Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
TEZĂ DE DOCTORAT
REZUMAT
Coordonator ştiinţific,
Prof. Dr. Mircea Ioan POPA
Doctorand,
Asist. univ. Alina Cristina NEGUȚ
2016
CUPRINS
INTRODUCERE .................................................................................................. 6
PARTEA GENERALĂ ......................................................................................... 7
Capitolul 1. Germenii problemă ......................................................................... 7
Capitolul 2. Staphylococcus spp. ...................................................................... 8
2.1 Microbiologie și taxonomie .................................................................................... 8
2.2 Epidemiologie .......................................................................................................... 9
2.3 Patogenia infecțiilor stafilococice ....................................................................... 10
2.4 Interacțiune gazdă – patogen în infecțiile stafilococice ................................... 12
2.5 Sindroame clinice .................................................................................................. 13
Capitolul 3. Pseudomonas spp. ....................................................................... 17
3.1 Microbiologie și taxonomie .................................................................................. 17
3.2 Epidemiologie ........................................................................................................ 18
3.3 Patogenia infecțiilor cu piocianic ........................................................................ 18
3.4 Interacțiune gazdă – patogen în infecțiile cu P. aeruginosa ............................ 21
3.5 Sindroame clinice .................................................................................................. 21
Capitolul 4. Virulența bacteriană ..................................................................... 23
4.1 Virulența Staphylococcus spp. ............................................................................ 23
4.2 Reglarea virulenței stafilococului ........................................................................ 26
4.3 Virulența Pseudomonas spp. ............................................................................... 27
4.4 Reglarea virulenței Pseudomonas aeruginosa ................................................. 29
Capitolul 5. Biofilmul bacterian ........................................................................ 30
Capitolul 6. Comunicarea interspecii bacteriene ........................................... 33
Capitolul 7. Mecanisme de rezistență la antibiotice ...................................... 34
Capitolul 8. Alte opțiuni terapeutice – direcții de cercetare .......................... 36
Capitolul 9. Bacteriofagii, trecut – prezent ..................................................... 37
9.1 Tratamentul cu bacteriofagi în lume ................................................................... 37
9.1.1 Începuturile terapiei cu bacteriofagi în lume ................................................................ 37
9.1.2 Contextul actual internațional în terapia cu bacteriofagi .......................................... 39
9.2 Tratamentul cu bacteriofagi în România ............................................................ 41
9.2.1 Primele studii românești în acest domeniu................................................................... 41
9.2.2 Terapia cu bacteriofagi în România, în perioada 1960-1975..................................... 41
Rezultate și discuții
In vitro – Studiul Staphylococcus spp.
Lotul de studiu a inclus 117 pacienți cu infecții cu Staphylococcus spp. cu o mediană a
vârstei de 47 ani (28.5 ani, 64 ani), din care 17 pacienți (14.5%) au avut vârsta sub 18 ani în
momentul efectuării studiului. Peste 60% dintre pacienții incluși în studiu au fost Carmeli 3, deci
pacienți imunodeprimați, peste 30% din aceștia având ca și cauză de imunodepresie diabetul
zaharat. Alte cauze de imunodepresie fiind infecția HIV și diversele neoplazii.
Cele mai multe tulpini stafilococice izolate au fost din specia S. aureus (80.3%), acesta
având o incidență a infecțiilor mai crescută față de SCN (p=0.000).(26, 40) Ca și în literatură,
stafilococul a fost identificat cel mai frecvent din infecțiile cutanate (45.3%), urmate de
bacteriemii (23.9%) și infecții respiratorii (13.7%). (41-43) În grupul S. aureus, tulpinile au
prezentat o rată de virulență semnificativ mai mare față de SCN, prin producerea zonelor de
hemoliză (56.3% vs. 23.1%, p=0.026), dar și a lecitinazei (87.2% vs. 0%, p=0.000).
În rândul tulpinilor din acest studiu am înregistrat următorul profil de rezistență:
meticilină 48.3%, eritromicină 61.4%, clindamicină 62.3%, rifampicină 24.5%, levofloxacin
22.9%, gentamicină 14.5%, pentru restul antibioticelor rezistența a fost sub 10.0%. Nu s-a
înregistrat rezistență pentru vancomicină sau linezolid.
Spre deosebire de virulență, rezistența la antibiotice este semnificativ mai crescută în
rândul SCN față de S. aureus pentru levofloxacin (40.1% vs. 18.1%, p=0.023), acid fusidic
(37.5% vs. 0.0%, p=0.000), gentamicină (40.9% vs. 8.0%, p=0.000), teicoplanină (14.3% vs.
0.0%, p=0.000) și cotrimoxazol (25% vs. 3.3%, p=0.000).
Tulpinile recoltate de la nivelul torentului sangvin au profil de rezistență mai cresut față
de cele recoltate prin tampon nazal, având pentru meticilină un procent de rezistență de 64.3%
vs. 25.0% (p=0.012), pentru levofloxacin 38.4% vs. 0.0% (p=0.009), pentru eritromicină 64.3%
vs. 26.7% (p=0.018).
Pentru unele dintre antibioticele testate, rezistența tulpinilor de la nivel cutanat este
semnificativ mai crescută față de cele de la nivel nazal, fiind pentru clindamicină 76.4% vs.
26.7% (p=0.000), iar pentru eritromicină 68.6% vs. 26.7% (0=0.003).
