INTRODUCCIÓN

Azospirillum brasilense es una bacteria que tiene importancia industrial como promotor de crecimiento en plantas de interés
comercial.

No hay ningún producto líquido producido en biorreactores a escala piloto que pueda almacenarse a temperatura ambiente
durante más de 2 años.

Azospirillum brasilense es una rizobacteria promotora del crecimiento de plantas (PGPR) por su capacidad para fijar nitrógeno
(diazótrofo) y también por la capacidad de producir señales y componentes clave para la promoción del crecimiento de las
plantas (como auxinas, citoquininas y gibberlellinas, así como óxido nítrico)

Azospirillum spp. son diazotrofos asociados con varias plantas, principalmente trigo, sorgo, cebada, arroz y maíz.

El género Azospirillum pertenece a la clase Alphaproteobacteria y comprende bacterias de fijación de nitrógeno de vida libre,
que producen flagelos polares y peritrícos.

Se denomina como PGPR (plant growth-promoting rhizobacteria) a un conjunto de bacterias que habitan en la rizosfera de las
plantas y que producen en ellas todo tipo de beneficios.

Los diazótrofos son bacterias que hacen fijación de nitrógeno atmosférico en una forma más disponible como es el amonio
(Postgate, 1998). Un diazótrofo es un organismo que es capaz de crecer sin fuentes externas de nitrógeno fijado

Los datos sobre la producción a gran escala de Azospirillum brasilense son escasos, y pocos estudios informaron la producción
de este producto como biofertilizante en biorreactores.
Se han informado diferentes informes sobre factores que afectan el crecimiento y la producción de auxinas clave en Azospirillum
brasilense.
La mayoría de las publicaciones publicadas se basan en el efecto de los componentes de los medios de cultivo sobre el
crecimiento y la vida útil de los inoculantes basados en A. brasilense

Sin embargo, pocos estudios se basan en los parámetros críticos del medio ambiente sobre el crecimiento, como el oxígeno, el
pH o la temperatura.

En el caso de la tensión de oxígeno disuelto (DOT) Didonet y Magalhaes (1997) sugieren que las condiciones de oxígeno semi-
anaeróbico (alrededor del 50% de DOT al comienzo de los cultivos en matraces de agitación) son un factor determinante en la
producción de nitrito y en el incremento de la tasa de crecimiento en diferentes Azospirillum spp.
Además, proponen que la tasa de crecimiento de A. brasilense, el tiempo de cultivo y la producción de auxinas (principalmente
ácido indol-3-acético) están altamente relacionados con bajas concentraciones de oxígeno en el biorreactor (cerca del 3% DOT
durante A. brasilense exponencial crecimiento).
Sin embargo, los cultivos de A. brasilense cercanos al 30% de DOT producen una concentración de biomasa similar en
comparación con aquellos cultivos realizados al 3% de DOT.
Además, la presencia de oxígeno alto (hasta 70% DOT, asociado con algunas fuentes de nitrógeno de carbono) aumenta los
fenómenos de floculación y formación de flóculos por A. brasilense
Además, las tensiones de oxígeno altamente disueltas (> 85% DOT) causan una fase inicial larga de retraso (12 h) y una
disminución en la tasa de crecimiento específico (μ = 0.17 h − 1) en cultivos sumergidos de Azospirillum lipoferum, mientras que
en cultivos realizados con un DOT más bajo (cerca del 30%), una fase de retraso corta (8 h) y una tasa de crecimiento específica
más alta (μ = 0.26 h − 1) fueron observado.

