PRACTICAS DE BIOQUIMICA Dr. Pedro Chimoy Effio – Dr. Juan Rodríguez Vega - Est.

José Carlos Carrasco

PERFUSION TRANSCARDIACA EN RATA

I. INTRODUCCION
En 1920, August Krogh fue galardonado con el Premio Nobel de Fisiología o
Medicina por descubrir el mecanismo de regulación de los capilares en el músculo
esquelético. Krogh fue el primero en describir la adaptación de la perfusión
sanguínea en el músculo y otros órganos, de acuerdo con la demanda, a través de
la apertura y cierre de arteriolas y capilares. La perfusión o perfusión tisular es el
paso de un fluido, a través del sistema circulatorio o el sistema linfático, a
un órgano o un tejido, normalmente refiriéndose al traspaso capilar de sangre a
los tejidos. El término deriva del verbo francés «perfuser», que significa «verter
encima o a través de». Todos los tejidos animales requieren un suministro
adecuado de sangre para mantenerse vivos y saludables. Una perfusión pobre
puede causar isquemia que, si no es revertida a tiempo, puede derivar en muerte
celular o el cese de las funciones vitales. Durante una Cirugía importante,
especialmente cirugía torácica, la perfusión tiene que ser mantenida y dirigida por
los profesionales de la salud. Es habitual que, en estos casos, se cuente con la
asistencia de un profesional para que se ocupe del control hemodinámico.
Para la perfusión intracardiaca, se abre la caja torácica del animal y se separa el
pericardio. Seguidamente, se secciona el ápice del ventrículo izquierdo (con unas
tijeras de punta fina) y se introduce una cánula rígida que se conecta a la bomba
peristáltica o a un embolo, produciendo así un flujo continuo de líquido a nivel de la
aorta ascendente. La cánula se ajusta al ventrículo con la ayuda de unas pinzas
planas. Una vez comenzada la perfusión se facilita la evacuación de fluidos de
perfusión mediante un corte en la aurícula derecha.

Figura 1: modelo explicativo de la perfusión como método de fijación histológica: Mediante este tipo
de perfusión se introduce la solución fijadora en el sistema sanguíneo. La bomba peristáltica aporta
la presión suficiente para permitir al fijador entrar a través del ventrículo izquierdo (Vi) y pasar a la
aorta, desde la cual se distribuye por todo el cuerpo (excepto por el circuito pulmonar). Tras pasar
por la red capilar la solución fijadora pasa a los vasos venosos que terminan por verter su contenido
en la aurícula derecha (Ad). A esta cavidad hay que hacerle una abertura para que la solución
fijadora, una vez realizada su función, salga del circuito. Ai: aurícula izquierda; Vd: ventrículo
derecho.
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Por este procedimiento la solución fijadora se introduce a través del sistema

circulatorio por el cual accede a todas las células del tejido gracias a la red de
capilares. Mediante este método se puede fijar un animal completo introduciendo
la solución fijadora a través del ventrículo izquierdo del corazón. El fijador llegará a
todas las células irrigadas por la sangre bombeada por dicho ventrículo (circuito
corporal). Si se quieren fijar los pulmones habría que introducir el fijador por el
ventrículo derecho. También podemos fijar un único órgano en el caso de que
podamos introducir la solución fijadora en la arteria principal que irriga dicho
órgano. La perfusión no siempre es posible en algunos casos como en muchas
biopsias o en los tejidos vegetales. Este procedimiento de fijación por
perfusión requiere conocer la presión a la que se va a introducir la solución fijadora
en el animal o estructura, la cual debe ser similar a la que posee la presión sanguínea
normal en estado vivo. La presión que ejercerá la solución fijadora se puede regular
mediante bombas peristálticas (ver figura) o por gravedad, es decir, variando la
altura a la cual se coloca la solución fijadora respecto a la del animal. Esto es
importante porque una presión muy baja podría impedir que la solución fijadora
alcanzara todas las partes de la estructura y una presión muy alta podría provocar
roturas de los vasos sanguíneos y de la propia estructura tisular.