Pentru trimetoprim/sulfametoxazol rezistența a fost semnificativ diferită între tulpinile
recoltate de la nivel cutanat față de cele din torentul sangvin (1.9% vs. 21.5%, p=0.003)
Nu am înregistrat semnificație statistică pentru corelația dintre rezistența la meticilină și
prezența genei mecA (p=0.147), am identificat 6/34 (17.6%) din tulpinile susceptibile la
meticilină vs. 10/28 (35.7%) din cele rezistente la meticilină. A fost înregistrată corelație între
rezistența la meticilină și prezența genei ccrB2 sau a SCCmecVJ1 (p=0.034, OR= 4.167,
CI95%=1.137 – 15.265, respectiv p=0.000, OR= 13.867, CI95%=2.772 – 69.378).
Rezistența la eritromicină se corelează cu prezența genei SCCmecVJ1 (p=0.034, OR=
0.218, CI95%=0.054 – 0.890), dar și cu absența genei hlg (p=0.033, OR= 3.643, CI95%=1.201 –
11.054). O proporție mai mare din tulpinile susceptibile la eritromicină au avut gena ermA
prezentă față de cele rezistente la eritromicină (7/28, 25% vs. 3/31, 9.7%). La fel ca și la
eritromicină, rezistența la clindamicină se corelează cu prezența genei SCCmecVJ1 (p=0.041), cu
absența hlg (p=0.019).
Rezistența la levofloxacin se corelează cu absența genelor clfA și clfB (p=0.048), în
consecință prezența celor 2 gene sunt factori protectori pentru sensibilitate la quinolone.
Din cele 62 microorganisme, 17.6% tulpini Staphylococcus spp. meticilino-sensibile au
prezentat gena mecA, proprietate explicată prin faptul că gena nu este exprimată fenotipic în
absența supresiei. Orice exprimare a genelor de rezistență sau virulență se efectuează cu consum
de energie, astfel bacteria neavând organit producător de energie realizează fenomenul mai sus
menționat ca și mecanism de protecție. In vivo, în momentul supresiei antibiotice, bacteria
activează exprimarea ca și mecanism de evadare.
Un total de 10/28 (35.7%) tulpini meticilino-rezistente au prezentat gena mecA, iar orice
genă din caseta SCCmec a fost întâlnită la 19/28 (67.8%) tulpinile meticilino-rezistente ceea ce
sugerează diversitatea elementelor SCCmec ce pot determina rezistența la meticilină în tulpinile
studiate.(44) Din cele 62 tulpini testate, un total 7/10 (70%) tulpini pozitive pentru gena ermA
sunt sensibile la eritromicină, având aceeași explicație ca pentru absența exprimării genei mecA
la tulpinile meticilinosensibile.
Un total de 61.3% tulpini testate prezintă gene clfA și clfB, 58.1% pentru hlg, restul
genelor de virulență fiind prezente în procent mai scăzut. Cele 2 gene sunt frecvent întâlnite la
tulpinile stafilococice și în alte cercetări, fiind extrem de importante în procesul de aderare,
colonizare (gena pentru clumping factor A/B) și în procesul de liză a hematiilor și leucocitelor
prin producerea de către gena hlg a unei leucocidine (γ hemolizină).(45)
Gena fnbA a fost întâlnită la 4/62 (6.4%) tulpini provenite de la pacienți Carmeli 3 cu
infecții cutanate sau osoase. Toate tulpinile cu gena fnbA au asociată și gena luk-PV. Pentru 2
dintre tulpinile cu această genă a fost evaluată capacitatea de a forma biofilm, ambele formând
biofilm puternic, proprietate care a fost inhibată de adăugarea bacteriofagilor în diluția 1/2.
Frecvența genei fnbA în populația de stafilococ studiată este mult mai scăzută față de cea
identificată de alți autori de 21.4 – 72.5%.(46)
Literatura de specialitate sugerează o asociere între rezistența la meticilină și prezența
genelor pentru proteinele de suprafață precum fnb,(47) în această cercetare din cele 4 tulpini cu
gena fnbA, 2 aveau profil fenotipic MRSA și a treia prezenta gena mecA în evaluarea genotipică,
dar care nu este exprimată in vitro.
Genele clfA/B și fnbA, codând proteine cu rol în prima etapă a formării biofilmului au rol
important în infecțiile cutanate sau osoase, fapt confirmat și în cercetarea noastră.
Asocierea dintre genele fnbA și luk-PV dovedește că cele 4 tulpini pot deveni foarte
virulente atât prin capacitatea de a forma biofilm, cât și prin liza leucocitelor și determinarea de
necroză tisulară.(48)
Încă un potențial factor de prognostic negativ la aceste tulpini este asocierea dintre
prezența genei hlg și rezistența la meticilină, 41.6% dintre tulpinile cu această genă având
asociată și rezistența la meticilină.
Un număr de 6 tulpini au avut și gena bbp, care codifică bone sialoprotein-binding
protein, cu rol în infecțiile osteoarticulare prin formarea biofilmului la nivel osos. În studiul
nostru, acestea au fost izolate de la nivel nazal (4 tulpini) și de la nivel cutanat, respectiv din
torentul sangvin (câte 1 tulpină). Știind că de la nivel nazal tulpinile pot fi propagate foarte ușor
și izolând de la acest nivel 4/6 tulpini cu gena bbp este important să evaluăm importanța
eradicării tulpinilor virulente din portajul nazal.