Al ampliar la etapa de fermentación, el objetivo es obtener mayores cantidades de células/productos a gran escala (planta
industrial o piloto) con al menos la misma "viabilidad/calidad" que se obtiene a escala de laboratorio.
Sin embargo, esta no es una tarea fácil debido a los cambios en la geometría de los vasos, una reducción en la calidad de la
mezcla y la ocurrencia de nutrientes / gradientes de oxígeno dentro de los biorreactores.
Para una ampliación exitosa, se debe seleccionar un parámetro clave (o una combinación de algunos) entre los que afectan el
calor, el momento y la transferencia de masa, típicamente agitación, aireación, tiempo de mezcla, entrada de potencia,
velocidad de punta y coeficiente de transferencia de masa de oxígeno (KLa), entre otros.
Además, algunos parámetros físicos deben combinarse para obtener números adimensionales destinados a mantenerse
constantes durante los procesos de ampliación (o reducción). Los más utilizados son el número de potencia y el número de
mezcla adimensional.
El escaso conocimiento sobre la influencia de las condiciones de operación en la transferencia de masa y la hidromecánica en los
matraces de agitación dificultó la ampliación a tanques agitados.
Sin embargo, en los últimos años, las propiedades de los matraces de agitación se han descrito con modelos experimentales y
empíricos, y se ha informado de algunos intentos para intentar escalar desde frascos hasta tanques agitados.
En cultivos aeróbicos, la tasa de absorción de oxígeno (OUR) tiene que ser menor que la tasa de transferencia de oxígeno (OTR)
para garantizar condiciones de cultivo sin limitación de oxígeno.
El OUR depende de la tasa de crecimiento específica, el rendimiento de oxígeno de la biomasa y la concentración de biomasa.
Por otro lado, OTR es la tasa de oxígeno transferido al líquido a granel a través de la interfase gas-líquido (superficie líquida en
matraces de agitación y burbujas y superficie líquida en biorreactores) y puede describirse como sigue:

donde kL es el coeficiente de transferencia de masa,

a es el área de transferencia específica del volumen,
(CL * −CL) es la fuerza impulsora que causa la transferencia de masa;
CL * y CL se refieren a la concentración de oxígeno en fase líquida en la saturación y la concentración de oxígeno en la masa
líquida en cualquier momento, respectivamente.

Para evaluar si un recipiente de cultivo dado podría suministrar oxígeno a una velocidad no limitante, es esencial tener una
buena estimación de la capacidad de transferencia de oxígeno del recipiente. Esto se puede medir en términos del coeficiente
de transferencia de masa de oxígeno (KLa).
El KLa a menudo sirve para comparar la eficiencia de los biorreactores y sus dispositivos de mezcla y, como se dijo
anteriormente, es un criterio importante de ampliación en los bioprocesos.

Nuestro grupo de investigación desarrolló un medio de cultivo optimizado para la producción de una formulación inoculante
líquida basada en la bacteria plantas A. brasilense en matraces de agitación para una empresa en México.
Aunque el inoculante ya se vende en México desde 2003, el nuevo medio de cultivo optimizado (producido en concentraciones
celulares más altas y una vida útil más larga) era necesario para ampliarlo a grandes biorreactores.
Además, fue necesario probar las características del inoculante y el promotor de crecimiento en las plantas, en comparación con
los fertilizantes químicos.

En este trabajo, se presenta una estrategia práctica de escalamiento de magnitud de cuatro órdenes, basada en datos empíricos
y experimentales del coeficiente de transferencia de masa volumétrica (KLa).
El éxito de la estrategia de ampliación es demostrado por:
- la concentración final de biomasa,
- la vida útil
- y los experimentos de inoculación de invernaderos realizados con la formulación final de inoculante líquido.

OBJETIVOS

El objetivo de este trabajo fue escalar un proceso para la producción de la bacteria para la formulación de un inoculante líquido
desde un matraz de agitación a un biorreactor a escala de laboratorio de 10 L y a escala piloto de 1,000 L

otros objetivos
determinar la vida útil de la formulación líquida almacenada a temperatura ambiente y aumentar el rendimiento de los cultivos
de maíz en invernaderos.
MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas A. brasilense y medios de cultivo

Dos cepas de A.B., nativas de México, aisladas previamente.

Estas cepas están en la colección de cultivos de la compañía “Biofábrica siglo XXI’’ y un banco de células adicional está en la
colección de cultivos del Centro de Ciencias Genómicas.
La única diferencia entre ambas cepas es la capacidad de adaptarse a diferentes tipos de suelos dentro del país. Esta es la razón
por la cual la formulación final del inoculante se compone de una mezcla de estas dos cepas.

Los pre-cultivos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 500 ml a 30 ° C, 150 rpm, con 100 ml de NFb modificado, que
contiene en gramos por litro lo siguiente:

 5.0 ácido málico

 0.5 K2HPO4
 0.2 MgSO47H2O
 0.1 NaCl
 0.02 CaCl2
 0.012 FeSO4
 0.0015 Na2MoO4
 MnSO4
 4.8 KOH
 0.3 NH4Cl
 H3BO4
 0.3 extracto de levadura

El crecimiento se determinó por densidad óptica a 600 nm (espectrofotómetro Beckman DU730).