II. OBJETIVOS:
- Adquirir habilidades en la técnica de perfusión transcardiaca empleando
modelo animal rata y paloma.
- Aplicar la técnica para obtener un encéfalo correctamente fijado y poder
seccionar a posteriori por microtomía por criostato
- Comprender el proceso de fijación de cualquier órgano del cuerpo para
posteriormente ser teñido en histología.

III. MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS

3.1. Preparación del paraformaldehido para fijación
a. Materiales:
Material de vidrio: beakers, bagueta
Material diverso: papel aluminio, agua destilada, termómetro, papel filtro,
guantes, mascarilla, pHmetro.
Equipos: calentador con agitador magnético
Reactivos: paraformaldehido en polvo SIGMA, NaOH en granos, NaCl,
fosfato de sodio monobásico 0,2 M, fosfato de sodio dibásico 0,2 M
b. Procedimientos:
La preparación de la solución fijadora de paraformaldehido al 4% debe
realizarse correctamente para que esta pueda actuar sobre los órganos que
deseen estudiarse, pero la preparación debe desarrollarse con la mayor
cautela posible ya que algunos de los componentes de la mezcla son muy
tóxicos (paraformaldehido).
Técnica:
Preparación de soluciones Stock: buffer fosfato salino (PBS) 0,2 M
1) Mezclar 27,6 g de fosfato de sodio monobásico 0,2 M en 1 litro de agua
destilada
2) Mezclar 28,4 g de fosfato de sodio dibásico 0,2 M en 1 litro de agua
destilada
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3) Unir en estas proporciones:

Sustancias 500 ml 1000 ml
Fosfato de sodio monobásico 140 ml 280 ml
Fosfato de sodio dibásico 360 ml 720 ml
NaCl 4,5 g 9g
Preparación de la solución de paraformaldehido

1) Calentar agua destilada en un calentador con agitador magnético en un

beaker y taparlo con papel aluminio para evitar la salida de vapor de agua
2) Para preparar paraformaldehido al 4% debe usarse 40 g para 1 litro de
solución final o 20 g para 500 ml de solución final
3) El paraformaldehido tiene varias formas de presentación, en granos que
no diluyen bien por lo tanto no sirven para preparar solución fijadora y en
forma de polvo blanco que es muy toxico.
4) El agua destilada debe calentarse hasta 60 – 70°C (65°C), osea que el
beaker presente agua condensada en sus paredes sin que llegue a hervir,
entonces se le agrega el paraformaldehido, por ejemplo 20 g de
paraformaldehido en 2 – 3 partes a los 250 mil de agua destilada, para una
preparación final de 500 ml de paraformaldehido al 4%.
5) Luego de la agitación de todo el paraformaldehido con el agitador
magnético siguiendo el calentamiento (agitar 10´/65°C, controlando la
temperatura), agregar a la solución lechosa 1 grano de NaOH para
clarificarla y agitar 30¨
6) Añadir 250 ml de PBS 0,2M pH 7,2 – 7,4, por lo que como la solución
final de paraformaldehido es de 500 ml, el PBS disminuyo su molaridad a
0,1 M; verificar el pH.
7) Filtrar con papel filtro, usar guantes y mascarilla porque el
paraformaldehido es toxico y libera vapores irritantes de las mucosas,
procurar filtrar rápidamente.
Para 1000 Para 2000 Para 4000 Final
ml. Total ml Total ml Total %
Paraformaldehido 40 g 80 g 160 g 4%
Buffer fosfato 0,2M, Ph 500 ml 1000 ml 2000 ml ------
7,2