Studiile dovedesc o asociere între rezistența la meticilină și gena bbp, fapt neconfirmat și
de această cercetare, 5 din cele 6 tulpini fiind sensibile la meticilină. Literatura sugerează
inclusiv o asociere între prezența genei bbp și cea a genei luk-PV, observație neconfirmată în
acest studiu, nicio tulpină cu bbp nu prezintă gena luk-PV.(49)
Toate tulpinile cu gena bbp au avut capacitate de a forma biofilm, 2 formând biofilm
slab, 2 moderat și 2 puternic; după adăugarea fagilor în diluția 1/2 capacitatea a fost inhibată
pentru toate cele 6 tulpini.
Gena luk-PV (gena pentru leukocidina Panton-Valentine) apare la 5 dintre tulpinile
testate (8.1%), 4 din acestea fiind S. aureus, iar a cincea S. epidermidis, frecvență similară cu cea
identificată și de alți autori.(50) Tulpinile provin din infecții cutanate (3), una din infecție oculară
și o bacteriemie. Două dintre tulpini sunt meticilino-rezistente, proprietate care nu se corelează
cu literatura unde este specificat că tulpinile cu gena luk-PV sunt meticilino-rezistente.(51)
Gena tst a fost identificată la 3 tulpini de stafilococ auriu, fiind recoltate în 2/3 cazuri de
la nivel nazal și una de la nivel cutanat. Toate cele 3 tulpini prezentau și gena hlg, dar aveau un
profil bun de sensibilitate la antibiotice (sensibile la meticilină, rifampicină, etc.). Localizarea
infecției sugerează că aceste 3 tulpini extrem de virulente pot fi foarte ușor răspândite în mediul
intraspitalicesc.
Sensibilitatea la meticilină (51.7%) este mai scăzută față de susceptibilitatea la
bacteriofagii PYO (53%) și mai crescută față de susceptibilitatea la bacteriofagii INTESTI
(51.3%). Dacă însumăm susceptibilitățile PYO și INTESTI procentul va crește la 60.7%.
Tulpinile susceptibile la bacteriofagii PYO au fost semnificativ mai frecvent recoltate de
la nivel nazal față de cele de la nivel cutanat sau torent sangvin (p=0.012, respectiv p=0.001), la
fel și pentru cele susceptibile la INTESTI (p=0.022, respectiv p=0.013). Inclusiv
susceptibilitățile la PHAGYO și PHAGESTI sunt influențate de produsul patologic, fiind
semnificativ statistic mai susceptibile cele de la nivel nazal, față de cele care provin de la nivel
cutanat sau torent sangvin (p=0.010, p=0.003; p=0.010, p=0.001). Și susceptibilitatea la
STAPHYLOCOCCAL este mai crescută în cazul tulpinilor provenite de la nivel nazal vs.
cutanat/torent sangvin. (p=0.035, p=0.011).
Pentru toate cele 5 mixturi fagice (PYO, INTESTI, PHAGYO, PHAGESTI,
STAPHYLOCOCCAL) sensibilitatea la meticilină a fost semnificativ statistic corelată cu
susceptibilitatea la fagi (p=0.003, p=0.000, p=0.016, p=0.016, p=0.009). Sensibilitatea la
eritromicină s-a corelat semnificativ statistic cu susceptibilitatea pentru PHAGYO (p=0.000) și
cu cea pentru PHAGESTI (p=0.038).
Susceptibilitatea la PYO a fost corelată cu prezența S. aureus (p=0.000), absența genei
SCCmecVJ1 (p=0.002), valori normale ale proteinei C reactive (p=0.048). De asemenea,
susceptibilitatea la INTESTI a fost corelată cu prezența S. aureus (p=0.002) și absența genei
SCCmecVJ1 (p=0.001). Inclusiv susceptibilitățile la PHAGYO și STAPHYLOCOCCAL sunt
corelate cu prezența S. aureus (p=0.031, respectiv p=0.040), iar cele la PHAGYO și PHAGESTI
sunt corelate favorabil cu Carmeli 1 (p=0.022).
Un total de 82 de tulpini au fost utilizate pentru testarea susceptibilității la INTESTI în
mediul lichid, fiind evaluate diluțiile binare de PYO 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 și 1/64. Creșterea
evaluată atât macroscopic cât și prin cultivarea a 10 µL din fiecare godeu pe mediu solid a fost
semnificativ inhibată în godeurile ce conțineau bacteriofagii în diverse diluții față de martorul
pozitiv (p=0.000).
În experimentul INTESTI (EI), creșterea bacteriană în godeul cu diluția INTESTI 1/2 a
fost corelată cu rezistența la meticilină (p=0.021), rezistența la meticilină fiind factor de risc
pentru creșterea bacteriană la această diluție (OR=2.636, CI95%= 1.060 – 6.560).
Un total de 79 de tulpini au fost folosite pentru testarea susceptibilității la PYO în mediul
lichid fiind evaluate diluțiile de PYO 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 și 1/64. Creșterea evaluată ca și în
EI a fost semnificativ inhibată în godeurile ce conțineau bacteriofagii în diverse diluții față de
martorul pozitiv (p=0.000). În experimentul PYO (EP), creșterea în niciuna dintre diluții, nu se
corelează semnificativ statistic cu profilul de rezistență la meticilină.
