Universitatea Tehnică "Gheorghe Asachi" din Iaşi

Facultatea de Inginerie Chimică şi Protecţia Mediului

"Cristofor Simionescu"

Determinarea concentraţiei de compuşi fenolici

Profesor coordonator:

Masterand:

IAŞI
2019

CUPRINS
CAPITOLUL 1 ASPECTE GENERALE ALE COMPUŞILOR
FENOLICI............................................................................................................3
CAPITOULUL 2 APARATURĂ UTILIZATĂ……………………..……..…….5
2.1 SPECTROFOTOMETRIA ………………………………………...…..5
2.2 SPECTROFOTOMETRUL SPECORD 200 PLUS...........................6
CAPITOLUL 3 METODE DE ANALIZĂ CHIMICĂ.......................................8
3.1 PRINCIPIUL METODEI.....................................................................8
3.2 .REACTIVI............................................................................................8
3.3 MOD DE LUCRU................................................................................9
CAPITOLUL 4 REZULTATE OBTINUTE......................................................11
BIBLIOGRAFIE.................................................................................................13
 CAPITOLUL 1
ASPECTE GENERALE ALE COMPUŞILOR FENOLICI

Printre beneficiile speciei Brassica, amintim potenţialul glucozinolaţilor, ce au proprietăţi

anticancerigene, dar de asemenea, beneficile sunt legate şi de amestecul complex de compuşi
fitochimici care au activitate antioxidantă, şi unde sunt evidenţiaţi compuşii fenolici (Vale, 2014).

Aceştia sunt compuşi care rezultă din metabolismul secundar şi adesea sunt sintetizaţi de
plante ca răspuns la situaţiile de stres. Ca şi glucozinolaţi, compuşii fenolici au proprietăţi bioactive
cu interferenţe în sănătatea umană (Vale, 2014) şi, împreună cu acidul ascorbic, ele sunt cel mai
mare grup de antioxidanţi din brassicaceae.

Potenţialul antioxidant al compuşilor fenolici rezultă din proprietăţile lor chimice, în timp ce
donatorii de hidrogen, acţionează precum potenţiali terorişti ai radicalilor liberi (Rice-Evans şi
colab., 1996).

Termenul de compuşi fenolici corespunde unui grup de substanţe, care include mai mult de
8000 de structuri diferite (Cartea şi colab., 2011), care sunt clasificate în clase, în funcţie de
structura lor chimică şi subclasificate în funcţie de numărul şi poziția grupării hidroxil și de prezența
altor constituenți (Vale, 2014). Acești compuși pot apărea în formă liberă sau legată de zaharuri
(glicozide) sau proteine (Croft, 1998), şi poate varia de la compuşii masei moleculare, cu un singur
inel aromatic, până la taninuri şi polifenoli complecşi (Pereira şi colab., 2009).

Compuşii fenolici reprezintă un interes crescut pentru cercetători, datorită capacităţii lor
antioxidantă şi a beneficiilor aduse organismului uman. Studiile de laborator au demonstrat că
flavonoidele încetinesc creşterea tumorii, au proprietăţi anti-inflamatorii şi previn apariţia
cheagurilor de sânge (Kris-Etherton şi colab., 2002).
Clasificarea acestor compuși se face pe baza numărului și a aranjamentului de atomi de
carbon, fiind clasificate în compuși ai flavonoidelor şi compuşi ai non-flavonoidelor. Polifenolii,
inclusiv subcategoria lor, flavonoidele, sunt omniprezente în toate plantele. În Brassicaceae,
compuşii fenolici ce se găsesc mai des sunt flavonoidele, în special flavonele şi antocianii (Vale,
2014). Flavonoidele, constituie grupul de compuşi fenolici cel mai dispersat şi mai diversificat.
Structura de bază a flavonoidelor este formată din două inele benzoice (A și B) și un al treilea inel
(C), care poate fi un piranoheterociclic sau o pironă.
 Până în prezent, au fost identificate peste 4000 de compuşi diferiţi de flavonoide, dintre
care mulţi sunt responsabili pentru culorile atractive ale florilor, fructele şi al frunzelor, în
special prin culorile galben, portocaliu şi roşu (Patel, 2008).

Mai multe studii relevă prezenţa compuşilor fenolici în diferite plante din genul
Brassica.
Printre aceste plante, broccoli a fost cel mai studiat, iar diferitele studii efectuate arată
un potenţial ridicat de antioxidanţi, asociat cu nivelul ridicat de compuşi fenolici
(Llorach şi colab.,2003).

Cu toate acestea, profilul fenolic al germenilor este diferit de profilul plantelor adulte
(Vale, 2014).
 CAPITOLUL 2

APARATURĂ UTILIZATĂ
2.1 Spectrofotometria

Este o ramură a spectroscopiei care se ocupă cu măsurarea cantitativă a proprietăților de

reflexie sau de transmisie ale unui material (substanță) în funcție de lungimea de undă. Termenul
de spectrofotometrie este specific măsurătorilor în care este utilizată radiația electromagnetică
din spectrul infraroșu (IR), vizibil (VIS) și ultraviolet (UV), ea făcând astfel parte din
spectroscopia electromagnetică. În practică, metoda se bazează pe proprietatea de absorbție sau
de transmisie a compușilor chimici la diverse lungimi de undă. Astfel, spectrofotometria este
folosită atât ca metodă calitativă pentru identificarea prezenței unei substanțe într-o soluție, cât și
cantitativă pentru identificarea concentrației unei substanțe dintr-o soluție. De asemenea, metoda
poate fi utilizată pentru determinarea constantei de echilibru a unei soluții. Într-o reacție chimică,
echilibrul chimic este starea în care ambii reactanți și produși sunt prezenți în concentrații care
nu mai manifestă tendința de modificare în timp. De obicei, această stare se atinge când reacția
directă are loc cu aceeași rată ca și reacția inversă. Ratele de conversie a reacției directe și a celei
inverse sunt diferite de zero dar, fiind egale, nu există modificări nete ale concentrațiilor
reactantului și produsului. Acest proces se numește echilibru dinamic. Din punct de vedere
spectrofotometric, determinarea concentrațiilor reactanților și produșilor într-o astfel de situație,
presupune măsurarea luminii transmise de către soluție. Orice compus chimic absoarbe,
transmite sau reflectă lumină (radiație electromagnetică) în cadrul unui interval de lungimi de
undă. Aparatele destinate acestor măsurători se numesc spectrofotometre.
Spectrofotometrul este un instrument capabil să măsoare cu precizie cantitatea de fotoni
(intensitatea luminii) absorbită de trecerea lor printr-o probă (soluție). Astfel, se poate determina
indirect și cantitatea de substanță (concentrația). În funcție de spectrul lungimilor de undă pe care
le emite sursa de lumină, spectrofotometria are două variante: – UV/VIS utilizează lungimi de
undă cuprinse între 185 – 400 nm (UV) și 400 – 750 nm (VIS). – IR utilizează lungimi de undă
cuprinse între 750 nm – 1000 µm.
Spectrofotometria UV/VIS este utilizată cel mai frecvent în chimia analitică
pentru determinarea cantitativă:
1) A soluțiilor ce conțin cationi ai metalelor tranziționale, majoritatea fiind colorate
(absorb radiații electromagnetice din spectrul vizibil) datorită electronilor de pe orbitalii de tip d
care pot fi ușor excitați fiind astfel determinați să execută tranziții cuantice. Culoarea soluțiilor
ce conțin astfel de cationi poate fi însă afectată de prezența unor anioni sau liganzi. De ex. soluția
de CuSO4 de culoare albastră deschis poate fi intensificată cu ajutorul amoniacului care poate să
schimbe maximul de absorbție.
2) A compușilor organici, în special aceia care manifestă un înalt grad de conjugare
(sisteme cu orbitali p în care alternează legături simple cu cele multiple și care, în general, scad
energia totală a moleculei, crescându-i astfel stabilitatea). De ex. ADN, ARN și proteinele absorb
radiația electromagnetică mai ales din spectrul UV și foarte rar din cel vizibil. Pentru aceste
determinări, ca solvent, se folosește de cele mai multe ori etanolul pentru că absoarbe mult mai
puțin decât apa
Principiul spectrofotometriei UV/VIS se bazează pe legea Lambert-Beer. Această lege
prevede că cantitatea de lumină absorbită de o soluție este expresia unei funcții exponențiale a
concentrației și a lungimii de undă în raport cu acea soluție. Calibrarea metodei pentru o anumită
substanță implică două etape distincte:
1. Se determină maximul de absorbție al substanței respective făcând un scanning a
lungimilor de undă în concordanță cu culoarea acesteia. Dacă substanța este incoloră, se
identifică o reacție de culoare specifică acesteia și se analizează produsul colorat.
2. Se determină relația dintre concentrația substanței luată în analiză (sau a
produsului rezultat dacă e vorba de o reacție de culoare) și absorbție. Această determinare se face
la lungimea de undă ce corespunde maximului de absorbție determinat la etapa 1.

OBSERVAȚII

Identificarea lungimii de undă ce manifestă absorbție maximă trebuie realizată pe o probă a

cărei concentrație nu determină la această lungime de undă o absorbție mai mare de 1. Valorile
convenabile pentru absorbție sunt situate între 0,1 și 1. Peste această valoare efectul de umbrire
al particulelor poate modifica corectitudinea rezultatelor. Această situație implică concentrații
prea mari în care particulele componente ale soluției, fiind prea apropiate, se pot afla una în
spatele celeilalte și nu contribuie la absorbție. De aceea, pentru o substanță oarecare,
identificarea acestei concentrații se face prin încercări.
 2.2 Spectrofotometrul Specord 200 Plus

Spectrofotometrul (figura 5.2) a stat la baza determinării de compuşi fenolici totali

din germenii de conopidă. Acest aparat poate realiza analize spectrofotometrice de
transmitanţă, refletanţă, absorbanţă şi energie, atât pentru probe solide, cât şi probe lichide,
la o temperatură controlată. Printre principalele caracteristici ale spectrofotometrului,
enumerăm: consumul redus de energie, imagistică foarte bună, se poate realiza şi măsurarea
eşantioanelor în tuburi, stabilitate pe termen lung, calibrare automată cu ajutorul filtrului cu oxid
de holmi.

Figura 2.1 Spectrofotometrul SPECORD 200 Plus

 CAPITOLUL 3
METODE DE ANALIZĂ CHIMICĂ

Determinarea conţinutului total de compuşi fenolici ( Metoda Folin Ciocâlteau)

3.1 Principiul metodei

Este concentrat pe amestecul format din acizii fosfomolibdic, ce prezintă formula

moleculară H3PMo12O40 şi fosfotungistic cu formula moleculară H3PW12O40, determină
formarea oxizilor albaştri de molibden şi tungisten, având formulele moleculare Mo12O23 şi
W8O23 într-un mediu cu pH-ul alcalin.
În urma reducerii amestecului format din cei doi acizi, rezultă culoarea albastră, care
îşi modifică intensitatea cu cât cantitatea de fenoli totali are o valoare mai mare, curba de
absorbţie prezentând un maxim la λ= 750 nm.
Culoarea albastră suferă în timp anumite modificări din cauza instabilităţii acesteia,
prin urmare se poate interpreta faptul că aceste modificări străbat două faze:
prima fază se înregistrează într-un interval de timp cuprins între 0-30 de minute,
unde culoarea este albastră, aceasta fiind faza rapidă (figura 1);
a doua fază începe după 30 de minute şi are loc modificarea culorii din albastru în
albastru închis; această fază mai este numită şi faza lentă (figura2);
Un rol deosebit de important îl reprezintă citirea absorbanţei ce trebuie realizată după 30-
45 de minute, eroarea fiind foarte mică în acest caz. Există multe opinii legate de perioada de
timp în care se realizează citirea, aceasta realizându-se după minim 45 de minute, ajungând
uneori până la două ore.

3.2 .Reactivi

În metoda Folin-Ciocâlteau, respectiv determinarea compuşilor fenolici totali se utilizează

un singur reactiv, şi anume reactivul Folin-Ciocâlteau. Prepararea reactivului Folin-Ciocâlteau
are loc în mai multe etape. Iniţial are loc dizolvarea a 100 g de wolframatului de sodiu şi a 25 g
de molibdat de sodiu în aproximativ 700 ml de apă distilată.
Odată realizată dizolvarea, se adaugă acid ortofosforic în cantitate de 50 ml, având
o concentraţie de 85% şi acid clorhidric în cantitate de 100 ml, cu ρ= 1,18-1,19. Se
realizează o omogenizare uşoară, apoi amestecul este supus operaţiei de fierbere care
durează aproximativ 10 ore. Înainte de fierbere, soluţia trebuie introdusă într-un balon care este
dotat cu un refrigerent.
După ce s-a realizat fierberea se adugă 150 g de sulfat de sodium şi 5 picaturi de apă
de brom. Amestecul este supus din nou unei fierberi ce se realizează timp de 15 minute, până
când se modifică culorea în galben-deschis.
Atunci când este utilizat reactivul Folin-Ciocâlteau pentru a se determina compuşii
fenolici totali, este recomandată utilizarea de Na2CO3, soluţie 20% sau 200 g/l din soluţia ce se
prepară prin solvatarea a 200 g carbonat de sodiu în 700-800 ml apă fierbinte, urmând apoi
răcirea şi aducerea la semn în balonul cotat cu apă distilată.

3.3 Mod de lucru

Înainte de a începe analiza propriu-zisă, extractele sunt scoase de la frigider şi aduse

la temperatura camerei, apoi sunt vortexate.
Balonul cotat folosit la determinare este de 100 ml şi este recipientul în care are loc
reacţia propriu- zisă, fiind introduse pe rând substanţele în el, respectând următoarea ordine:
1 ml extract ce a fost diluat în prealabil 1/3;
50 ml apă distilată;
5 ml din reactivul Folin-Ciocâlteau;
20 ml soluţie de Na2CO3 de concentraţie 20%
Substanţele necesare amestecului sunt introduse cu o pipetă automată,dar şi prin
intermediul unor vârfuri. După introducerea substanţelor menţionate anterior, balonul cotat este
adus la semn cu apă distilată, respectiv până la 100 ml, apoi se realizează o agitare continuă,
urmată apoi de un repaus de aproximativ 30 minute. După trecerea perioadei de repaus are
loc citirea absorbanţei la λ=750 nm. Pentru realizarea citirii se foloseşte o cuvă de 10 mm,
unde se adaugă extractul, citirea fiind raportată la un martor, respectiv la o cuvă ce are apă
distilată.
Citirea absorbanţei ce se realizează la spectrofotometru se semnalează cu A750. În cazul
în care se observă erori ale citirii cu valori incluse între 0,3-0,8, citirea se repetă, dar numai
după ce are loc diluţia extractului până vom ajunge la absorbanţa corespunzătoare.
Rezultatele obţinute sunt formulate în mg echivalenţi de acid galic/l, ilustrându-se sub forma
unei curbe etalon.
Figura 3.1. Curba de etalonare pentru metoda Folin – Ciocâlteau
 CAPITOLUL 4
REZULTATE OBTINUTE

Evaluarea conţinutului total de compuşi fenolici - Metoda Folin Ciocâlteau

În vederea obţinerii conţinutului de compuşi fenolici totali, s-a efectuat determinarea

din germenii de conopidă recoltaţi în zilele 5,7 şi 9. Am supus determinării germeni obţinuţi cu
ajutorul germinatorului MLR 351h din laboratorul de legumicultură al universităţii şi
germeni obţinuţi cu ajutorul germinatorului casnic.
În urma evaluări conţinutului de compuşi fenolici (figura 6.1), am observat faptul că
acesta este mai ridicat în germenii recoltaţi în ziua 5 obţinuţi în germinatorul MLR (96,73 mg
GAE/100 g produs proaspăt), spre deosebire de cei obţinuţi în germinatorul casnic (86,60 mg
GAE/100 g produs proaspăt). La germenii recoltaţii în ziua a 7 în germinatotul MLR nu
s-au observat diferenţe semnificative faţă de de cei obţinuţi în ziua 5. Însă este o diferenţă
destul de semnificativă a celor casnici şi cei MLR. În 9 zile cantitatea de compuşi fenolici
scade mult în MLR, pe când în ce casnic creşte foarte puţin din cauza variaţiilor de
temperatură din laborator. Scăderea compuşilor fenolici poate continua până la dezvoltarea
deplină a plantei.

Figura 4.1 Reprezentarea grafică a conţinutului total de compuşi fenolici

 BIBLIOGRAFIE

1. Aires A., Fernandes C., Carvalho R., Bennett RN., Saavedra MJ., Rosa EAS.,
2011. Seasonal Effects on Bioactive Compounds and Antioxidant Capacity of Six
Economically Important Brassica Vegetables. Molecules, vol.16, nr. 8, pp. 6816-6832.
2. Baenas N., Moreno DA., Garcia-Viguera C., 2012. Selecting Sprouts of Brassicaceae
for Optimum Phytochemical Composition. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, vol. 60, nr. 45, pp. 11409-11420.
3. Barillari J., Cervellati R., Costa S., Guerra MC., Speroni E., Utan A., Iori R., 2006.
Antioxidant and Choleretic Properties of Raphus sativus L. Sprouts (Kaiware
Daikon) Extract. Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 54, nr. 26, pp.
9773-9778.
4. Bass L., Sanders DC., 1994. Bean Sprouts and Other Vegetable Seed Sprouts.
Horticulture Information Leaflet, North Carolina Cooperative Extention Service, North
Carolina State University. Bellostas N., Kachlicki P., Sorensen JC., 2007.
Glucosinolate profiling of seeds and sprouts of B. Oleracea varieties used for food.
Scientia Horticulturae, vol. 114, pp. 234-242.
5. Borş MD., 2015. Cercetări privind evaluarea unor compuși bioactivi cu capacitate
antioxidantă și antimicrobiană din surse vegetale la diferite stadii de dezvoltare,
U.S.A.M.V. Cluj-Napoca, pp. 1-30. Cartea ME., Francisco M., Soengas P., Velasco
P., 2011. Phenolic Compounds in Brassica Vegetables. Molecules, vol. 16, nr. 1, pp.
251-280.
6. Cartea ME., Lema M., Francisco M., Velasco P., 2011. Basic information on
vegetable Brassica crops. Science Publishers, New Hampshire, pp. 1-34.
7. Chemat F., Zill-e-Huma, Khan MK., 2011. Applications of ultrasound in food
technology: processing, preservation and extraction. Ultrasonics Sonochemistry, vol.18,
pp. 813-835.
8. Croft KD., 1998. The chemistry and biological effects of flavonoids and phenolic
acids. Annals of the New York Academy of Science, vol. 854, pp. 435-442.
9. Llorach R., Espin JC., Tomas-Barberan FA., Ferreres F., 2003. Valorization of
cauliflower (Brassica oleracea L. var. botrytis) by-products as a source of antioxidant
60
phenolics. Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 51, nr. 8, pp. 2181-2187.
10. Rice-Evans CA., Miller NJ., Paganga G., 1996 Structure-antioxidant activity
relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology & Medicine, vol
 20, nr. 7, pp. 933–956. Rincon-Leon F., 2003. Encyclopedia of Food Sciences
and Nutrition. Editura Academic Press, Ed. II, pp. 2827-2832.
11. Patel, J., 2008. A Review of Potential Health Benefits of Flavonoids. LURJ –
Lethbridge Undergraduate Research Journal.
12. Pereira DM., Valentao P., Pereira JA., Andrade PB., 2009. Phenolics: From Chemistry
to Biology. Molecules , vol. 14, pp. 2202-2211.
13.https://www.univapollonia.ro/laborator-spectrofotometrie/