Además, las unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro se determinaron mediante diluciones en serie 1:10 con NaCl
al 0,85%, cultivadas en medio NFb con colorante rojo Congo (2,5 ml de 1% p / v de colorante por 1,000 ml de medio NFb ) que
se utilizó para diferenciar Azospirillum de los otros géneros a 30 ± 2 ° C durante 48 h. Las UFC finales por mililitro se
determinaron multiplicando el número de colonias en la placa de Petri por el factor de dilución.

El protocolo de la unidad de formación de colonias también se usó para controlar la vida útil de los cultivos bacterianos pre
formulados a temperatura ambiente (22–26 ° C). La formulación de estantería es una formulación patentada por ‘’Biofábrica
Siglo XXI’’. Los ensayos se realizaron mensualmente por triplicado. El pH de los cultivos bacterianos pre formulados se midió en
las mismas muestras utilizadas para la vida útil, con un medidor de pH.

Condiciones de cultivo, biorreactores y control A. brasilense

Start y Calf se cultivaron en Erlenmeyer de 500 ml agitados individuales que contenían 100 ml de un nuevo medio de cultivo
enriquecido modificado a 30 ° C y 220 rpm.
Este nuevo medio de cultivo no definido recientemente modificado fue optimizado para aumentar el crecimiento de la biomasa.
Esta optimización se basó en el medio NFb, variando la relación carbono / nitrógeno.

Start y Calf también se cultivaron en biorreactores de 10 y 1,000 L en un medio de cultivo enriquecido no definido recientemente
modificado.

Los cultivos en tanques agitados de 14 L (Volumen de trabajo de 10 L), diámetro del tanque de 21 cm, equipados con tres
impulsores Rushton (relación de impulsor / diámetro del tanque = 1: 3), y cuatro deflectores de 1/10 de diámetro del tanque.
El pH se controló dentro de 7.0 ± 0.2 mediante un control de encendido y apagado que agregó H3PO4 (40%). Todas las
fermentaciones se llevaron a cabo a 30 ° C usando una velocidad de agitación de 205 rpm y un caudal de gas total de 5.0 L / min.
La tensión de oxígeno disuelto, la temperatura, la agitación y el pH se mostraron en línea y se almacenaron en un disco duro para
su posterior análisis.

Los cultivos sumergidos a escala piloto se llevaron a cabo en lotes, en un tanque de agitación de 1.400 L (volumen de trabajo
máximo de 1.000 L) y cabeza toriesférica de diámetro 0,94m y altura 1,88 m, equipado con tres impulsores Rushton de 0,31 m
(relación impulsor / diámetro del tanque = 1: 3). Los impulsores Rushton son discos de un diámetro de 0,19 m y una altura y ancho
de pala de 0,06 y 0,07 m, respectivamente. El tanque estaba equipado con cuatro deflectores de 1/10 de diámetro del tanque.
Todas las fermentaciones se realizaron a 30 ° C usando una velocidad de agitación de 52 rpm. El aire fue rociado en el fondo del
tanque por un anillo rociador a 500 L / min (0.5 vvm), y la presión de la cabeza fue controlada a 0.2 kg / cm2. El control de pH a
7.0 ± 0.2 se realizó mediante un control de encendido y apagado, agregando H3PO4 concentrado. El volumen de llenado, la tensión
de oxígeno disuelto, la temperatura (cultivo y esterilización), la agitación y el pH se mostraron en línea y se almacenaron en un
disco duro para su posterior análisis.

Determinación de la KLa para matraces de agitación

La correlación empírica informada por Klöckner y Büchs (2012) se utilizó para la evaluación de KLa. Esta correlación se realizó
utilizando el método químico de consumo de oxígeno (sulfito), considerando los siguientes parámetros operativos en unidades SI:

 diámetro máximo del matraz de agitación interior (d) (en metros),

 frecuencia de agitación (n) (uno por segundo)
 diámetro de agitación (d0) (en centímetros)
 llenado volumen (V) (en metros cúbicos)

Método sulfito: Este método se basa en la reacción de un agente reductor (sulfito de sodio) con el oxígeno disuelto en agua para
producir sulfato, en presencia de un catalizador (generalmente Cu o Co).

2 Na2SO3 + O2 Cu ++ 2 Na2SO4

Determinación experimental de la KLa para biorreactores de 10 y 1,000 l.

En biorreactores de 10 y 1,000 L, tambien se usó el método de consumo de oxígeno químico experimental (sulfito).
El KLa se determinó usando agua corriente en biorreactores de 10 y 1,000 l.
Sin embargo, se realizaron algunos experimentos para determinar KLa (por el mismo método) utilizando los medios de cultivo
enriquecidos no definidos modificados, y no se encontraron diferencias significativas.

Los recipientes de cultivo se llenaron primero hasta el volumen de trabajo con agua/medio.
El agua/medio se purgó luego con oxígeno agregando una cantidad suficiente de sulfito de sodio hasta que el medio estuvo libre
de oxígeno.
Finalmente, el sistema se roció con aire, y la tensión de oxígeno disuelto resultante se midió en línea mediante el sensor (InPro)
de oxígeno disuelto.
El coeficiente de transferencia de masa (KLa) se determinó integrando la ecuación. 1 (como se presenta en la ecuación 3), lo que
resulta en la ecuación. 4.
El valor de KLa fue la pendiente lineal resultante, trazando la expresión logarítmica contra el tiempo.

Experimentos de promoción del crecimiento de las plantas

Se esterilizaron superficialmente semillas de maíz (Zea mays) sumergiéndolas durante 5 minutos en hipoclorito de sodio (5%)
seguido de cinco lavados con agua destilada estéril. Se llevaron a cabo cuatro tratamientos al mismo tiempo, y para cada uno, se
sembraron cinco semillas en cinco macetas.
Todas las macetas se llenaron con 5 kg de tierra estéril y se regaron con una solución nutritiva (Jensen, 50% de la fuente de
nitrógeno) una vez por semana, alternando con agua corriente dos veces por semana.
La composición del medio Jensen está en gramos por litro de la siguiente manera:

 20 Sacarosa
 K2HPO4 1.0
  MgSO4 · 7H2O 0.5
 0.5 NaCl
 FeSO4
 0.005 Na2MoO4 · 4H2O
 2.0 CaCO3

Todas las macetas se mantuvieron en un invernadero a 23–28 ° C y un período de luz de 12–13 h.

La primera prueba fue el control, donde solo se agregó fertilizante químico (1,000 mL de solución Jensen una vez por semana).

En la segunda prueba, se agregó A. brasilense del biorreactor de 1,000 L de 8 meses de vida útil en una proporción de 1 × 104CFU
/ semilla.

El tercer experimento fue similar al segundo, pero se agregó 1 × 104 UFC / semilla a otro cultivo de 1,000 L de una vida útil de 2
meses.

Finalmente, el cuarto experimento fue similar al segundo y al tercero, pero este tratamiento se consideró como un control positivo
al agregar el producto convencional de ‘’Biofábrica Siglo XXI’’ (una vida útil de 8 meses) en una proporción de 1 × 104 UFC / semilla.

Después de la germinación, todas las plantas crecieron hasta 60 días. La recolección se realizó cortando el tallo del suelo y quitando
las mazorcas para pesarlas por separado (la hoja que rodea la mazorca se pesa junto con la biomasa aérea).
Se determinó la biomasa seca (secada durante 48 ha 70 ° C en horno)

Análisis estadístico.

Todas las mediciones de KLa y los matraces de agitación y los cultivos sumergidos en biorreactor se realizaron al menos por
triplicado.
Los experimentos de promoción del crecimiento de las plantas se realizaron por quintuplicado.

Se realizó un ANOVA unidireccional para muestras independientes y comparaciones por pares utilizando Tukey HSD (prueba para
después del ANOVA) para calcular las diferencias estadísticas, a menos que se indique lo contrario. Los análisis se realizaron
utilizando Excel 2007, y el sitio web VassarStats.

RESULTADOS

El coeficiente de transferencia de masa volumétrica (KLa) fue el criterio utilizado para ampliar el proceso de cultivo desde
matraces de agitación hasta biorreactor de 10 y 1,000 l.
Figura (1)
Fig. 1 Coeficiente de transferencia de masa volumétrica (KLa) en función de la frecuencia de agitación. La línea de guión corta representa los datos utilizando la
correlación no empírica para los matraces de agitación informados por Klöckner y Büchs (2012). Los círculos y cuadrados representan datos experimentales de
KLa en biorreactores de 10 y 1,000 L, determinados por la reacción de oxidación de sulfito

La Figura 1 muestra:
- la estimación de la KLa que ocurre en un matraz de agitación usando la ecuación propuesta por Klöckner y Büchs (2012)
- la KLa que ocurre en biorreactores de 10 y 1,000 L determinados experimentalmente.
Para un KLa de 31 h − 1, se requiere una agitación de 220 rpm en matraces Erlenmeyer convencionales de 500 ml (que
contienen 100 ml de medio de cultivo).
Se realizó un estudio del efecto de la velocidad de agitación en los matraces de agitación, y el mejor crecimiento de AB se
obutvo a 220 rpm, evaluando 100, 150, 200, 220 y 250 rpm (datos no mostrados).