În experimentul INTESTI, 12.2% dintre tulpini nu au dezvoltat biofilm, 4.9% au
dezvoltat biofilm slab, 32.9% biofilm mediu, iar 50.0% biofilm puternic. Un total de 36 tulpini
au avut capacitatea de a forma biofilm cantitativ peste tulpina ATCC folosită. În momentul
adăugării diluției 1/64, 52 dintre tulpini au avut valoarea OD_1/64 peste valoarea tulpinei ATCC
în aceleași condiții, iar la adăugarea diluției 1/2, 62 dintre tulpini au avut valoarea OD_1/2 peste
ATCC. Adăugarea bacteriofagilor INTESTI în diverse diluții a inhibat semnificativ statistic
formarea biofilmului (p=0.004). (Tabel 13. 1)
Adăugarea diluției de INTESTI 1/2, a influențat semnificativ statistic formarea
biofilmului (p=0.000), un număr de 34 tulpini care au avut capacitatea de a forma biofilm, au
avut această proprietate inhibată la adăugarea fagilor.
În EI, formarea biofilmului nu a fost corelată cu scorul Carmeli, dar gradarea biofilmului
a fost corelată semnificativ statistic cu acest scor, astfel: pacienții Carmeli 3 au format în
proporție de 70% biofilm puternic față de 25% biofilm moderat (p=0.004); iar pacienții Carmeli
2, 84.6% biofilm puternic vs. 15.4% biofilm moderat (p=0.001). Formarea biofilmului puternic a
fost corelată semnificativ statistic cu localizarea infecției, 83.3% tulpini cutanate formează
biofilm puternic 42.9% din cele din spută (p=0.067). Toate tulpinile recoltate din secreție
mamară, secreție otică și lichid articular, au format biofilm puternic.
În EP, din cele 33 de tulpini testate, 78.8% au dezvoltat biofilm puternic, 18.1% biofilm
moderat, iar 3.1% biofilm slab. Un total de 17 tulpini au avut capacitatea de a forma biofilm
cantitativ peste valoarea ATCC. În momentul adăugării diluției 1/64, 10 dintre tulpini au avut
valoarea OD_1/64 peste valoarea ATCC în aceleași condiții, iar la adăugarea diluției 1/2, 32
dintre tulpini au avut valoarea OD_1/2 peste ATCC.
Adăugarea diluției de PYO 1/2, a influențat semnificativ statistic formarea biofilmului
(p=0.019), un număr de 5 tulpini care au avut capacitatea de a forma biofilm, au avut această
proprietate inhibată la adăugarea fagilor.
Adăugarea bacteriofagilor PYO în diverse diluții a inhibat semnificativ statistic formarea
biofilmului (p=0.001) prin modificarea semnificativă a medianelor densităților optice. (Tabel 13.
4)
Pentru 19 tulpini a fost evaluată capacitatea bacteriofagilor PYO și INTESTI la diluția 1/4 să
distrugă biofilmului deja format.
Adăugarea bacteriofagilor INTESTI după 24 ore de creștere bacteriană au modificat
valorile OD492nm semnificativ statistic (p=0.011) fapt ce conclude că bacteriofagii INTESTI au
capacitatea de a distruge biofilmul preformat atât prin infectarea celulelor bacteriene din stratul
superficial al biofilmului și multiplicarea exponențială la acest nivel, dar și prin sinteza de liaze
de către bacteriofagi, care au rol în penetrarea biofilmului, dezorganizarea și distrugerea
acestora.(52, 53)
* comparație între mediana densității optice cultură și mediana densității optice a diluțiilor de
fagi. Cifre aldine (bold) – rezultat semnificativ statistic
Concluzii
IN VITRO
Staphylococcus spp.
1. Cel mai frecvent agent etiologic din genul Staphylococcus a fost S. aureus (p=0.000),
producând infecții cutanate, urmate de bacteriemii și infecții respiratorii.
2. Evaluată fenotipic, rata potențială de virulență a S. aureus a fost mai înaltă comparativ cu
SCN, atât prin producerea de hemoliză (p=0.026), cât și prin producera de lecitinază
(p=0.000). Clasamentul se inversează în cazul profilului fenotipic de rezistență
antimicrobiană, când stafilococii coagulazo-negativi au rezistență semnificativ mai
crescută față de S. aureus pentru: levofloxacin (p=0.023), acid fusidic (p=0.000),
gentamicină (p=0.000), teicoplanină (p=0.000) și cotrimoxazol (p=0.000).
3. Tulpinile izolate din hemoculturi au profil de rezistență pentru meticilină (p=0.012),
levofloxacin (p=0.009), eritromicină (p=0.018) mai crescut față de cele izolate de la nivel
nazal. Inclusiv rezistența la clindamicină (p=0.000) și eritromicină (p=0.003) este
semnificativ mai crescută în rândul tulpinilor de la nivel cutanat comparativ cu cele
izolate de la nivel nazal.
4. Am identificat corelație între rezistența la meticilină și prezența genelor ccrB2 (p=0.034)
sau SCCmecVJ1 (p=0.000). Rezistența la eritromicină și clindamicină s-a corelat cu
prezența genei SCCmecVJ1 (p=0.034, respectiv 0.041), dar și cu absența genei hlg
(p=0.033, respectiv p=0.019). Rezistența la levofloxacin se corelează cu absența genelor
clfA și clfB (p=0.048).
5. Din cele 62 microorganisme, 17.6% tulpini Staphylococcus spp. meticilino-sensibile au
prezentat gena mecA, neexprimată fenotipic în absența supresiei antibioticelor pentru a-și
conserva energia. Același fenomen se întâmplă și în cazul genei ermA.
