KAJIAN ANTIDIABETOGENIK EKSTRAK DAUN SIRIH

MERAH (Piper crocatum) IN VITRO

MUHAMMAD ALFARABI
G851080051

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kajian Antidiabetogenik Ekstrak

Daun Sirih Merah (Piper crocatum) In Vitro adalah karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, 18 Februari 2010

Muhammad Alfarabi
NIM G851080051
 ABSTRACT
MUHAMMAD ALFARABI. Study on Antidiabetogenic of The Leaf Extract of
Piper crocatum (Sirih merah) In Vitro. Under direction of MARIA BINTANG
and SURYANI.

Diabetes mellitus can be caused by the existence of free radical which

attacks membrane lipid of pancreatic cells. Previous research showed that the
extract of Piper crocatum leaf has an activity as antidiabetic and antioxidant.
However, there is no scientific reports about the mechanism of Piper crocatum as
antidiabetogenic. The main goal of this research is to elucidate the mechanism of
Piper crocatum as antidiabetogenic by acting as antioxidant and inhibitor of α-
glucosidase. This study used ethanol 70% as an eluent to extract Piper crocatum
leaf, followed by testing antioxidant activity of the extract and testing its ability to
inhibit α-glucosidase. Extract compounds detected by GC-MS. The results of this
study was extract of Piper crocatum leaf has an antidiabetogenic activity through
as antioxidants, which inhibited the oxidation of fatty acids and radical scavenger
as well as a competitive inhibitor of the α-glucosidase. Antioxidative activity
extract of Piper crocatum leaf could inhibit the oxidation of fatty acids 80.40%
(200 ppm) and radical scavenger (IC50 = 85.82 ppm). Inhibition activity of α-
glucosidase could inhibit 39.62% (1% b/v). Compounds in extract of Piper
crocatum leaf were groups of fatty acids, terpenoids, flavonoids, steroids,
alkaloids, pyrimidine, essential oils, polyphenols, and vitamin E.

Keyword: antidiabetogenic, antioxidant, inhibitor α-glucosidase, Piper crocatum

 RINGKASAN
MUHAMMAD ALFARABI. Kajian Antidiabetogenik Ekstrak Daun Sirih Merah
(Piper crocatum) In Vitro. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan SURYANI.

Pola hidup masyarakat yang tidak sehat menyebabkan masuknya senyawa-

senyawa xenobiotik ke dalam tubuh sehingga menyebabkan terjadinya berbagai
penyakit. Senyawa-senyawa xenobiotik tersebut dapat berupa logam berat atau
senyawa radikal bebas. Salah satu penyakit tersebut adalah diabetes mellitus yang
terjadi akibat beberapa proses xenobiotik yang merusak sel beta pankreas
sehingga menyebabkan terganggunya proses metabolisme. Karakteristik diabetes
mellitus adalah terjadinya hiperglikemia, yaitu tingginya kadar glukosa di dalam
darah akibat kurangnya sekresi insulin, menurunnya aktivitas insulin, atau
keduanya. Indonesia menempati urutan ke empat di dunia dalam jumlah penderita
diabetes mellitus. Oleh karena itu, diabetes mellitus merupakan suatu penyakit
yang sangat serius bagi masyarakat Indonesia.
Hiperglikemia kronis pada diabetes dapat menghasilkan senyawa radikal
bebas akibat terjadinya autooksidasi glukosa sehingga menyebabkan kerusakan
sel dan jaringan pada tubuh termasuk sel beta pankreas. Radikal bebas yang
terbentuk akan mengoksidasi serta merusak senyawa lipid, protein, dan
menurunkan aktivitas enzim. Banyaknya senyawa radikal bebas di dalam tubuh
dapat menimbulkan berbagai macam penyakit lainnya sehingga terjadi komplikasi
penyakit pada penderita diabetes Saat ini, selain menggunakan insulin dan obat-
obat sintetik, masyarakat di Indonesia melakukan pengobatan alternatif dengan
menggunakan tumbuhan-tumbuhan yang berkhasiat sebagai antihiperglikemia dan
antioksidan untuk menurunkan peningkatan kadar peroksidasi lipid pada penderita
diabetes mellitus. Salah satu tumbuhan yang memiliki kedua khasiat tersebut
adalah sirih merah. Secara ilmiah, daun sirih merah mengandung senyawa bioaktif
flavonoid, tanin, dan alkaloid serta memiliki aktivitas antihiperglikemia. Selain
itu, air rebusan daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidan. Berdasarkan data
penelitian ilmiah tersebut perlu dikaji lebih lanjut mengenai mekanisme sirih
merah sebagai antihiperglikemia, apakah karena sifat antioksidasinya atau sebagai
inhibitor α-glukosidase, yaitu enzim yang berperan dalam penyerapan glukosa di
usus sehingga kadar glukosa di dalam darah dapat diturunkan.
Penelitian ini dilakukan dengan menguji aktivitas antioksidasi ekstrak etanol
70% daun sirih merah (metode TBA dan DPPH) dan daya inhibisi terhadap α-
glukosidase serta komponen ekstrak dianalisis dengan GC-MS. Hasil penelitian
ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% daun sirih merah memiliki aktivitas
sebagai antidiabetogenik. Proses antidiabetogenik ini melalui aktivitas
antioksidasi, yaitu menghambat oksidasi asam lemak dan radical scavenger serta
sebagai inhibitor competitive α-glukosidase. Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol
70% daun sirih merah dapat berperan sebagai penghambat oksidasi asam lemak
dengan daya hambat terbesar 80.40% dan sebagai radical scavenger dengan nilai
IC50 85.82 ppm. Aktivitas inhibisi terhadap α-glukosidase mempunyai daya
hambat terbesar 39.62% dengan jenis inhibisi competitive. Oleh karena itu, daun
sirih merah berpotensi mengurangi kadar senyawa radikal bebas dan oksidasi lipid
serta kadar gula darah bagi penderita diabetes mellitus. Komponen senyawa yang
terkandung pada ekstrak etanol 70% daun sirih merah adalah golongan asam
lemak, terpenoid, flavonoid, steroid, alkaloid, pirimidin, minyak atsiri, polifenol,
dan vitamin E. Senyawa yang diperkirakan memiliki aktivitas antidiabetogenik
adalah polifenol, alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan vitamin E.

Kata kunci: antidiabetogenik, antioksidan, inhibitor α-glukosidase, sirih merah

 © Hak Cipta milik IPB, tahun 2010
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa

mencantumkan atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau
tinjauan suatu masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya
tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
KAJIAN ANTIDIABETOGENIK EKSTRAK DAUN SIRIH
MERAH (Piper crocatum) IN VITRO

MUHAMMAD ALFARABI

Tesis
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
Judul Tesis : Kajian Antidiabetogenik Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper
crocatum) In Vitro
Nama : Muhammad Alfarabi
NIM : G851080051

Disetujui

Komisi Pembimbing

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S Dr. Suryani, S.P, M.Sc
Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana

Biokimia

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S

Tanggal Ujian: 18 Februari 2010 Tanggal Lulus:

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
 PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat
dan karunia Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tak lupa penulis
panjatkan shalawat serta salam bagi teladan penulis Nabi Muhammad SAW.
Karya ilmiah berjudul Kajian Antidiabetogenik Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper
crocatum) In Vitro disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan mulai bulan
Juli 2009 hingga November 2009 di Laboratorium Biokimia Departemen
Biokimia dan Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Prof. Dr. drh. Maria
Bintang, MS dan Dr. Suryani, SP, M.Sc yang telah memberikan bimbingan dan
saran selama berlangsungnya penelitian dan dalam penyusunan karya ilmiah.
Terima kasih juga penulis ucapkan kepada orang tua, adik, Mega Safithri S.Si,
M.Si, dan Tyas yang telah memberi dukungan materi, non materi, dan doa kepada
penulis dalam penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih
penulis tujukan kepada Waras, Dimas, Rangga, Nophe, Olga, staf laboratorium
Pusat Studi Biofarmaka dan laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia,
FMIPA IPB atas kerja samanya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Februari 2010

Muhammad Alfarabi
 RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 4 Juni 1986 dari ayah MZ Iqbal
Moenaf dan ibu Dewi R. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara.
Tahun 2004 penulis terdaftar sebagai mahasiswa pada program sarjana mayor
Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB dan
menamatkannya pada tahun 2008. Kesempatan untuk melanjutkan program
pascasarjana S2 pada program studi yang sama diperoleh pada tahun 2008.
 DAFTAR ISI

Halaman
DAFTAR GAMBAR ...............................................................................................x
DAFTAR TABEL ....................................................................................................x
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... xi
PENDAHULUAN ...................................................................................................1
TINJAUAN PUSTAKA
Sirih Merah ..........................................................................................................4
Diabetes mellitus .................................................................................................5
Radikal Bebas ......................................................................................................7
Antioksidan .........................................................................................................8
Inhibitor enzim α-glukosidase .............................................................................9
Analisis Aktivitas Antioksidasi dan Inhibisi Enzim α-glukosidase ..................11
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ..................................................................................................13
Metode penelitian ..............................................................................................14
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi daun sirih merah ................................................................................18
Aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah (metode TBA) .......................19
Aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah (metode DPPH) .....................24
Inhibisi dan kinetika inhibisi enzim α-glukosidase ...........................................27
Analisis komponen senyawa ekstrak etanol 70% daun sirih merah ..................29
SIMPULAN DAN SARAN ...................................................................................31
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................32
LAMPIRAN ...........................................................................................................36
 DAFTAR GAMBAR

Halaman
1 Tanaman sirih merah (Piper crocatum) ................................................................4
2 Beberapa senyawa antioksidan eksogen ...............................................................8
3 Grafik Lineweaver-Burk .....................................................................................10
4 Kurva kadar MDA terhadap waktu .....................................................................19
5 Kadar MDA ekstrak etanol 70% daun sirih merah .............................................20
6 Mekanisme reaksi pembentukkan MDA .............................................................22
7 Pembentukkan senyawa kompleks MDA-TBA ..................................................23
8 Kadar p-nitrofenol ekstrak etanol 70% daun sirih merah dan grafik jenis inhibisi
ekstrak etanol 70% daun sirih merah ..................................................................28

DAFTAR TABEL

Halaman
1 Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah dan vitamin E
metode DPPH ......................................................................................................25
2 Komponen senyawa ekstrak etanol 70% daun sirih merah .................................30
 DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
1 Tahapan umum penelitian ...................................................................................37
2 Ekstraksi daun sirih merah ..................................................................................37
3 Analisis ekstrak etanol 70% daun sirih merah dengan GC-MS ..........................38
4 Penentuan waktu inkubasi maksimum asam linoleat ..........................................38
5 Analisis aktivitas antioksidasi metode TBA .......................................................39
6 Analisis aktivitas antioksidasi metode DPPH .....................................................39
7 Analisis inhibisi enzim α-glukosidase.................................................................40
8 Analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase ...................................................40
9 Rendemen hasil ekstraksi daun sirih merah dengan etanol 70% ........................41
10 Absorban inkubasi kadar MDA (µM) terhadap waktu (λ = 532 nm) ...............41
11 Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah metode TBA .......42
12 Absorban kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) ...........................42
13 Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah metode DPPH ....43
14 Aktivitas antioksidasi α-tokoferol (vitamin E) metode DPPH..........................44
15 Inhibisi ekstrak etanol 70% daun sirih merah terhadap enzim α-glukosidase ..45
16 Hasil kurva standar p-nitrofenol........................................................................45
17 Hasil analisis kinetika inhibisi ekstrak etanol 70% daun sirih merah terhadap
enzim α-glukosidase ..........................................................................................46
18 Hasil analisis GC-MS........................................................................................47
19 Analisa statistika data aktivitas antioksidasi dan inhibisi enzim ......................49
20 Dokumentasi hasil penelitian ............................................................................51
 PENDAHULUAN