Para obtener un valor similar de KLa (31 h − 1), el biorreactor de 10 L debe agitarse a 205 rpm (manteniendo una aireación de
0.5 vvm) mediante el uso de una interpolación de KLa experimental medida por el consumo de oxígeno químico (sulfito) (Figura
1).

Finalmente, para escalar este cultivo a un biorreactor de 1,000 L usando el mismo KLa (31 h − 1), se requiere una agitación de 52
rpm, manteniendo un flujo de aire de 0.5 vvm (Fig. 1).

El efecto del aumento de escala, basado en KLa, sobre el crecimiento de dos cepas diferentes de A. brasilense se muestra en la
Fig. 2.
Fig. 2
Crecimiento de biomasa medido como densidad óptica (puntos) y unidades formadoras de colonias (triángulos) para cepas de A. brasilense Start (símbolos
rellenos) y de ternera (símbolos abiertos) cultivadas en matraces de agitación (a), biorreactor de 10 L (b), y biorreactor de 1.000 l (c), que aumenta su escala al
mismo coeficiente de transferencia de masa volumétrica (KLa, determinado por la reacción de oxidación de sulfito).
Comportamiento de tensión de oxígeno disuelto durante el cultivo para biorreactor de 10 L (d) y biorreactor de 1000 L (e). Condiciones de funcionamiento:
matraces de agitación: volumen de llenado de 100 ml (matraces de volumen nominal de 500 ml), 30 ° C, frecuencia de agitación de 220 rpm y diámetro de
agitación de 2,54 cm; Fermentador de 10 l: a 30 ° C, 205 rpm y 0,5 vvm; Fermentador de 1,000 L: temperatura de 30 ° C, velocidad de agitación de 52 rpm y 0.5
vvm

Como se observa, el crecimiento fue seguido en todos los cultivos midiendo la densidad óptica en al menos tres experimentos
independientes (por escala) y midiendo las unidades formadoras de colonias por mililitro al final de los cultivos.
Con la intención de proporcionar uniformidad en la comparación del crecimiento de A. brasilense, se decidió iniciar todos los
matraces de agitación y biorreactores a una densidad óptica de 0.1 ± 0.04 unidad de absorbancia (AU) utilizando el volumen
correspondiente de inóculo y completando el volumen de reacción al tamaño de la escala.

La Figura 2 (a) muestra la cinética de crecimiento de los cultivos en matraces de agitación, y no se observaron diferencias
significativas entre ambas cepas de A. brasilense (2.33 ± 0.4 y 2.08 ± 0.1 A.U. para terneros y de inicio, respectivamente).

Se encontró un comportamiento similar en cultivos realizados en biorreactores de 10 L (Fig. 2 (b)), donde 2.12 ± 0.23 y 2.31 ±
0.22 A.U. se encontraron al final de los cultivos de cepas Start y Calf, respectivamente, sin diferencias significativas.

Para cultivos de biorreactor de 1000 L, se tomó la decisión de fusionar ambas cepas en el mismo inóculo, en vista del hecho de
que, para las pruebas de campo y la vida útil del producto, ambas cepas se usan en la formulación final. Además, se había
demostrado que no había competencia en el crecimiento de ambas cepas, y la única diferencia entre estas cepas es la capacidad
de adaptarse a diferentes tipos de suelos en México (datos no mostrados). Al ampliar este cultivo hasta 1,000 L, una biomasa
máxima de 2.52 ± 0.14 A.U. se observó (Fig. 2 (c)), y no se encontraron diferencias significativas entre los matraces de agitación y
los cultivos de biorreactor de 10 l.

Los datos reportados en este trabajo están en el mismo rango que aquellos reportados para cultivos discontinuos por Ona et al.
(2005), quienes reportaron un crecimiento máximo de 1.596 ± 0.06, 1.338 ± 0.06, 0.824 ± 0.07 y 0.682 ± 0.06 A.U. para
diferentes fuentes de carbono de L-malato, D-gluconato, D-fructosa y DL-lactato, respectivamente.
Cada una de estas fuentes de carbono se usó a una concentración de 0.02M en un medio mínimo (MMAB) (Vanstockem et al.
1987), suplementado con tetraciclina (25 μg / mL). Usando 5.0 g / L de L-malato, Ona et al. (2005) informaron un máximo de
2.045 ± 0.05 A.U.
Sin embargo, una estrategia de alimentación por lotes no aumentó el crecimiento de la biomasa (1.839 ± 0.08 A.U.).