6. În rândul tulpinilor noastre am observat variabilitatea elementelor SCCmec ce pot
determina rezistența la meticilină, astfel simpla prezență a casetei SCCmec nu conduce la
argumentarea severității unui proces infecțios cu această etiologie.
7. Cele mai frecvente gene de virulență întâlnite în acestă cercetare sunt clfA/B și hlg, fiind
gene extrem de importante în procesul de aderare, colonizare (gena pentru clumping
factor A/B), dar și în procesul de liză a hematiilor și leucocitelor prin producerea de către
gena hlg a unei leucocidine (γ hemolizină).
8. Bacteriofagii s-au dovedit mult mai eficienți în realizarea bacteriolizei față de stafilococul
izolat de la nivel nazal comparativ cu cei izolați de la nivel cutanat sau din hemoculturi.
Prima opțiune de verificare a sensibilității este PYO, urmată de INTESTI, PHAGYO,
PHAGESTI și STAPHYLOCOCCAL.
9. Portajul nazal de stafilococ meticilino-rezistent poate beneficia de decontaminare prin
utilizarea de bacteriofagi, concluzie de luat în considerație în special în secțiile de Terapie
Intensivă în vederea diminuării portajului nazal de MRSA la personalul medico-sanitar
de îngrijire.
10. Sensibilitatea la eritromicină se corelează cu susceptibilitatea la PHAGYO și
PHAGESTI (p=0.000, respectiv p=0.038), în timp ce sensibilitatea la meticilină se
corelează cu toți bacteriofagii testați (p=0.003, p=0.000, p=0.016, p=0.016, p=0.009).
Rezultă că în context clinic, dacă dorim să testăm utilizarea fagilor în tratamentul
pacienților cu infecții stafilococice, ne putem orienta după sensibilitatea celor două
antibiotice.
11. La un stafilococ auriu, fără gena SCCmecVJ1 la nivelul casetei SCCmec, cu infecție
neivazivă (proteina C reactivă normală) putem utiliza cu șanse mari de succes PYO sau
INTESTI (p=0.048). Din punct de vedere practic un pacient cu scorul Carmeli 1 are o
rată de răspuns favorabilă la terapia cu PHAGYO și PHAGESTI (p=0.022).
12. Adăugarea bacteriofagilor atât PYO cât și INTESTI în orice diluție a inhibat semnificativ
statistic formarea biofilmului (p=0.004, p=0.001).
13. Rata de scădere a valorilor biofilmului între lotul susceptibil vs. non-susceptibil la
INTESTI sau PYO în momentul adăugării diluției 1/2 a fost mai crescută în primul lot
față de al doilea (mean ranks 47.92 vs. 29.76, U=428, p=0.001; respectiv mean ranks
43.65 vs. 30.55, U=419, p=0.023). Rezultă că bacteriofagii diminuează dezvoltarea
biofilmului indiferent de nivelul de susceptibilitate.
14. Expunera stafilococului la bacteriofagi, indiferent de profilul de susceptibilitate, reduce
agresivitatea prin diminuarea capacității de formare de biofilm și nu neapărat prin liză
bacteriană.
15. Biofilmul preformat a fost semnificativ diminuat după adăugarea bacteriofagilor PYO și
INTESTI (p=0.009, respectiv 0.000), atât prin infectarea celulelor bacteriene din stratul
superficial al biofilmului și multiplicarea exponențială la acest nivel, cât și prin sinteza de
depolimeraze care ajută la penetrarea fagilor în stratul profund al biofilmului.
16. Evaluarea la 48, respectiv 72 de ore a magnitudinii biofilmului arată în mod clar
diminuarea grosimii acestuia la 72 ore în comparație cu 48 ore (p=0.000).
Pseudomonas aeruginosa
17. P. aeruginosa a fost mai frecvent incriminat ca și agent etiologic în infecțiile urinare
(38.6%) și cutanate (34.1%). Tulpinile izolate de la nivel urinar și cutanat au avut profil
de rezistență mai crescut față de cele din spută, atât pentru piperacilină (p=0.048), cât și
piperacilină/tazobactam (p=0.044).
18. S-a înregistrat susceptibilitate de 16.2% la bacteriofagul STAPHYLOCOCCAL, cu toate
că acesta conține doar bacteriofagi pentru Staphylococcus spp. Cel mai probabil acesta
acționează pe un receptor întâlnit și la unele tulpini de P. aeruginosa. Sunt necesare studii
de secvențiere atât a bacteriofagilor cât și a tulpinilor susceptibile la
STAPHYLOCOCCAL.
19. Susceptibilitatea la bacteriofagi PYO și INTESTI se corelează cu situsul de recoltare al
tulpinilor bacteriene (p=0.028, respectiv 0.05), dar și cu profilul de rezistență la
antibiotice: cefepim (p=0.033); imipenem (p=0.001), meropenem (p=0.008), gentamicină
(p=0.003), ciprofloxacin (p=0.013). Susceptibilitatea la PHAGYO se coreleză
semnificativ statistic cu profilul de rezistență al unor antibiotice: imipenem (p=0.002),
meropenem (p=0.002), gentamicină (p=0.030), ciprofloxacin (p=0.008). Rezultă că în
context clinic dacă dorim să testăm utilizarea fagilor în tratamentul pacienților cu infecții
stafilococice, ne putem orienta după sensibilitatea la antibiotice.