3.2. Técnica de perfusión transcardiaca en modelo animal

a. Materiales
Material biológico: rata albina de raza Holtzmann, ratón albino raza Swiss,
Paloma.
Material diverso: jeringa y agujas N° 14 (limada en la punta para que quede
roma) y 25, soporte para el animal, pabilo, equipo de cirugía menor con
gubia pequeña, pinzas hemostáticas grandes, medianas y pequeñas, tijeras
de cirugía medianas y pequeñas, tijeras iris, hojas de bisturí N° 21,
venoclisis.
Equipos: balanza.
Reactivos: anestésico halatal (pentobarbital sódico), ketaminol
(hidrocloruro de ketamina) y Narcoxyl (hidrocloruro de xilacina) solución
salina al 0,9% (4 °C) y al 0,75% (41 °C), paraformaldehido al 4% (4 °C),
sacarosa al 5%, 10%, 20%, y 30% (todas a 4 °C), heparina sódica al 1%
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b. Procedimientos
La perfusión transcardiaca es la técnica más utilizada para la fijación de
tejidos en animales de experimentación debido a que se puede considerar
que la técnica fija “in vivo” evitando los efectos indeseables de la alteración
de la composición y estructura de los órganos o putrefacción, lo que haría
difícil su estudio o evaluación, sobretodo en la aplicación de técnicas de
coloración como la inmunohistoquimica que requiere que se mantenga la
estructura del sistema nervioso central con sus respectivas moléculas como
por ejemplo neuropeptidos, y que es de uso frecuente en neurociencias,
esta técnica puede aplicarse tanto en mamíferos como en aves, con
variantes como se verá a continuación.
Técnica para perfusión transcardiaca en ratas y ratones.
1) Anestesiar al animal con una inyección de halatal utilizando la aguja N°
25, para esto antes se debe calcular la cantidad de anestésico que se
debe inocular en el animal (usando la fórmula de Turk)
2) Al momento de la inyección intraperitoneal, echar brevemente al
animal hacia un lado para que las vísceras caigan por gravedad y el
anestésico no sea absorbido por ellas (en especial por las heces), se
debe estirar la pata del lado en que se aplicara la inyección para evitar
daños.
3) Esperar a que el anestésico haga efecto (cerca de 10´), para estar seguro
que el animal esta anestesiado, presionar fuertemente la parte inferior
de la pata, en la almohadilla. Si no hace el movimiento de jalarla o
contraerla, ya está anestesiada, el efecto dura aproximadamente 90´
4) Amarrar al animal anestesiado a un soporte por las 4 patas con el
vientre hacia arriba.
5) Cortar la parrilla costal (piel, musculo, etc.) con cuidado utilizando el
equipo de cirugía, de manera que se puede exponer el corazón y la
arteria aorta, que se muestra como vaso grueso color blanco en rata y
transparente en ratón. Debe tratar de darse espacio para poder
maniobrar sin dificultad.
6) Abrir el sistema de lavado (venoclisis conteniendo 100 – 200 ml de
solución salina 0,9%), el líquido fluirá por la aguja N° 14 limada en su
extremo (punta roma) a la que está conectado.
7) Introducir la aguja por el ventrículo izquierdo del corazón del animal
suavemente sosteniendo con las pinzas hemostáticas y ver que entre
en la aorta ascendente (se ve claramente). Sostener la aguja en el
interior del corazón con pinzas hemostáticas (clampers)
8) Se corta la aurícula derecha con las tijeras iris para que la sangre drene
primero y posteriormente se hace pasar la solución salina 0,9%. Así se
lava la sangre de todo el organismo.
9) Cuando esté a punto de terminar de fluir la solución salina al 0.9%,
verter en el sistema el fijador paraformaldehido al 4& y dejar fluir por
todo el organismo, el cuerpo inanimado va a empezar a contraerse
debido a que el paraformaldehido produce cambios conformacionales
en el retículo sarcoplásmico, lo que origina la salida de calcio y la
posterior contracción del cuerpo.
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10) Cuando termine de fluir el fijador cerrar el sistema, sacar la aguja del
corazón del animal, desamarrarlo y empezar la operación de extracción
del encéfalo.
11) Decapitar al animal y empezar a cortar y desechar todo el tejido que
esta fuera del cráneo, envolviéndolo.
12) Empezar a retirar el hueso con cuidado y poco a poco con la gubia para
extraer el encéfalo fijado.
13) Extraer el encéfalo y llevarlo a un frasco conteniendo fijador, al día
siguiente pasarlo a sacarosa al 5%, al día siguiente 10%, luego 20% y
finalmente 30%.

