, se han encontrado condiciones en las que la enzima se extenderá

incluso el 3'-OH blindado de los términos 5'-cohesivos generados por Eco RI (Roychoudhury et al. 1976, Humphries et al. 1978). Las reacciones de la

transferasa terminal se han caracterizado recientemente en detalle con respecto a su uso en la manipulación de genes (Deng y Wu 1981, Michelson y

Orkin 1982). Típicamente, se añaden 10-40 residuos homopoliméricos a cada extremo. En 1972, Jackson et al. estuvieron entre los primeros en

aplicar el método del homopolímero cuando construyeron un recombinante en el que se insertó un fragmento de ADN del fago X en el ADN SV40.

En sus experimentos, las brechas monocatenarias que permanecieron en las dos cadenas en cada unión se repararon in vitro con ADN polimerasa y

ADN ligasa para producir moléculas circulares cerradas covalentemente, que luego se usaron para transfectar células de mamíferos susceptibles (ver

Capítulo 13 ) Posteriormente, el método de homopolímero, que emplea homopolímeros dA.dT o dG.dC, se ha aplicado de forma extensa en la

construcción de plásmidos recombinantes para la clonación en E. coli. Comúnmente, los círculos recocidos se usan directamente para la

transformación con reparación de los huecos que ocurren in vivo. En el ejemplo que sigue veremos cómo se puede aplicar el seguimiento de

homopolímeros a la clonación de copias de ADN de ARN mensajero eucariota y cómo puede ser importante una cuidadosa elección de qué

homopolímeros se usan
Clonación de ADNc por colas de homopolímero

Si deseamos construir un clon que contenga secuencias derivadas de ARNm eucariota, primero debemos obtener la secuencia en forma de ADN.

Podemos hacer esto haciendo una copia complementaria (ADNc) del ARNm, usando la enzima transcriptasa inversa, que es un tipo de ADN

polimerasa que se encuentra en los retrovirus, y cuya función es sintetizar ADN sobre una plantilla de ARN.

Al igual que otras ADN polimerasas verdaderas, la transcriptasa inversa solo puede sincronizar el tamaño de una nueva cadena de ADN si se

proporciona un punto de crecimiento en forma de un cebador preexistente que se combina con la plantilla y tiene un grupo 3'-OH libre.

Afortunadamente, la mayoría de los ARNm eucariotas se producen naturalmente en una forma poliadenilada con hasta 200 residuos de adenilato en

sus 3 extremos y, por lo tanto, podemos proporcionar un cebador simplemente hibridando una molécula oligo (dT) corta con esta secuencia de poli

(A). El cebador se localiza entonces adecuadamente para la síntesis de un ADNc completo mediante transcriptasa inversa en presencia de los cuatro

desoxinucleósidos trifosfatos (Fig. 2.11). El producto inmediato de la reacción es un híbrido de ARN-ADN. La cadena de ARN puede destruirse luego

por hidrólisis alcalina, a la que el ADN es resistente, dejando un ADNc monocatenario que se puede convertir en la forma bicatenaria en una segunda

reacción de ADN polimerasa. Esta reacción depende de la observación de que los ADNc pueden formar una estructura de autocebado transitoria en la

que un bucle de horquilla en el extremo 3 'se estabiliza mediante un emparejamiento de bases suficiente para permitir el inicio de la síntesis de la

segunda cadena. Una vez iniciada, la síntesis posterior de la segunda cadena estabiliza la horquilla (Efstratiadis et al. 1976, Higuchi et al. 1976). La

horquilla y cualquier ADN monocatenario en el otro extremo de la molécula de ADNc se recortan luego mediante tratamiento con la nucleasa

específica de cadena sencilla SI, dando lugar a una molécula completamente dúplex

n nuestro ejemplo (Fig. 2.11), el ADNc dúplex se sigue con oligo (dC) y se recuece con el vector pBR322 que se ha abierto con Pst I y se sigue con

oligo (dG). Se verá que estos homopolímeros se han elegido para que los sitios objetivo de Pst I se reconstruyan en la molécula recombinante,

proporcionando así un medio simple para escindir las secuencias insertadas después de la amplificación (Smith et al. 1979). Esto se puede lograr de

otra manera, construyendo uniones dA.dT. En ese caso, las regiones homopoliméricas tendrán una temperatura de fusión más baja que el resto de la

molécula recombinante y, por lo tanto, en condiciones de desnaturalización parcial, la nucleasa SI puede escindir para liberar la secuencia insertada.

Clonación de ADNc de longitud completa En los dos esquemas de ADNc ilustrados en este capítulo, la síntesis de la segunda cadena se autoceba, lo

que da como resultado la formación de un ADNc dúplex con un bucle de horquilla que posteriormente se elimina mediante la nucleasa Si. Este paso
necesariamente conduce a la pérdida de una cierta cantidad de secuencia correspondiente a el extremo 5 'del ARNm, y a menos que la nucleasa SI sea

muy pura, puede

Daño accidental al cDNA dúplex. Por esta razón, autocebante

de síntesis de segunda cadena ahora rara vez se lleva a cabo; métodos mejorados

han sido desarrollados y se discuten en el Capítulo 7