20. Adăugarea bacteriofagilor INTESTI sau PYO în diverse diluții a inhibat semnificativ
statistic formarea biofilmului (p=0.001) prin modificarea semnificativă a medianelor
densităților optice.
21. Biofilmul preformat a fost semnificativ diminuat după adăugarea bacteriofagilor
INTESTI (p=0.011) atât prin infectarea celulelor bacteriene din stratul superficial al
biofilmului și multiplicarea exponențială la acest nivel, cât și prin sinteza de liaze care au
rol în penetrarea biofilmului, dezorganizarea și distrugerea acestora.
22. Evaluarea la 48, respectiv 72 de ore a magnitudinii biofilmului arată în mod clar
diminuarea grosimii acestuia la 72 ore în comparație cu 48 ore (p=0.011).
23. Bacteriofagii par a reprezenta opțiuni fezabile în profilaxia infecțiilor peri-protetice, prin
rolul lor demonstrat de inhibare a formării biofilmului. Aceștia ar putea fi utilizați în
prevenirea recăderilor din osteomielită prin diminuarea biofilmului local via instilații cu
bacteriofagi prin traiectul de fistulă.
24. În contextul unei determinări bacteriene pe material protetic utilizarea bacteriofagilor
poate fi benefică prin diminuarea biofilmului preformat și expunerea germenilor la
antibioticele sistemice.
25. Pentru ambele genuri bacteriene, bacteriofagii georgieni au un procent satisfăcător de
acțiune asupra tulpinilor autohtone, dar sunt necesare studii ulterioare de evaluare a
efectului bacteriofagilor izolați din România.
IN VIVO
26. Toate cele 6 cazuri tratate au dovedit siguranța terapiei, neînregistrându-se reacții adverse
locale sau sistemice corelate cu fagoterapia.
27. La 5 din 6 cazuri s-a înregistrat inițial răspuns bacteriologic favorabil prin negativarea
culturilor, urmat după oprirea terapiei cu bacteriofagi de repozitivarea creșterii
bacteriene.
28. Unicul răspuns bacteriologic susținut, a fost al pacientei pluri-alergice care datorită
statusului alergic, dar și a tijelor metalice de susținere a coloanei care nu au putut fi
îndepărtate a necesitat o alternativă de tratament pentru vindecare. Pentru a nu
compromite terapia cu bacteriofagi și a nu risca ca pacienta plurialergică, cu capacitate de
sensibilizare rapidă la orice substanță, să dezvolte alergie și la bacteriofagi, am decis
administrarea acestora doar topic.
29. Consider că răspunsul susținut s-a datorat bacteriofagilor deoarece terapia cu cefuroxim
nu a reușit sterilizarea culturilor, acestea menținându-se pozitive pentru S. aureus. După
adăugarea bacteriofagilor, inflamația de la nivel cutanat și subcutanat s-a remis
considerabil, motiv ce accentuează și mai mult rolul bacteriofagilor.
30. În infecțiile greu de tratat din cauza prezenței germenilor multirezistenți, a infecțiilor
multibacteriene, a germenilor cu capacitate de formare a biofilmului pe material viu sau
inert și cu capacitate de invazie intracelulară sau a pacienților greu de tratat în contextul
patologiei asociate, a prezenței corpilor străini sau a localizării infecției în locuri greu de
sterilizat, antibioticele au nevoie de un adjuvant pentru a reuși să distrugă focarul
infecțios.
31. Un rol important într-un management terapeutic corect la pacienții cu infecții dificil de
tratat îl are și colaborarea interdisciplinară.
32. Aceste studii constituie piatra de temelie pentru viitoarele cercetări cu privire bacteriofagi
și fagoterapie în România.
33. Datele prezentate dovedesc importanța cunoașterii profilului complet, atât genotipic cât și
fenotipic, al bacteriei incriminate pentru a putea decide managementul terapeutic corect
al pacienților cu opțiuni terapeutice limitate.
Referințe
1. Miller LG, Kaplan SL. Staphylococcus aureus: a community pathogen. Infectious disease clinics of North
America. 2009;23(1):35-52.
2. Song KH, Kim ES, Sin HY, Park KH, Jung SI, Yoon N, et al. Characteristics of invasive Staphylococcus aureus
infections in three regions of Korea, 2009-2011: a multi-center cohort study. BMC infectious diseases.
2013;13:581.
3. Rupp M, Fey P. Staphylococcus epidermidis and Other Coagulase-Negative Staphylococci
Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases. Eight edition: Churchill Livingstone
Elsevier; 2015. p. 2272-82.
4. Kahl BC. Small colony variants (SCVs) of Staphylococcus aureus--a bacterial survival strategy. Infection,
genetics and evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases.
2014;21:515-22.
5. Amato SM, Fazen CH, Henry TC, Mok WW, Orman MA, Sandvik EL, et al. The role of metabolism in
bacterial persistence. Frontiers in microbiology. 2014;5:70.
6. Proctor RA, Kriegeskorte A, Kahl BC, Becker K, Loffler B, Peters G. Staphylococcus aureus Small Colony
Variants (SCVs): a road map for the metabolic pathways involved in persistent infections. Frontiers in cellular and
infection microbiology. 2014;4:99.