Pola hidup masyarakat yang tidak sehat menyebabkan masuknya senyawa-

senyawa xenobiotik ke dalam tubuh sehingga menyebabkan terjadinya berbagai
penyakit. Senyawa-senyawa xenobiotik tersebut dapat berupa logam berat atau
senyawa radikal bebas. Salah satu penyakit tersebut adalah diabetes mellitus yang
terjadi akibat beberapa proses xenobiotik yang merusak sel beta pankreas
sehingga menyebabkan terganggunya proses metabolisme. Karakteristik diabetes
mellitus adalah terjadinya hiperglikemia, yaitu tingginya kadar glukosa di dalam
darah akibat kurangnya sekresi insulin, menurunnya aktivitas insulin, atau
keduanya (The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes
Mellitus 2003). Diabetes mellitus merupakan salah satu penyakit yang banyak
diderita di dunia. Terdapat 171 juta kasus diabetes mellitus di dunia dan
diperkirakan pada tahun 2030 akan menjadi 366 juta kasus (Wild 2004). Indonesia
menempati urutan ke empat di dunia dalam jumlah penderita diabetes mellitus.
Oleh karena itu, diabetes mellitus merupakan suatu penyakit yang sangat serius
bagi masyarakat Indonesia.
Hiperglikemia kronis pada diabetes dapat menghasilkan senyawa radikal
bebas akibat terjadinya autooksidasi glukosa sehingga menyebabkan kerusakan
sel dan jaringan pada tubuh termasuk sel beta pankreas (Dobretsov et al. 2007).
Radikal bebas yang terbentuk akan mengoksidasi serta merusak senyawa lipid,
protein, dan menurunkan aktivitas enzim (Murray 2003). Banyaknya senyawa
radikal bebas di dalam tubuh dapat menimbulkan berbagai macam penyakit
lainnya sehingga terjadi komplikasi penyakit pada penderita diabetes (Maritim et
al. 2003). Kasus yang banyak terjadi adalah penderita diabetes mellitus disertai
dengan peningkatan kadar peroksidasi lipid. Salah satu hasil penelitian
menunjukkan bahwa dari 38 penderita diabetes mellitus terjadi peningkatan kadar
peroksidasi lipid dari orang normal (Memisogullari et al. 2003). Oleh karena itu
diperlukan pengobatan yang dapat mengurangi keadaan hiperglikemia dan
mencegah terjadinya komplikasi penyakit akibat meningkatnya peroksidasi lipid.
Pengobatan tersebut dapat dilakukan dengan pemberian insulin atau obat-obat
yang bersifat hipoglikemia dengan cara mengurangi distribusi glukosa ke dalam
darah. Namun saat ini, selain menggunakan insulin dan obat-obat sintetik,
masyarakat di Indonesia melakukan pengobatan alternatif dengan menggunakan
tumbuhan-tumbuhan yang berkhasiat sebagai antihiperglikemia dan antioksidan
untuk menurunkan peningkatan kadar lipid peroksida pada penderita diabetes
mellitus. Salah satu tumbuhan yang memiliki kedua khasiat tersebut adalah sirih
merah.
Sirih merah (Piper crocatum) merupakan jenis sirih yang merambat dan
banyak tumbuh di daerah tropis khususnya Indonesia. Sirih jenis ini sebelumnya
terkenal sebagai tanaman hias, kemudian berubah menjadi tanaman obat sejak
diperkenalkan oleh produsen obat di Bulnyahrejo (Duryatmo 2005). Kegunaannya
di masyarakat selain antiseptik, daun sirih merah dapat digunakan untuk
mengobati diabetes mellitus, maag, tekanan darah tinggi, asam urat, batu ginjal,
dan ambeien dengan cara memakan daunnya (Sudewo 2005). Secara ilmiah, daun
sirih merah mengandung senyawa bioaktif flavonoid, tanin, dan alkaloid serta
memiliki aktivitas antihiperglikemia (Safithri & Fahma 2005). Selain itu, air
rebusan daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidasi (Alfarabi 2008). Oleh
karena itu, sirih merah ini merupakan tumbuhan yang berkhasiat obat multifungsi
bagi penderita diabetes mellitus. Selain dapat sebagai antihiperglikemia, daun
sirih merah dapat mengurangi kadar peroksida lipid bagi penderita diabetes
mellitus yang mengalami peningkatan kadar peroksidasi lipid akibat autooksidasi
glukosa. Berdasarkan data penelitian ilmiah tersebut perlu dikaji lebih lanjut
mengenai mekanisme sirih merah sebagai antihiperglikemia, apakah karena sifat
antioksidasinya sehingga dapat mengurangi efek radikal bebas yang terbentuk
pada penderita diabetes mellitus atau sebagai inhibitor enzim α-glukosidase, yaitu
enzim yang berperan dalam penyerapan glukosa di usus sehingga kadar glukosa di
dalam darah dapat diturunkan.
Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji daun sirih merah sebagai
antidiabetogenik secara in vitro. Mekanisme tersebut dapat melalui reaksi
antioksidasi, sebagai inhibitor enzim α-glukosidase, atau keduanya. Hipotesis
penelitian ini adalah ekstrak daun sirih merah dapat berperan sebagai
antidiabetogenik melalui reaksi antioksidasi dan inhibisi enzim α-glukosidase
secara in vitro. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah
mengenai aktivitas antidiabetogenik daun sirih merah secara in vitro. Informasi ini
dapat dijadikan dasar pengembangan produk fitofarmaka sirih merah sebagai
antihiperglikemia bagi penderita diabetes mellitus.
 TINJAUAN PUSTAKA

Sirih Merah (Piper crocatum)

Tumbuhan sirih dikenal sebagai antiseptik sejak 600 SM. Sirih termasuk
famili Piperaceae yang merambat dan bersandar di batang pohon lain (Duryatmo
2005). Salah satu jenis sirih adalah sirih merah. Klasifikasi ilmiah dari sirih merah
ini adalah kingdom Plantae, subkingdom Tracheobionta, super divisi
Spermatophyta, divisi Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, subkelas
Magnoliidae, bangsa Piperales, suku Piperaceae, genus Piper, spesies Piper
crocatum. Sirih merah tumbuh menjalar seperti sirih hijau, batangnya bersulur dan
beruas dengan jarak buku 5-10 cm dengan setiap buku tumbuh bakal akar.
Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi
rata, mengkilap atau tidak berbulu, dan mempunyai warna yang khas yaitu
permukaan atas hijau gelap berpadu dengan tulang daun dan bagian bawah daun
berwarna merah hati keunguan, daun berasa pahit, berlendir, serta mempunyai bau
tidak khas seperti sirih.
Sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak terlalu
banyak kena sinar matahari. Jika terlalu sering kena sinar matahari maka warna
merah daunnya bisa menjadi pudar, buram, kurang menarik dan batangnya cepat
mengering. Sirih merah akan tumbuh baik jika mendapatkan 60-75% cahaya
matahari sehingga tempat tumbuh yang paling cocok untuk sirih merah adalah
lingkungan berhawa dingin (Gambar 1).

Gambar 1 Sirih merah

 Sirih merah (Piper crocatum) merupakan salah satu jenis sirih yang banyak
dimanfaatkan sebagai tanaman hias pada tahun 1900-an namun sekarang
mengalami perubahan fungsi menjadi tanaman obat sejak dikenalkan oleh
Bambang Sudewo, seorang produsen tanaman obat di Bulnyahrejo (Duryatmo
2005). Daun sirih merah ini dapat digunakan untuk mengobati diabetes mellitus,
maag, tekanan darah tinggi, asam urat, batu ginjal, dan ambeien. Selain itu sirih
merah dapat digunakan secara bersama dengan tanaman obat lainnya untuk
mengobati penyakit (Sudewo 2005). Secara ilmiah, air rebusan daun sirih merah
dengan dosis pemberian 20 g/kg bobot badan dapat berfungsi sebagai
antihiperglikemia (Safithri & Fahma 2005), tidak memiliki efek toksik (Salim
2006), dapat memperbaiki pankreas terhadap tikus hiperglikemia (Permata 2006),
dan memiliki potensi sebagai hepatoprotektor (Windyagiri 2006). Selain itu, air
rebusan daun sirih merah mempunyai aktivitas antioksidasi dalam menghambat
oksidasi asam lemak (Alfarabi 2008).

Diabetes Mellitus
Beberapa proses metabolisme di dalam tubuh akibat adanya senyawa-
senyawa xenobiotik yang dapat berupa senyawa logam berat atau radikal bebas
dapat menimbulkan berbagai macam penyakit. Salah satu penyakit tersebut adalah
diabetes mellitus. Penyakit ini biasa disebut dengan penyakit kencing manis
karena memiliki karakteristik tingginya kadar glukosa darah dan adanya glukosa
di dalam air seni (Purwakusumah 2003). Keadaan hiperglikemia dapat terjadi
karena kurangnya sekresi insulin, menurunnya aktivitas insulin, atau keduanya.
Hiperglikemia kronis dalam jangka waktu lama akan menyebabkan komplikasi
penyakit lain seperti tidak berfungsinya organ mata, ginjal, dan jantung (The
Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus 2003).
Secara etiologi diabetes mellitus dibagi menjadi empat kelompok, yaitu
diabetes mellitus tipe 1, tipe 2, tipe spesifik akibat kelainan genetik, dan akibat
kehamilan. Namun yang banyak diderita adalah diabetes mellitus tipe 1 dan tipe 2.
Diabetes mellitus tipe 1 merupakan penyakit diabetes mellitus yang tergantung
dengan insulin. Tipe ini sangat tergantung dengan insulin dari luar tubuh untuk
menurunkan kadar glukosa darah karena sel-β pankreas penderita tidak memiliki
kemampuan untuk memproduksi insulin. Peristiwa ini terjadi akibat rusaknya sel-
β pankreas akibat proses autoimun tubuh atau serangan virus. Diabetes mellitus
tipe 2 merupakan penyakit diabetes mellitus yang tidak tergantung dengan insulin.
Penyakit jenis ini diasumsikan bahwa penderita mampu memproduksi insulin
tetapi kerja insulin tidak maksimal (The Expert Committee on the Diagnosis and
Classification of Diabetes Mellitus 2003). Kerja insulin ini dapat diganggu dengan
terjadinya stress oksidatif sehingga terbentuk radikal bebas di dalam tubuh.
Radikal bebas tersebut akan mengganggu kerja insulin sehingga insulin tidak
maksimal menurunkan kadar glukosa darah (Ceriello 2000).
Keadaan hiperglikemia akan memproduksi banyaknya radikal bebas
(Ceriello 2003). Hiperglikemia kronis pada diabetes dapat juga menyebabkan
autooksidasi glukosa (Dobretsov et al. 2007). Banyaknya terbentuk senyawa
radikal bebas akan meningkatkan stress oksidatif dan banyak merusak senyawa-
senyawa makromolekul lainnya seperti lipid dan protein. Kerusakan
makromolekul tersebut akan menyebabkan penurunan fungsi kerja organ sehingga
terjadi penyakit lainnya seperti kebutaan, gagal ginjal, dan aterosklerosis (Maritim
et al. 2003). Oleh karena itu, usaha untuk menjaga tidak terjadinya komplikasi
penyakit pada penderita diabetes mellitus sangat penting. Usaha tersebut selain
menggunakan obat yang bersifat hipoglikemik, dapat juga dengan mengkonsumsi
tumbuhan berkhasiat antidiabetes. Penggunaan herbal Cina yang terdiri dari Radix
Astragali (akar dari Astragalus membranaceus yang dikeringkan) dan Radix
Rehmanniae (rhizoma dari Rehmania glutinosa yang dikeringkan) mempunyai
efek antidiabetes (Lau 2009). Penggunaan senyawa kuarsetin (flavonoid) dari
daun Annona squamosa juga memiliki efek antidiabetes pada tikus yang
menderita diabetes mellitus (Panda & Kar 2007). Selain itu, senyawa pycnogenol
(flavonoid) dari ekstrak Pinus maritima mempunyai efek antidiabetes dan mampu
menurunkan stress oksidatif tikus yang menderita diabetes mellitus, sehingga
senyawa tersebut dapat menghambat terjadinya komplikasi penyakit pada
penderita diabetes mellitus (Jankyova et al. 2009).
 Radikal Bebas
Radikal bebas adalah molekul yang kehilangan elektron sehingga molekul
tersebut tidak stabil dan sangat reaktif berusaha mengambil elektron dari molekul
atau sel lain (Betteridge 2000). Radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh
seperti hasil oksidasi enzimatik, fagositosis dalam respirasi, transpor elektron di
mitokondria, atau oksidasi ion-ion logam transisi. Selain itu, radikal bebas dapat
berasal dari luar tubuh seperti asap rokok, asap kendaraan bermotor, hasil
penyinaran sinar ultra violet, bahan kimia dalam makanan, dan polutan lainnya
(Murray 2003).
Contoh akibat adanya radikal bebas dari luar tubuh adalah terkenanya
lapisan kulit oleh sinar UV. Peristiwa ini bila terjadi dalam jangka waktu lama
akan membentuk lapisan atau titik hitam pada kulit akibat rusaknya lapisan kulit
yang terdiri dari senyawa lipid dan protein (Nakayama et al. 2003). Beberapa
contoh lain kerusakan di dalam tubuh yang dapat timbul akibat radikal bebas dari
luar tubuh adalah kerusakan protein, DNA, peroksidasi lipid, kerusakan membran
sel. Kerusakan tersebut menyebabkan penyakit yang bersifat kronis, yaitu
dibutuhkan waktu untuk penyakit tersebut menjadi nyata (terjadi akumulasi dalam
tubuh). Radikal bebas yang biasa terdapat di dalam tubuh dan dapat merusak
berasal dari turunan oksigen reaktif. Contoh oksigen reaktif ini mencakup
superoksida (O2`), hidroksil (`OH), peroksil (ROO`), hidrogen peroksida (H2O2),
singlet oksigen (O`), oksida nitrit (NO`), peroksinitrit (ONOO`) dan asam
hipoklorit (HOCl) (Murray 2003).
Radikal bebas, baik dari dalam maupun luar tubuh terjadi melalui tahap-
tahap mekanisme reaksi dan menimbulkan reaksi berantai sehingga radikal bebas
yang terbentuk semakin banyak. Tahap pertama adalah pembentukan awal radikal
bebas (inisiasi), lalu perambatan atau terbentuknya radikal baru (propagasi), dan
tahap terakhir (terminasi), yaitu pemusnahan atau pengubahan menjadi radikal
bebas stabil dan tak reaktif. Mekanisme reaksinya dapat dituliskan sebagai berikut
(Hart et al. 2003):
Inisiasi
RH + OH R* + H2O
Propagasi
R* + O2 ROO-
ROO- + RH ROOH + R*
Terminasi
ROO- + ROO- ROOR + O2
ROO- + R* ROOR
R* + R* RR

Antioksidan
Antioksidan adalah senyawa yang dapat menetralisir radikal bebas dan
mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas terhadap sel normal,
protein, dan lemak dengan cara melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki
radikal bebas sehingga senyawa radikal bebas tersebut stabil dan menghambat
terjadinya reaksi berantai dari pembentukkan radikal bebas. Berdasarkan cara
kerjanya, antioksidan terbagi menjadi dua bagian, yaitu antioksidan pelindung
merupakan antioksidan yang mereduksi rantai inisiasi radikal bebas, kemudian
yang kedua antioksidan pemutus rantai propagasi radikal bebas. Selain itu,
berdasarkan sumbernya, antioksidan terbagi menjadi antioksidan dari dalam tubuh
(endogen) dan dari luar tubuh (eksogen). Antioksidan endogen contohnya seperti
superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutation peroksidase (GSH.Prx).
Enzim-enzim ini bekerja menetralkan senyawa-senyawa radikal bebas hasil
metabolisme tubuh atau radikal bebas dari luar tubuh. Antioksidan eksogen
contohnya berupa vitamin dan senyawa bioaktif dari tumbuhan, seperti α-
tokoferol (vitamin E), beta karoten (vitamin A), dan asam askorbat (vitamin C)
(Murray 2003) (Gambar 2).

Flavonoid

Gambar 2 Beberapa senyawa antioksidan eksogen (Murray 2003, Hans & Heldt
2005)
 Secara umum, senyawa bioaktif dari tumbuhan yang memiliki aktivitas
antioksidasi merupakan golongan flavonoid (Harborne & William 2000). Namun
selain flavonoid, golongan tanin dan alkaloid juga mempunyai aktivitas
antioksidasi. Senyawa-senyawa tersebut banyak terdapat di sayuran dan buah
(Hans & Heldt 2005). Oleh karena itu, mengkonsumsi buah dan sayuran yang
cukup akan membantu kerja tubuh untuk menurunkan kadar senyawa-senyawa
radikal bebas. Bagi penderita diabetes mellitus, hal tersebut akan menurunkan
tingkat peroksidasi lipid, karena terdapat banyak kasus diabetes mellitus yang
terjadi peningkatan lipid peroksida (Kalaivanam et al. 2006). Penelitian dengan
menggunakan kuarsetin (flavonoid) dari daun Annona squamosa memiliki efek
antioksidasi dengan menurunkan kadar lipid peroksida pada tikus yang menderita
diabetes mellitus (Panda & Kar 2007). Selain itu, senyawa polifenol dari Citrus
sinensis mampu menurunkan kadar lipid peroksida (Parmar & Kar 2007).

Inhibitor α-glukosidase
Senyawa yang dapat menghambat kerja katalisis enzim disebut dengan
inhibitor. Senyawa ini merupakan bagian dari modulator enzim yang memberikan
efek negatif terhadap kerja katalisis enzim. Terdapat dua jenis inhibitor, yaitu
yang bersifat reversible dan irreversible. Inhibisi reversible merupakan jenis
inhibisi enzim yang tidak merusak gugus fungsi dari enzim tersebut, hanya
menghambat proses katalisis. Jenis inihibisi reversibel dibagi menjadi tiga jenis,
yaitu competitive, noncompetitive, dan uncompetitive. Inhibisi competitive
merupakan proses inhibisi dengan senyawa inhibitor yang mempunyai tempat
ikatan yang sama dengan tempat ikatan substrat pada enzim. Jenis inhibisi ini
dapat dikurangi dengan menambah jumlah substrat dibandingkan jumlah inhibitor
karena jenis inhibisi ini bersifat kompetisi antara substrat dengan inhibitor. Jenis
yang kedua adalah noncompetitive, merupakan proses inhibisi dengan senyawa
inhibitor yang mempunyai tempat ikatan yang berbeda dengan tempat ikatan
substrat pada enzim. Jenis inhibisi ini dapat terjadi walaupun enzim telah
berikatan dengan substrat karena tidak bersifat kompetisi. Jenis yang terakhir
adalah uncompetitive, yaitu jenis inhibisi yang dapat terjadi bila suatu enzim telah
berikatan dengan substrat. Ketiga macam jenis inihibisi reversible ini dapat
diketahui bila reaksi enzim dengan dan tanpa inhibitor diplotkan ke grafik
Lineweaver-Burk (Gambar 3). Jenis inhibisi kedua adalah inhibisi irreversible.
Jenis inhibisi ini merupakan inhibisi yang dapat merusak struktur atau gugus
fungsi dari enzim sehingga enzim tersebut menjadi tidak aktif. Mekanisme
inhibisi ini merupakan mekanisme yang dimiliki oleh obat-obat tertentu seperti
obat kanker (Stryer 2000). Proses inhibisi ini dapat membantu penderita diabetes
mellitus untuk mengurangi kadar gula darah yang tinggi dengan cara menghambat
kerja enzim yang berperan membantu penyerapan karbohidrat, yaitu enzim α-
glukosidase.
α-glukosidase (EC 3.2.1.20) merupakan enzim dari golongan hidrolase.
Enzim ini berfungsi mengkatalisis reaksi akhir dari proses penyerapan karbohidrat
di usus. Enzim ini mengkatalisis hidrolisis ikatan α-1,4 sehingga menghasilkan α-
D-glukosa (Stuart et al. 2004). Terhambatnya kerja enzim α-glukosidase
menyebabkan berkurangnya glukosa yang diserap oleh usus sehingga
berkurangnya sumber glukosa yang masuk ke dalam aliran darah. Peristiwa ini
mampu membantu menurunkan keadaan hiperglikemia sehingga penderita
diabetes dapat mengatur kadar glukosa darahnya. Saat ini banyak obat-obat yang
dibuat untuk menghambat (inhibitor) kerja α-glukosidase. Beberapa obat inhibitor
enzim α-glukosidase dapat ditemukan dengan mudah seperti, acarbose, miglitol,
dan voglibose. Namun, saat sekarang banyak penelitian yang telah melaporkan
bahwa banyak ekstrak tumbuhan yang berkhasiat sebagai inhibitor α-glukosidase.
Salah satu penelitian melaporkan bahwa asam triterpen yang diisolaasi dari daun

(a) (b) (c)

Gambar 3 Grafik Lineweaver-Burk: (a) inhibisi competitive, (b) noncompetitive,

(c) uncompetitive (Illanes A 2008)
Lagerstroemia speciosa mampu sebagai inhibitor α-glukosidase (Wenli et al.
2009). Selain itu, beberapa ekstrak tumbuhan asal Meksiko yang mengandung
kaempferol seperti Cecropia obtusifolia, Equisetum myriochaetum, Acosmium
panamense, dan Malmea depressa dapat menghambat kerja α-glukosidase secara
in vitro dan in vivo (Cetto et al. 2008).

Analisis Aktivitas Antioksidasi dan Inhibisi α-glukosidase

Analisis aktivitas antioksidasi yang dilakukan dalam percobaan ini
menggunakan dua metode, yaitu metode DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazyl)
dan TBA (thiobarbituric acid). Kedua metode ini digunakan karena dapat
menunjukkan aktivitas dari ekstrak daun sirih merah sebagai penangkap senyawa
radikal bebas dan penghambat terjadinya peroksidasi lipid. Prinsip metode DPPH
adalah menguji kemampuan penangkapan senyawa radikal bebas (DPPH) oleh
senyawa ekstrak daun sirih merah (Aqil et al. 2006), kemudian prinsip metode
TBA adalah untuk menguji kemampuan ekstrak daun sirih merah menghambat
proses terjadinya peroksidasi lipid (Kikuzaki & Nakatani 1993). Adanya aktivitas
antioksidasi dengan cara menangkap senyawa radikal bebas pada ekstrak daun
sirih merah ini dapat mencegah radikal bebas dari dalam dan luar tubuh untuk
mengganggu proses metabolisme tubuh sehingga dapat mengurangi kemungkinan
terjadinya penyakit diabetes mellitus. Selain itu, kemampuan ekstrak daun sirih
merah menghambat terjadinya proses lipid peroksida dapat membantu penderita
diabetes mellitus kronis yang terjadi komplikasi dengan meningkatnya kadar lipid
peroksida di dalam tubuh. Selain itu, penggunaan konsentrasi yang sama untuk
kedua metode tersebut adalah untuk mempermudah melihat aktivitas ekstrak daun
sirih merah sebagai penangkap senyawa radikal bebas dan penghambat proses
peroksidasi lipid. Penggunaan α-tokoferol (vitamin E) dalam metode ini bertujuan
sebagai pembanding karena α-tokoferol telah diketahui merupakan senyawa
antioksidan (Linder 2006). Konsentrasi yang digunakan adalah 200 ppm
berdasarkan jumlah maksimum dalam makanan yang diperbolehkan dalam
peraturan Uni Eropa (Pokorny et al. 2001).
Selain aktivitas antioksidasi, ekstrak daun sirih merah dianalisis aktivitasnya
sebagai inhibitor α-glukosidase. Terhambatnya kerja enzim ini akan membantu
mengurangi penyerapan glukosa oleh usus sehingga tingginya kadar glukosa
darah pada penderita diabetes mellitus dapat diturunkan. Senyawa pembanding
menggunakan acarbose, yaitu senyawa aktif dari obat diabetes mellitus yang
berperan sebagai inhibitor α-glukosidase dengan konsentrasi 1% b/v (Suteja L
2003).
 BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat ekstrak daun sirih merah
adalah daun sirih merah 25 gram dan etanol 100 mL. Bahan-bahan untuk analisis
aktivitas antioksidasi metode DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazyl) adalah
larutan DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazyl) (Sigma Aldrich), metanol, dan α-
tokoferol (vitamin E) (Sigma Aldrich). Bahan-bahan untuk penentuan waktu
inkubasi asam linoleat, analisis aktivitas antioksidasi, dan pembuatan kurva
standar metode TBA adalah buffer fosfat 0,1 M pH 7, asam linoleat 50 mM
(Sigma Aldrich), etanol absolut, α-tokoferol (vitamin E) (Sigma Aldrich), TCA
(trichloroacetic acid) 20%, TBA (tiobarbituric acid) 1% (Sigma Aldrich), asam
asetat 50%, dan TMP (1,1,3,3-tetrametoksipropana) (Sigma Aldrich). Bahan-
bahan untuk analisis inhibisi dan kinetika inhibisi enzim α-glukosidase adalah
enzim α-glukosidase (Sigma Aldrich), 0,1 M buffer fosfat pH 7, DMSO, 0,02 M
p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida (Sigma Aldrich), 0,2 M Na2CO3, dan acarbose.
Bahan-bahan untuk analisis komponen senyawa ekstrak etanol 70% daun sirih
merah adalah larutan pendukung perangkat GC-MS (Gas Chromatography Mass
Spectro).
Alat-alat yang digunakan untuk membuat ekstrak daun sirih merah adalah
labu Erlenmeyer, rotavapor, lemari pendingin, dan freeze dryer. Alat-alat untuk
analisis aktivitas antioksidasi metode DPPH adalah autopipet, tabung reaksi, gelas
ukur, batang pengaduk, labu Erlenmeyer, sudip, corong, botol gelap, vortex,
kuvet, dan spektrofotometer (Hitachi U-2800). Alat-alat penentuan waktu
inkubasi asam linoleat, analisis aktivitas antioksidasi, dan pembuatan kurva
standar metode TBA adalah autopipet, tabung reaksi, penangas air, gelas ukur,
batang pengaduk, labu Erlenmeyer, sudip, pemanas, termometer, neraca analitik,
gelas piala, botol gelap, vortex, kuvet, spektrofotometer (Genesys 10 UV 190-
1100 nm), sentrifus (Hettich Universal Sentrifuse, 0-6000 rpm), dan tabung
sentrifus. Alat-alat untuk analisis inhibitor enzim α-glukosidase adalah autopipet,
tabung reaksi, pemanas, gelas ukur, batang pengaduk, labu Erlenmeyer, sudip,
termometer, neraca analitik, gelas piala, vortex, kuvet, dan spektrofotometer. Alat-
alat untuk analisis komponen senyawa ekstrak etanol 70% daun sirih merah
adalah kolom, detektor, dan perangkat pendukung GC-MS (Agilent 6890N).

Metode Penelitian

Ekstraksi Daun Sirih Merah Cara Maserasi (Harborne 1987)

Daun sirih merah sebanyak 25 g diekstrak dengan 100 mL etanol 70% dan
dimaserasi pada suhu ruang selama 24 jam. Selanjutnya disaring menggunakan
kertas saring, kemudian dipekatkan dengan rotavapor pada suhu 50 °C sehingga
diperoleh ekstrak kasar. Ekstrak kasar tersebut dikeringkan dengan freeze dryer
dengan suhu – 50 °C dan tekanan 8 mBar. Rendemen dihitung dengan rumus
sebagai berikut:
Rendemen (%) = bobot ekstrak x 100%
bobot daun

Analisis Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Daun Sirih Merah dengan Metode

TBA (thiobarbituric acid) (Kikuzaki & Nakatani 1993)
Penentuan waktu inkubasi asam linoleat ditentukan dengan menggunakan 6
mL buffer fosfat 0,1 M pH 7, kemudian ditambah 6 mL asam linoleat 50 mM
dalam etanol 99,8%, dan 3 mL air bebas ion dicampurkan. Sebanyak 1 mL
campuran ditempatkan di botol gelap kemudian campuran diinkubasi pada suhu
40 °C. Pengukuran intensitas serapannya dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL
campuran asam linoleat yang telah diinkubasi ditambahkan 2 mL larutan TCA
20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi
diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah dingin larutan
disentrifus dengan kecepatan 15,5 g selama 15 menit. Kemudian panjang
gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Pengukuran dilakukan
setiap hari hingga tercapai serapan maksimum. Larutan blanko digunakan 1 mL
campuran 3 mL etanol 99.8 % dan 2 mL buffer fosfat 0,1 M pH 7.0, kemudian
ditambahkan 2 mL TCA 20 % dan 2 mL TBA 1 % dalam asetat 50 %. Larutan
blanko tersebut diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah
dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 15,5 g selama 15 menit.
 Analisis antioksidasi ekstrak daun sirih merah sebagai larutan sampel dibuat
dalam konsentrasi 25, 50, 75, 100, dan 200 ppm. Masing-masing sampel diambil
sebanyak 1 mL kemudian ditambahkan 2 mL bufer fosfat 0,1 M pH 7 dan 2 mL
asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%. Larutan kontrol positif digunakan 1 mL
α-tokoferol, 2 mL bufer fosfat 0,1 M pH 7 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam
etanol 99,8%, sedangkan larutan kontrol negatif ditambahkan 1 mL air bebas ion,
2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol
99.8%.
Semua larutan ini kemudian dimasukkan dalam botol gelap dan diinkubasi di
penangas 40°C selama waktu inkubasi optimum dari metode TBA. Pada hari
waktu inkubasi optimum, dilakukan pengukuran MDA (malondialdehida) melalui
metode TBA dengan mengambil 1 mL dari setiap larutan, kemudian ditambahkan
2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%.
Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah
dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 15,5 g selama 15 menit. Kemudian
panjang gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Larutan blanko
digunakan 1 mL campuran 3 mL etanol 99,8 % dan 2 mL buffer fosfat 0,1 M pH
7, kemudian ditambahkan 2 mL TCA 20 % dan 2 mL TBA 1 % dalam asetat 50
%. Larutan blanko tersebut diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10
menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 15,5 g selama 15
menit. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan menggunakan larutan 1,1,3,3-
tetrametoksipropana (TMP) dengan konsentrasi 1, 2.5, 5, 7.5, dan 10 µM. Tiap
larutan dipipet 1 mL dan ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan
TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air
100°C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 15,5
g selama 15 menit. Serapannya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Larutan
blanko menggunakan 1 mL akuades yang diberi perlakuan seperti larutan
konsentrasi TMP lainnya (konsentrasi 0 TMP). Persentase daya hambat ekstrak
dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
% daya hambat = [MDA] kontrol negatif – [MDA] ekstrak x 100%
[MDA] kontrol negatif
Analisis Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Daun Sirih Merah dengan Metode
DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazyl) (Aqil et al. 2006)
Penentuan aktivitas antioksidasi dengan metode DPPH menggunakan 2 mL
ekstrak 70% daun sirih merah dengan berbagai konsentrasi (25, 50, 75, 100, 200
ppm). Ekstrak tersebut dicampurkan dengan 0,1 mM DPPH 2 mL (larutan DPPH
di dalam metanol). Larutan kontrol adalah 2 mL larutan DPPH dicampurkan
dengan 2 mL metanol. Selanjutnya diinkkubasi pada suhu ruang selama 30 menit.
Reduksi dari sejumlah konsentrasi DPPH dihitung serapannya dengan panjang
gelombang 517 nm. Senyawa α-tokoferol dengan berbagai konsentrasi (1, 2.5, 5,
7.5, 10 ppm)digunakan sebagai pembanding. Persentase daya hambat dapat
dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
% daya hambat = absorban kontrol – absorban ekstrak x 100%
absorban kontrol

Analisis Ekstrak Daun Sirih Merah Sebagai Inhibitor Enzim α-glukosidase

(Suteja L 2003)
Enzim α-glukosidase sebanyak 0,5 mg dilarutkan dengan 0,1 M buffer
fosfat pH 7 yang mengandung 100 mg BSA (Bovine Serum Albumin). Sebelum
digunakan enzim diencerkan 25 kali dengan 0.1 M buffer fosfat pH 7.
Selanjutnya untuk sistem reaksi enzim terdiri dari 500 µL 20 mM p-nitrofenil-α-
D-glukopiranosida (substrat), 980 µL buffer fosfat 0,1 M pH 7, 20 µL ekstrak
dengan konsentrasi 0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75%, dan 1% b/v dalam DMSO
(dimethylsulfoxide). Campuran reaksi diinkubasi suhu 37 °C selama 5 menit.
Reaksi enzimatis dimulai dengan mencampurkan 500 µL enzim dengan pereaksi
lainnya dan diinkubasi 37 °C selama 15 menit. Produk yang terbentuk dari reaksi
enzimatis tersebut adalah p-nitrofenol (pNP). Reaksi dihentikan dengan
penambahan 2 mL 200 mM Na2CO3 dan diukur serapannya dengan panjang
gelombang 400 nm. Larutan pembanding menggunakan acarbose dengan
konsentrasi 1%. Analisis kinetik inhibisi menggunakan dua sistem reaksi, yaitu
substrat dengan konsentrasi berbeda (5, 10, 15, 20, 25 mM) dicampurkan dengan
enzim dan yang kedua menggunakan ekstrak daun sirih merah sebagai inhibitor
(konsentrasi ekstrak 1%). Pembuatan kurva standar dilakukan dengan
menggunakan larutan p-nitrofenol (pNP) dengan konsentrasi 1, 2,5, 5, 7,5, 10,
12,5, dan 15 µM. Larutan blanko menggunakan larutan buffer fosfat 0,1 M pH 7
(pelarut larutan standar p-nitrofenol) Serapannya diukur pada panjang gelombang
400 nm. Persentase daya hambat ekstrak dapat dihitung dengan menggunakan
rumus sebagai berikut:
% daya hambat = [pNP] kontrol negatif – [pNP] ekstrak x 100%
[pNP] kontrol negatif

Analisis Komponen Senyawa Ekstrak Etanol 70% Daun Sirih Merah

Menggunakan GC-MS (Gas Chromatography Mass Spectrometry)
Ekstrak etanol 70% daun sirih merah dideteksi komponen senyawanya
dengan GC-MS. Ekstrak etanol 70% sebanyak 842,1 mg dilarutkan dengan 1 mL
etanol 99% dan diinjeksikan sebanyak 1 µL. Kondisi GC-MS menggunakan
kolom kapiler HP-5 (Agilent 19091J-433: 0,25 mm x 30 m x 0,25 µm
mengandung 5% difenil 95% dimetilpolisilosan), laju alir yang digunakan adalah
1,0 mL/menit dengan suhu injeksi 300 °C mode split, dan tekanan 10,47 psi. Gas
pembawa yang digunakan adalah He (Helium). Parameter MS yang digunakan
adalah mendeteksi senyawa dengan massa 50-800. Kondisi MS adalah suhu MS
quad 150-200 °C dan suhu MS source 250-300 °C. Hasil kromatogram dianalisis
dengan database, untuk menentukan komponen senyawa yang terdapat di dalam
ekstrak.

Analisis Data
Pengolahan data dari pengukuran aktivitas antioksidasi dan analisis inhibitor
enzim α-glukosidase dilakukan dengan Anova (Analysis of Variance) dengan
model rancangan percobaan RAL (Rancangan Acak Lengkap). Selanjutnya bila
terdapat perbedaan yang nyata dilakukan dengan uji lanjut Duncan. Model
rancangan tersebut adalah:
Yij = μ + λ + εij
keterangan:
 = Pengaruh rataan umum
λi = Pengaruh perlakuan (konsentrasi ekstrak) ke-i, i = 1,2,3,..,6
ij= Pengaruh galat perlakuan ke-i dan
ulangan ke-j, j = 1,2,3
 HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi Daun Sirih Merah

Hasil ekstraksi etanol 70% didapatkan rerata rendemen dari 25 g daun sirih
merah segar adalah 4,42% (1,1195 g) (Data lengkap pada Lampiran 9). Hasil
rendemen ini lebih besar dari ekstrak etanol 30% daun sirih merah sebesar 2,47%
dengan bobot daun 30,8416 g dan bobot ekstrak 0,7633 g (Marlina PW 2008), hal
ini menunjukkan bahwa etanol dengan kadar yang lebih tinggi dapat mengekstrak
senyawa-senyawa bioaktif dari daun sirih merah lebih banyak dibandingkan
dengan etanol dengan kadar yang lebih rendah. Ekstraksi merupakan salah satu
cara untuk memisahkan satu atau lebih senyawa dari suatu bahan. Bahan tersebut
dapat berupa suatu jaringan atau organ tumbuhan. Metode ekstraksi yang
digunakan adalah maserasi. Metode ini dilakukan dengan cara merendam jaringan
atau organ tumbuhan dengan larutan yang tepat untuk mendapatkan senyawa yang
diinginkan (Harborne 1987). Maserasi yang dilakukan dalam penelitian ini adalah
daun sirih merah segar yang telah digerus direndam dengan larutan etanol 70%
selama 24 jam. Penggunaan daun yang segar bertujuan untuk mencegah terjadinya
perubahan kimia terhadap senyawa-senyawa yang terdapat di daun sehingga tidak
merusak senyawa yang diinginkan.
Pemilihan pelarut yang digunakan berdasarkan sifat dari senyawa yang
ingin diekstrak dari daun tersebut, apakah senyawa tersebut bersifat polar atau
nonpolar. Berdasarkan uji fitokimia pada penelitian sebelumnya, bahwa daun sirih
merah mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, dan tannin (Safithri & Fahma
2005), maka senyawa-senyawa tersebut bersifat polar terutama flavonoid. Oleh
karena itu, penggunaan etanol merupakan pelarut yang tepat untuk mengekstrak
senyawa-senyawa tersebut. Selain etanol, pelarut-pelarut lain yang dapat
digunakan untuk mengekstrak senyawa bersifat polar adalah metanol dan aseton,
namun tingkat toksisitasnya lebih tinggi dibandingkan dengan etanol (Harborne
1987). Walaupun etanol merupakan pelarut yang tepat, namun perlu dilakukan hal
yang dapat membantu proses ekstraksi menjadi lebih efesien, yaitu penggerusan
daun. Penggerusan ini bertujuan untuk memperbesar peluang terlarutnya
senyawa-senyawa yang ingin diekstrak dengan etanol karena dengan adanya
penggerusan maka dinding dan membran sel daun akan rusak sehingga
memudahkan etanol berinteraksi dengan senyawa-senyawa yang ingin diekstrak.
Penggunaan etanol 70% dalam maserasi ini bertujuan untuk dapat
mengekstrak senyawa aktif yang bersifat polar atau semipolar. Selain itu dapat
mencegah berkembangnya mikroba karena penggunaan daun segar rentan
terkontaminasi mikroba. Setelah dimaserasi, larutan tersebut dipekatkan dengan
rotavapor dengan suhu 50 °C. Penggunaan suhu 50 °C ini bertujuan untuk
mencegah rusaknya senyawa yang diekstrak oleh suhu tinggi. Setelah itu ekstrak
dikeringkan dengan freeze dryer untuk menghilangkan pelarut-pelarut yang masih
terdapat dari hasil pemekatan dengan rotavapor.

Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Daun Sirih Merah (Metode TBA)

Hasil percobaan penentuan waktu inkubasi asam linoleat menunjukkan
kadar MDA dari hari ke-0 hingga hari ke-6 mengalami peningkatan dan setelah
hari ke-6 mengalami penurunan. Pembentukan MDA sebagai produk hasil
oksidasi asam linoleat terjadi maksimum di hari ke-6 (Gambar 4). Proses ini dapat
ditentukan karena ada lonjakan tinggi kadar MDA dari hari sebelumnya (hari ke-
5) dan hari berikutnya (hari ke-7) terjadi penurunan kadar MDA (Data lengkap
pada Lampiran 10). Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa ekstrak etanol
70% daun sirih merah memiliki kemampuan menghambat terjadinya oksidasi
asam linoleat. Aktivitas ini dapat ditunjukkan dengan rendahnya kadar MDA
setiap konsentrasi dari ekstrak etanol 70% daun sirih merah dibandingkan dengan

Gambar 4 Kurva kadar MDA terhadap waktu

kontrol negatif (larutan asam linoleat tanpa ekstrak) (Gambar 5). Peningkatan
konsentrasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah berbanding terbalik dengan
kadar MDA yang terbentuk. Konsentrasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah
terbesar (200 ppm) memiliki kadar MDA terkecil (1,0586 µM) dibandingkan
dengan konsentrasi lainnya. Konsentrasi esktrak etanol 70% daun sirih merah 200
ppm memiliki daya hambat terbesar, yaitu 80,40%. Kemampuan menghambat
pembentukkan MDA sekitar 50% dimiliki oleh esktrak etanol 70% daun sirih
merah 50 ppm, yaitu sebesar 56,30%. Daya hambat terkecil dimiliki ekstrak
etanol 70% daun sirih merah dengan konsentrasi 25 ppm, yaitu 44,31% dan nilai
ini merupakan setengah dari daya hambat konsentrasi terbesar (200 ppm) ekstrak
etanol 70% daun sirih merah. Oleh karena itu, konsentrasi 25 ppm ekstrak etanol
70% daun sirih merah dapat diasumsikan aktivitas antioksidasinya setengah dari
konsentrasi 200 ppm (Data lengkap pada Lampiran 11). Aktivitas antioksidasi
setiap konsentrasi ekstrak berbeda nyata dengan konsentrasi ekstrak lainnya dan
kontrol negatif (α = 0,05). Namun aktivitas antioksidasi konsentrasi ekstrak etanol
70% daun sirih merah 200 ppm tidak berbeda nyata dengan α-tokoferol 200 ppm
(α = 0,05). Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70%
daun sirih merah 200 ppm sama dengan aktivitas antioksidasi α-tokoferol 200
ppm (Data lengkap hasil analisisa statistika pada Lampiran 19). Senyawa 1,1,3,3-
tetrametoksipropana (TMP) digunakan sebagai larutan baku, dengan persamaan
garis adalah y = 0,0163 + 0,1096 x; r = 99,68% (Data lengkap pada Lampiran 12).
Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah sebagai
penghambat oksidasi asam lemak lebih besar bila dibandingkan dengan air
rebusan daun sirih merah. Konsentrasi terbesar air rebusan daun sirih merah, yaitu

Gambar 5 Kadar MDA ekstrak etanol 70% daun sirih merah

20 mg/ mL larutan mempunyai daya hambat pembentukkan MDA 81,78%
(Alfarabi 2008). Data tersebut nilainya lebih tinggi bila dibandingkan dengan
daya hambat dari penelitian ini menggunakan konsentrasi terbesar dari ekstrak
etanol 70% daun sirih merah yaitu 200 ppm, yaitu 80,40%. Namun konsentrasi
ekstrak yang digunakan dalam penelitian ini jauh lebih kecil dari konsentrasi
rebusan daun sirih merah, yaitu ppm (mg/L). Hal ini membuktikan bahwa ekstrak
etanol 70% lebih besar mengekstrak senyawa aktif dari daun sirih merah
dibandingkan dengan air.
Daya hambat ekstrak etanol 70% daun sirih merah ini lebih besar bila
dibandingkan dengan daun sirih hijau dan daun tembakau. Ekstrak etanol 95%
daun sirih hijau dengan konsentrasi 100 ppm menghambat pembentukkan MDA
dari oksidasi lipid sebesar 42% (Bhattacharya et al. 2007), sedangkan fraksi
ekstrak daun tembakau yang sudah dihidrolisis proteinnya dengan menggunakan
enzim dan suhu tinggi untuk inaktivasi enzimnya menghambat pembentukkan
MDA 42,62% (Guohua R et al. 2007). Hal ini dimungkinkan terjadi karena etanol
95% lebih mudah menguap daripada etanol 70% yang digunakan dalam penelitian
ini sehingga proses ekstraksi tidak sempurna. Suhu tinggi juga dapat mengurangi
aktivitas karena rusaknya senyawa bioaktif sehingga dalam penelitian ini
menggunakan suhu 50 °C untuk proses pemekatan.
Suatu lipid yang mengandung asam lemak tak jenuh dapat dengan mudah
diserang oleh radikal bebas pada ikatan rangkapnya sehingga menghasilkan
peroksida lipid. Asam lemak tersebut telah teroksidasi sehingga rusak secara
struktur. Suatu asam lemak dapat rusak akibat teroksidasi oleh beberapa faktor
seperti suhu, cahaya, ion-ion logam, dan oksigen (Sen et al. 2000). Penelitian ini
menggunakan asam linoleat yang laju oksidasinya dipercepat dengan mengatur
suhu tetap pada 40 °C. Tahap awal reaksi radikal asam lemak adalah asam lemak
akan kehilangan pasangan elektron pada ikatan ganda. Reaksi ini terjadi secara
bertahap sehingga terjadi penataan ulang struktur asam lemak sebagai diena
terkonjugasi. Tahap selanjutnya adalah asam lemak banyak terbentuk menjadi
radikal menghasilkan senyawa-senyawa peroksida dan reaksi lanjut senyawa
peroksida tersebut terdekomposisi menjadi senyawa yang lebih sederhana, salah
satunya adalah malondialdehida (MDA) (Gambar 6) (Murray 2003).
 Gambar 6 Mekanisme reaksi pembentukkan MDA (Murray 2003)

Senyawa MDA merupakan salah satu produk dari golongan aldehida yang
dihasilkan dari oksidasi asam lemak. Produk oksidasi asam lemak dapat berupa
senyawa alkohol, aldehida, atau senyawa hidrokarbon volatil. Beberapa metode
yang dapat digunakan untuk mengukur kerusakan suatu asam lemak atau lipid
adalah metode diena terkonjugasi, metode FTC (feritiosianat), dan metode TBA
(asam tiobarbiturat). Metode diena terkonjugasi merupakan metode yang
digunakan untuk mengukur kadar asam lemak yang telah terbentuk ikatan diena
terkonjugasi pada strukturnya. Serapannya akan diukur pada panjang gelombang
234 nm (Sen et al. 2000). Metode selanjutnya adalah metode FTC, yaitu metode
yang mengukur kadar senyawa peroksida yang terbentuk akibat oksidasi senyawa
asam lemak atau lipid. Senyawa peroksida yang terbentuk ini akan membentuk
senyawa kompleks dengan logam Fe menghasilkan warna merah. Serapannya
akan diukur pada panjang gelombang 500 nm (Chen et al 1996). Metode yang
ketiga adalah metode TBA, yaitu metode yang digunakan untuk mengukur kadar
MDA. Reaksi MDA dengan TBA akan menghasilkan kompleks MDA-TBA yang
berwarna merah dan serapannya diukur pada panjang gelombang 532 nm
(Gambar 7). Parameter penelitian ini adalah MDA untuk mengetahui kerusakan
yang terjadi pada asam linoleat sehingga digunakan metode TBA. Namun TBA
tidak spesifik dengan MDA sehingga pembentukkan kompleks senyawa MDA-
TBA dapat menurun kadarnya, hal ini dapat disebabkan adanya senyawa aldehida
lain yang terbentuk setelah tahap pembentukkan MDA yang dapat bereaksi
dengan TBA dengan panjang gelombang yang berbeda (Pokorny et al. 2001).
 Gambar 7 Pembentukkan senyawa kompleks MDA-TBA (Pokorny et al. 2001)

Metode lainnya (diena terkonjugasi dan FTC) dapat juga digunakan untuk
mengukur kadar MDA dengan cara mencari terlebih dahulu waktu terbentuk
senyawa peroksida dan diena terkonjugasi terbanyak, dua hari setelah waktu
tersebut dapat diasumsikan jumlah MDA telah banyak terbentuk (Kikuzaki &
Nakatani 1993).
Tahap pertama dalam menguji aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70%
daun sirih merah dengan metode TBA adalah mencari waktu terbentuknya kadar
terbanyak MDA. Tahap ini dilakukan dengan mengukur kadar MDA dari asam
linoleat setiap 24 jam yang diinkubasi suhu 40 °C di dalam botol gelap.
Penggunaan botol gelap ini bertujuan untuk menghindari faktor lain selain suhu
dan oksigen yang dapat mengoksidasi asam linoleat. Setelah didapatkan waktu
terbentuknya jumlah terbanyak MDA, maka dilakukan analisis aktivitas ekstrak
etanol 70% daun sirih merah dengan waktu inkubasi 6 hari (sesuai dengan waktu
inkubasi dengan kadar MDA terbanyak). Larutan ekstrak dicampurkan dengan
larutan linoleat dan diinkubasi pada suhu 40 °C. Asam linoleat akan terhambat
memproduksi senyawa MDA bila proses oksidasi asam lemak tersebut dihambat
oleh suatu senyawa antioksidan. Peristiwa ini disebabkan karena senyawa
antioksidan memiliki kemampuan menstabilkan suatu senyawa radikal bebas yang
dapat merusak asam linoleat. Secara mekanisme, senyawa antioksidan dapat
dibagi menjadi dua kelompok, yaitu senyawa antioksidan preventif dan senyawa
antioksidan pemutus reaksi berantai radikal bebas. Senyawa antioksidan preventif
memiliki kemampuan mengurangi kecepatan reaksi awal dari pembentukkan
senyawa radikal bebas atau menangkap senyawa radikal bebas yang menyebabkan
oksidasi asam lemak sedangkan senyawa antioksidan pemutus reaksi berantai
memiliki kemapuan untuk memutuskan reaksi berantai pembentukkan senyawa
radikal bebas (Evans CAR et al. 1996).
Senyawa-senyawa aktif dari tumbuhan yang merupakan hasil dari proses
metabolisme sekunder memiliki kemampuan tersebut. Senyawa tersebut seperti
flavonoid, alkaloid, dan senyawa fenol lainnya (Harborne 2000). Flavonoid yang
memiliki efek antioksidasi kuat memiliki kemampuan untuk memodifikasi ikatan
lemak membran yang telah diinduksi menjadi radikal, bahkan mampu berinteraksi
dan mempenetrasi lipid dwi lapis (Saija A et al 1995). Selain flavonoid, senyawa
tanin dari ekstrak Allium sativum L., Cichorium intybus L., dan Terminalia
bellerica Roxb. juga memiliki aktivitas antioksidasi (Aqil et al. 2006).

Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Daun Sirih Merah (Metode DPPH)

Hasil uji aktivitas antioksidasi dengan DPPH menunjukkan bahwa setiap
konsentrasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah memiliki kemampuan
menghambat senyawa radikal bebas DPPH. Hal ini terjadi karena nilai absorban
setiap konsentrasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah lebih kecil dibandingkan
dengan absorbansi kontrol negatif (larutan DPPH tanpa ekstrak). Daya hambat
terbesar dimiliki oleh konsentrasi ekstrak 200 ppm sebesar 73,41% dan daya
hambat terkecil dimiliki oleh konsentrasi 25 ppm sebesar 13,10%. Senyawa α-
tokoferol juga direaksikan dengan senyawa radikal bebas DPPH sebagai
pembanding. Daya hambat terbesar α-tokoferol sebesar 80,36% pada konsentrasi
10 ppm dan daya hambat terkecilnya sebesar 37,87% pada konsentrasi 1 ppm.
Konsentrasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah yang memberikan daya hambat
50% adalah 85,82 ppm dan konsentrasi α-tokoferol yang memberikan daya
hambat 50% adalah 2.12 ppm (Tabel 1). Daya hambat 50% atau yang biasa
disebut dengan IC50 (Inhibiton Concentration 50) ini menyatakan nilai konsentrasi
suatu senyawa antioksidan yang dapat menghambat reaksi senyawa radikal bebas
sebanyak 50%. Rendahnya nilai IC50 suatu senyawa antioksidan terhadap senyawa
radikal menyatakan bahwa senyawa antioksidan tersebut memiliki aktivitas
antioksidasi yang tinggi karena dengan konsentrasi yang kecil telah dapat
menghambat reaksi senyawa radikal bebas sebanyak 50%. Hasil penelitian
menyatakan bahwa nilai IC50 ekstrak etanol 70% daun sirih merah lebih tinggi
daripada nilai IC50 α-tokoferol (Data lengkap pada Lampiran 13 dan 14).
Hasil ini terjadi karena ekstrak daun sirih merah tidak senyawa murni
seperti α-tokoferol sehingga terdapat senyawa-senyawa yang tidak memiliki
aktivitas antioksidasi menghambat reaksi antioksidasi seperti senyawa-senyawa
karbohidrat, lipid, dan protein. Bila dibandingkan dengan tumbuhan lain, yaitu
ekstrak etanol daun kemuning dengan nilai IC50 sebesar 126,17 ppm (Rohman A
& Riyanto 2005), nilai IC50 ekstrak etanol 70% daun sirih merah lebih rendah
sehingga daun sirih merah mempunyai aktivitas antioksidasi yang lebih tinggi
daripada daun kemuning. Namun aktivitas ini lebih rendah dengan ekstrak daun
ginseng Korea yang sudah terfraksinasi dengan etanol pada konsentrasi 200 ppm
yang mampu menghambat sebesar 80% (ekstrak etanol 70% daun sirih merah
200 ppm menghambat 73,41%) (Chang HJ et al. 2005). Hal ini mungkin terjadi
karena perlakuan fraksinasi menyebabkan komponen-komponen lain yang dapat
mengganggu proses antioksidasi telah terpisahkan pada fraksi pelarut lainnya.
Uji aktivitas antioksidasi suatu senyawa antioksidan dapat berupa aktivitas
menghambat oksidasi senyawa stabil tertentu yang mudah dioksidasi dengan suhu
atau cahaya seperti senyawa asam lemak atau senyawa lipid seperti metode TBA,

Tabel 1 Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah dan vitamin E
metode DPPH
Larutan Daya hambat (%) IC50
Ekstrak (25 ppm) 13,10
Ekstrak (50 ppm) 28,90
Ekstrak (75 ppm) 47,47 85,82 ppm
Ekstrak (100 ppm) 59,34
Ekstrak (200 ppm) 73,41
Vitamin E (1 ppm) 37,87
Vitamin E (2,5 ppm) 52,91
Vitamin E (5 ppm) 59,72 2,12 ppm
Vitamin E (7,5 ppm) 74,75
Vitamin E (10 ppm) 80,36
namun dapat berupa kemampuan menangkap senyawa radikal bebas atau yang
biasa disebut radical scavenger. Kedua metode ini dapat dijadikan model bagi
kemampuan daun sirih merah dalam mengurangi tingginya kadar lipid peroksidasi
dan senyawa radikal bebas pada penderita diabetes mellitus. Metode radical
scavenger dapat menggunakan larutan DPPH (2,2-diphenil-1-picryl hydrazyl).
Senyawa DPPH ini merupakan senyawa radikal bebas yang mudah bereaksi
dengan senyawa antioksidan pada suhu kamar. Larutan senyawa ini berwarna
ungu, ketika bereaksi dengan senyawa antioksidan warna larutan berubah menjadi
kuning. Prinsip metode ini adalah menetralkan senyawa radikal bebas DPPH
dengan senyawa antioksidan yang dapat ditunjukkan dengan perubahan warna
larutan. Secara mekanisme, terdapat dua macam reaksi senyawa DPPH dengan
senyawa antioksidan. Mekanisme reaksi pertama merupakan proses transfer
secara langsung elektron atau atom H dari senyawa antioksidan ke senyawa
DPPH. Mekanisme reaksi kedua adalah proses transfer elektron dengan proton
terkonsentrasi, yaitu senyawa DPPH kehilangan proton yang diberikan ke
senyawa antioksidan, sehingga senyawa DPPH bermuatan negatif. Senyawa
antioksidan berubah bermuatan positif dan mentransfer atom hidrogen ke senyawa
DPPH (Lan FW dan Hong YZ 2003). Mekanisme reaksinya sebagai berikut:

DPPH· + RXH DPPHH + RX· (1)

DPPH· + RXH DPPH¯ + RXH·+ DPPHH + RX· (2)

Hasil penelitian aktivitas antioksidasi dengan dua metode berbeda

menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% daun sirih merah dapat menghambat
oksidasi asam lemak dan juga dapat berperan sebagai radical scavenger. Namun
daya hambat yang dihasilkan lebih besar pada metode TBA dengan konsentrasi
yang sama sehingga dapat diasumsikan bahwa ekstrak etanol 70% daun sirih
merah lebih efektif sebagai penghambat oksidasi asam lemak daripada sebagai
radical scavenger. Hal ini membuktikan ekstrak daun sirih merah berpotensi
sebagai sumber antioksidan untuk mengurangi senyawa radikal bebas dan
oksidasi asam lemak pada uji in vitro.
 Inhibisi dan Kinetika Inhibisi α-glukosidase
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol 70% daun sirih merah
memiliki aktivitas inhibisi kerja α-glukosidase. Aktivitas ini dapat ditunjukkan
dengan rendahnya kadar p-nitrofenol setiap konsentrasi dari ekstrak etanol 70%
daun sirih merah dibandingkan dengan kontrol negatif (larutan enzim substrat
tanpa ekstrak daun sirih merah). Peningkatan konsentrasi ekstrak etanol 70% daun
sirih merah berbanding terbalik dengan kadar p-nitrofenol yang terbentuk.
Konsentrasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah terbesar (1% b/v) memiliki
kadar p-nitrofenol terkecil (6,1038 µM) dibandingkan dengan konsentrasi lainnya.
Konsentrasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah 1% b/v memiliki daya inhibisi
terbesar, yaitu 39,62%. Daya inhibisi terkecil dimiliki ekstrak etanol 70% daun
sirih merah dengan konsentrasi 0,1% b/v, yaitu 1,26% dengan kadar p-nitrofenol
sebesar 9,9816 µM. Daya inhibisi acarbose 1% b/v sebesar 78,64% (Gambar 8a).
Aktivitas inhibisi konsentrasi terbesar ekstrak daun sirih merah berbeda nyata
dengan acarbose dan kontrol negatif (α = 0,05). Namun aktivitas inhibisi
konsentrasi ekstrak daun sirih merah terkecil tidak berbeda nyata dengan kontrol
negatif (α = 0,05) sehingga kurang efektif dalam menghambat kerja α-
glukosidase. Daya inhibisi ekstrak dengan konsentrasi 1% b/v dengan konsentrasi
0,75% b/v tidak berbeda nyata sehingga dapat diasumsikan aktivitasnya sama
dalam menghambat kerja α-glukosidase (Data lengkap hasil analisisa statistika
pada Lampiran 19). Bila dibandingkan daya inhibisi acarbose 1% b/v dengan
konsentrasi terbesar ekstrak (1% b/v), daya inhibisi ekstrak adalah setengah dari
daya inhibisi acarbose (Data lengkap pada Lampiran 15). Daya inhibisi ekstrak
daun sirih merah ini lebih besar bila dibandingkan dengan tumbuhan lain seperti
buah salak yang mempunyai daya inhibisi 13,18% pada konsentrasi 1% b/v
terhadap α-glukosidase (Pratama NR 2009). Namun daya inhibisi daun sirih ini
lebih rendah daripada fraksi etanol daun sukun yang sudah menghambat α-
glukosidase sebesar 50% pada konsentrasi 12,9 ppm (Udin et al. 2005). Senyawa
p-nitrofenol digunakan sebagai larutan baku, sehingga persamaan garis adalah y =
-0,012971 + 0,044612 x; r = 99,75% (Data lengkap pada Lampiran 16).
Setelah diketahui bahwa ekstrak etanol 70% daun sirih merah memiliki
aktivitas inihibisi terhadap enzim α-glukosidase, maka perlu diketahui jenis
inhibisi ekstrak tersebut terhadap enzim. Jenis inhibisi ini dapat diketahui setelah
hasil analisis diplotkan pada kurva Lineweaver-Burk (Data lengkap pada
Lampiran 17). Hasil penelitian menunjukkan inhibisi ekstrak etanol 70% daun
sirih merah adalah competitive (Gambar 8b). Jenis inhibisi sama dengan inhibisi
acarbose terhadap α-glukosidase (Myo JK et al. 1999). Penghambatan oleh
inhibitor competitive dapat dikurangi dengan cara menambahkan jumlah substrat
sehingga dapat meningkatkan peluang bagi substrat untuk berikatan dengan
enzim. Enzim merupakan suatu biomakromolekul yang mempunyai kemampuan
katalitik dan spesifisitas tinggi. Reaksi enzim dengan senyawa kimia sangat
terkendali karena enzim akan optimal bekerja dengan substrat tertentu dan
keadaan lingkungan yang sesuai (suhu dan pH). Enzim sebagian besar merupakan

Konsentrasi Ekstrak (% b/v)

Keterangan: KN (kontrol negatif), E (ekstrak), A (acarbose)

(a)

(b)
Gambar 8 (a) kadar p-nitrofenol ekstrak etanol 70% daun sirih merah, (b) grafik
jenis inhibisi ekstrak etanol 70% daun sirih merah
molekul protein. Namun, enzim dapat dihambat dengan suatu senyawa kimia atau
biasa disebut dengan inhibitor. Inhibitor ini akan menghambat kerja enzim
sehingga produk yang dihasilkan sedikit. Substrat yang digunakan dalam
penelitian ini adalah p-nitrofenil-α-D-glukopiranosida sehingga produknya berupa
senyawa p-nitrofenol. Terhambatnya kerja α-glukosidase oleh ekstrak daun sirih
merah, maka senyawa p-nitrofenol yang dihasilkan jumlahnya sedikit. Adanya
inhibitor tidak selalu memberikan efek negatif karena inhibitor dapat dijadikan
obat bagi suatu penyakit. Prinsip tersebut yang digunakan dalam penelitian ini.

Analisis Komponen Senyawa Ekstrak Etanol 70% Daun Sirih Merah

Hasil analisis GC-MS (Gas Chromatography Mass Spectrometry) dengan
parameter MS untuk mendeteksi senyawa dengan massa 50-800 menunjukkan
pola kromatogram dari senyawa yang terkandung di dalam ekstrak etanol 70%
daun sirih merah (Data lengkap pada Lampiran 18). Senyawa yang terdeteksi
dengan instrumen ini adalah senyawa-senyawa yang dapat berubah menjadi gas
atau yang bersifat volatil, karena prinsip dari instrumen ini adalah menguapkan
senyawa dengan suhu tinggi. Hasil kromatogram tersebut diolah dengan database
perangkat lunak menunjukkan komponen senyawa ekstrak etanol 70% daun sirih
merah terdiri atas golongan asam lemak, terpenoid, flavonoid, steroid, alkaloid,
pirimidin, minyak atsiri, polifenol, dan vitamin E. Namun terdapat beberapa
senyawa yang mempunyai nilai kesesuaian rendah dengan database.
Kemungkinan hal ini terjadi karena database yang digunakan tidak mempunyai
data-data kromatogram yang sesuai dengan kromatogram ekstrak (Tabel 2).
Senyawa-senyawa terdeteksi oleh GC-MS yang diperkirakan memiliki
aktivitas antidiabetogenik dalam penelitian ini adalah polifenol, flavonoid,
alkaloid, terpenoid, dan vitamin E. Senyawa polifenol, flavonoid, alkaloid
merupakan senyawa metabolit sekunder yang terdapat di tumbuhan dan memiliki
aktivitas sebagai antioksidan (Hans & Heldt 2005) dan dapat juga sebagai
inhibitor α-glukosidase. Terpenoid pun senyawa yang terdapat di tumbuhan, salah
satu penelitian melaporkan bahwa senyawa turunan dari terpenoid dapat berperan
sebagai inhibitor α-glukosidase (Wenli 2009) sedangkan vitamin E atau α-
tokoferol merupakan suatu senyawa yang sudah banyak dikenal sebagai
antioksidan.

Tabel 2 Komponen senyawa ekstrak etanol 70% daun sirih merah

Waktu retensi (menit) Area (%) Nama Kesesuaian (%)
9.87 1.80 Asam miristat (asam lemak) 98
11.68 1.78 Fitol (terpenoid) 91
12.07 6.13 Asam linolenat (asam lemak) 91
12.28 1.93 Asam stearat (asam lemak) 99
21.15 1.81 Mirisetin (flavonoid) 43
22.05 2.06 Pirazol (minyak atsiri) 25
23.56 4.96 2,4,6(1H,3H,5H)- 59
pyrimidinetrione (pirimidin)
23.87 2.67 Naftalena (minyak atsiri) 46
24.03 4.05 2,4,6(1H,3H,5H)- 59
pyrimidinetrione (pirimidin)
24.89 12.19 Stilben (polifenol) 30
26.12 4.52 methyl (25R)-5-oxo-A-nor- 90
3,5-secospirostan-3-oate
(steroid)
27.20 44.69 4,4-stilbendiamin (polifenol) 60
28.42 1.53 pirimidin 44
28.85 1.83 4-Allyloxy-6-methoxy-N,N- 91
dimethyl-1,3,5-triazin-2-
amine (alkaloid)
36.46 1.65 Vitamin E 99
 SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan dari penelitian ini adalah ekstrak etanol 70% daun sirih merah
memiliki aktivitas sebagai antidiabetogenik. Proses antidiabetogenik ini melalui
hambatan oksidasi asam lemak dan radical scavenger serta sebagai inhibitor
competitive α-glukosidase. Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70% daun sirih
merah dapat berperan sebagai penghambat oksidasi asam lemak dengan daya
hambat terbesar 80,40% dan sebagai radical scavenger dengan nilai IC50 85,82
ppm. Aktivitas inhibisi terhadap α-glukosidase mempunyai daya hambat terbesar
39,62% dengan jenis inhibisi competitive. Oleh karena itu, daun sirih merah
berpotensi mengurangi kadar senyawa radikal bebas dan oksidasi lipid serta kadar
gula darah bagi penderita diabetes mellitus. Komponen senyawa yang terkandung
pada ekstrak etanol 70% daun sirih merah adalah golongan asam lemak,
terpenoid, flavonoid, steroid, alkaloid, pirimidin, minyak atsiri, polifenol, dan
vitamin E. Senyawa yang diperkirakan memiliki aktivitas adalah polifenol,
alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan vitamin E.
Saran bagi penelitian selanjutnya adalah perlunya isolasi dan pemurnian
senyawa aktif dari daun sirih merah serta diuji aktivitasnya. Perlu dikaji
mekanisme antioksidasi dari daun sirih merah dan uji in vivo antioksidasi untuk
menurunkan kadar peroksidasi lipid. Selain itu perlu diketahui dosis yang tepat
bagi senyawa murni ekstrak daun sirih merah untuk uji klinis pada hewan coba
sehingga dapat dikonsumsi penderita diabetes mellitus.
 DAFTAR PUSTAKA

Alfarabi M. 2008. Aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah [skripsi].

Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.

Aqil F, Ahmad I, Mehmood Z. 2006. Antioxidant and free radical scavenging

properties of twelve traditionally used Indian medicinal plants. Turk J Biol
30:177-183

Betteridge DJ. 2000. What is oxidative stress. Metabolism 49 (Suppl 1): 3-8

Bhattacharya S et al. 2007. Inhibitory property of Piper betel extract against

photosensitization-induced damages to lipids and proteins. Food Chemistry
100: 1474-1480

Ceriello A. 2000. Oxidative stress and glycemic regulation. Metabolism 49 (Suppl

1): 27-29

Ceriello A. 2003. New insights on oxidative stress and diabetic complications

may lead to a causal antioxidant therapy. Diabetes Care 26: 1589-1596

Cetto AA, Jimenez JB, Vazquez RC . 2008. Alfa-glucosidase inhibiting activity of

some Mexican plants used in the treatment of type 2 diabetes. Journal of
Ethnopharmacology 117: 27-32

Chang HJ, Ho MS, In WC, Hong YC. 2005. Antioxidant activities of cultivated
and wild korean ginseng leaves. Food Chemistry 92: 535-540

Chen HM, Muramoto K, Yamauchi F, Nokihara K. 1996. Antioxidant activity of

designed peptides base on the antioxidative peptide isolated from digest of
soybean protein. J Agric Food Chem 44: 2619

Dobretsov M, Romanovsky D, Stimers JR. 2007. Early diabetic neuropathy:

triggers and mechanism. World J Gastroenterol 13: 175-191

Duryatmo S. 2005. Dulu hiasan kini obat. Trubus 427:37

Evans CAR, Miller NJ, Paganga G. 1996. Sturcture antioxidant activity

relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology and
Medicine 20: 933-956

Guohua R, Mouming Z, Weifeng L, Haiyan L. 2007. Antioxidative activity of

tobacco leaf protein hydrolysates. Food Technol Biotechnol 45: 80-84

Hans, Heldt W. 2005. Plant Biochemistry Third Edition. San Diego: Elsevier
Academic Press
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan. K Padmawinata, I Sudiro, penerjemah. Bandung: ITB. Terjemahan
dari: Phytochemical Method

Harborne JB, Williams CA. 2000. Advances in flavonoid research since 1992.
Phytochemistry 55: 481-504

Hart H, Craine LE, Hart DJ. 2003. Kimia Organik: Suatu Kuliah Singkat.
Achmadi S, penerjemah; Safitri A, editor. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari:
Organic Chemistry: A Short Course

Illanes A. 2008. Enzyme Biocatalysis: Principles and Applications. Chile:

Springer

Jankyova S et al. 2009. Pycnogenol efficiency on glycaemia, motor nerve

conduction velocity, and markers of oxidative stress in mild type diabetes in
rats. Phytotherapy Research 23: 1169-1174

Kalaivanam KN, Dharmalingam M, Marcus SR. 2006. Lipid peroxydation in type

2 diabetes mellitus. Int J Diab Dev Ctries 26: 30-32

Kikuzaki H, Nakatani N. 1993. Antioxidant effect of some ginger constituents.

Journal of Food Science 58(6):1407-1410

Lan FW, Hong YZ. 2003. A theoretical investigation on DPPH radical scavenging
mechanism of edaravone. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 13:
3789-3792

Lau et al. 2009. Radix Astragali and Radix Rehmanniae, the principal components
of two antidiabetic foot ulcer herbal formulae, elicit viability-promoting effects
on primary fibroblast cultured from diabetic foot ulcer tissues. Phytotherapy
Research 23: 809-815

Linder MC. 2006. Biokimia Nutrisi dan Metabolisme dengan Pemakaian Secara
Klinis. Aminuddin Parakkasi, penerjemah. Jakarta: UI Press. Terjemahan dari:
Nutritional Biochemistry and Metabolism

Maritim AC, Sanders RA, Watkins JB. 2003. Diabetes, oxidative stress, and
antioxidant: a review. J Biochem Molecular Toxicology 17: 24-38

Marlina PW. 2008. Konsentrasi flavonoid dan lethal concentration 50 (LC50)

ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) [skripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor

Memisogullari R, Taysi S, Bakan E, Capoglu I. 2003. Antioxidant status and lipid

peroxidation in type II diabetes mellitus. Cell Biochem Funct 21: 291-296
Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper Edisi
25. Hartono, penerjemah. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Harper’s
Biochemistry

Myo JK et al. 1999. Comparative study of the inhibition of α-glucosidase, α-

amylase, and cyclomaltodextrin glucanosyltransferase by acarbose,
isoacarbose, and acarviosine-glucose. Archives of Biochemistry and Biophysics
371: 277-283

Nakayama S, Katoh EM, Tsuzuki T, Kobayashi S. 2003. Protective effect α-

tocopherol-6-O-phosphate against ultraviolet B-induced damage in cultured
mouse skin. The Journal Investigative Dermatology 121: 406-411

Panda S, Kar A. 2007. Antidiabetic and antioxidative effects of Annona squamosa

leaves possibly mediated through quercetin-3-O-glucoside. BioFactors 31:
201-210

Parmar HS, Kar A. 2007. Antidiabetic potential of Citrus sinensis and Punica
granatum peel extracts in alloxan treated meal mice. BioFactors 31: 17-24

Permata DA. 2006. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) terhadap
perbaikan pankreas tikus putih hiperglikemia [skripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor

Pokorny J, Yanishlieva N, Gordon M. 2001. Antioxidants In Food: Practical

Applications. New York: CRC Press

Pratama NR. 2009. Aktivitas antihiperglikemik ekstrak daging dan kulit buah
salak (Salacca edulis Reinw) varietas bongkok [skripsi] Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor

Purwakusumah ED. 2003. Tumbuhan sebagai sumber biofarmaka. Di dalam:

Pelatihan Tanaman Obat Tradisional (Swamedikasi). Prosiding Pertemuan
Pengobatan Penyakit Diabetes Mellitus; Bogor, 3-4 Mei 2003. Bogor: Pusat
Studi Biofarmaka Lembaga Penelitian IPB

Rohman A, Riyanto S. 2005. Daya antioksidan ekstrak etanol daun kemuning

(Murraya paniculata (L) Jack) secara in vitro. Majalah Farmasi Indonesia 16:
136-140

Saija A et al. 1995. Flavonoids as antioxidant agents: important of their

interaction with biomembranes. Free Radical Biology and Medicine 19: 481-
486

Safithri M, Fahma F. 2005. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum)
Sebagai senyawa antihiperglikemia pada tikus putih galur Sprague Dawley.
Laporan penelitian. Bogor: LPPM IPB
Salim A. 2006. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) sebagai
senyawa antihiperglikemia pada tikus putih galur Sprague-Dawley [skripsi].
Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor

Sen CK, Packer L, Hanninen O. 2000. Handbook of Oxidants and Antioxidants in

Exercise. Amsterdam: Elsevier

Stryer L. 2000. Biokimia Edisi ke 4. Sadikin M et al., penerjemah; Soebianto S,

Setiadi E, editor. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Biochemistry

Stuart AR, Gulve EA, Wang M. 2004. Chemistry and biochemistry of type 2
diabetes. Chemical Reviews 104: 1255-1282

Sudewo B. 2005. Basmi Penyakit dengan Sirih Merah. Jakarta: Agromedia

Pustaka

Suteja L. 2003. Bioprospecting tumbuhan obat Indonesia sebagai sediaan

fitofarmaka antidiabetes. Laporan kemajuan tahap II riset unggulan terpadu.
Pusat Penelitian Kimia LIPI

The Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus.

2003. Report of the expert committee on the diagnosis and classification of
diabetes mellitus. Diabetes Care 26 (Suppl 1): 5-20

Udin LZ, Sutedja L, Soemardji AA, Dewi P, Sundawati U. 2005. Daun sukun
(Artocarpus communis) sebagai fitofarmaka antidiabetes. Proyek Industri
Bahan Baku Kimia Jadi

Wenli et al. 2009. Triterpene acid isolated from Lagerstroemia speciosa leaves as
α-glucosidase inhibitors. Phytotherapy Research 23: 614-618

Wild S, Roglic G, Green A, Sicree R, King H. 2004. Global prevalence of

diabetes: estimates for the year 2000 and projections 2030. Diabetes Care 27:
1047-1053

Windyagiri A. 2006. Potensi hepatoprotektor air rebusan daun sirih merah (Piper
crocatum) pada tikus putih hiperglikemia [skripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor
LAMPIRAN
 Lampiran 1 Tahapan umum penelitian

Daun sirih merah

Ekstraksi daun sirih

merah dengan etanol 70%

Analisis aktivitas Analisis aktivitas Analisis inhibitor

antioksidasi metode antioksidasi metode α-glukosidase
DPPH TBA

Analisis komponen ekstrak dengan GC-MS

Lampiran 2 Ekstraksi daun sirih merah

25 gram daun sirih merah

ditambah etanol 70% 100 mL,
dimaserasi 24 jam suhu ruang

Rotavapor 50 °C

Ekstrak dikeringkan dengan freeze dryer -50 °C,

8 mbar
Lampiran 3 Analisis ekstrak etanol 70% daun sirih merah dengan GC-MS

Ekstrak etanol 70% 842,1 mg dilarutkan dengan 1

mL etanol 99% dan diinjeksikan sebanyak 1 µL

Kondisi GC-MS: kolom HP-5 (Agilent 19091J-433: 0,25 mm x 30 m

x 0,25 µm mengandung 5% difenil 95% dimetilpolisilosan), laju alir
1,0 mL/menit, suhu injeksi 300 °C mode split, tekanan 10,47 psi, gas
pembawa adalah He

Parameter MS: deteksi senyawa dengan massa 50-

800. Kondisi MS adalah suhu MS quad 150-200 °C
dan suhu MS source 250-300 °C, hasil dianalisis
dengan database

Lampiran 4 Penentuan waktu inkubasi maksimum asam linoleat

6 ml asam linoleat dalam etanol 99,8 %

6 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7
3 mL akuades

Campuran dipipet ke dalam botol gelap (terdapat

11 botol dan 1 mL campuran untuk setiap botol),
diinkubasi 40 °C

1 mL diambil setiap 24 jam, ditambahkan

2 mL TCA 20 % dan 2 mL TBA 1 %
dalam asam asetat 50 %

Larutan diinkubasi 100 °C, dinginkan

Sentrifus 15,5 g 15 menit

diukur serapannya pada λ 532 nm
Lampiran 5 Analisis aktivitas antioksidasi metode TBA
1 mL ekstrak etanol 70% daun sirih merah (25,
50, 75, 100, 200 ppm), vitamin E 200 ppm, dan
akuades
2 mL buffer fosfat 0,1 M pH 7
2 mL asam linoleat 50 mM

Inkubasi 40 °C.
lama inkubasi optimum hasil
pengukuran

Masing-masing diambil 1 mL
2 mL TCA 20%
2 mL TBA 1 % dalam asam asetat 50%

Larutan
Inkubasi 100 °C selama 10 menit,
dinginkan, sentrifus 15,5 g selama
15 menit
diukur serapannya pada λ 532 nm

Lampiran 6 Analisis aktivitas antioksidasi metode DPPH

2 mL ekstrak etanol 70 % daun sirih merah (25, 50, 75, 100,

200 ppm) dan vitamin E dicampur dengan 2 mL DPPH 0.1 mM

diinkubasi 30 menit
dengan suhu ruang

diukur reduksi DPPH

dengan λ = 517 nm
Lampiran 7 Analisis inhibisi α-glukosidase

0,5 g α-glukosidase + buffer 500 µL 20 mM p-nitrofenil-α-D-

fosfat 0,1 M pH 7
(mengandung 100 mg BSA)
diencerkan 25 kali
glukopiranosida + 980 µL buffer fosfat
pH 7 + 20 µL ekstrak (0,1%, 0,25%,
0,5%, 0,75%, 1% b/v dalam DMSO)
diinkubasi suhu 37 °C selama 5 menit.
Pembanding acarbose 1%.

Reaksi enzimatis dimulai

diinkubasi 37 °C selama 15 menit

Penghentian reaksi dengan

2 mL 200 mM Na2CO3

Diukur dengan λ= 400 nm

Lampiran 8 Analisis kinetika inhibisi enzim α-glukosidase

Enzim + substrat (5, 10, 15, 20, Enzim + substrat (5, 10, 15, 20, 25 mM)
25 mM) + ekstrak daun sirih merah 1%

Reaksi enzimatis dimulai

diinkubasi 37 °C selama 15

Penghentian reaksi dengan

2 mL 200 mM Na2CO3

Diukur dengan λ= 400 nm

Lampiran 9 Rendemen hasil ekstraksi daun sirih merah dengan etanol 70%
Ekstrak Bobot daun Bobot botol Bobot botol + Bobot ekstrak Rendemen
(g) kosong (g) ekstrak (g) (g) (%)
Daun 1 25,0078 37,3183 38,2874 0,9691 3,87
Daun 2 25,8432 37,6933 38,6341 0,9408 3,64
Daun 3 25,1343 35,9828 37,4315 1,4487 5,76
Rerata 25,3284 1,1195 4,42
Contoh perhitungan: Rendemen (%) = bobot ekstrak x 100%
bobot daun
= 1,1195 x 100%
25,3284
= 4,42%

Lampiran 10 Absorban inkubasi kadar MDA (µM) terhadap waktu (λ = 532 nm)
Hari A1 A2 A3 [MDA]1 [MDA]2 [MDA]3 Rerata [MDA] ± SD
0 0,156 0,154 0,170 1,2746 1,2564 1,4024 1,3111 ± 0,0795
1 0,193 0,201 0,209 1,6122 1,6852 1,7582 1,6852 ± 0,0730
2 0,262 0,283 0,275 2,2417 2,4333 2,3604 2,3451 ± 0,0967
3 0,387 0,350 0,397 3,3823 3,0447 3,4735 3,3002 ± 0,2258
4 0,456 0,487 0,444 4,0118 4,2947 3,9024 4,0663 ± 0,2024
5 0,500 0,509 0,498 4,4133 4,4954 4,3951 4,4346 ± 0,0534
6 0,893 0,901 0,910 7,9991 8,0721 8,1542 8,0751 ± 0,0775
7 0,670 0,660 0,653 5,9644 5,8732 5,8093 5,8823 ± 0,0779
8 0,621 0,621 0,631 5,5173 5,5173 5,6086 5,5477 ± 0,0527
9 0,550 0,575 0,583 4,8695 5,0976 5,1706 5,0459 ± 0,1569
Contoh perhitungan :
Kadar MDA hari ke-0 (A1) y = 0,0163 + 0,1096 x
0,156 = 0,0163 + 0,1096 x
x = 1,2746
Lampiran 11 Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah metode
TBA (532 nm)
Larutan A1 A2 A3 [MDA]1 [MDA]2 [MDA]3 Rerata [MDA] ± Daya
(µM) (µM) (µM) SD hambat
(%)
K (-) 0,650 0,600 0,575 5,7819 5,3257 5,0976 5,4017 ± 0,3484 0
K (+) 0,128 0,130 0,115 1,0192 1,0374 0,9005 0,9857 ± 0,0743 81,75
E1 0,345 0,328 0,365 2,9991 2,8439 3,1815 3,0082 ± 0,1689 44,31
E2 0,287 0,265 0,273 2,4698 2,2692 2,3422 2,3604 ± 0,1015 56,30
E3 0,228 0,248 0,230 1,9315 2,1141 1,9498 1,9984 ± 0,1005 63,00
E4 0,178 0,178 0,178 1,4753 1,4753 1,4753 1,4753 ± 0 72,68
E5 0,128 0,144 0,125 1,0192 1,1651 0,9917 1,0586 ± 0,0932 80,40
Keterangan: K = kontrol negatif (asam linoleat tanpa ekstrak dan vitamin E) dan
positif (vitamin E 200 ppm), E1 = ekstrak 25 ppm, E2 = ekstrak 50 ppm, E3 =
ekstrak 75 ppm, E4 = ekstrak 100 ppm, E5 = ekstrak 200 ppm

Contoh perhitungan:
Kadar MDA K (+) A1: y = 0,0163 + 0,1096 x
0,128 = 0,0163 + 0,1096 x
x = 1,0192
% daya hambat K (+) = [MDA] kontrol negatif – [MDA] ekstrak x 100%
[MDA] kontrol negatif
= 5,4017 – 0,9857 x 100%
5,4017
= 81,75%

Lampiran 12 Absorban kurva standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP)

[TMP] (µM) A1 A2 A3 Rerata ± SD
0 0 0 0 0
1 0,111 0,115 0,114 0,113 ± 0,0021
2,5 0,350 0,343 0,360 0,351 ± 0,0085
5 0,523 0,530 0,519 0,524 ± 0,0055
7,5 0,838 0,850 0,860 0,849 ± 0,0110
10 1,108 1,112 1,114 1,111 ± 0,0031
Lampiran 13 Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah metode
DPPH (λ = 517 nm)
Larutan A1 A2 A3 Rerata ± SD Daya hambat (%)
Kontrol 0,502 0,556 0,500 0,519 ± 0,0317 0
E1 0,469 0,431 0,454 0,451 ± 0,0191 13,10
E2 0,415 0,363 0,330 0,369 ± 0,0428 28,90
E3 0,299 0,206 0,314 0,273 ± 0,0552 47,47
E4 0,245 0,176 0,211 0,211 ± 0,0345 59,34
E5 0,112 0,110 0,194 0,138 ± 0,0479 73,41
Keterangan: K = kontrol (larutan DPPH tanpa ekstrak), E1 = ekstrak 25 ppm, E2
= ekstrak 50 ppm, E3 = ekstrak 75 ppm, E4 = ekstrak 100 ppm, E5 = ekstrak 200
ppm