La exitosa estrategia de ampliación también se corroboró midiendo las unidades formadoras de colonias al final de cada cultivo
(Fig. 2). Al comparar la viabilidad final de la cepa de ternera A. brasilense en matraces de agitación (5,56 ± 0,40 × 108 UFC / ml) y
cultivos de biorreactor de 10 L (5,71 ± 0,22 × 108 UFC / ml), no se obtuvieron diferencias significativas. Se obtuvo el mismo
resultado para la cepa de A. brasilense Start sin diferencias significativas entre los matraces de agitación (4,65 ± 0,32 × 108 UFC /
ml) y los cultivos de biorreactor de 10 L (4,81 ± 0,22 × 108 UFC / ml).
Sin embargo, se encontraron diferencias significativas entre las cepas que usan el mismo vaso de crecimiento. Probablemente
esto se deba a una mayor capacidad en la acumulación de polihidroxialcanoatos intracelulares (principalmente
polihidroxibutirato o PHB) para la cepa A. brasilense Start. En observaciones microscópicas, A. brasilense Start parece tener
gránulos de PHB más altos que en el ternero A. brasilense. Sería interesante medir la cantidad de PHB acumulada por las
bacterias y determinar la relación entre la cantidad de este polisacárido y la vida útil del producto.

Las tasas de crecimiento específicas de los cultivos en matraces con agitación fueron 0.25 ± 0.02 y 0.23 ± 0.02 h − 1 para las
cepas Start y Calf, respectivamente.
No se encontraron diferencias significativas con los cultivos realizados en biorreactor de 10 L (0.25 ± 0.02 y 0.26 ± 0.03 h − 1 para
cepas Start y Calf, respectivamente) y biorreactor de 1000 L (0.21 ± 0.03 h − 1). Comparando la tasa de crecimiento específica
para ambas cepas de A. brasilense en las tres escalas, fueron similares a las reportadas por Ona et al. (2005) (0,20 ± 0,03 h − 1).
Sin embargo, Ona et al. (2005) informaron que se observaron dos patrones de crecimiento distintos en la fase de crecimiento:
una fase de crecimiento rápido inicial (μ1) seguida de una segunda fase de crecimiento lento (μ2). La transición se observó
cuando se agotó la fuente de carbono. Se informó un promedio de 0.20 ± 0.03 y 0.09 ± 0.07 h − 1 para μ1 y μ2, respectivamente.
En este trabajo, no se observó fase de desaceleración a ninguna escala (Fig. 2). Esto puede deberse a diferencias entre los
cultivos.
Las fórmulas medianas utilizadas por Ona et al. (2005): un medio mínimo L-malato y los medios de cultivo enriquecidos
modificados no definidos.

Al modificar la agitación a 400 rpmin en un biorreactor de 10 L, KLa aumentó en 264% (83 h − 1), y la concentración final de
biomasa (2.09 ± 0.35 AU) no se vio afectada en comparación con la obtenida en un KLa de 31 h −1, pero la tasa de crecimiento
se redujo en casi un 35% (0.16 ± 0.02 h − 1), y se observó una breve fase de retraso en el crecimiento registrado (datos no
mostrados). En esos cultivos (realizados a una KLa de 83 h − 1), el DOT no disminuyó significativamente, y los valores por encima
del 90% de DOT (con respecto a la saturación del aire) siempre estuvieron presentes en el cultivo, pero en cultivos realizados a
una KLa de 31 h − 1 (ya sea en biorreactores de 10 o 1,000 L), el DOT disminuyó a valores cercanos al 30% de DOT en la fase de
crecimiento exponencial (Fig. 2 (d, e )).
Esos datos son consistentes con los reportados previamente por Paul et al. (1990), quienes informaron, en cultivos realizados en
KLa entre 48 y 65 h − 1 (concentración de oxígeno más baja, <30% DOT), una fase de retraso corta (8 h) y una tasa de
crecimiento más rápida (μ = 0.26 h− 1), mientras que se obtuvieron una fase inicial larga de retraso (12 h) y una disminución en
la tasa de crecimiento específica (μ = 0.17 h − 1) en KLa entre 90 y 120 h − 1 (altas concentraciones de oxígeno durante el
cultivo,> 85% DOT).
Fig. 3
Viabilidad de la formulación de inoculante líquido de A. brasilense (mezcla de cepas Start y Calf) mantenida a temperatura ambiente (alrededor de 22–26 ° C) y
medida como unidades formadoras de colonias para cultivos cultivados en matraces de agitación (puntos llenos) ), Biorreactor de 10 L (triángulos abiertos) y
biorreactor de 1000 L (cuadrados abiertos). b Evolución del pH de la formulación de inoculante líquido durante la vida útil.