7. Sifri CD, Baresch-Bernal A, Calderwood SB, von Eiff C. Virulence of Staphylococcus aureus small colony
variants in the Caenorhabditis elegans infection model. Infection and immunity. 2006;74(2):1091-6.
8. Proctor RA, von Eiff C, Kahl BC, Becker K, McNamara P, Herrmann M, et al. Small colony variants: a
pathogenic form of bacteria that facilitates persistent and recurrent infections. Nature reviews Microbiology.
2006;4(4):295-305.
9. Tande AJ, Osmon DR, Greenwood-Quaintance KE, Mabry TM, Hanssen AD, Patel R. Clinical characteristics
and outcomes of prosthetic joint infection caused by small colony variant staphylococci. mBio. 2014;5(5):e01910-
14.
10. Tuchscherr L, Kreis CA, Hoerr V, Flint L, Hachmeister M, Geraci J, et al. Staphylococcus aureus develops
increased resistance to antibiotics by forming dynamic small colony variants during chronic osteomyelitis. The
Journal of antimicrobial chemotherapy. 2015.
11. Schneider M, Muhlemann K, Droz S, Couzinet S, Casaulta C, Zimmerli S. Clinical characteristics associated
with isolation of small-colony variants of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa from respiratory
secretions of patients with cystic fibrosis. Journal of clinical microbiology. 2008;46(5):1832-4.
12. Hentzer M, Teitzel GM, Balzer GJ, Heydorn A, Molin S, Givskov M, et al. Alginate overproduction affects
Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of bacteriology. 2001;183(18):5395-401.
13. Painter KL, Krishna A, Wigneshweraraj S, Edwards AM. What role does the quorum-sensing accessory
gene regulator system play during Staphylococcus aureus bacteremia? Trends in microbiology. 2014;22(12):676-
85.
14. D’Agata E. Pseudomonas aeruginosa and Other Pseudomonas Species
Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases Eighth edition: Churchill Livingstone
Elsevier; 2015. p. 2518-31.
15. Goncalves-de-Albuquerque CF, Silva AR, Burth P, Rocco PR, Castro-Faria MV, Castro-Faria-Neto HC.
Possible mechanisms of Pseudomonas aeruginosa-associated lung disease. International journal of medical
microbiology : IJMM. 2015.
16. Lopez D, Vlamakis H, Kolter R. Biofilms. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2010;2(7):a000398.
17. Flemming HC, Wingender J. The biofilm matrix. Nature reviews Microbiology. 2010;8(9):623-33.
18. Lazăr V. Aderența microbiană: Editura Academiei Române; 2003.
19. Allen RC, McNally L, Popat R, Brown SP. Quorum sensing protects bacterial co-operation from exploitation
by cheats. The ISME journal. 2016.
20. Rutherford ST, Bassler BL. Bacterial quorum sensing: its role in virulence and possibilities for its control.
Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2012;2(11).
21. Wei Y, Perez LJ, Ng WL, Semmelhack MF, Bassler BL. Mechanism of Vibrio cholerae autoinducer-1
biosynthesis. ACS chemical biology. 2011;6(4):356-65.
22. Jayaraman A, Wood TK. Bacterial quorum sensing: signals, circuits, and implications for biofilms and
disease. Annual review of biomedical engineering. 2008;10:145-67.
23. Thornton RB, Rigby PJ, Wiertsema SP, Filion P, Langlands J, Coates HL, et al. Multi-species bacterial biofilm
and intracellular infection in otitis media. BMC pediatrics. 2011;11:94.
24. Mottola C, Mendes JJ, Cristino JM, Cavaco-Silva P, Tavares L, Oliveira M. Polymicrobial biofilms by diabetic
foot clinical isolates. Folia microbiologica. 2016;61(1):35-43.
25. Katayama Y, Ito T, Hiramatsu K. A new class of genetic element, staphylococcus cassette chromosome
mec, encodes methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrobial agents and chemotherapy.
2000;44(6):1549-55.
26. Que Y, Moreillon P. Staphylococcus aureus(Including Staphylococcal ToxicShock Syndrome). Mandell,
Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases Eighth edition: Churchill Livingstone Elsevier;
2015. p. 2237-71.
27. Becker K, Heilmann C, Peters G. Coagulase-negative staphylococci. Clinical microbiology reviews.
2014;27(4):870-926.
28. Tuchscherr L, Bischoff M, Lattar SM, Noto Llana M, Pfortner H, Niemann S, et al. Sigma Factor SigB Is
Crucial to Mediate Staphylococcus aureus Adaptation during Chronic Infections. PLoS pathogens.
2015;11(4):e1004870.
29. Dublanchet A. Des Virus Pour Combattre les Infections: La Phagothérapie: Favre; 2009.
p.
30. Sulakvelidze A, Alavidze Z, Morris JG, Jr. Bacteriophage therapy. Antimicrobial agents and chemotherapy.
2001;45(3):649-59.
31. Miedzybrodzki R, Borysowski J, Weber-Dabrowska B, Fortuna W, Letkiewicz S, Szufnarowski K, et al.
Clinical aspects of phage therapy. Advances in virus research. 2012;83:73-121.
32. Kutter E, Gvasalia G, Alavidze Z, Brewster E. Phage Therapy. In: Grassberger M, editor. Biotherapy –
History, Principles and Practice: A Practical Guide to the Diagnosis and Treatment of Disease Using Living
Organisms: Springer Science 2013.
