Factorul de transcriere PAX6

 Introducere

Genele Paired box (Pax) codifică factori de transcriere care conțin un domeniu de legare la
ADN înalt conservat, numit domeniu pereche (PD), considerat principalul reglator al expresiei
genice și care sunt implicați în controlul proceselor complexe care au loc în timpul dezvoltării
embrionare (Blake și Ziman, 2014). Unul dintre acești factori este factorul transcripțional PAX6
(la om)/ Pax6 (la șoarece), acesta fiind esențial pentru dezvoltarea țesuturilor (ochi, nas, sistem
nervos central și glande endocrine) ale vertebratelor și nevertebratelor. Factorul de transcriere
PAX6 a fost izolat pentru prima data de la oameni, șoarece și peștele zebra și ulterior din alte
vertebrate și nevertebrate, inclusiv Drosophila melanogaster (Simpson și Price, 2002).
Identificarea proteinei eyeless de la Drosophila ca omolog al PAX6 cu expresie în dezvoltarea
ochiului a condus la propunerea unei funcții conservate în mod evolutiv a proteinei PAX6.
Cercetarea a căpătat amploare în momentul descoperirii faptului că supraexprimarea regional-
specifică a genei eyeless și Pax6 de la șoarece induce formarea ochilor ectopici la nivelul unor
părți multiple din corpul musculiței precum antene, picioare și aripi. Ulterior, studiile au arătat că
genomul musculiței de oțet conține 4 gene Pax6-like: eyeless (ey), twin of eyeless (toy), eye gone
(eyg) și twin of eye gone (toe) (Cvekl și Callaerts, 2017).
În general, cercetările cu referire la factorul de transcriere PAX6 au avut în atenție rolul
major al acestuia de a regla expresia altor gene în timpul dezvoltării ochiului, sugerându-se astfel
că un rol ancestral al PAX6 a fost acela de a genera o structură sensibilă la lumină. Totuși, există
și cazuri în care PAX6 nu este necesar pentru dezvoltarea unor structuri, precum în regenerarea
ochiului planariei (vierme platelmint) sau în dezvoltarea progenitorilor retinieni la șoarece
(Simpson and Price, 2002). Pax6 este exprimat de asemenea în sistemul nervos central (CNS),
sistemul olfactiv și pancreas, unde joacă un rol extrem de important. It regulates the expression of
a broad range of molecules, including transcription factors, cell adhesion and short-range cell–cell
signalling molecules, hormones and structural proteins. It has been implicated in a number of key
biological processes including cell proliferation, migration, adhesion and signalling both in normal
development and in oncogenesis. The mechanisms by which Pax6 regulates its downstream targets
likely involve the use of different splice variants and interactions with multiple proteins, allowing
it to generate different effects in different cells (Simpson and Price, 2002).
Mutația genei care codifică proteina PAX6 la om determină o tulburare numită aniridia, în
care pacienții manifestă anormalități oculare precum hipoplazie, cataractă, displazie foveală,
hipoplazia nervului optic și nistagmus. La șoarece, mutația genei Pax6 determină un fenotip analog
cu aniridia la om, numit “small eye”. La Drosophila, mutația genei eyeless determină fenotipuri
analoage cu cele prezentate anterior la om și șoarece și supraexprimarea genei ey în embrionii de
Xenopus conduce la dezvoltarea ochilor cu structura celor de la vertebrate (Simpson and Price,
2002).

 Clasificare (Wingender și colab., 2013)

Superclasa 3: Superclasa factorilor de transcriere cu domenii HTH (helix-turn-helix)

3.1. Clasa factorilor cu homeodomeniu
3.2. Clasa factorilor de transcriere Pax (Paired box)
3.2.1. Familia factorilor de transcriere Pax care conțin homeodomeniu
3.2.1.1. Subfamilia Pax-3/7
3.2.1.2. Subfamilia Pax-4/6
3.2.1.2.1. Pax-4
3.2.1.2.2. Pax-6 – 3 izoforme: izoforma 1, izoforma 3 și
izoforma 5a

De asemenea, factorii de transcriere PAX se pot clasifica în funcție de structura

proteinei (Blake și Ziman, 2014):
  Structura factorului transcriptional PAX6 (Žílová, 2016).