Está claro que la promoción del crecimiento depende de la presencia de bacterias vivas, y el efecto sobre las raíces está
directamente relacionado con la concentración bacteriana de A. brasilense. Para producir un efecto beneficioso sobre el maíz, se
ha informado que la concentración bacteriana óptima es 1.0 × 107 UFC / planta. En México, los inoculantes disponibles en el
mercado generalmente tienen un título entre 1 × 107 y 1 × 108 CFU / mL, y 250 mL de producto preformulado es una cantidad
adecuada para 1.0 ha (2.47 ac). Se almacenaron suficientes muestras de cada cultivo a temperatura ambiente para controlar la
vida útil de los cultivos bacterianos preformulados líquidos de matraces de agitación, cultivos de biorreactor de 10 y 1,000 l (Fig.
3a), y se sacrificaron al menos tres muestras cada vez que se realizaba una viabilidad. Se realizó la lectura.
No se obtuvieron diferencias significativas en la vida útil durante los primeros 8 meses entre cultivos en cada escala. Además, se
perdió un orden de magnitud después de un período de vida útil de 2 años para aquellos cultivos llevados a cabo en un
biorreactor de 1,000 L. Estos datos mejoran los datos reportados por Fallik y Okon (1996), donde en cultivos alimentados por
lotes de A. brasilense se obtuvieron 1–3 × 1010 UFC / ml, y se perdieron dos órdenes de viabilidad de magnitud después de 6
meses de almacenamiento en diferentes portadores sólidos (turba molida o granulada, vermiculita, talco en polvo, gránulos de
basalto y bentonita). Se informó una formulación basada en células quísticas de Azospirillum en medio de sales mínimas donde
se observó la supervivencia de las células quísticas hasta 1 año y 2 meses, y se mantuvo 1 × 108 UFC / ml. Como se muestra en la
Fig. 3b, a medida que la viabilidad disminuye con el tiempo de almacenamiento, el pH aumenta de valores cercanos a 6.2 a 8.5
en 2 años. Aunque no hay informes (que sepamos) de la relación directa entre el pH y la pérdida de viabilidad en A. brasilense,
creemos que este aumento debería deberse a que la lisis permite una salida de material intracelular.
Fig. 4.
Peso seco de la biomasa aérea Z. mays (punteada) y mazorcas (rayadas) en experimentos de promoción del crecimiento de las plantas. Cada experimento se
realizó por quintuplicado, y se presentan las desviaciones estándar de la biomasa completa (sobre el suelo) y las mazorcas. La primera prueba fue el control,
donde se agregó una solución nutritiva (Jensen, 50% de la fuente de nitrógeno) una vez por semana, alternando con agua corriente dos veces por semana. En la
segunda prueba, se añadió la mitad del fertilizante químico a cada maceta y se añadieron 1 × 104 UFC / semilla (del cultivo de 1000 L), con una vida útil de 8
meses. El tercer experimento fue similar al segundo, pero se agregó 1 × 104 UFC / semilla (de otro cultivo de 1,000 L), con una vida útil de 2 meses. El cuarto
experimento fue similar al segundo y al tercero, pero se añadió 1 × 104 UFC / semilla de la formulación sólida de turba, con una vida útil de 8 meses. Después de
la germinación, todas las plantas crecieron hasta 60 días después de la siembra

La Figura 4 muestra cuatro experimentos de promoción del crecimiento de las plantas.

Como se ve en la figura, en el experimento de control que usa solo solución de nutrientes fertilizantes químicos (Jensen, 50% de
la fuente de nitrógeno) una vez por semana, alternando con agua corriente dos veces por semana, un promedio de 21.4 ± 3.6 g
de biomasa aérea y Se obtuvo un promedio de mazorca de 16.8 ± 7.7 g.
Se encontraron diferencias significativas al comparar el primer experimento, donde se usó fertilizante químico solo, con todos
los otros experimentos donde se usó biofertilizante. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias significativas entre los
experimentos con A. brasilense de cultivo de 1000 L con una vida útil de 8 o 2 meses y el control positivo con una vida útil de 8
meses.
En promedio, en ensayos de biofertilizantes, se obtuvieron 36.5 ± 7.3 y 32.7 ± 6.5 g de biomasa y mazorcas sobre el suelo,
respectivamente.
DISCUSIÓN

Bajo un coeficiente de transferencia de masa de oxígeno constante (KLa), se escaló con éxito un proceso de fermentación de
matraces de agitación a biorreactores de 10 y 1,000 l.
Se obtuvo una concentración que oscilaba entre 3,5 y 7,5 x 108 UFC / ml en matraces de agitación y biorreactores,
y después de 2 años almacenados a temperatura ambiente, la formulación líquida mostró una disminución de un orden de
magnitud.
Las aplicaciones de las bacterias cultivadas en los rendimientos de maíz resultaron en aumentos de hasta 95% en mazorcas de
maíz y 70% en biomasa aérea.

En este trabajo, utilizando un criterio de escala de transferencia de oxígeno, se presentó una nueva forma de obtener grandes
cantidades de inoculantes basados en A. brasilense.
Además, bajo este proceso de ampliación, se alcanzan altas concentraciones celulares, medidas como unidades formadoras de
colonias.
Se puede suponer que el uso de valores bajos de KLa para ampliar este bioproceso es un parámetro que se utilizará para ampliar
PGPR similar, debido a su sensibilidad al oxígeno altamente disuelto en los biorreactores
Sería interesante evaluar valores más bajos de KLa en matraces de agitación o en biorreactores. Por ejemplo, en los matraces de
agitación, el oxígeno se transfiere del espacio de cabeza al volumen del líquido, y el KLa puede modificarse simplemente
aumentando el volumen de llenado o disminuyendo la velocidad de agitación (Klockner y Buchs 2012; Maier 2002).

Además, bajo una formulación líquida adecuada para la conservación a temperatura ambiente, se puede alcanzar una vida útil
del producto de hasta 2 años. Esto se obtuvo mediante el diseño de una formulación líquida adecuada. Como se ve en la Fig. 3,
después de 24 meses, se encontró viabilidad de alrededor de 108 UFC / ml utilizando células viables en cultivos bacterianos
preformulados. El almacenamiento y la utilización de polímeros de polbetahidroxialcanoato (principalmente PHB) son
importantes para la vida útil de las bacterias en la producción de inoculantes, y algunos informes presentan a A. brasilense como
un excelente productor, que comprende hasta el 70% del peso seco de la célula. Aunque el objetivo de este trabajo no es
determinar la producción de PHB, sería interesante evaluar la relación entre la producción de este polisacárido y la vida útil de
A. brasilense. Además, será valioso evaluar el efecto de las condiciones ambientales de cultivo (como el pH y la tensión de
oxígeno disuelto) en la formación de PHB en A. brasilense para desarrollar nuevas formulaciones de inoculantes.

Incluso se encontraron diferencias sutiles en las formulaciones de pH (Fig. 3b), no se observó ningún efecto sobre la vida útil de
los tres tipos de biorreactores. Estas diferencias en el pH pueden deberse a variaciones en la formulación de inoculantes, así
como a cierta disparidad en la agregación bacteriana para cada cultivo (Burdman et al. 1998). Los aumentos de pH observados
en la figura 3b podrían estar asociados con la liberación de un material intracelular (implicado en la muerte celular) y / o la
aparición de subproductos en el consumo de PHB.

Además, el producto final puede aumentar significativamente el rendimiento de la biomasa aérea y las mazorcas de maíz en
plantas en experimentos con invernadero. En comparación con los cultivos que utilizan solo fertilizantes químicos, se obtuvo un
aumento de al menos el 70% del peso de la biomasa aérea y del 95% en las mazorcas en las plantas biofertilizadas. Se ha
informado repetidamente un aumento en la productividad del maíz con Azospirillum tanto en invernaderos como en campos
experimentales.
En general, se ha mencionado que la inoculación con Azospirillum sp. resultó en un aumento significativo del 10 al 30% (Bashan
et al. 2004). Aunque las estrategias experimentales son diferentes, se pueden mencionar pocos informes, como los que miden la
biomasa aérea; Se ha informado un aumento de hasta el 70% en Argentina en la temporada 2007/2008 (Puente et al. 2009).
Además, 15 días después de sembradas las semillas, se observó un aumento del 22 al 60% de los brotes aéreos de maíz por
inoculación con A. brasilense, y el peso seco maduro aumentó del 27 al 34% (Lin et al. 1983).