Contoh perhitungan:
% daya hambat E1 = absorban kontrol – absorban ekstrak x 100%
absorban kontrol
= 0,519 – 0,451 x 100%
0,519
= 13,10%

IC50: y = -85,9440 + 30,5332 ln(x)

50 = -85,9440 + 30,5332 ln(x)
ln(x) = 4,4523
x = 85,82 ppm
Lampiran 14 Aktivitas antioksidasi α-tokoferol (vitamin E) metode DPPH (λ =
517 nm)
Larutan A1 A2 A3 Rerata ± SD Daya hambat (%)
Kontrol 0,500 0,501 0,498 0,499 ± 0,0015 0
E1 0,306 0,315 0,309 0,310 ± 0,0045 37,87
E2 0,247 0,208 0,250 0,235 ± 0,0223 52,91
E3 0,198 0,200 0,204 0,201 ± 0,0030 59,72
E4 0,119 0,130 0,128 0,126 ± 0,0058 74,75
E5 0,090 0,100 0,105 0,098 ± 0,0076 80,36
Keterangan: K = kontrol (larutan DPPH tanpa α-tokoferol), E1 = α-tokoferol 1
ppm, E2 = α-tokoferol 2.5 ppm, E3 = α-tokoferol 5 ppm, E4 = α-tokoferol 7.5
ppm, E5 = α-tokoferol 10 ppm

Contoh perhitungan:
% daya hambat E1 = absorban kontrol – absorban ekstrak x 100%
absorban kontrol
= 0,499 – 0,310 x 100%
0,499
= 37,87%

IC50: y = 36,3614 + 18,0913 ln(x)

50 = 36,3614 + 18,0913 ln(x)
ln(x) = 0,7538
x = 2,12 ppm
Lampiran 15 Inhibisi ekstrak etanol 70% daun sirih merah terhadap α-glukosidase
(λ = 400 nm)
Larutan A1 A2 A3 [pNP]1 [pNP]2 [pNP]3 Rerata [pNP] ± Daya
(µM) (µM) (µM) SD hambat
(%)
K (-) 0,437 0,440 0,437 10,0863 10,1535 10,0863 10,1087 ± 0,0387 0
K (+) 0,086 0,080 0,084 2,2185 2,0839 2,1736 2,586 ± 0,0685 78,64
E1 0,437 0,425 0,435 10,0863 9,8173 10,0414 9,9816 ± 0,1441 1,26
E2 0,323 0,334 0,313 7,5309 7,7775 7,3068 7,5384 ± 0,2354 25,43
E3 0,279 0,283 0,288 6,5446 6,6343 6,7464 6,6417 ± 0,1011 34,30
E4 0,270 0,268 0,263 6,3429 6,2981 6,1860 6,2756 ±0,0808 37,92
E5 0,262 0,268 0,248 6,1636 6,2981 5,8497 6,1038 ± 0,2301 39,62
Keterangan: K = kontrol negatif (enzim dan substrat) dan positif (acarbose 1%),
E1 = ekstrak 0,1%, E2 = ekstrak 0,25%, E3 = ekstrak 0,5%, E4 = ekstrak 0,75%,
E5 = ekstrak 1%

Contoh perhitungan:
Kadar pNP K (+) A1: y = -0,012971 + 0,044612 x
0.086 = -0,012971 + 0,044612 x
x = 2,2185
% daya hambat K (+) = [pNP] kontrol negatif – [pNP] ekstrak x 100%
[pNP] kontrol negatif
= 10,1087 – 2,1586 x 100%
10,1087
= 78,64%

Lampiran 16 Hasil kurva standar p-nitrofenol (pNP)

[pNP] (µM) A1 A2 A3 Rerata ± SD
0 0 0 0 0
1 0,034 0,034 0,034 0,034 ± 0
2,5 0,101 0,106 0,100 0,102 ± 0,0032
5 0,206 0,206 0,210 0,207 ± 0,0023
7,5 0,312 0,300 0,308 0,306 ± 0,0061
10 0,400 0,400 0,400 0,400 ± 0
12,5 0,560 0,575 0,550 0,562 ± 0,0125
15 0,691 0,660 0,665 0,672 ± 0,0166
Lampiran 17 Hasil analisis kinetika inhibisi ekstrak etanol 70% daun sirih merah
terhadap α-glukosidase (λ = 400 nm)
 Reaksi enzim substrat tanpa inhibitor (ekstrak 1%)
[S] A1 A2 [pNP]1 [pNP]2 Aktivitas1 Aktivitas2 Rerata aktivitas ±
(mM) (µM) (µM) (U/ml.menit) (U/ml.menit) SD
5 0,177 0,179 4,2583 4,3031 0,5677 0,5737 0,5707 ± 0,0042
10 0,221 0,220 5,2445 5,2222 0,6993 0,6963 0,6978 ± 0,0021
15 0,270 0,270 6,3429 6,3429 0,8457 0,8457 0,8457 ± 0
20 0,298 0,300 6,9705 7,0154 0,9294 0,9354 0,9324 ± 0,0042
25 0,320 0,325 7,4637 7,5757 0,9952 1,0101 1,0026 ± 0,0105

 Reaksi enzim substrat dengan inhibitor (ekstrak 1%)

[S] A1 A2 [pNP]1 [pNP]2 Aktivitas1 Aktivitas2 Rerata aktivitas ±
(mM) (µM) (µM) (U/ml.menit) (U/ml.menit) SD
5 0,032 0,028 1,0080 0,8883 0,1344 0,1184 0,1264 ± 0,0113
10 0,057 0,058 1,5684 1,5908 0,2091 0,2121 0,2106 ± 0,0021
15 0,098 0,099 2,4874 2,5098 0,3316 0,3346 0,3331 ± 0,0021
20 0,110 0,109 2,7564 2,7340 0,3675 0,3645 0,3660 ± 0,0021
25 0,136 0,135 3,3393 3,3168 0,4452 0,4422 0,4437 ± 0,0021

 Nilai 1/[S], 1/V tanpa dan dengan inhibitor

1/[S] 1/V 1/V*
Persamaan garis:
0,2 1,7522 7,9114
 tanpa inhibitor: y = 4,643 x + 0,863; r = 99,00
0,1 1,4331 4,7483
 dengan inhibitor: y = 35,55 x + 0,879; r = 99,50
0,067 1,1825 3,0021
0,05 1,0725 2,7322
0,04 0,9974 2,2537
Keterangan: (*) dengan inhibitor
Contoh perhitungan:
Aktivitas enzim: [pNP] (µM) V = volume enzim dalam sistem reaksi
V.t t = waktu inkubasi
Aktivitas enzim dengan [S] 5 mM = 1,0080 µM
0,5 mL.15 menit
= 0,1344 U/mL.menit

Lampiran 18 Hasil analisis GC-MS

Abundance

TIC: SIRIH MERAH.D

1.4e+07

1.2e+07

1e+07

8000000

6000000

4000000

2000000

0
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
Time-->

Pk# RT Area% Library/ID Qual

_____________________________________________________________________________
1 9.87 1.80 C:\Database\wiley7n.l
n-Hexadecanoic acid 98
Myristic acid 98
Palmitic acid 95

2 11.68 1.78 C:\Database\wiley7n.l

trans-Phytol 91
Phytol 90
Phytol 90

3 12.07 6.13 C:\Database\wiley7n.l

Linolenic acid 91
ethyl linoleolat 91
9,12,15-Octadecatrien-1-ol 90

4 12.28 1.93 C:\Database\wiley7n.l

Stearic acid 99
Octadecanoic acid 99
Octadecanoic acid 98

9 21.15 1.81 C:\Database\Willey and Nist.L

myricetin $ 4'-hydroxy-3',5'-dimethoxyphenyl 43
 4-amino-2-isopropyl-5-methylphenol 35
[2,2'-Binaphthalene]-1,4,5',8'-tetrone 30

10 22.05 2.06 C:\Database\Willey and Nist.L

Pyrazol 25
N-[2-(2-Isopropyl-5-methyl-phenoxy)-ethyl]- 25
2-methylsulfanyl-benzamid
2-Propenoic Acid 25

12 23.56 4.96 C:\Database\Willey and Nist.L

2,4,6(1H,3H,5H)-Pyrimidenetrione 59
Benzenemethanol 59
Benzofuran 58

13 23.87 2.67 C:\Database\Willey and Nist.L

Naphthalene 46
Naphthalene 46
Naphthalene 46

14 24.03 4.05 C:\Database\Willey and Nist.L

2,4,6(1H,3H,5H)-Pyrimidinetrione 59
Benzo[B]Thiophene 53
Benzene 50

15 24.89 12.19 C:\Database\Willey and Nist.L

t-4-Methylstilbene oxide 30
3,5-Dimethoxybenzamide 25
3,4-Dimethoxybenzaldehyde oxime 25

16 26.12 4.52 C:\Database\wiley7n.l

methyl (25R)-5-oxo-A-nor-3,5-secos pirostan-3-oate 90
Endosulfan 55
4-(Ethoxycarbonyl)dibenzo[f,h]quin oline-2,3-dicarboxylate Acid 47
N-Phenylimide

17 27.20 44.69 C:\Database\Willey and Nist.L

4,4'-Stilbenediamine 60
Phenol 38
C-1-(4-methoxyphenyl)-2-phenylethene 38

18 28.42 1.53 C:\Database\Willey and Nist.L

Pyrimidine, 4-amino-6-methoxy-2-(t rifluoromethyl) 44
Pyrimidine, 4-amino-6-methoxy-2-(t rifluoromethyl) 44
Pyrimidine, 4-amino-6-methoxy-2-(t rifluoromethyl) 44

19 28.85 1.83 C:\Database\wiley7n.l

4-Allyloxy-6-methoxy-N,N-dimethyl-1,3,5-triazin-2-amine 91
(E)-2-hydroxy-4'-methylstilbene 64
tricyclo[4.3.3.0(1,6)]dodeca-7,10- diene-7,11-dinitrile 55

23 36.46 1.65 C:\Database\wiley7n.l

Vitamin E 99
dl-.alpha.-Tocopherol 98
Vitamin E 96
Lampiran 19 Analisa statistika data aktivitas antioksidasi dan inhibisi enzim

 Kadar MDA terhadap waktu

ANOVA
Sum of df Mean F Sig.
Squares Square
Between 118.085 9 13.121 844.185 .000
Groups
Within .311 20 1.554E-02
Groups
Total 118.396 29

Duncan
N alpha = .05
Hari 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 3 1.3111
1 3 1.6852
2 3 2.3451
3 3 3.3002
4 3 4.0696
5 3 4.4346
9 3 5.0459
8 3 5.5477
7 3 5.8823
6 3 8.0751
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

 Aktivitas antioksidasi ekstrak etanol 70% daun sirih merah

ANOVA
Sum of df Mean F Sig.
Squares Square
Between 42.481 6 7.080 268.490 .000
Groups
Within .369 14 2.637E-02
Groups
Total 42.850 20

Duncan
N alpha = .05
Konsentrasi 1 2 3 4 5 6
Vitamin E 3 .9857
200 ppm 3 1.0587
100 ppm 3 1.4753
75 ppm 3 1.9985
50 ppm 3 2.3604
25 ppm 3 3.0082
Kontrol negatif 3 5.4017
Sig. .591 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
 Aktivitas inhibisi enzim ekstrak etanol 70% daun sirih merah
ANOVA
Sum of df Mean F Sig.
Squares Square
Between 131.201 6 21.867 1006.349 .000
Groups
Within .304 14 2.173E-02
Groups
Total 131.505 20

Duncan
N alpha = .05
Konsentrasi 1 2 3 4 5
acarbose 3 2.1587
1% 3 6.1038
0.75% 3 6.2757
0.50% 3 6.6418
0.25% 3 7.5384
0.1% 3 9.9817
Kontrol negatif 3 10.1087
Sig. 1.000 .175 1.000 1.000 .309
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

 Kinetika Inhibisi enzim

ANOVA
Sum of df Mean F Sig.
Squares Square
Between 1.695 9 .188 6331.022 .000
Groups
Within 2.975E-04 10 2.975E-05
Groups
Total 1.695 19

Duncan
N alpha = .05
[S] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
5 mM* 2 .1264
10 mM* 2 .2106
15 mM* 2 .3331
20 mM* 2 .3660
25 mM* 2 .4437
5 mM 2 .5707
10 mM 2 .6978
15 mM 2 .8457
20 mM 2 .9324
25 mM 2 1.0027
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000
*) with inhibitor.
Lampiran 20 Dokumentasi hasil penelitian

larutan hasil maserasi waktu inkubasi Aktivitas antioksidan metode

hari ke-6 TBA (konsentrasi ekstrak dari
kiri ke kanan): 0, 25, 50, 75,
100, 200 ppm, dan vitamin E
200 ppm

Aktivitas antioksidan metode Aktivitas antioksidan metode

DPPH (konsentrasi ekstrak dari DPPH (konsentrasi vitamin E dari
kiri ke kanan): kontrol negatif, kiri ke kanan): kontrol negatif, 1,
25, 50, 75, 100, dan 200 ppm 2.5, 5, 7.5, dan 10 ppm

inhibisi enzim α-glukosidase

(konsentrasi kiri ke kanan):
acarbose 1% , 1%, 0.75%, 0.5%,
0.25%, 0.1% dan kontrol negatif