33. http://www.nih.gov/news-events/news-releases/new-nih-awards-will-support-development-therapeutic-
alternatives-traditional-antibiotics. [cited 2016 25 Februarie].
34. M Sefer MS. La 10 ani de la moartea profesorului Mihai Ciuca (18.VIII.1883-20.II.1969) Mihai Ciucă și
studiul bacteriofagului, însemnări în caietele de lucru. Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia.
1979;XXIV(2).
35. Kutter EM, Kuhl SJ, Abedon ST. Re-establishing a place for phage therapy in western medicine. Future
microbiology. 2015;10(5):685-8.
36. Chatterjee M, Anju CP, Biswas L, Anil Kumar V, Gopi Mohan C, Biswas R. Antibiotic resistance in
Pseudomonas aeruginosa and alternative therapeutic options. International journal of medical microbiology :
IJMM. 2016;306(1):48-58.
37. Hyman P, Abedon ST. Bacteriophage host range and bacterial resistance. Advances in applied
microbiology. 2010;70:217-48.
38. Negut AC, Sandulescu O, Popa M, Streinu-Cercel A, Alavidze Z, Berciu I, et al. Experimental approach for
bacteriophage susceptibility testing of planktonic and sessile bacterial populations - Study protocol. Germs.
2014;4(4):92-6.
39. Waters EM, McCarthy H, Hogan S, Zapotoczna M, O'Neill E, O'Gara JP. Rapid quantitative and qualitative
analysis of biofilm production by Staphylococcus epidermidis under static growth conditions. Methods in
molecular biology. 2014;1106:157-66.
40. Herchline T. Staphylococcal Infections 2015 [cited 2015 25 Noiembrie]. Available from:
http://emedicine.medscape.com/article/228816-overview#a5.
41. Staph infections [cited 2015 22 Decembrie]. Available from: http://www.mayoclinic.org/diseases-
conditions/staph-infections/basics/definition/con-20031418.
42. Staphylococcal infections [cited 2015 23 Decembrie]. Available from:
http://www.nhs.uk/conditions/Staphylococcal-infections/Pages/Introduction.aspx.
43. Meddeb, Zaraa I, Zribi M, Trojjet S, El Euch D, Mebazaa A, et al. [Staphylococcus aureus skin infections: a
hospital study]. La Tunisie medicale. 2009;87(11):778-81.
44. Hill-Cawthorne GA, Hudson LO, El Ghany MF, Piepenburg O, Nair M, Dodgson A, et al. Recombinations in
staphylococcal cassette chromosome mec elements compromise the molecular detection of methicillin resistance
in Staphylococcus aureus. PloS one. 2014;9(6):e101419.
45. Alonzo F, 3rd, Torres VJ. The bicomponent pore-forming leucocidins of Staphylococcus aureus.
Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 2014;78(2):199-230.
46. Khoramian B, Jabalameli F, Niasari-Naslaji A, Taherikalani M, Emaneini M. Comparison of virulence factors
and biofilm formation among Staphylococcus aureus strains isolated from human and bovine infections. Microbial
pathogenesis. 2015;88:73-7.
47. McCarthy H, Rudkin JK, Black NS, Gallagher L, O'Neill E, O'Gara JP. Methicillin resistance and the biofilm
phenotype in Staphylococcus aureus. Frontiers in cellular and infection microbiology. 2015;5:1.
48. Adler A, Temper V, Block CS, Abramson N, Moses AE. Panton-Valentine leukocidin-producing
Staphylococcus aureus. Emerging infectious diseases. 2006;12(11):1789-90.
49. Wisniewska K, Piorkowska A, Kasprzyk J, Bronk M, Swiec K. Clonal distribution of bone sialoprotein-
binding protein gene among Staphylococcus aureus isolates associated with bloodstream infections. Folia
microbiologica. 2014;59(6):465-71.
50. McClure JA, Conly JM, Lau V, Elsayed S, Louie T, Hutchins W, et al. Novel multiplex PCR assay for detection
of the staphylococcal virulence marker Panton-Valentine leukocidin genes and simultaneous discrimination of
methicillin-susceptible from -resistant staphylococci. Journal of clinical microbiology. 2006;44(3):1141-4.
51. Voyich JM, Otto M, Mathema B, Braughton KR, Whitney AR, Welty D, et al. Is Panton-Valentine leukocidin
the major virulence determinant in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus disease?
The Journal of infectious diseases. 2006;194(12):1761-70.
52. Azeredo J, Sutherland IW. The use of phages for the removal of infectious biofilms. Current
pharmaceutical biotechnology. 2008;9(4):261-6.
53. Abedon ST. BACTERIOPHAGES AND BIOFILMS: ECOLOGY, PHAGE THERAPY, PLAQUES: Nova Science
Publishers; 2011.
54. Qin Z, Yang L, Qu D, Molin S, Tolker-Nielsen T. Pseudomonas aeruginosa extracellular products inhibit
staphylococcal growth, and disrupt established biofilms produced by Staphylococcus epidermidis. Microbiology.
2009;155(Pt 7):2148-56.
55. Yang L, Liu Y, Markussen T, Hoiby N, Tolker-Nielsen T, Molin S. Pattern differentiation in co-culture
biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. FEMS immunology and medical
microbiology. 2011;62(3):339-47.
56. Shrestha A, Shi Z, Neoh KG, Kishen A. Nanoparticulates for antibiofilm treatment and effect of aging on its
antibacterial activity. Journal of endodontics. 2010;36(6):1030-5.