Gena Pax6 are o lungime de 28 kb și conține 16 exoni care pot să producă câteva produse genice.

Figure 7. Structure of Pax6 gene and Pax6 protein. (A) Structure of mouse Pax6 gene. Exons are indicated by colored
boxes with numbers; transcription start sites are indicated with arrows; regulatory sequences are indicated by gray
boxes stained with letters (a-o). (B) Schematic structure of the transcription factor Pax6. Two DNA binding domains;
the bipartite paired domain (PD) and the paired-type homeodomain (HD) are indicated with red and violet color,
respectively. C-terminal prolin-serin-threonin (PST) domain is indicated with blue color. Phosphorylation sites within
PST domain involved in transactivation properties of Pax6 are indicated with arrowheads. The numbers represent
amino acid positions within the canonical Pax6 protein. (C) DNA specificity of the PD. The bipartite PD recognizes a
bipartite consensus (P6CON) with PAI and RED recognition sequences. Adapted from Shaham et al., 2012.

La mamifere, proteina Pax6 conține 422 de aminoacizi (aa) având 2 domenii înalt
conservate de legare la ADN: domeniul pereche bipartit (format din 2 părți) (notat PD – paired
domain) care se găsește la capătul N-terminal și homeodomeniul paired-like (HD).
PD (codificat de exonii 4-7) este format din 128 aa și este prezent la toate proteinele PAX.
Acesta este împărțit în 2 subdomenii, PAI și RED. Ambele subdomenii sunt reprezentate de 3
structuri α helix cu formarea a 2 motive de legare la ADN helix-turn-helix (HTH). PD recunoaște
un situs de legare bipartit format din aproximativ 17 nucleotide denumit P6CON și se leagă la
ADN ca monomer. Specificitatea domeniului PD este dependentă de existența a 3 aa (izoleucina
59, glutamina 61 și asparagina 64) localizați în subdomeniul PAI.
Homeodomeniul (HD) – codificat de exonii 8-10 – este format din 61 aa și se leagă ca
homo sau heterodimer la o secvență palidrom ATTA. La fel ca PD, HD este reprezentat de 3
structuri α helix cu motive HTH. Acesta este situat spre capătul C-terminal.
Regiunea C-terminală a proteinei Pax6 este bogată în prolină-serină-treonină (PST) și este
implicată în prorietățile de transactivare a transcripției ale Pax6. Regiunea PST prezintă câteva
situsuri de fosforilare și s-a demonstrat că este fosforilat de MAPKs P38 și Erk2 și de către Hipk2
(homeodomain-interacting protein kinase 2). Fosforilarea resturilor specifice este necesară pentru
transactivarea transcripțională mediată de Pax6 care se realizează prin recrutarea diferiților co-
activatori la enhancer prin interacții proteină-proteină. Înafară de regiune PST, domeniile PD și
HD s-au demonstrat a fi implicate în interacțiile proteină-proteină.
Pax6 este cunoscut că acționează ca activator transcripțional, dar, au fost descoperite și
situații în care acesta inhibă expersia câtorva gene. Pax6 inhibă expresia unor gene ale cristalinului
și expresia Crx în retină. Deși mecanismul exact nu este cunoscut, se presupune că inhibiția este
mediată prin competiția pentru ocuparea promotorului (Žílová, 2016).
HTH HTH HTH

PAI RED HD PST

Capăt
N-terminal Capăt
C-terminal

Paired domain Homeodomeniu

(PD)

Structura factorului transcripțional PAX6

 Modul de legare la ADN a FT PAX6 și interacția cu ADN

PAX6 recunoaște moleculele de ADN printr-o varietate de mecanisme moleculare activate

de domeniile PD și HD și splicing alternativ. Activitatea de legare a domeniului PD a fost arătată
pentru prima data în cadrul proteinei Prd (Drosophila Paird), urmate de studii ale domeniului PD
de la proteina Pax5 de la șoarece, care au stabilit rolul important al structurii bipartite a domeniilor
PD și corespondența lor cu secvențele de legare. Mecanismele de legare a proteinlor PAX6 a fost
studiat mai mult de 20 de ani și a rezultat identificarea unor secvențe similare de legare la ADN.
Folosind SELEX, a fost derivat un situs de legare optim pentru domeniul PD al Pax6 (P6CON).
Aceste rezultate au confirmat situsul de legare bipartit și au arătat că domeniul PD este format din
2 subdomenii independente, numite N- terminal (PAI) și C-terminal (RED). Modelul curent de
legare a Pax6 la ADN arată că aceasta se realizează atât cu ajutorul domeniului PD, cât și HD
(Cvekl și Callaerts, 2017).

Most recently, the unbiased identification of the “optimal” in vivo Pax6 binding sites
emerged from genome-wide Pax6 ChIP-seq studies of forebrain and lens chromatin (Sun et al.
2015). The sequences identified from over 7,000 “peaks” (see also section 4.1) are comparable
with P6CON with most notable differences in nucleotides 4 and 14 of the binding site (Fig. 2B).
Similar to the previous study (Xie and Cvekl 2011), a small portion (< 10%) of binding sites
possesses both PD and HD sequences (Sun et al. 2015). Another subtype of Pax6 binding sites
involves sequences with adjacent Pax6 and Sox2 sequences (Kamachi et al. 2001; Narasimhan et
al. 2015), originally identified in the chicken d1-crystallin enhancer (Kamachi et al. 2001).
Taken together, in vitro and in vivo studies of Pax6-binding to DNA converged to highly
comparable sets of recognition sequences (Cvekl și Callaerts, 2017).

Biochemical and crystallographic studies have shown that the paired domain actually
consists of independent amino-terminal and carboxy-terminal subdomains (hereafter referred to as
the ‘N subdomain’ and the ‘C subdomain’). However, for other paired domains, genetic and
biochemical evidence shows that the C subdomain has important functions and can make DNA
contacts. This domain is well conserved among Pax6 homologs, and a missense mutation in the C
subdomain of human Pax6 results in foveal hypoplasia (Azuma et al. 1996). To better understand
paired domain–DNA interactions and the function of the C subdomain in particular, we have
determined the 2.5-Å resolution crystal structure of a complex containing the human Pax6 paired
domain with its optimal DNA-binding site. This cocrystal structure reveals specific DNA contacts
made by the N subdomain, the extended linker, and the C subdomain.
The Pax6 paired domain was crystallized with a 26-bp DNA duplex containing the optimal
Pax6 binding site.
The Pax6 paired domain, like the Prd paired domain (Xu et al. 1995), contains two globular
subdomains (Fig. 2) linked by an extended polypeptide chain (residues 61–76). The N subdomain
(residues 1–60) contains a short b motif (an antiparallel b hairpin, followed by a type II b turn) and
also includes three a helices that fold like a homeodomain. The C subdomain (77–133) contains
three a helices with a related homeodomain-like fold. There are no protein–protein contacts
between the N and C subdomains. Sequence comparisons show that the N subdomain is relatively
well conserved among Pax proteins, and this
part of the Pax6 structure is very similar to Prd. The first few residues of the N subdomain form a
b hairpin that spans the minor groove of the DNA and contacts the sugar phosphate backbone of
both DNA strands. This b hairpin is followed by a b turn (residues 13–16) that makes important
base contacts in the minor groove. The b hairpin and b turn pack against the subsequent helical
portion of this subdomain, which contains three a helices (helices 1–3 of the paired domain,
residues 20–60, Fig. 2A,B). This N subdomain uses a helix–turn–helix (HTH) unit to dock against
the major groove at one end of the binding site. The extended linker, which contains residues 61–
76 and connects the two subdomains, binds in the minor groove near the center of the site. The
linker makes numerous contacts with the sugar phosphate backbone and the DNA bases over an
8-bp region.
The C subdomain contains three a helices (helices 4, 5, and 6 of the paired domain, Fig.
2A,B) and uses a HTH motif to dock against the major groove in the distal portion of the Pax6
binding site. Helix 6 (the ‘recognition helix’ of the C subdomain) fits directly into the major
groove. Docking of this subdomain also is stabilized by the phosphate contacts from the amino-
terminal portion of helix 5 and from the carboxy-terminal portion of the linker. Helixurile 5
(resturile 95-106) și 6 (resturile 116-133) formează o unitate HTH și contactele cu bazele ADN
sunt mediate de portiunea amino-terminală a helixului 6. Contactele realizate de acest helix se
realizează între diverse resturi de aminoacizi și diverse baze azotate din structura moleculei de
ADN. De asemenea, subdomeniul C al Pax6 realizează contacte cu resturile fosfat de pe ambele
părți ale fosei majore din structura ADN.
The Pax6 binding site has a relatively standard B-DNA conformation in the crystals, and
the DNA duplexes stack to form a pseudocontinuous helix. However, there are significant local
deformations where the b turn and the linker bind in the minor groove. Although the C subdomain
is involved in recognizing the extended intact site, it appears that the N subdomain plays a
dominant role in DNA binding of the intact paired domain. The binding site for the N subdomain
shows a clear consensus sequence, the crystal structure shows more contacts in this region, and
the isolated N subdomain still binds DNA strongly.
The Pax6 linker that connects the N and C subdomains is well ordered (unlike the corresponding
region of the Prd complex) and makes extensive base contacts in the minor groove. Selections
show that binding site sequence is well conserved in this region, and minor groove contacts from
the linker explain the recognition specificity. However, compared with these amino- and carboxy-
terminal arms, the Pax6 linker is much better ordered and makes more numerous DNA contacts.
Having the linker tethered on both sides by the N and C subdomains may help stabilize the overall
structure of the linker region, and protein–protein interactions between the ends of the linker and
the adjacent subdomains also presumably constrain the linker conformation and enhance
specificity.
Paired domains can bind DNA cooperatively by interacting with other DNA-binding
domains such as the homeodomain. Like Pax3, Pax4, and Pax7 proteins, the intact Pax6 protein
contains a paired-type homeodomain, which is located about 80 residues downstream of the paired
domain. Although further data are needed to clarify the respective roles of these domains in gene
regulation, some sites are cooperatively recognized by the paired domain and the homeodomain.
For example, DNA binding to the adhesion molecule L1 promoter requires both the Pax6 paired
domain and homeodomain, and footprinting experiments reveal that the homeodomain protects
the DNA immediately adjacent to the binding site for the Pax6 N subdomain.
 Modeling of the homeodomain and the Pax6 paired domain with this spacing shows that
the homeodomain and the Pax6 amino-terminal HTH unit can both dock in the major groove,
contacting opposite sides of the double helix. The first b turn and the loop between helices 2 and
3 of the paired domain are closest to the homeodomain, which has an amino-terminal arm reaching
the paired domain from the minor groove (Xu et al., 1999).

Alfa helix – red

Structura beta pliata – magenta2
Structuri turn – white
 Structuri coil – yellow2
Coloring method – secondary structure pt proteina
Drawing method – new cartoon pt proteina
Material – opaque
Pt acid nucleic – coloring method segname, drawing method new cartoon, material
translucent
Imagini obtinute cu VMD (paired domain).

Homedomeniul se leagă la un motiv de tipul TAAT din ADN (Birrane et al., 2009).

HD residues Gln1, Arg2, Arg3, Arg5, Thr6, Tyr25, Pro26, Arg31, Glu42, Arg44, Val47,
Trp48, Ser50, Asn51, Arg53, and Arg57 mediate the interactions with DNA (Figure 3A). The N-
terminal arm of the HD inserts into the minor groove and forms base-specific interactions with the
DNA. Importantly, the Oγ atom of Ser50 makes a direct hydrogen bond to the N7 atom of G6′ and
a water-mediated hydrogen bond to the N6 atom of A7′ (Figure 3A,C), thereby providing the
structural basis for selection of the sequence CG 3′ to the TAAT core by the PAX3 HD dimer.
Illustration of the bend imposed on the palindromic DNA region due to protein binding. The bend
angle was calculated using CURVES (41) (Birrane și colab., 2009).

All PAX proteins contain a transactivation domain and

a DNA-binding domain known as the paired domain (PD). The
PD consists ofPAI and RED subdomains, each of which is
composed of three helices in ahelix-turn-helix motif. Some
PAX family members also contain an additionalDNA-binding
homeodomain and/or an octapeptide region (Blake and Ziman,
2014).
  Interacția cu alți factori de transcriere

PAX6 reglează expresia a numeroase molecule, incluzând factori de transcriere, molecule

de adeziune celulară și de semnalizare celulară, hormoni și proteine structurale. Acest factor de
transcriere este implicat într-un număr mare de procese biologice cheie, precum proliferarea
celulară, migrarea, adeziune și semnalizarea atât în dezvoltarea normală, cât și în oncogeneză.
Majoritatea factorilor de transcriere implicați în dezvoltarea structurilor de la nivel ocular
se află sub reglarea PAX6.
Gena sine oculis (so) de la Drosophila este reglată direct de proteina eyeless (omoloagă
proteinei PAX6) printr-un element reglator localizat într-un intron al genei so.
Factorul transcriptional Six3, un membru al familiei sine oculis este de asemenea
exprimat în dezvoltarea ochiului la vertebrate și se află sub controlul direct al proteinei omoloagă
cu PAX6 de la Xenopus și Mus. Un alt factor de transcriere implicat în dezvoltarea ochiului care
se află sub controlul PAX6 este Maf, un membru al familiei de oncogene v-Maf, care joacă un
rol important în diferențierea celulară a câtorva țesuturi. În urma studiilor realizate in vitro, s-a
constat că expresia Maf este puternic activate de Pax6. Ambii factori de transcriere se exprimă la
nivel ocular în regiunea în care celulele epiteliale
Pax6 controlează de asemenea factorii de transcriere cu motive bazice HTH, Mash1,
Math5 și Neurogenina2 prin legarea direct la secvențele promotorilor și enhencerilor acestora
(determinare și diferențiere a celulelor).
Prox1, un membru al familiei de factori transcripționali cu homeodomeniu Prospero este
direct reglat de către PAX6 în dezvoltarea ochiului.
Pax6 își autoreglează expresia.
În dezvoltarea ochiului, Pax6 interacționează cu un alt membru al clasei PAX și anume
PAX2 (Simpson and Price, 2002).
La nivelul pancreasului interacționează cu factori de transcriere precum Arx și Foxa2, doi
factori transcripționali necesari pentru dezvoltarea celulelor α.
  Rolul PAX6 în diferențierea și funcționarea celulelor α pancreatice
FT PAX6 este foarte important pentru dezvoltarea și funcționarea celulelor endocrine și
joacă un rol essential în homeostazia glucozei. Mutațiile genei PAX6 sunt associate cu fenotipul
diabetic.
Diabetul tip 2 este o tulburare comună caracterizată de rezistența la insulină și deficiența
în insulină, hiperglucagonemie, iar dereglarea secreției glucagonului reflectă disfuncția ambelor
tipuri de celule ale pancreasului endocrin (celulele alfa – glucagon și celulele beta – insulina).
S-a demonstrat faptul că disfuncția celulelor alfa pancreatice contribuie la menținerea
hiperglicemiei în diabetul de tip 2, complementar cu disfuncția celulelor beta. În diferențierea
celulelor alfa și funcționarea acestora sunt implicați numeroși determinanți, roluri cheie având
factorii de transcriere PAX6, Arx și Foxa2. Acest fapt a fost demonstrat prin analize realizate pe
șoareci cu mutații homozigote ale genelor ce codifică acești factori transcripționali și care au arătat
absența sau un număr foarte redus de celule alfa pancreatice. Pax6 este prezent timpuriu în
dezvoltarea embrionară a pancreasului la șoarece în mugurii dorsal și ventral și este limitat în
celulele endocrine în timpul dezvoltării și la maturitate.
Factorul Pax6 reglează direct sau indirect transcrierea genelor care codifică proglucagonul,
PC2, MafB, cMaf și NeuroD1/Beta1, aceste proteine fiind esențiale pentru dezvoltarea și
diferențierea celulelor alfa, dar și pentru biosinteza glucagonului.
Rolul Pax6 în reglarea directă a transcrierii genelor ce codifică MafB, cMaf și
NeuroD1/Beta2 în celulele producătoare de glucagon, dar și rolul acestuia în diferențierea celulelor
alfa ale pancreasului au fost demonstrate în cadrul unui studiu realizat pe un model deficient în
Pax6 în celulele alfa primare de șobolan. Ulterior, studiul a fost extins pe linii celulare
producătoare de glucagon.
În cadrul acestui studiu, au fost identificate genele țintă ale Pax6. În acest sens, s-a folosit
un ARN de interferență direcționat împotriva ARNm ce conținea informația genetică pentru
sinteza Pax6, iar ulterior s-a măsurat nivelul de expresie al genelor cheie implicate în diferențierea
și funcționarea celulelor alfa prin real time PCR. A fost analizat nivelul de ARNm pentru
Glucagon, Arx, Brain4 și MafB (markeri specifici pentru celulele alfa diferențiate) și Isl1, cMaf,
NeuroD1/Beta2, Nkx2.2, Sox4, Foxa1 și Foxa2 (implicați în diferențierea și dezvoltarea celulelor
alfa și expresia genei pentru glucagon) și PC2 (prohormon convertaza 2) care este responsabilă
pentru procesarea proglucagonului în celulele alfa pancreatice. S-au înregistrat scăderi
semnificative în exprimarea ARNm pentru glucagon, PC2, MafB, cMaf și NeuroD1/Beta2, ceea
ce indică faptul că ultimele 3 pot fi țintă ale Pax6. În plus, eliminarea parțială a Pax6 a fost însoțită
de o descreștere cu 50% a conținului de glucagon, ceea ce a demonstrat rolul crucial exercitat de
Pax6 asupra biosintezei glucagonului în celulele alfa primare (Figura 2). Toate aceste date indică
faptul că Pax6 controlează nivelurile de ARNm ale genelor cheie din celulele alfa pancreatice
adulte implicate în transcrierea genei glucagonului (MafB, cMaf și NeuroD1/Beta2) sau în
biosinteza glucagonului (PC2) în plus față de controlul său direct asupra genei glucagonului.
Pentru a demonstra efectul Pax6 asupra transcrierii genelor pentru MafB, cMaf și
NeuroD1/Beta2 a fost eliminat parțial factorul Pax6 într-o linie de clule producătoare de glucagon
numită αTC1.9. Rezultatele au arătat faptul că deficiența în Pax6 conduce la scăderea expresiei
genelor pentru glucagon, PC2, MafB, cMaf și NeuroD1/Beta2 (Fig 3C), în timp ce nivelul ARNm
pentru celelalte gene nu a fost afectat.
În cadrul acestui studio s-a demonstrat că Pax6 reglează direct transcrierea genelor MafB,
cMaf și NeuroD1/Beta2 în celulele producătoare de glucagon, ceea ce arată rolul important al Pax6
în diferențierea și funcționarea celulelor alfa pancreatice. Reglarea directă a acestor gene se
realizează prin activarea regiunilor promotor ale acestora. De asemenea, datele au indicat și faptul
că Pax6 afectează direct exprisa genei glucagonului și indirect prin reglarea genelor codificatoare
pentru MafB, cMaf și NeuroD1/Beta2 care sunt implicate la rândul lor în transcriere genei
glucagonului.
In conclusion, we have demonstrated that Pax6 acts as a crucial transcription factor in _
cell differentiation and function through the control of glucagon biosynthesis. We propose that
Pax6 activates directly and indirectly Proglucagon gene transcription through the control of
MafB/cMaf and NeuroD1/Beta2 (Fig. 9) (Gosmain și colab., 2010).
Birrane, G., Soni, A., and Ladias, J.A.A. (2009). Structural Basis for DNA Recognition by the
Human PAX3 Homeodomain †,‡. 1148–1155.
Blake, J.A., and Ziman, M.R. (2014). Pax genes: Regulators of lineage specification and
progenitor cell maintenance. Dev. 141, 737–751.
Cvekl, A., and Callaerts, P. (2017). PAX6: 25th anniversary and more to learn. Exp. Eye Res.
156, 10–21.
Eric Xu, H., Rould, M.A., Xu, W., Epstein, J.A., Maas, R.L., and Pabo, C.O. (1999). Crystal
structure of the human Pax6 paired domain-DNA complex reveals specific roles for the linker
region and carboxy-terminal subdomain in DNA binding. Genes Dev. 13, 1263–1275.
Gosmain, Y., Marthinet, E., Cheyssac, C., Guérardel, A., Mamin, A., Katz, L.S., Bouzakri, K.,
and Philippe, J. (2010). Pax6 controls the expression of critical genes involved in pancreatic α
cell differentiation and function. J. Biol. Chem. 285, 33381–33393.
Ian Simpson, T., and Price, D.J. (2002). Pax6; a pleiotropic player in development. BioEssays
24, 1041–1051.