Técnica de perfusión transcardiaca en aves: palomas.

1) Se prepara 1 ml del anestésico, pero tal vez no sea necesario usar toda
esa necesidad. Este anestésico consiste en una mezcla de ketaminol
(hidrocloruro de ketamina) 2:1 Narcoxyl (hidrocloruro de xilacina)
2) Inyectar 0,4 ml de la mezcla intramuscularmente a un lado de la quilla.
En ocasiones es necesario suministrar 0,2 ml más como refuerzo.
3) Esperar alrededor de 5 minutos a que el ave quede anestesiada.
4) Una vez anestesiada, desplumar la zona del pecho arrancando
suavemente las plumas y comprobar el reflejo de la paloma, pellizcando
la piel para ver si contrae esa parte, y jalar la pata para ver si aún siente.
Desde el paso 5 hasta el 9 debe hacerse lo más rápido posible, tratando
de hacerlo en 2 minutos.
5) Cortar con la hoja del bisturí la piel y luego el grueso musculo pectoral,
primero con bisturí y luego con tijeras grandes y gruesas ya que el
musculo posee un grosor de aproximadamente 2 cm (al cortar este
músculo se contrae por respuesta refleja)
6) Inyectar 0,3 ml de anticoagulante heparina sódica al 1% directamente
al corazón expuesto.
7) Tener preparada la venoclisis con dos agujas adaptadas para
introducirlas por ambos ventrículos del corazón, identificando las dos
bifurcaciones de la aorta, cortar por el ventrículo izquierdo que lleva de
frente a la aorta, el ventrículo derecho no lo hace, una vez introducidas
ambas agujas cortar las aurículas derecha e izquierda para que drene la
sangre y el fijador. Clampear ambas agujas a la altura de las
bifurcaciones de la aorta.
8) En primer lugar, hacer pasar 400 ml de solución salina al 75%.
9) Hacer pasar el fijador, 300 ml de paraformaldehido al 4%, para ver si el
animal está bien fijado observar que el paladar del ave palidezca de su
color rojizo natural a un tono blanco o claro.
10) Una vez terminada la fijación, retirar el material del cuerpo del ave,
decapitarla, extraer la piel y musculo de la cabeza, para retirar los
esponjosos y delgados huesos del cráneo, utilizando la gubia sin
maltratar el encéfalo.
11) Extraer el encéfalo y llevarlo a un frasco conteniendo fijador, al día
siguiente pasarlo a sacarosa al 5%, al día siguiente 10%, luego 20% y
finalmente 30%.
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Interpretación.

El uso de paraformaldehido o formaldehido va a permitir la correcta fijación

del encéfalo, que en la neurociencia es el órgano más importante a estudiar,
aunque puede aplicarse para fijar y extraer en buenas condiciones otros
órganos para su estudio.

IV. RESULTADOS
Se logrará fijar satisfactoriamente el sistema nervioso central (encéfalo y medula
espinal) de los animales de experimentación, tanto mamíferos como aves, de modo
que el tejido puede servir para la obtención de los cortes histológicos requeridos.

Figura 2: Toracotomía y levantamiento de parrilla costal

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Figura 3: Proceso de ajuste de la sonda al ventrículo

Figura 4: Perfusión in situ, técnica asistida

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V. CONCLUSIONES

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS