Biodegradación de Cloruro de Benzalconio Su Aplicación en La Depuración de Efluentes Líquidos PDF

BIODEGRADACIÓN DE
CLORURO DE BENZALCONIO:
SU APLICACIÓN EN LA
DEPURACIÓN DE EFLUENTES
LÍQUIDOS
Jesús David Álvarez Roncancio

MAESTRÍA EN BIOTECNOLOGÍA
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Tesis para optar al título de
MAGISTER EN BIOTECNOLOGÍA
AÑO 2017
BIODEGRADACIÓN DE CLORURO DE BENZALCONIO: SU APLICACIÓN EN LA

DEPURACIÓN DE EFLUENTES LÍQUIDOS
Maestrando: Jesús David Álvarez Roncancio

Directora: Dra. Sonia Edith Korol
Cátedra de Salud Pública e Higiene Ambiental (UBA)
Co-Director: Dr. Alfredo Gallego
Cátedra de Salud Pública e Higiene Ambiental (UBA)
A mí amada madre Rosa, a mis valientes
hermanos Frank y Yoam, a mi dulce amiga
Mayra, a mis queridos Alejo y Paula y a mi
eterno amigo Diego… Gracias.
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, agradezco infinitamente a mi maestro y gran amigo el Dr. Alfredo Gallego quien
desde el primer momento me brindo su guía académica, me mostró la riqueza cultural e histórica
de la Argentina, y a través de su paciencia y creatividad, me enseño una perspectiva diferente de
la labor del docente.
Igualmente agradezco a la Dra. Sonia Korol y a mi maestra Susana Fortunato por sus significativos
aportes a este proyecto y su incondicional apoyo durante mi estadía en la República Argentina,
haciéndome sentir siempre como un argentino más.
Finalmente agradezco a la UBA y al pueblo argentino quienes han aportado a la construcción de

Latinoamérica, abriendo las puertas a estudiantes quienes, como yo, sueñan con construir un
mundo mejor para todos los seres de este planeta.
Tabla de contenido
RESUMEN ...................................................................................................................................... 1
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 2
Contaminantes emergentes........................................................................................................... 2
Productos farmacéuticos y de cuidado personal como contaminantes emergentes ............................. 7
Desinfectantes como contaminantes. ........................................................................................... 13
Compuestos de Amonio Cuaternario (QACs) ................................................................................ 15
Cloruro de Benzalconio (BKC) como contaminante. .............................................................. 20
Alternativas de tratamiento del BKC .................................................................................... 23
Biodegradación del BKC .................................................................................................... 24
OBJETIVOS .................................................................................................................................. 26
Objetivo General ........................................................................................................................ 26
Objetivos Específicos ................................................................................................................. 26
MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................... 28
Medios de cultivo ....................................................................................................................... 28
• Medio mínimo mineral ................................................................................................ 28
• Solución de sales....................................................................................................... 28
• Solución de vitaminas ................................................................................................ 28
• Otros medios empleados para cultivo e identificación de bacterias ................................. 29
Compuestos químicos ................................................................................................................ 29
Toma y transporte de muestras ................................................................................................... 29
Caracterización de las muestras .................................................................................................. 42
• Demanda química de oxígeno (DQO) .......................................................................... 42
• Demanda bioquímica de oxígeno (DBO) ...................................................................... 42
• Caracterización microbiológica de las muestras ............................................................ 42
➢ Recuento de Bacterias Aerobias Mesófilas. .................................................................. 42
➢ Recuento de Coliformes termotolerantes y Escherichia coli ............................................ 42
➢ Recuento de Enterococos ........................................................................................... 43
Ensayo de biodegradabilidad en agua superficial .......................................................................... 44
Selección e identificación de bacterias degradadoras de BZC ........................................................ 45
• Confirmación de la utilización de los compuestos como única fuente de carbono............. 45
• Aislamiento e identificación de bacterias degradadoras de BKC ..................................... 46
Ensayos de biodegradación con BKC........................................................................................... 46
• Ensayos de biodegradación en reactores batch ............................................................ 46
• Ensayos de biodegradación en reactor continuo ........................................................... 47
• Parámetros de operación del reactor ........................................................................... 49
➢ Tiempo de retención hidráulico TRH ............................................................................ 49
➢ Carga orgánica .......................................................................................................... 49
Métodos analíticos y parámetros de control .................................................................................. 50
• Determinación del crecimiento bacteriano .................................................................... 50
➢ Determinación del número de microorganismos viables ................................................. 50
➢ Determinación de la cinética de crecimiento bacteriano ................................................. 50
➢ Estimación del número de microorganismos viables en la biopelícula .............................. 50
➢ Observación de la biopelícula por microscopía electrónica de barrido ............................. 51
Determinación del consumo de sustrato ....................................................................................... 51
• Determinación BKC por espectrofotometría .................................................................. 51
• Determinación BKC por HPLC .................................................................................... 51
Bioensayos de toxicidad ............................................................................................................. 52
• Ensayo de toxicidad en Vibrio fischeri .......................................................................... 52
• Bioensayo de toxicidad con Pseudokirchneriella subcapitata ......................................... 53
• Bioensayo de toxicidad con Lactuca sativa................................................................... 53
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................................ 55
Caracterización de las muestras .................................................................................................. 55
Ensayo de biodegradabilidad en agua superficial .......................................................................... 59
• Confirmación de la utilización de los compuestos como única fuente de carbono ............. 65
• Aislamiento e identificación de bacterias degradadoras de BKC ..................................... 66
Desarrollo de un método colorimétrico directo para la determinación de BKC. ................................. 67
Ensayos de biodegradación con BKC........................................................................................... 67
• Ensayos de biodegradación en reactores batch ............................................................ 67
• Ensayos de biodegradación en reactor continuo ........................................................... 72
Parámetros de operación del reactor ................................................................................... 73
➢ Tiempo de retención hidráulico TRH ............................................................................ 73
➢ Carga orgánica .......................................................................................................... 73
Bioensayos de toxicidad ............................................................................................................. 78
CONCLUSIONES........................................................................................................................... 80
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 82
RESUMEN
El aumento de la actividad humana, industrial y agrícola después del inicio de la revolución

industrial ha causado efectos negativos en el medio ambiente debido al uso descontrolado de un
gran número de sustancias que son arrojadas en la atmosfera, en cuerpos de agua y suelos.
Dentro de estas sustancias se encuentran los Contaminantes Emergentes, los cuales han tomado
recientemente especial relevancia en la investigación a causa de sus posibles consecuencias para
la vida en el planeta. El estudio de estos contaminantes es de vital importancia porque aún no se
tiene conocimiento de sus efectos en el medio ambiente y cómo pueden afectar a los organismos
vivos.
El objetivo del presente trabajo fue desarrollar procesos de tratamiento a escala laboratorio para
la biodegradación de Cloruro de Benzalconio (BKC) en efluentes líquidos. El BKC es un compuesto
de amonio cuaternario considerado contaminante emergente. Es un desinfectante de amplio uso
en centros de salud y en la industria de los productos farmacéuticos y del cuidado personal, sin
embargo su disposición aún no se encuentra regulada por autoridades ambientales.
Inicialmente se tomaron muestras de agua de la cuenca Matanza-Riachuelo, el río Reconquista y

el Río de la Plata con dos objetivos: determinar características microbiológicas y fisicoquímicas de
los cuerpos de agua, y realizar ensayos de biodegradabilidad de varios compuestos. A partir del
muestreo se seleccionó una cepa de Pseudomonas sp. capaz de utilizar el BKC como fuente
carbono. Una vez seleccionado e identificado el organismo se procedió a realizar ensayos de
biodegradación en sistemas batch. Se evaluó tanto la cinética de crecimiento como el porcentaje
de remoción del compuesto. Luego la bacteria fue empleada también en un reactor contínuo de
película biológica de flujo ascendente utilizando un soporte de Leca ®, El reactor estuvo en
operación durante 67 semanas. Se trabajó con un efluente conteniendo BKC a escala de
laboratorio, evaluando concentraciones desde 81 hasta 1172 mg∙L-1. Finalmente se evaluó la
remoción y se realizaron ensayos de toxicidad a los efluentes una vez tratados, que confirmaron
la eficiencia del proceso ya que se reduce la concentración de BKC a valores por debajo de los
límites de detección de las técnicas usadas.
Con este trabajo se demuestra que a partir de la metodología propuesta es posible desarrollar
sistemas de depuración de efluentes que sean eficientes, económicos, escalables a la industria y
que contribuyan significativamente a la conservación de los cuerpos de agua y de todos los
sistemas biológicos que puedan depender de ellos.
1
INTRODUCCIÓN
Contaminantes emergentes.
El creciente número de la población mundial, el desarrollo del comercio, la industria, la agricultura,

la expansión de las urbes y la continua actividad humana, han promovido un uso excesivo de
materiales que son transportados por efluentes líquidos o desechados en rellenos sanitarios. Una
gran variedad de estos contaminantes llega directamente a ríos, lagos, lagunas y arroyos sin ser
tratados previamente mediante algún proceso fisicoquímico o biológico, afectando
considerablemente los ecosistemas y las fuentes hídricas necesarias para la obtención de agua
potable. Hoy en el mundo se reconocen diversos tipos de contaminantes del agua como por
ejemplo metales pesados, detergentes, plaguicidas y fertilizantes. Si bien existe un amplio
conocimiento de estos contaminantes y una legislación que controla sus vertidos, en los últimos
años se han desarrollado estudios que demuestran la existencia de otros compuestos que se
encuentran presentes en el agua que podrían ser potencialmente peligrosos para los organismos
vivos debido a su persistencia, bioacumalación, biomagnificación y toxicidad. A estos
contaminantes se les ha denominado emergentes y existen organismos como la Organización
Mundial de la Salud (OMS) y la Agencia para la Protección del Medio Ambiente de Estados Unidos
(EPA), que las reconocen y estudian sus posibles efectos (Barceló y López, 2015).
Los contaminantes emergentes se han definido como “compuestos que actualmente no están
regulados por una legislación y pueden ser potencialmente peligrosos para la seguridad de los
ecosistemas y la salud humana” (La Farré et al., 2008).
De los contaminantes emergentes se tiene un escaso conocimiento. Su origen en algunos casos

es reciente: compuestos provenientes de nuevos procesos industriales y en otros casos son
sustancias que existen hace muchos años, pero solo desde hace poco tiempo se estudia su efecto
en el medio ambiente. Por esta razón no existe una legislación clara que los regule sus
concentraciones en los vertidos. Sin embargo, se conoce que una de las principales características
de estos contaminantes es que pueden causar efectos negativos debido a que tienen una alta tasa
de producción y consumo, lo cual genera su introducción continua en el medio ambiente (Barceló
y López, 2015).
Como se ha señalado, los contaminantes emergentes tienen un origen diverso y por lo tanto su
tratamiento y disposición puede variar significativamente dependiendo de las características
2
fisicoquímicas. Entre estos contaminantes pueden mencionarse algunos de los siguientes grupos:
(Gil, 2012; Barceló y López, 2015; La Farré et al., 2008)
• Plaguicidas
• Hormonas esteroides
• Productos farmacéuticos y de cuidado personal (PPCPs)
• Surfactantes
• Aditivos industriales y subproductos
• Aditivos alimentarios
• Parafinas cloradas
• Drogas ilícitas
• Retardantes de llama
• Aditivos de combustibles
• Disolventes
Las vías de entrada de estos compuestos y sus derivados en el medio ambiente dependen del uso
y del modo de aplicación. Una vez liberados estos compuestos en los cuerpos de agua pueden
sufrir diferentes transformaciones, ya sea por biodegradación, procesos químicos o fotoquímicos,
dependiendo de la zona en la cual se depositen (aguas subterráneas, aguas superficiales o
sedimentos) (Figura 1). En ocasiones este tipo de transformaciones químicas producen otros
compuestos que tienen un comportamiento y perfil ecotoxicológico diferente al del compuesto de
origen, creando un “cóctel” de sustancias que pueden ser en algunos casos de una mayor
persistencia y efecto tóxico (La Farré et al., 2008). Los contaminantes emergentes son capaces
de filtrarse a los cuerpos de agua fácilmente y dada la frecuencia de su empleo, representan un
potencial riesgo para la salud de cualquier organismo que haga uso de estas fuentes hídricas.
Aunque se ha registrado la presencia de este tipo de compuestos en aguas superficiales y
subterráneas, se tienen pocos datos de sus riesgos ambientales (Petrovic et al., 2003).
Una fuente de contaminantes emergentes es la actividad veterinaria. Las drogas que son usadas
para el tratamiento de animales y en la prevención de enfermedades de granja, llegan al ambiente
a través del estiércol. Estas drogas y sus metabolitos contaminan los suelos y afectan también las
aguas subterráneas (La Farré et al., 2008). Los rellenos sanitarios también pueden ser una fuente
de contaminación con estos compuestos. Varios estudios han demostrado la presencia de
sustancias potencialmente peligrosas para el ambiente y la salud humana en este tipo de rellenos
(Paxus, 2000; Schwarzbauer et al., 2002; Öman y Hynning, 1993). En estas zonas de disposición
3
de residuos se han identificado, por ejemplo, compuestos perfluorados (PFCs) (Schultz et al.,
2006) los cuales se pueden encontrar en una gran variedad de materiales, como productos de
limpieza, alfombras, textiles, revestimientos de papel, cosméticos, espumas contra incendios y
contenedores de comida envasada (Hekster, Laane, y de Voogt, 2003). Muchos de estos
compuestos provenientes de los lixiviados se encuentran en el agua (Schultz et al., 2006) debido
a que los rellenos realizan una importante descarga de efluentes sobre las plantas de tratamiento
de aguas residuales, dando como resultado la dispersión de PFCs y otros contaminantes
emergentes (Eggen, Moeder, y Arukwe, 2010).
Las transformaciones químicas de los contaminantes emergentes pueden ser de carácter biótico
o abiótico. Por ejemplo, en las aguas superficiales, las sustancias químicas pueden sufrir cambios
a través de procesos abióticos como la reacción con oxígeno (O2), hidroxilos (-OH) y radicales
peróxilos (HOO•), entre otros. Por otro lado, los cambios de tipo biótico pueden eliminar parcial o
totalmente algunos contaminantes emergentes, debido a que muchos microorganismos pueden
ser utilizarlos como fuente de carbono (La Farré et al., 2008). Otra importante vía de
biodegradación es el co-metabolismo, en donde el organismo modifica el compuesto orgánico,
pero no lo utiliza para su crecimiento (Nyholm et al., 1996).
Se ha sugerido prestar particular atención a ciertos compuestos polares que por sus características
fisicoquímicas tienen una pobre biodegradabilidad y una alta solubilidad en el agua. Estos son:
derivados de los productos farmacéuticos, de los plaguicidas y de surfactantes no iónicos (Petrovic
et al., 2003).
Otro grupo de sustancias que merecen atención como contaminantes emergentes son los ya
mencionados compuestos perfluorados (PFCs) en los que se incluye el sulfonato de
perfluorooctano (PFOS), el ácido perfluorooctanoico y otros compuestos estructuralmente
relacionados, que son tóxicos, persistentes y bioacomulables (La Farré et al., 2008).
4
Figura 1. Distribución de contaminantes emergentes y principales transformaciones en el medio ambiente y la “tecnosfera” (La Farré
et al, 2008).
Otra dificultad que se atraviesa a la hora de evaluar la presencia y el efecto de estos contaminantes
emergentes se da en los métodos analíticos que se requieren para este proceso; teniendo en
cuenta que químicamente son muy diversos y se encuentran en concentraciones muy bajas, lo
que exige un método de alta precisión y exactitud (Petrovic et al., 2003).
Una recopilación de contaminantes emergentes identificados en diferentes estudios realizados

sobre aguas utilizadas para el consumo se muestra en las siguientes tablas:
Tabla 1
Compuestos de uso industrial reportados en aguas de consumo.
Concentración Concentración
Compuestos Uso Compuesto
Mínima (μg·L-1) Máxima (μg·L-1)
Hidroxianisol butilado 5.0x102 5.0 x10-2

Aditivo para (BHA)
Antioxidantes
alimentos
Butil Hidroxitolueno (BHT) 1.0 x10-1 1.0 x10-1
3.0 x10-3 1.9 x101
Ácido perfluorooctanoico
Impermeabilización y
Perfluoratos (PFOA)
recubrimientos
Ácido perfluorooctano
6.0 x10-3 1.4
sulfónico (PFOS)
Nonilfenol 8.0 x10-1 4.0 x101

Limpiador y
producción de Tert-Octifenol 1.3 x10-2 5.6 x10-1
Fenoles
resinas, fungicidas y
plásticos Bisfenol A (BPA) 1.4 x10-1 1.2 x101
Bisfenol F (BPF) 1.8 x10-1
Dietil ftalato 2.0 x10-1 4.2 x10-1

Producción de
Ftalatos Di(2-etilhexil) ftalato 2.2 9.8 x101
plástico
(DEHP)
Dibutil ftalato (DBP) 5. x101 8.8

Nota. Adaptado de Murray, K. E., Thomas, S. M., y Bodour, A. A. (2010). Prioritizing research for
trace pollutants and emerging contaminants in the freshwater environment. Environmental
Pollution, 158(12), 3462-3471.
6
Tabla 2
Pesticidas reportados en agua de consumo.
Concentración Concentración
Grupo Uso Compuesto
mínima máxima
Acetoclor 1.0 x10-1 2.0 x10-1

Cloroacetanilido Herbicida Alaclor 5.0 x10-2 6.3 x10-1
Metalaclor 1.0 1.1 x101
DDT 1.8 x10-1 9.0 x10-1

Dieldrina 1.8 x10-1 2.1 x10-1
Endosulfan 1,8
Organoclorados Insecticida Heptacloro 2.4 x10-1
Lindano 2.0 x10-2 2.0 x10-1
Metoxicloro 1.0 x10-1 1.7
Bentazona 4.0 x10-3 2.5 x10-1

Ácido 2,4-
Clorofenoxiácidos Herbicida
Diclorofenoxiacético 3.0 x10-3 1.2
Clorpirifós 6.0 x10-2 3.1 x10-1

Organofosforados Insecticida Diazinón 7.0 x10-2 1.1
Piretroides Insecticida Esfenvalerato 1.4 x10-1

Cianazina 1.0 x10-1 3.0 x10-1
Simazina 1.0 x10-2 1.7 x10-1
Triazinas Herbicida
Atrazina 2.0 2.1
Nota. Adaptado de Murray, K. E., Thomas, S. M., y Bodour, A. A. (2010). Prioritizing research for
trace pollutants and emerging contaminants in the freshwater environment. Environmental
Pollution, 158(12), 3462-3471.
Productos farmacéuticos y de cuidado personal como contaminantes emergentes
Los productos de origen farmacéutico y de cuidado personal poseen un impacto en el medio

ambiente debido a su alto consumo y su fácil introducción en los ecosistemas. Los hogares y las
industrias aportan el mayor volumen de estos contaminantes a través de las redes de aguas
residuales que finalmente derivan a plantas de tratamiento. Los cuerpos de agua donde se liberan
los efluentes de plantas de tratamiento son los más afectados por los PPCPs. Se ha llegado a
encontrar cantidades de estas sustancias en aguas ya depuradas que pueden variar en el orden
de ng∙L-1 a μg∙L-1 (Bedner y MacCrehan, 2006). La tecnología y los diseños que son utilizados para
la construcción de estas plantas no logran la eliminación de algunos residuos provenientes de
PPCPs debido a que estos contienen compuestos y metabolitos que pueden evadir fácilmente los
procesos utilizados para la depuración del agua y así entrar a los sistemas acuáticos (Petrovic,
7
Gonzalez, y Barcelo, 2003). Por otro lado, las propiedades fisicoquímicas de los fármacos y sus
metabolitos permiten que estos puedan alcanzar aguas subterráneas, lo cual exige que para el
tratamiento de estos contaminantes sea necesario evaluar la relación entre los cuerpos de agua,
los suelos alrededor de ellos y los sedimentos presentes (Barceló y López, 2015).
Algunos de los PPCPs reportados en la literatura se mencionan a continuación:
• Analgésicos
• Fármacos antiepilépticos (AEDs)
• Antihiperlipidémicos
• Antiinflamatorios no esteroides (AINE)
• Hormonas sintéticas
• Desinfectantes
• Drogas ilícitas
• Filtros UV
• Repelentes
Para Barceló y Petrovic (2007) los PPCPs merecen especial atención por cuatro razones:
• Se introducen constantemente al ambiente por medio de los efluentes de plantas de

tratamiento y los sistemas sépticos.
• En el caso de los fármacos estos son compuestos que se diseñan para tener un efecto
biológico.
• Tienen propiedades fisicoquímicas similares a las de otros compuestos xenobióticos, lo

que les permiten ser persistentes
• Se liberan en gran volumen al ambiente
Algunos PPCPs han sido catalogados como compuestos disruptores endocrinos (EDCs por sus
siglas en inglés). Estas sustancias pueden alterar el normal funcionamiento del sistema hormonal
humano o animal (Bolongan et al, 2009), y comprenden un amplio espectro de compuestos como
lo reporta la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Unión Europea (UE) y la EPA.
La siguiente Tabla muestra una lista de sustancias consideradas EDCs:
8
Tabla 3.
Compuestos clasificados como disruptores endócrinos
Clase de EDC Compuesto detectado Uso/Origen
Se encuentran en
Ftalato de butilbencilo, di-(2- detergentes, resinas, algunos
Ftalatos etilhexil)ftalato, di-n-butil aditivos y monómeros
ftalato usados en producción de
plástico.
DDT, DDE, deltametrina,
carbofuran, atrazina, lindano, Usado extensivamente en la
Plaguicidas
vinclozolina, carbendazim y agricultura.
tributilo de estaño
Utilizado como antifouling en
Compuestos Orgánicos de Tributilo de estaño y trifenil de
pinturas para revestimiento
Estaño estaño
de barcos y lanchas
Usado en la producción de
Nonifenol, nonifenol etoxilado, aditivos plásticos,
Alquilfenoles
octilfenol, octilfenol etoxilado emulsionantes, aplicaciones
agrícolas e industriales.
Se pueden producir durante
Dibenzo-p-dioxina, 2,3,7,8-
la incineración de
tetraclorodibenzo-p-dioxin y
Dioxinas y furanos compuestos aromáticos
2,3,7,8-
clorados, papel y en la
tetraclorodibenzofurano
producción de PVC
Usado en la producción de
polímeros, retardantes de
Bisfenoles Bisfenol A
llama y químicos del caucho
Usado como preservante de

Metil, etil, propil y
Parabenos cosméticos y productos del
butilparabeno
cuidado personal
9
Tabla 3.
Compuestos clasificados como disruptores endócrinos (continuación)
Clase de EDC Compuesto detectado Uso/Origen
Usado en refrigerantes,
2,2’,4,4’-Tetrabromo difenil
lubricantes, transformadores,
Bifenilos policlorados éter, 2,5-dicloro-4-
condensadores y otros
hidroxibifenil
equipos eléctricos
Compuestos generados
Fluoreno, fenantreno,
Hidrocarburos policíclicos durante la combustión
fluoranteno, antraceno,
aromáticos incompleta de aceite, carbón
pireno, naftaleno
y madera
Hexabromociclododecano, Compuestos usados en la
Retardantes de llama
éter difenil polibromado y producción de mobiliarios,
bromados
tetrabromobisfenol A textiles y equipo electrónico
Usado en anticonceptivos y
Fármacos (Esteroides Dietilestilbestrol y 17α-
para el tratamiento de la
sintéticos) etinilestradiol
menopausia
Sustancias naturales
Daidzeina, genisteina, encontradas en granos,
Fitoestrogénos
enterodiol y enterolactona cereales, vegetales, frutas y
otros
Estrógenos naturales
Hormonas naturales Estrona, 17β-estradiol excretados en la orina
humana y animal
Nota. Adaptado de Esplugas, S., Bila, D. M., Krause, L. G. T., y Dezotti, M. (2007). Ozonation and
advanced oxidation technologies to remove endocrine disrupting chemicals (EDCs) and
pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) in water effluents. Journal of Hazardous
Materials, 149(3), 631-642.
Los efectos causados por sustancias EDCs en el medio ambiente son: (i) problemas en los huevos
de aves, peces y tortugas, (ii) feminización de peces macho, (iii) problemas en el sistema
reproductivo de aves, reptiles, mamíferos y peces y (iv) cambios en el sistema inmunológico de
mamíferos. Por otro lado, los efectos reportados de los EDCs sobre la salud humana pueden ser:
reducción en la cantidad de esperma, incremento del busto, cáncer testicular o de próstata y
endometriosis (Esplugas et al., 2007).
10
Los PPCPs se dispersan a través de las aguas residuales y posteriormente por el ciclo el agua
(Rodil et al., 2012). Estos compuestos pueden introducirse en el medio ambiente debido a que una
gran proporción de ellos son ionizables y se encuentran asociados a complejas matrices que
permiten mantener su función biológica (Cunningham, 2004). Se sabe que un importante
porcentaje de la contaminación derivada del uso de fármacos proviene de productos que han sido
metabolizados y procesados por sistemas biológicos, sin embargo, estos pueden mantener su
actividad debido a que los organismos no garantizan su total biotransformación (Jiménez
Cartagena, 2011) y pueden causar daños a otros organismos que se encuentren expuestos a estas
sustancias. También es importante resaltar que los medicamentos cuentan con características que
les permiten acumularse en el medio ambiente, por ejemplo: lipofilicidad para lograr atravesar
membranas y persistencia para evitar ser inactivados antes de producir el efecto curativo o
terapéutico (Halling-Sorensen et al., 1998).
Por otro lado, existen contaminantes emergentes provenientes de los productos de limpieza
usados ampliamente en hogares y la industria como el nonilfenol etoxilado (NPEOs) y los
alquilfenoles etoxilados (AEOs), los cuales han sido detectados en partículas suspendidas en
cuerpos de agua dulce y marinos, así como en sedimentos (La Farré et al., 2008).
Como afirman Kasprzyk-Hordern et al., (2008) la concentración y el destino de los PPCPs en los
sistemas acuáticos varía y depende de diferentes parámetros como la posición geográfica, las
condiciones meteorológicas, la efectividad de los procesos aplicados en las plantas de tratamiento
de aguas residuales y la proximidad de éstas a las fuentes de contaminación.
Se ha logrado demostrar que los procesos convencionales utilizados en plantas de tratamiento de

agua potable (coagulación, floculación y sedimentación) son métodos de baja efectividad en la
eliminación de PPCPs, mientras otras técnicas como la oxidación con cloro y ozono, el uso de
carbón activado y la filtración con membrana, tienen un mejor resultado en la remoción de este
tipo de productos (Boyd et al., 2003).
Suárez et al, (2008) describe los siguientes métodos de remoción de PPCPs usados comúnmente
por las plantas de tratamiento de aguas residuales:
• Sorción de sólidos: en este mecanismo se utiliza el lodo activado como retenedor de los
PPCPs usando la absorción y la adsorción. En el primero las moléculas del fluido entran
a una fase diferente. Este fenómeno se da en la interacción entre grupos alifáticos y
aromáticos con la membrana celular lipofílica de los microorganismos y la fracción lipídica
11
del lodo. En la adsorción las moléculas e iones de las sustancias derivadas de PPCPs se
adhieren físicamente a la superficie de otras moléculas mediante interacciones
electroestáticas.
• Volatilización: una fracción de los PPCPs se volatiliza durante el tratamiento de aireación

en tanque.
• Transformación biológica: A través del uso de comunidades bacterianas se puede

degradar microcontaminantes provenientes de PPCPs. Sin embargo, este tipo de
tratamientos se ven afectados por múltiples factores que pueden alterar el tiempo de
remoción.
Los mecanismos descritos anteriormente pueden presentar los siguientes problemas (Suárez et
al., 2008):
• En el tratamiento primario solo pueden ser absorbidas aquellas sustancias con altas
propiedades de sorción, lo que implica que una gran cantidad de PPCPs pueden no ser
eliminados en este proceso debido a sus propiedades fisicoquímicas.
• El uso de procesos fisicoquímicos puede mejorar considerablemente la eliminación de

PPCPs en las aguas residuales, sin embargo, este proceso puede resultar en un
incremento de los costos de tratamiento.
• Muchos PPCPs han demostrado una remarcada resistencia a los procesos aplicados en
las plantas de tratamiento de aguas residuales.
• Las plantas de tratamiento de aguas residuales no tienen a consideración las cantidades

promedio de PPCPs que llegan a sus instalaciones.
Durante los tratamientos de depuración que se aplican sobre las aguas residuales, una fracción
de los PPCPs se adsorve en los lodos. Esta cantidad es de especial relevancia debido a que
pueden ser en su mayoría compuestos lipofílicos y por lo tanto, pueden hallarse en los lodos que
son utilizados posteriormente en la agricultura (Suárez et al., 2008; Khan y Ongerth, 2002; Kupper
et al., 2004; Kinney et al., 2008).
Una dificultad relacionada a los PPCPs es la falta de una regulación que especifique los límites de
descarga de estas sustancias en las redes de aguas residuales. El avance de la industria y la
12
tecnología aplicada en ellas ha sobrepasado las prácticas regulatorias actuales. Básicamente el
problema subyace en el escaso o nulo monitoreo de las cantidades de PPCPs que se encuentran
en las plantas de tratamiento de aguas residuales y cuerpos de agua, más aún, cuando se trata
de compuestos que se encuentran en un rango bajo de concentración (Bolongan et al, 2009).
Entonces la necesidad de detectar y controlar las cantidades presentes de PPCPs en el agua
conlleva a plantear nuevas tecnologías para la detección y también para el tratamiento de
efluentes, que sean eficientes, económicas y competitivas en la degradación de material orgánico.
Adicionalmente es importante desarrollar nuevas estrategias de tratamientos terciarios para
garantizar la calidad del agua potable (Rosala et al., 2010).
Precisamente la detección de PPCPs y sus derivados presenta inconvenientes técnicos; debido a

que son una gran variedad de sustancias distintas no relacionadas estructuralmente y no existe
por lo tanto un método universal de análisis para los sistemas acuáticos. Para este propósito se
han utilizado diferentes métodos analíticos como cromatografía gaseosa-espectrometría de masas
(GC-MS), cromatografía gaseosa-espectrometría de masas- espectrometría de masas (GC-MS-
MS), cromatografía gaseosa con espectrometría de alta resolución, cromatografía liquida con
detección ultravioleta (LC-UV), cromatografía liquida-espectrometría de masas (LC-MS) y
cromatografía líquida-espectrometría de masas-espectrometría de masas (LC-MS-MS) (Desbrow
et al., 1998; Laganà et al., 2000; Moeder et al., 2000; Huang y Sedlak, 2001; Kolpin et al., 2002).
Los grupos de PPCPs sobre los cuales existe mayor interés por su posible impacto sobre el medio
ambiente son: (Kümmerer, 2001)
• Antibióticos y desinfectantes
• Agentes citostáticos y drogas inmunosupresoras
• Hormonas
Desinfectantes como contaminantes.
Los desinfectantes a menudo consisten en una mezcla de sustancias activas como alcoholes,
fenoles, compuestos clorados y compuestos de amonio cuaternario. Los desinfectantes generan
un efecto biológico sobre los microorganismos y tienen un amplio rango de aplicación en productos
de limpieza del hogar, en hospitales (desinfección de superficies e instrumentos, desinfección de
piel) y la industria (Kümmerer K., 2001). Estas sustancias llegan a los cuerpos de agua a través
de la descarga que se realiza en las redes de aguas residuales, alcanzando aguas superficiales y
subterráneas que posteriormente son usadas para su consumo.
13
Actualmente los desinfectantes pueden ser considerados como contaminantes emergentes debido
que pueden inducir a cepas resistentes lo cual constituye uno de los más importantes problemas
de salud pública en el mundo (Kümmerer, 2001). La resistencia se define como “la relativa
susceptibilidad de un microorganismo a un particular tratamiento bajo un conjunto de condiciones”
(Kümmerer, 2004), y se cuantifica como el mínimo de concentración requerido para causar un
efecto inhibitorio en una célula. Cualquier cambio que haga a un agente inefectivo contra un
determinado organismo, se refiere como resistencia. Estos cambios de susceptibilidad se
presentan debido a mutaciones o por incorporación de información genética que se ve favorecida
gracias a la presión selectiva a la que se somete a los microorganismos a través de antibióticos,
desinfectantes y otros agentes biocidas (Kümmerer, 2004). Se sabe que la exposición permanente
de las bacterias a elevadas concentraciones de sustancias antimicrobianas aumenta la velocidad
a la cual se seleccionan las cepas bacterianas resistentes (Mölstad et al., 2002; Khachatourians,
1998).
Dentro del grupo de desinfectantes se encuentran tres compuestos de especial interés: Triclosán,
Clorohexidina y Cloruro de Benzalconio.
El Triclosán es un agente antibacterial ampliamente usado en productos como dentífricos,

detergentes y en la industria textil. Esta sustancia es usada típicamente en concentraciones entre
0,1 y 0,3% (p/p) ya que se ha logrado demostrar que a esta concentración el Triclosán produce
efectos biológicos inhibitorios en hongos y bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (Ciba
Specialty Chemicals, 2001).
Ambientalmente el Triclosán puede llegar a presentar un riesgo dado que es un compuesto

estable, lipofílico y capaz de formar dioxinas cloradas por incineración o la acción de la luz solar
(Adolfsson-Erici et al, 2002).
En el estudio realizado por Singer et al., (2002) se determinó que una planta de tratamiento de
aguas residuales era capaz de depurar efluentes que contenían Triclosán hasta en un 94%, 79%
debido a biodegradación y 15% por adsorción. Sin embargo, el 6% remanente del compuesto aún
llegaba a las aguas superficiales, donde era detectado en una concentración de entre 11 y 98 ng∙L-
1. Esta baja concentración remanente aún podría ser responsable de generar resistencia y otros
efectos ambientales negativos.
Diferentes estudios han logrado detectar la presencia de Triclosán en cuerpos de agua (Kim et
al., 2007; Kasprzyk-Hordern et al., 2008; Peng et al., 2008; Yu y Chu, 2009; Yoon et al., 2010),
14
y aunque no existe una evidencia clara de su efecto sobre los mamíferos, se ha determinado que
puede ser toxico en organismos acuáticos como peces, crustáceos y especialmente en algas (p.
ej., Scenedesmus subspicatus) (Irgasan y Irgacare, 1998). También se ha demostrado que el
Triclosán encontrado en aguas residuales puede fomentar la resistencia bacteriana y estar
relacionada con la aparición de alergias. Igualmente cabe destacar que este compuesto ha sido
detectado en la leche materna en concentraciones menores a 20 μg∙Kg-1 hasta 300 μg∙Kg-1, sin
embargo, no se conoce su posible efecto sobre los lactantes y/o las madres (Adolfsson-Erici et al,
2002).
La clorhexidina es una sustancia con propiedades antimicrobianas que es usada comúnmente

para terapia de periodoncia, la prevención de caries (White et al., 1997) y como fungicida (Hiom et
al., 1992). Se ha logrado demostrar además que puede inhibir el crecimiento de esporas
bacterianas (Shaker et al., 1998) y micobacterias (Broadley et al., 1991), pero posee una baja
efectividad como viricida (Platt y Bucknall, 1985). La clorhexidina afecta la membrana celular de
las bacterias (Thomas, Maillard et al., 2000; Lund, 1994) causando la pérdida del material
intracelular, inhibición respiratoria y coagulación citoplasmática (Denyer, 1995). Las bacterias
Gram-positivas son más susceptibles a la acción de la clorhexidina que las Gram-negativas,
particularmente Pseudomonas aeruginosa y Proteus spp (Russell y Chopra, 1996), debido a que
su membrana externa restringe el acceso de la clorhexidina. La clorhexidina es capaz de acceder
al medio ambiente debido al masivo uso de esta sustancia en productos veterinarios (Hebert et al.,
2003), médicos (Larson y Committee, 1995) y dentales (Hope y Wilson, 2004), y a través de los
lodos que se producen en las plantas de tratamiento de aguas residuales (Lawrence et al., 2008).
En cuanto a su impacto, se ha reportado concentraciones entre 1,6 μg∙mL-1 y 10 μg∙mL-1 en aguas
residuales (Kido et al., 1998). En europea se ha clasificado la clorhexidina como perjudicial para
el medio ambiente debido a que tiene efectos tóxicos en los organismos acuáticos por su
bioacumulación en los tejidos grasos (Lawrence et al., 2008), dado que es una molécula lipofílica,
hidrofóbica y se encuentra cargada positivamente (Castillo et al., 2004). Por otro lado, la agencia
de protección ambiental (EPA) ha clasificado la clorhexidina como altamente tóxica para
organismos invertebrados y moderadamente toxica para peces (EPA, 1996).
Compuestos de Amonio Cuaternario (QACs)
En el conjunto de desinfectantes existe un grupo de sustancias llamadas compuestos de amonio

cuaternario (QACs por sus siglas en inglés) los cuales tienen un amplio uso como microbicidas
catiónicos utilizados en la desinfección de superficies (Russell y Ayliffe's, 1992). Estas sustancias
15
también son usadas en la fabricación de suavizantes, preservantes, productos de limpieza y en el
control de plagas (Núñez et al., 2004). Los QACs son compuestos orgánicos nitrogenados que en
su mayoría tienen la formula general R4N+X-. El átomo de nitrógeno se encuentra enlazado
covalentemente a cuatro grupos orgánicos y a la vez posee una carga neutralizada por un
contraión (Figura 2). También son considerados amonio cuaternario los compuestos heterocíclicos
en los cuales el nitrógeno se encuentra enlazado a dos carbonos mediante un enlace sencillo y a
otro carbono con un enlace doble. Los grupos R pueden ser hidrocarburos de tipo saturado,
insaturado, aromático, alifático, cadenas ramificadas o cadenas lineales (Dery, 2000).
Figura 2. Estructura general de los compuestos de amonio cuaternario.
Las propiedades físicas de los QACs dependen en gran medida de su estructura molecular y del
medio en el que se encuentran. Al menos una de las cadenas debe ser hidrofóbica. En su mayoría
son sustancias sólidas y su punto de ebullición es indeterminado. Estos compuestos tienen gran
facilidad para formar dispersiones acuosas lo cual les permite ser ampliamente utilizados. La
ubicación de grupos polares dentro de la estructura cuaternaria de los QACs le da la capacidad de
incrementar la solubilidad en solventes polares (Dery, 2000).
De los QACs detectados en el ambiente se pueden establecer tres grupos:
• Cloruro de dialildimetilamonio, con doble cadena n-alquil de un largo entre C8 y C18 (Li,
X y Brownawell, B. J., 2009).
• Compuestos de alquil trimetil amonio, con una cadena n-alquil que contiene entre C12 y
C22 (Lara-Martín et al., 2010).
• Compuestos Alquil dimetil bencil amonio (BACs), con una cadena alquilo entre C12 y C18
(Li y Brownawell, 2010).
Algunos QACs son capaces de formar pares de iones hidrofóbicos en presencia de surfactantes
aniónicos cambiando sus propiedades físicas y químicas. Por ejemplo, se ha evidenciado que
16
iones orgánicos como el Sulfonato de Alquilbenceno Lineal (LAS) y el Dodecilsulfato Sódico (SDS)
alteran su biodegradabilidad en un sistema donde existan compuestos QACs (Kümmerer, 2001).
Se sabe que los compuestos QACs pueden causar dermatitis e irritación bronquial en personas
que se encuentren en constante contacto con estas sustancias, como se ha evidenciado entre los
trabajadores de la salud y la limpieza (Hecht et al, 1999). Se han descrito efectos como
sensibilización atópica (Preller et al., 1996) y asma ocupacional producida por obstrucción
bronquial (Purohit et al, 2000).
La contaminación de alimentos es otro de los riesgos relacionados con el uso de compuestos de

amonio cuaternario, los cuales son frecuentemente empleados para la limpieza de equipos con los
que se procesan alimentos. Existen reportes de contaminación con QACs en niveles mayores a
0,01 mg∙Kg-1, en donde el dodecil dimetil amonio (DDAC) se ha visto involucrado en casos de
contaminación en la producción de refrescos (SCoFCAH, 2012).
Al igual que se ha comprobado efectos perjudícales de los QACs sobre la salud humana, también
se ha logrado demostrar que estos compuestos traen graves consecuencias sobre otros
organismos. Se ha concluido que los QACs son fuertemente fitotoxicos en algas y en plantas
(Walker y Evans, 1978) generando así un grave problema para el medio ambiente.
La presencia de QACs en el agua también representa un riesgo para los organismos acuáticos
debido a que estas sustancias pueden alterar poblaciones de especies que son importantes en las
cadenas alimenticias. Esto puede llevar, por ejemplo, a afectar notablemente el número de peces
de un área (Cooper, 1988) y producir impacto directo en la actividad económica de regiones que
dependan de la pesca. Igualmente se ha demostrado que los compuestos de amonio cuaternario
no solo son altamente tóxicos para las bacterias, sino también para protozoos, que a su vez son
importantes en el proceso de autodepuración del agua y para los crustáceos que habitan en ella
(Nałecz-Jawecki et al., 2013)Por otro lado los QACs pueden generar efectos negativos en el
tratamiento de depuración de aguas residuales, pues las propiedades bactericidas de estos
compuestos consiguen afectar los organismos que se establecen en los lodos activados y por esta
vía perjudicar la eficacia del proceso y por consiguiente los ecosistemas acuáticos a los que llegan
sus efluentes (Boethling, 1984).
En un estudio realizado por Li y Brownawell (2010) se demostró que los QACs son persistentes
en los sedimentos que se generan en estuarios y sus concentraciones tienden a ser más altas que
17
las de otros contaminantes orgánicos como hidrocarburos aromáticos policíclicos y bifenilos
policlorados.
Origen de los Compuestos Amonio Cuaternario (QACs)
Como ya se ha descrito anteriormente los QACs son compuestos de un amplio uso comercial
debido a su actividad de superficie, su capacidad de absorción sobre sólidos de carga negativa y
su acción biocida (García et al., 2001). Los QACs son utilizados en agentes suavizantes y
humectantes, detergentes, germicidas, desodorantes y emulsionantes (Nałecz-Jawecki et al.,
2013). Como preservantes y antisépticos los QACs se encuentran en cosméticos, jabones,
lociones, productos para el cuidado de la piel, champús, ungüentos y gotas para los ojos (Purohit
et al., 2000). Los QACs también son usados como anti electroestáticos y catalizadores de
transferencia de fase (Kreuzinger et al., 2007). En 1994 el principal uso de estos compuestos era
en la fabricación de suavizantes (66%), seguido por la industria papelera (16%), la cual usa este
producto como agente para controlar los olores generados en su producción, seguido por la
elaboración de biocidas (8%) (Cross y Singer, 1994). Para el año de 1998 se estimó en Europa
que el consumo de estos productos en la industria llegaba a 17.000 toneladas mientras que en los
hogares era de 98.000 toneladas (Madsen et al., 2001)
Como se puede ver en la Figura 3, los QACs como parte de los contaminantes emergentes pueden
provenir de diferentes fuentes que vierten estas sustancias a redes cloacales o llegan directamente
a aguas subterráneas y/o superficiales. Cabe resaltar que una de las principales fuentes de
contaminación por compuestos amonio cuaternario son las clínicas y hospitales (Kümmerer et al.,
1997), donde estas sustancias tienen un amplio uso como desinfectante.
18
Figura 3. Vías de entrada de contaminantes en el ciclo del agua. Adaptado de Barceló, L., y López,
M. (09 de Agosto de 2015). Contaminación y calidad química del agua: el problema de los
contaminantes emergentes. Obtenido de Fundación nueva cultura del agua:
http://www.fnca.eu/
En la tabla 4 se puede observar un panorama más amplio del uso de los QACs en diferentes
aplicaciones. Es importante destacar que los compuestos de amonio cuaternario suelen
nombrarse como una sal de amonio sustituida, con su anión al inicio como por ejemplo: Cloruro
de dodecil dimetil amonio. El nombre de los sustituyentes se puede dar con las normas IUPAC
usando los prefijos numéricos. También es posible usar nombres comunes como sustituyentes si
la cadena más larga proviene de una sustancia natural, por ejemplo: Cloruro de dicocoalquil dimetil
amonio.
Tabla 4.
Compuestos amonio cuaternario seleccionados y sus aplicaciones.
Compuesto Aplicación y función Comentarios
Cloruro de cetil trimetil Químicos Agrícolas y Usado en la producción de
amonio catalizador de transferencia alcohol furfurílico
de fase
Bromuro de dodecil trimetil Catalizador de transferencia Usado en la producción de
amonio de fase alcohol furfurílico
Cloruro de trimetil octadecil Surfactante Usado en la formulación de
amonio agentes para el crecimiento
de plantas
Cloruro de dihexadecil dimetil Surfactante y agente Purificación de azúcar
amonio floculante
Imidazolina-Tipo cuaternario Fungicida Protección de semillas y
productos agrícolas
Cloruro de trimetil octadecil Surfactante Decoloración y purificación
amonio del silano
C10-C18-etoxilados Surfactante Recubrimiento de perlas
cuaternarios
19
Tabla 4.
Compuestos amonio cuaternario seleccionados y sus aplicaciones. (Continuación)
Compuesto Aplicación y función Comentarios
Surfactante Remoción de sulfato de hierro del
Cloruro octadecil trimetil amonio
metal
Cloruro de dicocoalquil dimetil Surfactante y agente floculante Formulación de herbicidas
amonio
Cloruro de soyaalquil trimetil Surfactante y agente floculante Componente herbicida
amonio
Surfactante Usado en la formulación para la
Cloruro de 2-cloro trimetil amonio regulación de crecimiento de
plantas.
Cloruro de dimetil dioctadecil Surfactante y agente floculante Purificación del licor de azúcar
amonio.
Fungicidas Protección de semillas y productos
Cadenas cortas alquil cuaternarias
agrícolas
Agente antiespumante Usado en la precipitación de
Cloruro de bencil dimetil amonio NaCO3y precursor de cristales de
NaHCO3
Dialqui dietoxilados Agente espumoso Elaboración de textiles
Cloruro de trialquil (C8-C10) metil Surfactante Solubiliza compuestos cromo
amonio hexavalente en pinturas
Acondicionadores, enjuagues y Formulación de productos para el
Cloruro de dodecil trimetil amonio
surfactantes cuidado del cabello.
Compuestos cuaternarios
sustituidos por derivados de Surfactante Formulación de cosméticos
esteroles
Removedor de sulfato de hierro de
Cloruro de didodecil metil amonio Surfactante
metales
Producción de desinfectantes
Alqui bencil dimetil cuternarios Biocida
líquidos de lavandería.
Mejora la absorción de las toallas
Cloruro de dialquil dimetil amonio Suavizante del papel
de papel.
Recuperación de metales preciosos
Cloruro de didodecilmetil amonio Floculante
por flotación.
Compuestos cuaternario Inhibidor de corrosión y Refinación de crudo (industria
tetraetoxilado desemulsificante. petrolera)
Remueve azufre de los productos
Hidróxido trimetil octadecil amonio. Catalizador
del petróleo
Bactericida y agente en el
Silicatos amonio cuaternarios. Microbicida
tratamiento de dermatosis.
Bromuro de dodecil dimetil (2- Soluciones acuosas para lentes de
Antimicrobial
fenoxietil) amonio contacto
Tratamiento en desordenes de la
Fosfatos tipo cuaternarios Desinfectantes
piel
Desinfectante en el tratamiento de
Bromuro de cetil trimetil amonio Biocida
aguas residuales.
Nota: Adaptado de Dery, M. (2000). Quaternary Ammonium Compounds. Kirk-Othmer
Encyclopedia of Chemical Technology. John Wiley y Sons.
Cloruro de Benzalconio (BKC) como contaminante.
Dentro del grupo de compuestos amonio cuaternario (QACs) se encuentra el Cloruro de

Benzalconio (BKC), el cual se puede definir como una mezcla de cloruro de alquil dimetil bencil
amonio con grupos alquilo de 8 a 18 carbonos (Figura 4), siendo los más comunes el dodecil
(C12BKC) por su efecto fungicida, el tetradecil (C14BKC) por su efectividad contra bacterias gram-
20
positivas y el hexadecil (C16BKC) por su acción contra bacterias gram-negativas (Merianos,
1991).La carga positiva que posee el nitrógeno en la molécula del BKC le permite mantener una
fuerte atracción electroestática por todo tipo de materiales y sustancias que presenten una carga
negativa (García et al., 2006).
El BKC es un compuesto de gran uso en la industria cosmética, alimentaria, farmacéutica y en la

elaboración de desinfectantes de superficies (Tezel y Pavlostathis, 2009).
R
H3C + -
N Cl
CH3
Figura 4. Estructura del cloruro de benzalconio.
En el año 2007 se determinó que cerca del 75% de los QACs utilizados en industrias y hogares
alcanzan los sistemas hídricos, de ellos el Cloruro de Benzalconio es el compuesto más
encontrado con concentraciones entre 20 y 300 μg∙L-1 (Martinez-Carballo et al., 2007; Clara et al.,
2007). El BKC ha sido encontrado en niveles significativos en efluentes industriales, hospitalarios,
de lavanderías (Kreuzinger et al., 2007; Martinez-Carballo et al., 2007; Kümmerer et al., 1997) y
cloacales (Kreuzinger et al., 2007; Merino et al., 2003), así como en sedimentos acuáticos
(Kreuzinger et al., 2007; Martinez-Carballo et al., 2007; Ferrer y Furlong, 2002), aguas
superficiales (Kreuzinger et al., 2007; Merino et al., 2003; Martinez-Carballo et al., 2007; Ding et
al., 2001; Ferrer y Furlong, 2002), y aguas que ya han sido depuradas en plantas de tratamiento
(Kreuzinger, et al., 2007; Clara et al., 2007; Ding Liao, 2001). El BKC es una sustancia
rápidamente absorbida por materiales ambientales como lodo, minerales, sedimentos y biomasa
(Tezel y Pavlostathis et al., 2009) lo cual contribuye a su persistencia en el ambiente.
El BKC puede resultar inhibitorio para bacterias (Yang, 2007). Como estas comunidades
microbianas son indispensables en el proceso de tratamiento secundario de aguas residuales, el
BKC debería ser removido previamente para no afectar su funcionamiento (Zhang et al., 2011).
Por ejemplo, en estudios realizados a las aguas residuales resultantes del procesamiento de aves
se detectó la presencia de BKC, el cual es utilizado frecuentemente como desinfectante en la
industria de alimentos. Estas aguas residuales son comúnmente tratadas mediante la eliminación
biológica de nitrógeno (BNR por sus siglas en inglés) usando una combinación de sistemas de
21
nitrificación y desnitrificación. Este proceso se ve seriamente afectado sí las poblaciones biológicas
encargadas de realizarlos no se encuentran en las condiciones fisiológicas y ambientales
adecuadas. La presencia del BKC ocasiona un efecto negativo en los procesos de BNR debido a
que las poblaciones microbianas utilizadas son susceptibles a esta sustancia química (Hajaya y
Pavlostathis, 2012). Se ha registrado que la concentración mínima de BKC que inhibe la
nitrificación es de 2 mg∙L-1 (Sütterlin, Alexy, y Kümmerer, 2008), mientras que la desnitrificación se
ve inhibida a una concentración de 50 mg∙L-1 (Tezel et al., 2008; Hajaya et al., 2011).
En estudios realizados con diatomeas (Beveridge et al., 1998) se detectó que el BKC en
concentraciones entre 0,001% y 0,0001% puede tener efectos inhibitorios en su crecimiento, con
lo cual se puede concluir que las diatomeas tienen una mayor resistencia al BKC en comparación
a las bacterias.
En el estudio realizado por Singh et al., (2002) en el que se evaluó la toxicidad de diferentes
surfactantes incluyendo los catiónicos (grupo al cual pertenece el BKC), se determinó que este
tipo de compuestos son más tóxicos en comparación a los aniónicos y no iónicos. La toxicidad fue
evaluada midiendo como efecto la inhibición de la movilidad sobre seis microorganismos de agua
fresca. García et al., (2001) realizó un estudio similar en el que evaluó la toxicidad de dos familias
de QACs: Alquil trimetil amonio y alquil bencil dimetil amonio (BKC). Al determinar el efecto tóxico
sobre Daphnia magna y Vibrio fisheri encontró que la sustitución del grupo bencil por un grupo
metil incrementa la toxicidad, sin embargo, no encontró diferencias significativas entre compuestos
homólogos que tienen cadenas con diferentes longitudes, es decir, los diferentes tipos de BKC no
varían en su toxicidad excepto sí su grupo bencilo es sustituido.
También se han descrito casos de efectos negativos del BKC en la salud humana. En el año de
1994 ya se reportaba que el BKC era el compuesto responsable del 5% de los casos de dermatitis
(Perrenoud et al., 1994). Igualmente se han descrito casos de eritema conjuntival, ardor en los
ojos, edema parpebral y edema angineurotico (Aoki, 1997; Chiambaretta et al., 1997).
El impacto del BKC sobre la salud humana no solo se ha evidenciado en su posible efecto
alergénico; también se ha catalogado a esta sustancia como un broncoconstrictor que produce
problemas en personas asmáticas que usan fármacos por vía inhalatoria que contienen BKC como
preservante (Miszkiel et al., 1988), por ejemplo, salbutamol (Byoung Hoon y Sang-Hoon, 2007),
bromuro de ipratropio (Beasley, Rafferty, y Holgate, 1987) y beclometasona dipropionato (Clark,
1986).
22
Al igual que otros QACs, el BKC puede generar resistencia bacteriana tal como se demuestra en
los trabajos realizados por Adair et al, (1969) y Houari et al, (2007) en donde se afirma que células
de Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas sp son capaces de multiplicarse en diferentes
concentraciones de soluciones salinas que contienen BKC. Esta resistencia bacteriana puede
llegar a ser un serio problema de salud debido a que el BKC es un desinfectante de uso masivo
en clínicas, hospitales y centros veterinarios, en donde las bacterias pueden generar problemas
significativos en la población de pacientes y estos a su vez pueden servir de transporte de los
microorganismos resistentes.
Alternativas de tratamiento del BKC
Las alternativas de tratamiento convencionales para la depuración de efluentes líquidos en general

son ineficientes para la remoción de los contaminantes emergentes. Esto en parte es debido a que
se trata de compuestos persistentes y también a las bajas concentraciones presentes (Halling-
Sorensen, 1998).
Se han descrito en la literatura tanto procesos fisicoquímicos como procesos biológicos para
encarar el problema. Los primeros incluyen tecnologías como los procesos avanzados de
oxidación, coagulación, floculación, flotación. También han sido usadas técnicas de separación
basadas en la adsorción con carbón activado o la ósmosis inversa (Carballa, 2005; Westerhoff, et
al, 2005).
Los procesos fisicoquímicos han sido utilizados en algunos casos en combinación con procesos
biológicos, por ejemplo, utilizando fotocatálisis heterogénea en combinación con procesos
biológicos (Loveira et al., 2012).
Las tecnologías enumeradas tienen el atractivo de su versatilidad ya que una misma tecnología
puede ser utilizada para la remoción de múltiples compuestos, sin embargo, existen algunas
desventajas que deben ser tenidas en cuenta. Una de las más relevantes es su elevado costo. La
otra no menos significativa, es que en ocasiones el proceso de transformación del compuesto es
parcial y pueden incluso obtenerse compuestos más tóxicos que los de partida (Tamer et al., 2006).
La biodegradación es el proceso más importante en las plantas de tratamiento para la eliminación

de los potenciales contaminantes en los efluentes líquidos (Kümmerer et al., 2000). A pesar de su
resistencia a la biodegradación se han descrito tratamientos biológicos para la eliminación de BAC,
como procesos de lodos activados (Zhang et al., 2011) o reactores secuenciales para la
eliminación biológica de nitrógeno (Hajaya y Pavlostathis, 2012). También han sido descritas
23
algunas cepas bacterianas capaces de utilizar BAC como única fuente de carbono (Patrauchan y
Oriel, 2003).
Biodegradación del BKC
Se ha demostrado dos efectos que se relacionan directamente con el aumento del tamaño de las
cadenas alquilo del BKC: su biodegradabilidad desciende (Ying, 2006) y hay un aumento de la
absorción de esta sustancia en los lodos activados utilizados en el tratamiento de aguas residuales
(Clara et al., 2007), lo cual tiene un efecto en su toxicidad y biodisponibilidad (García et al., 2006).
En el estudio realizado por Clara et al., (2007) se determinó que esta sustancia puede removerse
de forma parcial a través de los métodos utilizados en las plantas de tratamiento, en donde entre
un 80 y 94% de la cantidad total de BKC logra una biotransformación de sus estructuras,
concluyéndose, además, que sus homólogos de cadena C12 y C14 tienen especial relevancia,
pues estos son los que se detectan en mayor concentración en afluentes y efluentes de plantas
de tratamiento (Tabla 5).
Tabla 5.
Promedio, mínimo y máximo de concentración (ng L-1) de BKZ medido en afluentes y efluentes de
plantas de tratamiento.
Afluente Efluente
Media Mínima Máxima Media Mínima Máxima
(ng L-1) (ng L-1) (ng L-1) (ng L-1) (ng L-1) (ng L-1)
BKC -C12 55111 14000 170000 175 34 500
BKC -C14 39278 6500 110000 177 26 630
BKC -C16 6901 810 18000 74 14 270
BKC -C18 4233 1200 8800 85 14 180
Nota: Clara, M., Scharf, S., Scheffknecht, C., y Gans, O. (2007). Occurrence of selected surfactants
in untreated and treated sewage. Water Research, 41, 4339– 4348.
La biodegradación del BAC suele iniciarse con la separación del grupo alquilo del nitrogéno
cuaternario resultando en una bencil dimetil amina. Este compuesto luego se convierte a amonio
tras procesos de debencilación y desmetilación (Patrauchan y Oriel, 2003; van Ginkel, 2004; Qin,
Zhang, Kang, Y., 2005).
En un estudio realizado sobre la biodegradación del BDAC por Aeromonas hydrophila sp. K.
(Figura 5) (Patrauchan y Oriel, 2003) se determinó por cromatografía gaseosa acoplado a
espectrometría de masas (GC-MS) que el primer intermediario que se origina en este proceso es
la bencildimetilamina, lo que confirma que el organismo rompe inicialmente el enlace Alquil-N y
utiliza la cadena alquílica como fuente de carbono. Una vez que la bencildimetilamina se obtiene,
se produce mediante reacciones de N-desmetilación la becilmetilamina y posteriormente la
24
belcilamina, la cual tiene una menor velocidad de degradación. Como resultado de la acumulación
de belcilamina, se evidencian la producción de benzaldehído y ácido benzoico, lo que fue
confirmado por análisis por HPLC. Finalmente cabe destacar que en el proceso de biodegradación
de BKC se observó la síntesis de bencil alcohol, el cual es utilizado como fuente de carbono y es
transformado a benzaldehído, al igual que se logró determinar la presencia de amonio como
subproducto, el cual puede servir como fuente de nitrógeno por el microorganismo.
Figura 5. Propuesta de la vía de biodegradación del cloruro de dimetilbenzalconio (BDAC) por

Aeromonas hydrophila sp. K. (Patrauchan y Oriel, 2003)
25
OBJETIVOS
Objetivo General
• Desarrollar procesos de tratamiento a escala laboratorio para la biodegradación de Cloruro

de Benzalconio (BKC) en efluentes líquidos.
Objetivos Específicos
• Determinar la biodegradabilidad de distintos desinfectantes en aguas superficiales del

área urbana de Buenos Aires.
• Caracterizar las aguas superficiales y relacionar el grado de contaminación con la

presencia de comunidades degradadoras de los compuestos en estudio.
• Seleccionar microorganismos autóctonos capaces de biodegradar BKC.
• Evaluar la capacidad de las cepas seleccionadas para la biodegradación del BKC en

reactores batch y continuos.
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ESQUEMA DE
TRABAJO
Cuenca Matanza-Riachuelo
Río Reconquista Selección Puntos de Muestreo
Río de la Plata
DBO
Muestreo Caracterización DQO
Análisis Microbiológico
Determinación del Consumo de O2 Ensayo

en equipo respirométrico Biodegradabilidad
Selección e identificación bacteria Confirmación de la utilización como

degradadora BKC única fuente de carbono
Aislamiento
Ensayos de
Biodegradación Sistema API 20 NE
Identificación Secuenciación del gen del
16SRNA
Reactor batch Reactor Continuo
Recuento en placa: Soporte y líquido

Recuento en Evaluación del crecimiento
del reactor
placa
Microscopía Electrónica de barrido
DQO Evaluación de la degradación del DQO

Espectrofotometría compuesto Espectrofotometría
Cromatografía Cromatografía
Vibrio fischeri Evaluación de la detoxificación Vibrio fischeri

Pseudokirchneriella subcapitata Pseudokirchneriella subcapitata
Lactuca sativa Lactuca sativa
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MATERIALES Y MÉTODOS
Medios de cultivo
• Medio mínimo mineral

o Fosfato dipotásico 1730 mg
o Fosfato monopotásico 680 mg
o Sulfato de amonio 830 mg
o Sulfato de magnesio heptahidratado 100 mg
o Agua destilada c.s.p. 1000 mL
o Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos.
o Enfriar a 45-50 ºC y añadir 0,5 mL de solución de sales y 1 mL de solución de vitaminas por
litro de medio mí nimo.
• Solución de sales
o Cloruro de calcio dihidratado 1000 mg
o Sulfato de manganeso monohidratado 300 mg
o Sulfato ferroso heptahidratado 500 mg
o Sal disódica del ácido eltilendiaminotetraacético 200 mg
o Agua destilada c.s.p. 1000 mL
o Esterilizar por filtración con membrana de 0,22 μm de tamaño de poro.
• Solución de vitaminas
o Pantotenato de calcio 40 mg
o Ácido fólico 2 mg
o Inositol 200 mg
o Niacina 40 mg
o Ácido p-aminobenzoico 20 mg
o Piridoxina 40 mg
o Tiamina 40 mg
o Riboflavina 20 mg
28
o Agua destilada csp 100 mL
o Esterilizar por filtración por membrana de 0,22 μm de tamaño de poro.
• Otros medios empleados para cultivo e identificación de bacterias

Para la caracterización microbiológica de cada una de las muestras recolectadas se utilizaron los
siguientes medios de cultivo: Agar tripteína soja (TSA), Caldo tripteína soja (TSB), Caldo nutritivo
(CN), Caldo Mac Conkey, Caldo glucosa azida, Agar Slanetz-Bartley (SBA), Agar bilis esculina,
Caldo cerebro corazón, Medio basal OF (oxidación-fermentación) según Hugh y Leifson. Los
medios nombrados fueron provistos por Merck (Darmstadt, Alemania), Difco (Detroit, EE.UU.) y
Biokar Diagnostic (Zac de Ther, Francia).
Compuestos químicos
El BKC de 98,5% de pureza fue provisto por Carlo Erba (Sabadell, España), mientras que el
Triclosán (98,5%) y la clorhexidina (98,5%) fueron obtenidos de una compañía farmacéutica local.
El azul de bromotimol fue obtenido de Chroma Gesselschaft (Stuttgart, Alemania),.La 2-cloro-6
(triclorometil) piridina, empleada en los ensayos de biodegradación fue provista por Hach
Company, (Loveland, EE.UU.)
La solución stock de cada desinfectante utilizada en los ensayos de biodegradación (10000 mg·L -
1) se preparó disolviendo la cantidad necesaria del desinfectante en agua destilada.
Las soluciones utilizadas para HPLC fueron filtradas a través de una membrana de Nylon de 0,45
μm (Micron Separations Inc., Westboro, Ma, USA) y desgasificados antes de su uso. Las vitaminas
utilizadas en el proceso fueron suministradas por Sigma Chemical Company. El ácido fosfórico
(85%) fue suministrado por Mallinckrodt (New York, USA) y el metanol por Sintorgan (Buenos
Aires, Argentina). El agua ultrapura fue obtenida mediante el equipo EASY pure RF (Barnstead,
Dudubuque, IA, USA).
Todos los otros compuestos empleados fueron drogas de calidad analítica provistos por Merck
(Darmastadt, Alemania) y Mallinckordt (St. Louis, EE.UU.)
Toma y transporte de muestras
Se realizó la toma de muestras a partir de cursos de agua ubicados dentro de la región de la

Ciudad Autónoma de Buenos Aires (CABA) y la Provincia de Buenos Aires (Figura 6) durante la
estación de otoño del año 2015.
29
Las muestras fueron tomadas en aguas superficiales a una profundidad no mayor a un metro, en
recipientes esterilizados, y se procesaron dentro de las 6 horas posteriores a su recolección.
Los puntos de muestreo se encuentran ubicados en las siguientes zonas: (Los números asignados
serán usados como referencia en este documento).
• Punto 1 (Figura 7). Arroyo Durazno en su cruce con la ruta provincial 6 (Marcos Paz,
Provincia de Buenos Aires).
• Punto 2 (Figura 8). Dique Roggero (Moreno, Provincia de Buenos Aires).
• Punto 3 (Figura 9). Río Reconquista sobre el puente Bernardo de Irigoyen (Merlo,
provincia de Buenos Aires).
• Punto 4 (Figura 10). Arroyo Morón en su cruce con la Ruta 8 (Gral. San Martín, Provincia
de Buenos Aires).
• Punto 5 (Figura 11). Río Reconquista en su cruce con la Ruta 8 (Gral. San Martín,
• Punto 6 (Figura 12). Río Reconquista en su cruce con la calle Viamonte (Tigre, Provincia
de Buenos Aires).
• Punto 7 (Figura 13). Arroyo Morales en su cruce con la Ruta Provincial 6 (Gral. Las Heras,
• Punto 8 (Figura 14). Arroyo Rodríguez en su cruce con la Ruta Provincial 6 (Gral. Las
Heras, Provincia de Buenos Aires).
• Punto 9 (Figura 15). Rio Matanza en su cruce con la Autopista Teniente Gral. Pablo
Ricchieri (Ezeiza, Provincia de Buenos Aires).
• Punto 10 (Figura 16). Rio Matanza en su cruce con Avenida General Paz (Puente La
Noria) (CABA).
• Punto 11 (Figura 17). Riachuelo en su cruce con Avenida Sáenz (Puente Alsina) (CABA).
• Punto 12 (Figura 18). Riachuelo en el cruce entre Avenida Don Pedro de Mendoza y la
calle Benito Quinquela Martín (CABA).
• Punto 13 (Figura 19). Río de la Plata sobre la calle Ribera (San Isidro, Provincia de
Buenos Aires)
• Punto 14 (Figura 20). Río de la Plata en el Puerto de Olivos (Vicente López, Provincia de
Buenos Aires)
• Punto 15 (Figura 21). Río de la Plata sobre Avenida Costanera Rafael Obligado (CABA).
30
• Punto 16 (Figura 22). Río de la Plata. Muelle de la Asociación Argentina de Pesca.
Reserva Ecológica Costanera Sur (CABA).
• Punto 17 (Figura 23). Río de la Plata en el cruce entre Avenida Isidoro Iriarte con Avenida
Cervantes (Quilmes, Provincia de Buenos Aires)
• Punto 18 (Figura 24). Río de la Plata en el cruce entre Camino Costanero Almirante Brown
con la Calle 118, Punta Lara (La Plata, Provincia de Buenos Aires)
31
Figura 6. Google. (s.f.). [Mapa de muestreo en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y la Provincia de Buenos Aires, Argentina en Google maps]. Recuperado
el 4 de Abril, 2016, de: https://www.google.com.ar/maps/@-34.6919002,-58.7302982,10z
32
Figura 7. Google. (s.f.). [Punto 1. Arroyo Durazno en su cruce con la ruta provincial 6 (Marcos
Paz, Provincia de Buenos Aires) en Google maps]. Recuperado el 17 de Abril, 2016, de:
https://www.google.com.ar/maps/@-34.7785631,-58.9965636,2809a,20y,40.97t
Figura 8. Google. (s.f.). [Punto 2. Dique Roggero (Moreno, Provincia de Buenos Aires) en Google
maps]. Recuperado el 17 de Abril, 2016, de: https://www.google.com.ar/maps/@-34.8165422,-
58.8735846,18417a,20y,39.27t
33
Figura 9. Google. (s.f.). [Punto 3. Río Reconquista sobre el puente Bernardo de Irigoyen (Merlo,
provincia de Buenos Aires) en Google maps]. Recuperado el 17 de Abril, 2016, de:
Figura 10. Google. (s.f.). [Punto 4. Arroyo Morón en su cruce con la Ruta 8 (Gral. San Martín, Provincia
de Buenos Aires) en Google maps]. Recuperado el 17 de Abril, 2016, de:
34
Figura 11. Google. (s.f.). [Punto 5. Río Reconquista en su cruce con la Ruta 8 (Gral. San Martín,
Provincia de Buenos Aires) en Google maps]. Recuperado el 17 de Abril, 2016, de:
Figura 12. Google. (s.f.). [Punto 6. Río Reconquista en su cruce con la calle Viamonte (Tigre, Provincia
35
Figura 13. Google. (s.f.). [Punto 7. Arroyo Morales en su cruce con la Ruta Provincial 6 (Gral. Las
Heras, Provincia de Buenos Aires) en Google maps]. Recuperado el 17 de Abril, 2016, de:
Figura 14. Google. (s.f.). [Punto 8. Arroyo Rodríguez en su cruce con la Ruta Provincial 6 (Gral. Las
Heras, Provincia de Buenos Aires) en Google maps]. Recuperado el 17 de Abril, 2016, de:
36
Figura 15. Google. (s.f.). [Punto 9. Rio Matanza en su cruce con la Autopista Teniente Gral. Pablo
Ricchieri (Ezeiza, Provincia de Buenos Aires) en Google maps]. Recuperado el 17 de Abril, 2016, de:
Figura 16. Google. (s.f.). [Punto 10. Rio Matanza en su cruce con Avenida General Paz (Puente La
Noria) (CABA) en Google maps]. Recuperado el 17 de Abril, 2016, de:
37
Figura 17. Google. (s.f.). [Punto 11. Riachuelo en su cruce con Avenida Sáenz (Puente Alsina) (CABA)
en Google maps]. Recuperado el 17 de Abril, 2016, de: https://www.google.com.ar/maps/@-
34.7295006,-58.4221249,8993a,20y,40.21t
Figura 18. Google. (s.f.). [Punto 12. Riachuelo en el cruce entre Avenida Don Pedro de Mendoza y la
calle Benito Quinquela Martín (CABA) en Google maps]. Recuperado el 17 de Abril, 2016, de:
38
Figura 19. Google. (s.f.). [Punto 13. Río de la Plata sobre la calle Ribera (San Isidro, Provincia de
Buenos Aires) en Google maps]. Recuperado el 17 de Abril, 2016, de:
Figura 20. Google. (s.f.). [Punto 14. Río de la Plata en el Puerto de Olivos (Vicente López, Provincia
39
Figura 21. Google. (s.f.). [Punto 15. Río de la Plata sobre Avenida Costanera Rafael Obligado (CABA)
en Google maps]. Recuperado el 17 de Abril, 2016, de: https://www.google.com.ar/maps/@-
34.600721,-58.423106,6895a,20y,40.46t
Figura 22. Google. (s.f.). [Punto 16 Río de la Plata. Muelle de la Asociación Argentina de Pesca.
Reserva Ecológica Costanera Sur (CABA) en Google maps]. Recuperado el 17 de Abril, 2016, de:
40
Figura 23. Google. (s.f.). [Punto 17. Río de la Plata en el cruce entre Avenida Isidoro Iriarte con
Avenida Cervantes (Quilmes, Provincia de Buenos Aires) en Google maps]. Recuperado el 17 de
Abril, 2016, de: https://www.google.com.ar/maps/@-34.7533731,-58.2232468,5472a,20y,40.64t
Figura 24. Google. (s.f.). [Punto 18. Río de la Plata en el cruce entre Camino Costanero Almirante
Brown con la Calle 118. Punta Lara (La Plata, Provincia de Buenos Aires) en Google maps].
Recuperado el 17 de Abril, 2016, de: https://www.google.com.ar/maps/@-34.8431868,-
58.0012855,4854a,20y,40.75t/
41
Caracterización de las muestras
La caracterización de las muestras se realizó con el objetivo de establecer un perfil fisicoquímico
y microbiológico del agua de la zona de muestreo en el momento de recolección. Los
procedimientos se ejecutaron en base a lo establecido por el Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater (American Public Health Association, 2012), y se explican
a continuación.
• Demanda química de oxígeno (DQO)

La determinación DQO se realizó mediante el método de reflujo cerrado (Hach Company,
Loveland. USA®).
• Demanda bioquímica de oxígeno (DBO)

Este indicador se evaluó por el método respirométrico empleando un equipo BOD Track II® (Hach
Company, Loveland. USA).
• Caracterización microbiológica de las muestras
➢ Recuento de Bacterias Aerobias Mesófilas.

Se realizaron diluciones sucesivas 1 en 10 de las muestras de agua en solución fisiológica estéril.
En los cursos de agua para los que se esperaba una mayor contaminación se realizaron diluciones
hasta 1/1000. Las diluciones fueron de un orden menor (1/100) en los cursos que se esperaba
menor contaminación. Posteriormente se sembraron 0,1 mL de dos diluciones sucesivas en placas
de Petri con TSA (Tripteina Soya Agar) como medio de cultivo para hacer el recuento en superficie.
La siembra se realizó por duplicado y pasado un periodo de incubación de 24 horas a una
temperatura entre 35°C y 37°C, se determinó el promedio de UFC de las diluciones que contenían
entre 30 y 300 colonias.
➢ Recuento de Coliformes termotolerantes y Escherichia coli

Para este recuento se utilizaron dos técnicas simultáneas con el fin de poder abarcar potenciales
recuentos de bacterias altos y bajos en las muestras.
En el caso del recuento de coliformes termotolerantes y Escherichia coli, para números altos de
bacterias (mayor a 100·mL-1) se utilizaron recuentos en placa usando medio Chromagar®. La
muestra se siembra por duplicado de forma directa y en una dilución 1 en 10, con un volumen de
1 mL sí se siembra a profundidad ó 0,1 mL sí es en superficie, esto dependerá de las condiciones
de la muestra. Las placas se incubaron durante 24 horas a una temperatura de 44,5°C. El medio
Chromagar® permite identificar Escherichia coli debido a la detección de la enzima -
42
glucuronidasa, específica de este microorganismo, y que lleva al desarrollo de colonias de color
turquesa. En el mismo medio el resto de los coliformes forman colonias de color púrpura, por lo
que el conteo de coliformes termotolerantes se realizó sumando las colonias púrpura y las colonias
de E.coli. El número de UFC∙mL-1 se determinó calculando el promedio de ambos organismos en
placas con la misma dilución de la muestra y con un número entre 30 y 300 colonias.
Teniendo en cuenta que se podían esperar números bajos de estas bacterias en ambientes no
contaminados (menores a 100·mL-1), se utilizó también la técnica de número más probable (NMP).
Para coliformes termotolerantes/Escherichia coli se utilizó como medio de cultivo Caldo Mc
Conkey. En tres tubos que contenían el medio, se sembró 10 mL de la muestra y se repitió el
procedimiento variando la cantidad a 1 mL y 0,1 mL para un total de 9 tubos. Cabe acotar que para
los tubos que contienen los 10 mL de muestra fue necesario preparar el medio al doble de la
concentración de uso para garantizar que, al agregar el volumen de muestra, la concentración sea
de 1X. Los cultivos se llevaron a incubar por un periodo de 24 horas a una temperatura de 44,5°C.
Una vez cumplido este tiempo se consideró positivos para coliformes termotolerantes los tubos
que presentan viraje de purpura a amarillo y producción de gas en la campana de Durham.
Para confirmar la presencia de E.coli se realizó un pasaje de cada tubo positivo para coliformes
termotolerantes a medio Chromagar®. En el caso que se detectara luego de 24 horas de incubación
colonias turquesa, el tubo era confirmado como positivo. El cálculo de NMP para E. coli se realiza
teniendo en cuenta solamente los tubos que dan positivo esta prueba.
➢ Recuento de Enterococos
Para su detección se aplicaron simultáneamente las técnicas recuento en placa y NMP, teniendo
en cuenta la posibilidad de números altos o bajos de bacterias respectivamente en las muestras
de agua.
Para números altos el recuento se realizó por duplicado en placas que contienen Slanetz Bartley
como medio y Cloruro de Trifeniltetrazolio, el cual actúa como indicador redox y colabora para la
visualización de las pequeñas colonias características. La siembra se realizó por duplicado
agregando 0,1 mL en superficie ó 1 mL en profundidad de la muestra directa y de una dilución 1 a
10 de la misma. Éstas se llevaron a incubar entre 35-37°C durante 24 horas y posteriormente se
determinó el promedio entre placas con la misma dilución de muestra. Las presuntas colonias de
Enterococos se caracterizan por su forma puntiforme color rojo. Para confirmar la presencia del
microorganismo fue necesario realizar el aislamiento de cada colonia sospechosa en agar Bilis
Esculina a una temperatura entre 35° y 37°. En caso de ser colonias características en este medio,
43
se observa el crecimiento de UFC puntiformes de color gris con un halo negro a su alrededor. Sin
embargo, este aislamiento no es suficiente para la confirmación de Enterococos y fue necesario
realizar aún dos pruebas bioquímicas para confirmar su presencia: (1) cultivo en caldo Cerebro
Corazón con agregado de NaCl al 6,5% a 37 ºC y (2) cultivo en el mismo medio sin agregado de
sal a 45 °C. Sí se observa crecimiento en los dos medios se puede confirmar la presencia de
Enterococos.
Para números bajos se realizó el recuento por NMP en Glucosa-Azida sembrando por triplicado
10 mL, 1 mL y 0,1mL de la muestra. Es importante resaltar que para los tubos de 10 mL la
preparación del medio se realiza al doble de la concentración recomendada al igual que en caldo
McConkey. Se consideran positivos únicamente los tubos en los que se evidencia crecimiento, sin
embargo, se debe hacer un proceso de confirmación de la presencia de Enterococos realizando
el pasaje a medio agar Bilis Esculina, y posteriormente en cultivos caldo Cerebro Corazón en las
mismas condiciones que se realizó para el conteo en placa.
Ensayo de biodegradabilidad en agua superficial
La biodegradabilidad de los compuestos en el agua superficial fue estimada realizando ensayos

respirométricos. El consumo de oxígeno en las muestras de agua fue medido empleando un
equipo respirométrico (BOD track II®-Hatch), durante un periodo de incubación de 10 días a una
temperatura de 20°C. Esta medición se realizó por duplicado en recipientes que contenían 355 mL
de la muestra de agua superficial, y uno de los compuestos desinfectantes (BKC, Triclosán o
Clorohexidina) en una concentración de 20 mg L-1, para evaluar su degradabilidad. A cada frasco
se agregó además 2-cloro-6 (triclorometil) piridina, como inhibidor de la nitrificación, e hidróxido de
litio (LiOH), para capturar el CO2 producido durante la respiración. Un buzo magnético realiza una
homogeneización constante de la muestra durante todo el periodo de medición. El consumo de
oxígeno en las muestras fue comparado con un control de agua de río, que fue incubado en iguales
condiciones sin el agregado de ningún compuesto desinfectante. Una vez finalizado el periodo de
10 días se seleccionaron aquellas muestras que mostraron mayores niveles de consumo de
oxígeno en comparación a sus respectivos controles para posteriores experiencias (Figura 25). En
este ensayo se asume que los desinfectantes son inhibitorios sí estos presentan una
biodegradación menor al 25% (basado en el total DTeO) en comparación con el control (OECD
301D , 1992).
44
Figura 25. Ensayo de biodegradabilidad en agua superficial en equipo BODTrakTM.
Selección e identificación de bacterias degradadoras de BZC
• Confirmación de la utilización de los compuestos como única fuente de carbono

En aquellos ensayos en los que se observó un valor de consumo de oxígeno superior al obtenido
para el control se realizó la siguiente experiencia para confirmar el empleo del compuesto como
única fuente de carbono. En un frasco Erlenmeyer con 100 mL de medio mínimo mineral
previamente esterilizado por autoclavado; se adicionó el compuesto en una concentración de 20
mg·L-1. El medio fue suplementado asépticamente con 0,1 mL de la solución de vitaminas y 0,5
45
mL de la solución de sales previamente descripta. El frasco fue inoculado con 1% de la muestra
que se seleccionó del ensayo de biodegradabilidad. Los frascos fueron incubados a 28 ºC con
agitación plano rotatoria (200 rpm) durante 12 horas durante los cuales se evaluó el crecimiento
bacteriano y la concentración remanente de compuesto.
Las cepas bacterianas capaces de remover el compuesto en el menor tiempo fueron

seleccionadas para los ensayos posteriores e identificadas como se indica a continuación.
• Aislamiento e identificación de bacterias degradadoras de BKC

El aislamiento de las bacterias capaces de utilizar BKC como única fuente de carbono se llevó a
cabo en medio agar tripteína soya suplementado con 20 mg·L-1 del compuesto para mantener la
presión selectiva sobre las cepas.
Las bacterias fueron identificadas por tinción de Gram, pruebas bioquímicas convencionales y
mediante el sistema API 20 NE (Bio-Merieux, l’Etoile, Francia)
La identificación también fue llevada a cabo mediante secuenciación del gen del 16S rRNA. Se
utilizaron los siguientes primers usando como templado DNA extraído por calor: (50e30) 16SR:
GYTACCTTGTTACGACTT, 16SF: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG. Los fragmentos obtenidos
fueron purificados usando QIAquick PCR purification Kit (QIAGEN) y ambas cadenas fueron
secuenciadas usando el secuenciador ABI Prism DNA 3700. La lectura de la secuencia de los
fragmentos obtenidos por PCR fue realizado mediante el software Chromas y posteriormente fue
comparada en la base de datos de nucleótidos del NCBI (Nacional Center for Biotechnology
Information) mediante el uso de la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
Ensayos de biodegradación con BKC
• Ensayos de biodegradación en reactores batch

Utilizando las cepas bacterianas previamente aisladas se llevaron a cabo ensayos de
biodegradación en modo batch. Para ello se realizó previamente una adaptación por inoculación
de la cepa en medio mínimo suplementado con 100 mg∙L-1 de BKC como fuente de carbono. Esté
cultivo stock se incubó durante 24 horas a una temperatura de 28°C con agitación constante (200
rpm) y fue empleado como fuente del inóculo para los posteriores ensayos.
Los ensayos de biodegradación en modo batch se realizaron en frascos Erlenmeyer de 250 mL a

una temperatura 28 ºC, con agitación (200 rpm) y en condiciones aeróbicas, usando el mismo
medio de cultivo que se utilizó en la adaptación con el agregado de BKC en distintas
concentraciones de acuerdo a la experiencia realizada, e inoculando con 5 mL del cultivo stock. A
46
lo largo del ensayo se tomaron muestras a intervalos de tiempo apropiados, para verificar la
concentración del compuesto y el crecimiento bacteriano. Por otro lado, la perdida abiótica del
compuesto fue estimada mediante un ensayo control que no fue inoculado.
Al finalizar el proceso se estimó la eficiencia en términos de remoción del compuesto y de DQO.
• Ensayos de biodegradación en reactor continuo

Los ensayos de biodegradación en modo continuo fueron realizados en un reactor aeróbico de
lecho expandido y flujo ascendente con recirculación. El lecho está compuesto por Arlita (Leca ® -
Light Expanded Clay Aggregate), un material liviano muy usado en la construcción y en la
jardinería. Este material proviene de arcilla tratada a altas temperaturas y posee una gran cantidad
de cavidades de aire que le dan fortaleza y propiedades de aislamiento. Esta gran superficie brinda
un soporte ideal para el desarrollo de la biopelícula
Para el desarrollo inicial de la biopelícula, fue utilizado previamente un reactor de lecho fijo con un
volumen efectivo de 1,5L construido en acrílico. El reactor fue operado en modo batch alimentado,
a temperatura ambiente y sin esterilidad. El medio de cultivo estaba constituido por agua libre de
cloro, con el agregado de K2H(PO4) y NH4SO4 como fuente de fosforo y nitrógeno respectivamente
y BKC (100 mg∙L-1) como fuente de carbono. El reactor se mantuvo en operación durante un mes
bajo estas condiciones, para posteriormente transferir relleno de Leca al reactor continuo.
47
Figura 26. Diseño del reactor para tratamiento de efluente industrial
48
El reactor continuo fue construido con tubos de polipropileno utilizados comercialmente para redes
cloacales. Puede verse en detalle en la Figura 26. El régimen de flujo del reactor puede
considerarse de mezcla completa, con una caudal de recirculación de 2000 L·día-1 frente a un
caudal de entrada del líquido a tratar de aproximadamente 1 L·día-1. Para la recirculación se utilizó
una bomba sumergible marca RS Electrical de 35 W y con un caudal máximo de 2000 L·hora-1 y
una bomba peristáltica Longer pump Modelo BT 100 1J capaz de entregar un caudal de 1 L · día-
1
El reactor contó con un reservorio de 5 L en el cual se depositó el efluente a tratar, preparado a

partir de un efluente real de una concentración de 26346 ± 538 mg·L -1. Para cada ensayo éste se
diluyo con agua potable libre de cloro y se le agregó K2H(PO4) y NH4SO4 como fuente fósforo y
nitrógeno respectivamente. Los ensayos en reactor continuo fueron realizados en condiciones
ambientales, esto es, sin esterilidad ni control de temperatura para simular en lo posible las
condiciones de un tratamiento de efluentes.
Durante los ensayos se monitoreó diariamente la concentración de entrada y salida del compuesto.
Al igual que en los ensayos batch, se evaluó la eficiencia del reactor en términos de disminución
del porcentaje de remoción del BKC y de la DQO. También fueron tomadas muestras de la entrada
y la salida para la realización de Bioensayos estandarizados de toxicidad.
• Parámetros de operación del reactor

➢ Tiempo de retención hidráulico TRH
Este parámetro se define como la relación entre el tiempo de permanencia de un fluido de caudal
Q en un reactor de volumen V. Para un reactor de lecho fijo con un flujo ascendente el TRH se
calcula como:
➢ Carga orgánica
Cantidad de materia orgánica tratada por unidad de tiempo y de volumen de reactor.
49
Métodos analíticos y parámetros de control
• Determinación del crecimiento bacteriano
➢ Determinación del número de microorganismos viables

Los microorganismos viables fueron determinados por diluciones sucesivas en solución fisiológica
(pH 7). Un volumen de 0,1 mL de cada dilución se sembró en la superficie en placas de Petri
conteniendo TSA e incubado a 28º C por 24 horas. El número de microorganismos viables se
expresó como unidades formadoras de colonias por mL (UFC·mL-1) empleando para el cálculo
aquellas placas que presentan un número de entre 30 y 300 colonias.
➢ Determinación de la cinética de crecimiento bacteriano

Los datos de UFC/mL obtenidos fueron graficados en función del tiempo. Las curvas obtenidas
fueron analizadas por regresión no lineal empleando el programa GraphPad Prism versión 4.0
(GraphPad Software Inc., San Diego, EE.UU.). Las curvas se ajustaron a un modelo de crecimiento
exponencial de acuerdo con la ecuación.
𝑁 = 𝑁𝑜 ∙ 𝑒 𝜇𝑡
Donde N: número de bacterias a tiempo t

N0: Número inicial de bacterias
: velocidad específica de crecimiento
t: tiempo
La velocidad específica de crecimiento fue expresada con un intervalo de 95% de confianza.
La desviación del modelo fue estimada mediante el run test.
➢ Estimación del número de microorganismos viables en la biopelícula

Para estimar el número de microorganismos viables presentes en la biopelícula en los reactores
continuos las bacterias fueron desprendidas del medio soporte por agitación vigorosa. En una
experiencia previa se analizó por el método de recuento en placa el número de bacterias
desprendidas en función del tiempo de agitación en agua peptonada 0,1 % en presencia y en
ausencia de un tensioactivo no iónico (Tween 80, 5%). Se comprobó que luego de cuatro minutos
de agitación no se incrementa el desprendimiento de bacterias y que se obtienen los mismos
resultados en presencia o ausencia de Tween 80. Por lo tanto, los ensayos realizados para
desprender las bacterias del medio soporte se efectuaron bajo estas condiciones.
50
Se pesaron 10 g asépticamente del material de relleno del reactor y se transfirieron a un frasco de
boca ancha conteniendo 100 mL de agua peptonada estéril. Luego de la agitación se realizó un
recuento en superficie en placas de TSA a partir del frasco. El resultado obtenido fue expresado
como UFC·g-1 de material de relleno.
➢ Observación de la biopelícula por microscopía electrónica de barrido

Para evidenciar la formación de biopelícula en el material de relleno del reactor continuo se
procedió a la observación del medio soporte empleando microscopía electrónica de barrido. La
observación se realizó en muestras tomadas del reactor en funcionamiento y del material de
relleno sin inocular.
Para la observación de las bacterias y la biopelícula es necesario realizar un tratamiento de fijación

(Varesche, et al., 1997) sobre la superficie de LECA®. Este proceso se realizó tomando muestras
del relleno usado en el lecho del reactor y muestras de Leca sin inocular de un máximo de 0,5 cm,
las cuales fueron sumergidas en un buffer fosfato 0,1M (pH 7,3) adicionado con 1% de
glutaraldehído durante 10 horas a 4°C. Una vez pasado el tiempo de fijación, las muestras son
lavadas tres veces en el mismo buffer, pero sin la adición de glutaraldehído y son deshidratadas
por inmersión en soluciones sucesivas de etanol en una concentración creciente (50%, 70%, 80%,
90% y 95%). Cada paso de lavado y deshidratación se lleva a cabo en 10 minutos. Finalmente se
realiza un lavado en etanol absoluto y las muestras son secadas a una temperatura de 30 grados
durante 2 horas.
El metalizado de las muestras se realizó empleando una mezcla de oro/paladio 40/60. Las
muestras fueron observadas en un microscopio electrónico de barrido Philips (XL30).
Determinación del consumo de sustrato
• Determinación BKC por espectrofotometría

El método que se utilizó para la determinación cuantitativa del BKC se basó en la modificación
propuesta por Bergero y Lucchesi (2015) de la reacción colorimétrica de QACs con azul de
bromotimol planteada por Cross J. (1970).
• Determinación BKC por HPLC

Con el fin de evaluar con mayor precisión la concentración inicial y final de BKC en el reactor batch
y a la entrada y salida del reactor continuo, se seleccionaron muestras para ser analizadas por la
técnica de HPLC (Labranche, 2007). Para este procedimiento se usó un equipo HPLC Spectra
System SCM1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) con bomba cuaternaria P4000,
51
acoplado a un muestreador automático AS3000 y un detector de longitud de onda dual UV2000.
Los datos de los cromatográmas fueron analizados a través del software ChromQuest
Chromatography Data System.
La separación del BKC fue realizada empleando una columna Symmetry RP-18 (Longitud 75mm
x 4.6mm diámetro interno, 3,5 µm Tamaño de partícula) El tiempo de elución fue menor a 6
minutos.
Las condiciones de la cromatografía fueron las siguientes: volumen de inyección de 25 μL,

temperatura de la columna 50°C, fase móvil isocrática preparada con una mezcla de metanol y
dihidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4) (7,5mM, pH 3,0) (70:30, v/v) a un flujo de 1,0 mL · min-1.
La detección UV se realizó a λ 280 nm.
El estándar se diluyó en agua en un factor 1/25 y la muestra en la fase móvil hasta obtener una
concentración aproximada de 25 μg·mL-1.
Bioensayos de toxicidad
Sobre muestras extraídas al inicio y al final del proceso en batch y, a la entrada y salida del reactor
continuo, se realizaron bioensayos de toxicidad con organismos pertenecientes a distintos niveles
tróficos para evaluar la detoxificación efectiva de los compuestos. Los ensayos de toxicidad se
realizaron utilizando Vibrio fischeri, Pseudokirchneriella subcapitata y semillas de lechuga (Lactuca
sativa) como organismos de ensayo, de acuerdo a las normas ISO 11348-3 (ISO, 1998), ISO 8692
(ISO, 2004) y EPA600/3-88 (EPA, 1989) respectivamente. Las muestras fueron filtradas a través
de membrana de 0,45 μm de poro y conservadas en refrigeración hasta su análisis en un plazo de
24 horas.
• Ensayo de toxicidad en Vibrio fischeri

El bioensayo de toxicidad con Vibrio fischeri se basa en la inhibición de la producción de
luminiscencia por la bacteria cuando es expuesta a un compuesto tóxico. Para la determinación
de la inhibición de la luminiscencia en Vibrio fischeri se empleó el test Microtox ®. La cepa
liofilizada NRRL B-11177 fue provista por de Strategic Diagnostic Inc. (Carlsbad, CA, USA). El
ensayo fue realizado de acuerdo con la norma ISO 11348–3 (1998).
La bacteria fue expuesta a una serie de diluciones de la muestra durante 15 minutos a una
temperatura de 15 ± 1 °C antes de la medida de la inhibición de la luminiscencia (ISO 11348-3,
1998). Se empleó un analizador Microtox® modelo 500 (Azur Environmental, Carlsbad, CA, USA).
Los resultados obtenidos fueron expresados como concentración efectiva 50 (CE50), definida como
52
la concentración que causa un 50% en la reducción de la luminiscencia bacteriana referida a un
ensayo control. La CE50 fue determinada utilizando el software MicrotoxOmni®.
Previamente a la realización de los ensayos la sensibilidad del organismo fue evaluada empleando
fenol como compuesto tóxico de referencia
• Bioensayo de toxicidad con Pseudokirchneriella subcapitata

Este bioensayo de toxicidad emplea algas de la especie Pseudokirchneriella subcapitata y en él
se evalúa la inhibición que puede causar una sustancia en el crecimiento del organismo. Esta
prueba se ejecutó de acuerdo a la norma ISO 8692 (2004) en donde se establece que el ensayo
se debe realizar a 23 ± 2°C en condiciones de iluminación continua. Los resultados obtenidos
después de 72 horas se expresaron como concentración efectiva 50 (EC50); este parámetro es
estimado por método gráfico y se define como la concentración que causa una reducción del 50%
en el crecimiento del alga en relación a un control. El número de células del alga fue medido por
recuento directo.
Previamente a este ensayo se realizó una prueba de sensibilidad con Pseudokirchneriella
subcapitata empleando como toxico de referencia Dicromato de Potasio.
• Bioensayo de toxicidad con Lactuca sativa

En este bioensayo usado para evaluar la toxicidad de las muestras recolectadas se usan semillas
de lechuga de la especie Lactuca sativa. Las semillas deben encontrarse libres de cualquier
fungicida u otros compuestos que puedan interferir en el bioensayo.
En esta prueba se determina el porcentaje de inhibición de la elongación de las raíces de Lactuca

sativa una vez expuestas al compuesto tóxico, en relación a un control que presenta las mismas
condiciones de luz y temperatura, pero que no contiene el compuesto. Este ensayo se realizó bajo
los criterios de la norma EPA/600/3-88 (1989) en donde se ha establecido que las semillas deben
estar expuestas por un tiempo de 120 horas a 24 ± 2 C° en oscuridad, a diferentes diluciones del
compuesto tóxico por triplicado, sobre una superficie de papel filtro soportada en placas de Petri.
Los resultados obtenidos luego de las 120 horas se expresaron como concentración efectiva 50
(EC50); que se define como la concentración que causa una reducción del 50% en la elongación
de la raíz en relación con un control.
Previamente al ensayo, la sensibilidad del organismo fue evaluada usando Sulfato de Zinc como
la referencia del compuesto tóxico.
53
Concentración efectiva 50 y Unidades tóxicas.
La concentración efectiva 50 en los distintos ensayos expresa la concentración necesaria para

causar el 50% de un efecto. Cuando la muestra presenta un valor de toxicidad tan bajo que aún la
muestra pura causa una inhibición inferior al 50% la CE50 no puede calcularse y se expresa como
superior al máximo valor de concentración ensayado. De acuerdo a la metodología del ensayo
este valor puede ser la muestra pura, como en el ensayo con Lactuca sativa, y en ese caso se
hablaría de un valor de CE50 mayor a 100%. En otros métodos, como en el ensayo con Vibrio
fischeri, la metodología implica el agregado de un 10% del inóculo de bacterias. Debido a esto el
organismo de ensayo no es en ningún caso enfrentado a la muestra pura, sino que la máxima
concentración es 90%. Si la muestra no presenta toxicidad el valor se expresa como mayor a 90%.
La CE50 es inversamente proporcional a la toxicidad, cuanto más bajo su valor más tóxica es la
muestra. Para una mejor visualización del grado de toxicidad de una muestra los resultados
también suelen expresarse como Unidades tóxicas (UT). Este valor surge de convertir el dato de
CE50 mediante la siguiente fórmula
UT= 100/CE50
Las UT tienen una relación directa con la toxicidad de la muestra, a mayor UT mayor toxicidad.
Permiten también expresar la remoción de toxicidad a consecuencia de un proceso
Los resultados obtenidos en los ensayos serán presentados en ambas unidades.
54
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Caracterización de las muestras
Para la selección de los puntos de muestreo se tuvo en cuenta las áreas en donde se presentan
posibles cambios biológicos y fisicoquímicos en las aguas de los ríos de la Plata, Reconquista y la
cuenca Matanza-Riachuelo. Estos cambios en los diferentes cursos de agua se dan debido a las
variaciones geográficas, la actividad humana y la exposición constante a diversos tipos de
contaminantes provenientes del área urbana, industrial, comercial, agrícola y turística, presente
alrededor de estas fuentes hídricas.
Como parte de la caracterización se determinó la DQO y la DBO 5 en cada una de las muestras
recolectadas.
En la Tabla 6 se muestra los resultados obtenidos en la caracterización de cada uno de los puntos
de muestreo de las cuencas del río Reconquista, Matanza-Riachuelo y del Río de La Plata,
ubicados dentro de la zona de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y la provincia de Buenos
Aires.
Para la cuenca del río Reconquista es posible observar que los valores de DBO5 y DQO fueron
aumentando a medida que se iba bajando en la cuenca, sin embargo, es interesante observar una
caída de los valores en el Punto 6 (Figura 12) a pesar de que es una zona del río que en gran
parte se encuentra urbanizada. También es importante destacar que la materia orgánica
biodegradable y no biodegradable va en aumento a medida que el río se acerca a las zonas donde
hay mayor población e industria, lo cual muestra un impacto directo de la actividad humana sobre
la calidad del agua. Datos similares fueron encontrados por Salibián (2006) en donde se evidencia
un comportamiento de estos valores similar al obtenido en esta caracterización.
En el trabajo de Salibián (2006) también se mostró el aumento en los valores de indicadores

microbiológicos a medida que se desciende en la cuenca del río Reconquista, demostrando un
incremento en el número de Escherichia coli. Los datos presentados en la Tabla 6 no mostraron
una tendencia tan clara para todos los parámetros, presentándose variaciones en función del punto
del río y el tipo de bacteria que se analiza. A pesar de estas diferencias, los resultados en ambos
casos coinciden en señalar una importante contaminación fecal en el curso de agua. Pudo
observarse de igual modo, tanto para los parámetros fisicoquímicos como los bacteriológicos, una
disminución evidente en el punto 6 (Figura 12). Este resultado puede deberse a que el punto de
55
muestreo se encuentra aguas abajo del “Canal de los remeros” que desvía una gran parte del
caudal del río. También por la proximidad del punto a la desembocadura en el río Lujan., con una
posible influencia de sus aguas según las condiciones de vientos.
En cuanto a los valores obtenidos de la cuenca Matanza-Riachuelo es posible observar que éstos
son dispersos y no guardan un patrón reconocible, sin embargo, también se destacan algunas
características. La primera es que los valores de DBO5 aumentan considerablemente en la cuenca
baja del río, una zona que se encuentra densamente poblada, lo cual afecta la calidad del agua.
Al igual que lo registra la Autoridad de la Cuenca Matanza Riachuelo (ACUMAR, 2015), es
interesante observar que el Punto 8 (Figura 14) tiene valores bajos en comparación al Punto 7
(Figura 13) y ambos se encuentran en la cuenca alta. Esto permite inferir que el punto 7 recibe en
mayor proporción un aporte de contaminantes fecales y materia orgánica, lo cual se podría dar por
la actividad agrícola presente en esta región.
En el Río de la Plata, en el área estudiada, no puede hacerse una diferencia entre una zona rural
y una zona urbana, debido que toda la costa del río está sujeta a numerosas descargas de otros
cuerpos de agua que alteran localmente la calidad. Los datos encontrados, tanto de DBO-DQO
como microbiológicos, no tienen por lo tanto un patrón de variación definido. Los valores obtenidos
están en el orden de los reportados en otros estudios (ACUMAR, 2015).
56
Tabla 6. Indicadores fisicoquímicos y bacteriológicos evaluados.
PARÁMETRO
Bacterias
ColiformesTermotolerantes Escherichia coli Enterococos
Aerobias
Río DBO5 (mg · L-1) DQO (mg · L-1) (UFC · mL-1) (UFC · mL-1) (UFC · mL-1)
Mesofilas (UFC ·
PUNTO DE (NMP · 100 mL-1) * (NMP · 100 mL-1) * (NMP · 100 mL-1) *
mL-1)
MUESTREO
Punto 1 <5 38 4,0 x 10 3 460 * 460 * 93 *

Río Reconquista
Punto 2 13 88 1,9 x 10 3 7,3 * 7,3 * 43 *
Punto 3 20 125 1,2 x 10 7 5,7 x 10 3 2 x 10 3 8,5 x 10 2
Punto 4 23 76 1,0 x 10 6 4,7 x 10 3 3,2 x 10 3 9,2 x 10 2
Punto 5 53 127 8 x 10 5 2,8 x 10 3 1,7 x 10 3 9 x 10 1
Punto 6 <5 43,5 2,4 x 10 4 1,3 x 10 3 1,5 x 10 1 93

Riachuelo
Punto 7 6 69 1,6 x 10 5 3,1 x 10 3 3,0 x 10 2 5 x 10 1

Matanza-
Río
Punto 8 <5 29 1,6 x 10 4 8,0 x 10 1 3,0 2 x 10 1
Punto 9 9 89 5,0 x 10 4 1,2 x 10 3 8,0 x 10 1 2 x 10 1
57
Tabla 6. Indicadores fisicoquímicos y bacteriológicos evaluados (Continuación).
PARÁMETRO
Escherichia coli
Aerobias ColiformesTermotolerantes Enterococos
(UFC · mL-1)
Río DBO5 (mg · L-1) DQO (mg · L-1) Mesofilas (UFC · (UFC · mL-1) (UFC · mL-1)
(NMP · 100 mL-1)
PUNTO DE mL-1) (NMP · 100 mL-1) * (NMP · 100 mL-1) *
*
MUESTREO
Riachuelo
Punto 10 5 90 5,6 x 10 5 3,3 x 10 3 1,3 x 10 3 3,7 x 10 2
Matanza-
Río
Punto 11 26 79 1,7 x 10 5 1,0 x 10 3 4,2 x 10 2 4,0 x 10 1
Punto 12 28 82 3,5 x 10 5 7,5 x 10 3 2,5 x 10 3 2,5 x 10 2
Punto 13 <5 <3 3,8 x 10 3 3,5 x 10 1 1,0 x 10 1 36 *

Río de la Plata
Punto 14 <5 7 7,2 x 10 4 4,5 x 10 2 2,0 x 10 2 1100 *
Punto 15 <5 42 1,35 x 10 4 2,2 x 10 2 5,0 x 10 1 75 *
Punto 16 <5 49 8,0 x 10 4 6,5 x 10 2 2,2 x 10 2 64 *
Punto 17 <5 5 6,0 x 10 3 5,0 x 10 1 1100* 240*
Punto 18 <5 32 1,2 x 10 4 3,0 x 10 1 5 x 10 0 43 *
58
Ensayo de biodegradabilidad en agua superficial
Los resultados de estos ensayos (Figuras 27, 28 y 29) mostraron que de los tres desinfectantes
ensayados el BKC es el que presenta la mayor biodegradabilidad, teniendo en cuenta que se
observó un elevado consumo de oxígeno en comparación al control en 14 de los 18 puntos de
muestreo. Los microorganismos capaces de usar el BKC como fuente de carbono comienzan a
degradarlo en general durante las primeras 24 horas del ensayo. Sin embargo, en algunos puntos
de muestreo (4,5 y 7), puede notarse que el BKC puede llegar a ejercer una acción inhibitoria. La
bibliografía señala para este compuesto una vida media en el agua de 38 días, lo cual es bastante
menor que en otras matrices como suelos (75 días) o sedimentos (340 días) (Environmental Health
Analysis Center, 2012). Estos últimos valores exceden los criterios establecidos por la EPA para
considerar un compuesto como “persistente” y constituyen una razón importante para tratar los
efluentes de BKC antes de ser descargados y que podrían depositarse en otros medios.
59
Figura 27. Ensayos de biodegradabilidad en el río Reconquista.
60
Figura 28. Ensayos de biodegradabilidad en la cuenca Matanza-Riachuelo.
61
Figura 29. Ensayos de biodegradabilidad en el río de la Plata.
62
Al relacionar los resultados de los ensayos de biodegradabilidad del BKC con los obtenidos de la
caracterización, se encontró relación entre el consumo de oxígeno y los valores de DQO. Se
observa que en los puntos de muestreo donde hay valores elevados de DQO hay una mayor
posibilidad que el consumo de oxígeno logré una importante diferencia al control.
La vida media estimada para el triclosán en agua es de 60 días, por lo que es categorizado como
un contaminante persistente en esta matriz según la EPA. La persistencia de este compuesto se
evidenció durante los ensayos realizados en este trabajo. En cinco puntos de muestreo (6, 9, 11,
12 y 14) se obtuvieron valores de consumo de oxígeno superiores al del control (Figuras 27, 28 y
29). Se observó que el tiempo necesario para el inicio del proceso de degradación del triclosán fue
mayor que el obtenido en los ensayos con BKC, debido a que en los puntos donde se obtuvieron
resultados positivos fue necesario varios días de adaptación de la bacteria. Mediante posteriores
ensayos se determinó que el punto 12 (Figura 18) poseía comunidades bacterianas que eran
capaces de usar el triclosán como fuente de carbono, mientras que en los otros casos es posible
que se haya presentado una degradación parcial del compuesto. Actualmente se está utilizando
la cepa obtenida en el punto 12 en ensayos de biodegradación de triclosán en reactores batch y
continuos que aún se encuentran en proceso y que exceden el marco de esta tesis (Fortunato, et
al., 2016).
En cuanto a la clorhexidina se observó que esta posee propiedades inhibitorias sobre los
microorganismos teniendo en cuenta que en solo 2 de las muestras en las que fue adicionado el
compuesto se presentó un alto consumo de oxígeno en comparación con su respectivo control
(Figuras 17 y 20); sin embargo, para ambos casos no fue posible comprobar el uso de la
clorhexidina como fuente de carbono. De acuerdo con la literatura la clorhexidina es un compuesto
altamente resistente a la biodegradación alcanzando una vida media en agua de 180 días, en
suelo 360 días y en sedimentos hasta 1600 días (Environmental Health Analysis Center, 2012).
Estos valores demuestran la dificultad de los microorganismos para utilizar este compuesto como
fuente de carbono y explican los resultados obtenidos en los ensayos de biodegradabilidad
realizados en este trabajo.
A partir de los resultados se puede inferir que las razones por las cuales los compuestos no fueron
biodegradados son dos: en primer lugar, esto puede darse debido a que los compuestos
analizados no son aptos como fuente de carbono y, en segundo lugar, las comunidades
bacterianas pueden verse inhibidas como efecto del compuesto. Para este proyecto se consideró
63
que el efecto inhibitorio se manifiesta por un consumo de oxigeno por debajo del control del
experimento. Este efecto se observó con mayor frecuencia en la clorhexidina (8 puntos de
muestreo) seguido por el triclosán (6 puntos de muestreo) y por último el BKC (1 punto de
muestreo). También se observa que no se produce un efecto inhibitorio en la mayoría de los puntos
donde el desinfectante es total o parcialmente biodegradado. Esto ocurre en el 94% de los puntos
de muestreo para el BKC, en el 67% para el Triclosán y en el 56% para la clorhexidina.
Inicialmente se esperaba que la pre-exposición de las bacterias a los desinfectantes analizados

facilitará la selección de las cepas biodegradadoras (Alexander, 1999), sin embargo se observó
que la presencia de estas comunidades no se encontraban directamente relacionadas con la
contaminación fecal presente en los puntos de muestreo. Por ejemplo, se encontraron cepas
capaces de usar el BKC como fuente de carbono tanto en zonas rurales con una baja
contaminación como el arroyo Durazno y la zona alta del Reconquista, así como en Puente Alsina
en la cuenca Matanza- Riachuelo, el cual se caracteriza por sus altos niveles de contaminación.
Por lo anterior se hizo necesario tener en cuenta la presencia de bacterias degradadoras en
muestras con un consumo de oxígeno por debajo del control y no excluirlas para la selección de
la cepa que pudiera ser utilizada en los ensayos de degradación en batch.
Otro aspecto interesante observado en el ensayo de biodegradación en agua superficial es el

hecho de que en el 94% de los puntos de muestreo la concentración de 20mg∙L-1 de BKC no afecto
el consumo de oxígeno. Esto debe ser considerado teniendo en cuenta que los QACs son
reconocidos por su efecto biocida a concentraciones menores a 1 mg∙L -1 (Kümmerer K. ,
Resistance in the environment, 2004). Este mismo comportamiento ocurrió en el 67% de los puntos
de muestreo para el Triclosán y en el 56% para clorhexidina. Se ha reportado que la concentración
de inhibición en lodo activado para el Triclosán es de 1,8 mg∙L -1 (Neumegen, Fernández‐Alba y
Chisti, 2005) y mucho más bajo para la clorhexidina (Freitag, et al., 1982). Estos resultados
significan que las poblaciones bacterianas presentes en agua ya presentan resistencia a estos
desinfectantes y es un fenómeno que no se encuentra directamente relacionado a la
contaminación fecal. Este tipo de resistencia se observó sorpresivamente en el río de la Plata el
cual es la principal fuente hídrica de la Provincia de Buenos Aires y en donde las bacterias
mostraron una alta tolerancia a los ensayos con desinfectantes. Esto puede deberse a que el área
alrededor de este cuerpo de agua tiene una alta actividad agroindustrial y es ampliamente
conocido que en ella se hace uso de productos biocidas. Otra posible hipótesis se basa en la
posibilidad de una resistencia cruzada entre antibióticos y desinfectantes (Koljalg, et al., 2002;
Tandukar, et al., 2013), que se pudo haber originado por la exposición previa de las bacterias
64
endémicas a cualquiera de los agentes, sin embargo, para confirmar este hecho es necesario
realizar mayores estudios.
• Confirmación de la utilización de los compuestos como única fuente de carbono

Obtenidos los resultados del ensayo de biodegradabilidad en agua superficial, se seleccionaron
las muestras que presentaron un mayor consumo de oxígeno frente a su respectivo control, en
presencia de BKC como agregado (Figuras 27, 28 y 29). Estás muestras corresponden a los
puntos número 1, 2 ,3, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17 y 18 (Figuras 7, 8, 9, 12, 14, 15, 16, 17,
18, 20, 21, 22, 23 y 24). La confirmación de la utilización del BKC como única fuente de carbono
fue realizada utilizando las muestras del ensayo respirométrico como inóculo para un frasco con
medio mínimo y BKC como única fuente de carbono, como se describe en materiales y métodos.
El porcentaje de remoción de BKC fue evaluado transcurridas 12 horas (Figura 30). El tiempo de
duración del ensayo se definió teniendo en cuenta que el microorganismo seleccionado debería
transformar la mayor cantidad de BKC en el menor tiempo posible, con el fin de poder ser
compatible a los tiempos reales de un tratamiento de efluentes.
Figura 30. Resultados del ensayo de remoción de BKC a 12 horas
Como se puede observar en la Figura 30 todas las muestras evaluadas utilizaron el BKC como
única fuente carbono, destacándose los resultados obtenidos en los ensayos de los puntos 3 y 18,
donde hubo un porcentaje de remoción de BKC del 100% al finalizar las 12 horas. La cepa del
punto 18 fue seleccionada para su utilización en los posteriores ensayos de biodegradación en los
reactores batch y continuo.
65
La literatura ha reportado en experiencias similares que una concentración de 100 mg·L -1 de
cloruro bencil dimetil amonio (BDAA) puede tardar hasta 100 horas para degradarse
completamente (Khan, et al., 2015). Se ha logrado demostrar también que existe una diferencia
en el porcentaje de remoción al utilizarse bacterias inducidas, pues estas son capaces de degradar
el BKC hasta 3,5 veces más rápido y tienen un periodo de latencia de horas en comparación a los
7 días de latencia que tienen las células no inducidas (Patrauchan y Oriel, 2003).
• Aislamiento e identificación de bacterias degradadoras de BKC
La cepa bacteriana seleccionada correspondió a un bacilo Gram negativo, no fermentador de

glucosa, oxidasa negativo, incapaz de reducir nitrato a nitrito y móvil. La cepa fue identificada como
perteneciente al género Pseudomonas con un 99,6% de probabilidad mediante el sistema API 20
NE. El microorganismo fue capaz de utilizar glucosa, arabinosa, maltosa, manitol, N-acetil
glucosamina, gluconato, ácido cáprico, ácido málico, citrato y ácido fenil acético como fuente de
carbono. Asimismo, las pruebas realizadas demostraron que no fue capaz de utilizar como fuente
de carbono maltosa y ácido adípico. La secuenciación parcial del gen rRNA 16S (Anexo 1)
confirmó los resultados obtenidos. La cepa mostró una homología de 99% con el género
Pseudomonas y un valor (E)=0, lo cual muestra un resultado significativo (pvalor<0,05) en cuanto
al número de alineamientos aleatorios de la secuencia en todos los resultados obtenidos mediante
el Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (National Center for Biotechnology Information, s.f.)
(Anexo 2). En otros estudios se ha logrado demostrar la capacidad de los microorganismos
pertenecientes a este género de degradar detergentes de amonio cuaternario como el BKC debido
a que pueden utilizarlo como única fuente de carbono para sus procesos metabólicos. Por ejemplo,
Loveira, et al. (2012), identificaron dos microorganismos resistentes a la acción del BKC:
Pseudomonas sp. y Saccarococcus sp. Éstos se pueden encontrar en lodos activados y son
capaces de utilizar los QACs como única fuente de carbono. En otro estudio desarrollado por Khan,
et al. (2015) se utilizó también una cepa de Pseudomonas sp. aislada a partir de una planta de
lodos activados, para llevar a cabo la degradación de dos tipos de BKC: cloruro de bencil dimetil
dodecil amonio (BDDA) de forma independiente y en una mezcla de este compuesto con cloruro
bencil dimetil tetradecil amonio (BDTA).
Existen en la literatura numerosas referencias de cepas de Pseudomonas sp. capaces de utilizar

BKC como única fuente de carbono (Tezel, et al., 2012; Takenaka, et al., 2007; Nishihara, et al.,
2000; Kroon y Van Ginkel, 1994; Liffourrena et al., 2008). También se han encontrado otras cepas
66
pertenecientes a otros géneros, como Bacillus niabensis y Thalassospira sp., que pueden utilizar
y biodegradar este compuesto en periodos que llegan hasta los 7 días (Bassey y Grigson, 2011).
Desarrollo de un método colorimétrico directo para la determinación de BKC.
Los métodos colorimétricos de medición reportados para el BKC son técnicas complejas que
incluyen una fase de separación con solventes orgánicos (ANMAT; INAME, 2003). En su mayor
parte estos métodos se basan en la formación de un complejo formado con un colorante de carga
negativa y posteriormente extraído en la fase orgánica (Cross, 1970; Lowry, 1979)
Analizando el método planteado por Cross (1970) se observó que con un exceso moderado del
colorante puede producirse un cambio de color directamente en la solución acuosa debida a la
formación del complejo BKC-colorante. Esta respuesta fue cuantificable en valores de absorbancia
de la mezcla de reacción en función de la concentración de BKC presente. Este hecho también
fue observado por Lowry (1979). La técnica que finalmente utilizamos puede considerarse una
modificación del método de Lowry para trabajar con volúmenes más pequeños y con una mayor
sensibilidad (Baroni, et al., 2016).
La técnica desarrollada eliminó el empleo de solventes orgánicos, permitió trabajar con solo 1,5
mL de muestra y necesitó 10 minutos de incubación para el máximo desarrollo de color. Se
estableció el rango de linealidad mediante un Anova para bondad de ajuste (p-valor=0,664); la
regresión resultó significativa (p-valor <0,0001); la normalidad de los residuos se verificó mediante
el test de Shapiro-Wilks (p-valor=0,998). Sobre la base de la estimación de las curvas de
cuadrados mínimos se establecieron los límites de detección y cuantificación. El rango de
concentración en el que se verificó la linealidad fue de 5 a 40 mg·L -1. El límite de detección fue de
4 mg·L-1, y el de cuantificación, 5 mg·L-1. (Resultados no mostrados)
De este modo se pudo contar con un método sencillo, rápido y amigable con el medio ambiente
para la medición rutinaria de BKC.
Ensayos de biodegradación con BKC
• Ensayos de biodegradación en reactores batch

En los ensayos llevados a cabo en reactores batch se realizó el estudio de cinética de degradación
del BKC a diferentes concentraciones, utilizando la cepa de Pseudomonas sp. que fue aislada a
partir de los ensayos de biodegradabilidad de las muestras recolectadas en el punto 18 (Figura
24).
67
En estos ensayos la cepa de Pseudomona sp. degradó una concentración de 100 mg·L-1 de BKC
en un tiempo de 10 h (Figura 31), 200 mg·L-1 en 25 horas (Figura 32) y llegó a una capacidad
máxima de degradación de 500 mg·L-1 en un periodo de 46 h (Figura 33). Solamente se observa
una fase de latencia de aproximadamente 12 horas en presencia de la máxima concentración del
compuesto. Esto posiblemente sea debido a la adaptación del organismo al compuesto xenobiótico
(Chong y Chang, 2009). Durante el periodo de latencia se inducirían las enzimas que son
responsables de la degradación y que serían producidas sólo en la presencia del sustrato (BKC)
o un compuesto similar a su estructura química (Alexander, 1999).
Figura 31. Crecimiento bacteriano y porcentaje de remoción de BKC (100 mg L-·1) en ensayo batch.
Velocidad de crecimiento μ= 0,5652 h-1. IC 95% = 0.4467 - 0.6836. Coeficiente de regresión no
lineal R2= 0,9238. De acuerdo al run test la desviación del modelo exponencial fue no significativa
(Pvalor= 0,7932)
Figura 32. Crecimiento bacteriano y porcentaje de remoción de BKC (200 mg·L-1) en ensayo
batch. Velocidad de crecimiento μ= 0,2961 h-1. IC 95% = 0,2656- 0,3267. Coeficiente de regresión
no lineal R2= 0,9829. De acuerdo al run test la desviación del modelo exponencial fue no
significativa (Pvalor= 0,06409)
68
Figura 33. Crecimiento bacteriano y porcentaje de remoción de BKC (500 mg·L-1) en ensayo
batch. Velocidad de crecimiento μ= 0,1419h-1. IC 95% = 0,1242- 0,1595. Coeficiente de
regresión no lineal R2= 0,9832. De acuerdo al run test la desviación del modelo exponencial
fue no significativa (Pvalor= 0,05489)
Según la tendencia de la velocidad de crecimiento (μ) del microorganismo, los valores indican que
el BKC tiene un efecto inhibitorio sobre la célula ya que con el aumento de la concentración se
reduce la velocidad de crecimiento, lo que significa que el efecto tóxico del compuesto aumenta
con el incremento de su concentración (Alexander, 1999).
En cuanto a los ensayos de evaluación de la perdida abiótica que pueda presentar el BKC durante
el ensayo, se logró determinar que ésta es menor al 0,5% (resultados no mostrados). Esto
demuestra que el compuesto permanece estable en soluciones acuosas y que la degradación
observada en los ensayos batch se debe prácticamente en su totalidad a la acción de los
microorganismos.
En la literatura científica se pueden encontrar estudios de cinética de degradación de BKC. Khan,

et al. (2015) evaluaron el crecimiento de una cepa de Pseudomonas sp. utilizando cloruro de bencil
dimetil dodecil amonio (BDDA) como única fuente de carbono. Este compuesto es uno de los
homólogos que constituyen el BKC comercial. El tiempo empleado para la degradación de una
concentración de 100 mg·L-1 del compuesto fue de entre 150 y 175 horas. Este estudio también
demostró que la cepa utilizada poseía una mayor velocidad de crecimiento a la concentración de
100 mg·L-1 de BDDA y comenzaba a mostrar efectos inhibitorios cuando la concentración se
incrementaba a 150 mg·L-1.
69
Tezel y Pavlostathis (2009) investigaron la transformación del BKC en ensayos batch bajo
condiciones de reducción de nitratos usando como inóculo bacterias metanogénicas mesófilas. La
concentración de BKC se redujo desde 110 mg·L-1 a 10,8 mg·L-1 en un periodo de 42 días.
En otros estudios de degradación del BKC en reactores batch en los cuales se utilizó una cepa
Aeromonas hydrophila sp., se encontró que la bacteria era capaz de utilizar el compuesto también
como fuente de nitrógeno, sin embargo, la eficiencia de degradación del BKC fue baja. Se
determinó que las células no inducidas eran capaces de degradar entre un 12 y 16% de una
concentración inicial de 60 mg·L-1 en un tiempo de 7 días, después de una fase de latencia de dos
días en la que no se evidenció crecimiento de la población de bacterias. Por otro lado, las bacterias
que fueron inducidas, lograron degradar entre un 40 y un 43 % de BKC en un periodo de 7 días
con una fase de latencia entre 7 y 12 horas (Patrauchan y Oriel, 2003).
En comparación con los resultados p expuestos anteriormente, puede observarse que la cepa de
Pseudomonas sp. aislada del Punto 18 posee mayor velocidad de crecimiento y alcanza a
degradar concentraciones mayores del compuesto.
Con el fin de confirmar la eficiencia, se tomaron muestras al inicio y al final de cada uno de los
ensayos en batch y posteriormente se calcularon los porcentajes de disminución de la
concentración de BKC y de DQO.
Tabla 7. Eficiencia de la cepa Pseudomonas sp. en los ensayos en batch.
Concentración INICIAL REMOCIÓN

REMOCIÓN BKC (%)
(mg·L-1) DQO (%)
100 99,5 93,8
200 99,0 90,3
500 98,0 89,1
Como se puede observar en la Tabla 7, la cepa de Pseudomonas sp. disminuyó la concentración

de BKC casi en su totalidad, mientras que el porcentaje de disminución de DQO se encontró entre
un 89 y 94%. Estos resultados demuestran la efectividad de la bacteria y su potencial para llevar
a cabo la depuración de BKC.
Las pruebas cromatográficas realizadas a las muestras extraídas antes y después del ensayo en
batch, demuestran que al final del proceso la concentración de BKC se reduce y no se producen
metabolitos provenientes de la biodegradación (Figura 34). Igualmente, los resultados del HPLC
asociados con la reducción de los porcentajes de DQO y la ausencia de absorbancia al UV,
70
demuestran la mineralización del compuesto a pesar de los altos valores de toxicidad inicial,
similares a los publicados por otros autores (Sütterlin, et al., 2008)
Finalmente se realizaron bioensayos de toxicidad al inicio del ensayo en batch y una vez finalizado
éste, con el fin de complementar las pruebas químicas y verificar que durante el proceso de
degradación no se generen metabolitos tóxicos (Atlas y Bartha, 2002; Arias-Barreiro, et al., 2010).
Como se puede observar en la Tabla 8, los bioensayos de toxicidad muestran la detoxificación
como consecuencia del proceso de biodegradación.
Figura 34. Cromatografía ensayo de biodegración en batch del BKC. (A) Estándar BKC, (B) Salida
del reactor batch (<LOD) y (C) Entrada del reactor en batch. (108 µg/mL). LOD= 0.21 µg/mL
71
Tabla 8. Bioensayos de toxicidad en el ensayo en batch a 100 mg·L-1 de BKC.
Bioensayo - Duración CE50Inicial CE50Final

% v/v % v/v
Pseudokirchneriella 1,03 >90
subcapitata
Vibrio fischeri 0,41 >90
Lactuca sativa 0,36 >100
• Ensayos de biodegradación en reactor continuo
Como se describió en el capítulo de materiales y métodos una vez realizados los ensayos de
biodegradación en reactor batch y habiendo comprobado la eficiencia de la bacteria en el proceso
de degradación del BKC, el paso siguiente fue desarrollar un reactor continuo de lecho expandido
y flujo ascendente con recirculación. El objetivo de este reactor continuo de película biológica es
tratar un volumen mayor de efluente en un periodo de tiempo más corto, de tal modo que se
puedan reducir los costos de operación del tratamiento pensando en un posible uso industrial.
Para contener la matriz en la que se formó la biopelícula se diseñó una jaula metálica de 70 cm
de alto con un diámetro de 11 cm (Figura 35); en ella se introdujo el relleno de Leca® la cual
funciona como soporte de crecimiento del biofilm y que, debido a sus características, permite el
flujo constante del efluente a través del reactor y facilita las condiciones de aireación necesarias
para mantener la población bacteriana. Previamente se había expuesto el material de relleno,
inoculado con la bacteria seleccionada, a una baja concentración de BKC (100mg∙L-1). El material
de relleno fue mantenido en modo batch alimentado durante un mes un con el propósito de generar
una biopelícula inicial. Finalizado este proceso se procedió a ubicar la matriz dentro del reactor y
se mantuvo en funcionamiento cerca de un mes con un efluente de BKC a baja concentración, con
el fin de adaptar el microorganismo a las condiciones del lecho y de flujo del reactor. El
funcionamiento en modo batch hasta lograr un desarrollo satisfactorio de la biopelícula ha sido
empleado por distintos autores (Radwan y Ramanujam, 1997; Sa y Boaventura, 2001; Xiangchun,
et al., 2003; Kargi y Eker, 2005). Este objetivo fue conseguido ya que una vez puesto en
funcionamiento el reactor en modo continuo los valores a la salida se estabilizaron
inmediatamente. Una vez transcurrido este tiempo de adaptación se evaluó el desarrollo de la
película biológica realizando un recuento de bacterias en el material de relleno, luego de su
desprendimiento por agitación. Se determinó un valor de 6 x 108 UFC·g-1. La presencia de la
biopelícula también fue observada por microscopía electrónica de barrido (Figuras 36, 37 y 38).
72
Parámetros de operación del reactor
➢ Tiempo de retención hidráulico TRH
➢ Carga orgánica
Cantidad de materia orgánica tratada por unidad de tiempo y de volumen de reactor.
Figura 35. Reactor con recirculación continua y componentes interiores.
73
Figura 36. Micrografía electrónica del Biofilm de la matriz de Leca® (Aumento 700x)
74
Figura 39. Remoción del BKC en el reactor aeróbico de lecho expandido y flujo continuo
ascendente con recirculación
La Figura 39, muestra los datos de remoción del BKC en el reactor de flujo continuo durante las
66 semanas que estuvo en operación. La concentración inicial fue de 81 mg∙L-1 de BKC y se fue
75
aumentando progresivamente hasta alcanzar una concentración de 1172 mg∙L-1. Los resultados
obtenidos demuestran que para todo el rango de concentración ensayado los valores de salida se
mantienen en una concentración por debajo del límite de detección de BKZ. Además, debe
destacarse el hecho que no fue necesario realizar reinoculación del reactor durante todo el tiempo
de operación.
Un aspecto que resaltar de los resultados del reactor continuo es la alta concentración que se
logró biodegradar. Debe tenerse en cuenta que el BKC es un compuesto tóxico que puede inhibir
la remoción de la DQO en plantas de tratamiento de efluentes aún en concentraciones tan bajas
como 20 mg·L-1 (Zhang, et al., 2011). Sin embargo, en los procesos de lodos activados las
poblaciones de microorganismos pueden adaptarse a las bajas concentraciones presentes e
incluso son capaces de usar el BKC como fuente de carbono si no existe una fuente inmediata
como la glucosa, llegando a degradar completamente el compuesto.
A continuación, se presentan los resultados de la evaluación por HPLC de la eficiencia del

tratamiento en términos de remoción del compuesto y reducción del DQO, para la máxima
concentración de BKC a la que se sometió el reactor.
Figura 40. Cromatografía del efluente de BKC antes (A) y después (B) del tratamiento en el
reactor continuo. – Estándar de BKC; − Efluente de BKC
76
Tabla 9. Resultados de ensayos de DQO y eficiencia del reactor de flujo continuo en la máxima
concentración.
Entrada Salida Eficiencia (%)

DQO (mg O2·L-1) 4775 21 99,6%
Concentración BKC
1172 8,5 99,3%
(mg∙L-1)
Estos resultados (Figura 40) demuestran que el reactor continuo es capaz de reducir la máxima
concentración del efluente de BKC que se sometió a tratamiento. La Tabla 9 muestra la eficiencia
del proceso en términos de porcentaje de remoción de DQO y de la concentración de BKC;
superior en ambos casos al 99%.
Hajaya y Pavlostathis (2012), investigaron la degradación y el efecto del BKC en un proceso de

flujo continuo de remoción de nitrógeno (BNR) de una planta de tratamiento de efluentes
provenientes de la industria de las aves. Los autores utilizaron un sistema compuesto de tres
reactores: el primero es usado como reactor de fermentación para ofrecer carbono que pueda ser
útil en el proceso de desnitrificación que se lleva a cabo en el segundo reactor, mientras que en el
tercer reactor se realiza la degradación de la materia orgánica y su nitrificación. En este sistema
la concentración de BKC partió de una concentración inicial de 60 mg·L-1, y alcanzó una
concentración máxima de 120 mg·L-1, a lo largo de un período de 22 semanas. Este valor máximo
representa solamente el 10,23% de los valores alcanzados en el presente trabajo con una
eficiencia de remoción sustancialmente menor (27,33%). El TRH obtenido en el trabajo de Hajaya
y Pavlostathis (2012), en cambio, es significativamente menor (1 día). Sin embargo, debe tenerse
en cuenta que el BNR es un sistema mucho más complejo, que requiere de una gran área y tiene
más etapas en su proceso lo cual puede aumentar los costos de operatividad.
Cabe destacar el alto valor de carga orgánica (146,5 g∙m3∙día) que es capaz de remover el reactor.
Esta capacidad se debe en parte a la eficiente recirculación alcanzada, lo que permite que el flujo
dentro del reactor se aproxime a un modelo de mezcla completa ideal. Este resultado se puede
comparar con un reactor desarrollado años atrás en el mismo laboratorio. Este reactor de
biopelícula, flujo descendente y sin recirculación, se aproximaba a un modelo de flujo pistón y fue
empleado para el tratamiento de 2-4 diclorofenol y 2,4,6-triclorofenol. Los valores de carga
orgánica máxima obtenidos fueron respectivamente 35,2 g∙m3∙día y 37.4 g∙m3∙día (Gallego et al,
2011)
77
Si bien otros factores como la toxicidad de los compuestos en tratamiento y la capacidad
degradativa de los microorganismos también deben ser tenidos en cuenta, cuando se logra un
flujo que se aproxime a una mezcla completa, logra minimizarse la concentración en el interior del
reactor. Los reactores de este tipo son especialmente útiles para el tratamiento de compuestos
tóxicos, ya que minimizan la concentración a la que se ven expuestos los microorganismos en su
interior y posibilita incrementar mucho más la concentración de entrada. Teóricamente ésta se
mantiene ideal en el nivel de la salida, en contraposición a lo que ocurre en un flujo pistón, donde
la concentración es máxima a la entrada y va disminuyendo gradualmente hacia la salida.
Otra propuesta de para la eliminación del BKC en agua es a través de un tratamiento que combina
procesos biológicos con fotocatálisis con Dióxido de Titanio (TiO2) (Loveira, et al., 2012). En el
estudio se concluye que el uso de procesos fotocatalíticos mejora la biodegradación del BKC en
bajas concentraciones. La eficiencia del tratamiento fue de 50%, tanto en términos de remoción
de compuesto como de DQO, para una concentración máxima de 180 mg·L-1. En comparación el
tratamiento es más complejo y costoso, debido a los largos tiempos de exposición a la irradiación
a los que se debe someter el efluente, y presenta el riesgo de producir intermediarios de mayor
persistencia y toxicidad.
Es interesante destacar que la baja biodegrabilidad del BKC y otros QACs han sido el motivo para
el desarrollo de estos sistemas de tratamiento que se fundamentan en la asociación de procesos
fisicoquímicos a los biológicos (Loveira, et al., 2012). Aunque no puede negarse la versatilidad de
estos, ellos compiten difícilmente en términos de costos con los procesos biológicos, cuando
realiza el tratamiento de depuración de un solo agente químico (Fortunato, 2016). Por lo tanto, la
selección de una especie autóctona capaz de metabolizar altas concentraciones de un compuesto
es una estrategia realmente interesante para procesos de bioaumentación y el tratamiento parcial
de efluentes industriales.
Bioensayos de toxicidad
Con el objetivo de confirmar la disminución de la toxicidad como consecuencia del tratamiento

biológico se realizaron bioensayos estandarizados de toxicidad a la entrada y a la salida del reactor
contíno. Se emplearon como organismos de ensayo Vibrio fischeri, Pseudokirchneriella
subcapitata y semillas de lechuga (Lactuca sativa), de acuerdo a las normas ISO 11348-3 (ISO,
1998), ISO 8692 (ISO, 2004) y EPA600/3-88 (EPA, 1989) respectivamente. Los resultados se
muestran a continuación:
78
Tabla 10. Resultados ensayos de Toxicidad.
Entrada Salida
CE50 CE50
Organismo de ensayo (Tiempo) Unidades tóxicas Unidades tóxicas % Remoción
(% v/v) (% v/v)
Vibrio fischeri (15 min) 0,029 3571,4 1,58 63,65 98,2
Pseudokirchneriella subcapitata (72
0,017 5882,0 0,58 173 97,1
h)
Lactuca saliva (120 h) 0,47 212,8 44,2 2,3 98,9
Como se puede evidenciar en cada uno de los ensayos expuestos anteriormente, los niveles de
toxicidad se redujeron entre un 97% y un 99%, lo cual indica que el tratamiento tiene la capacidad
de reducir la toxicidad de las altas concentraciones de entrada de BKC como consecuencia de la
biodegradación.
79
CONCLUSIONES
A partir de aguas superficiales de las Cuencas de los ríos Reconquista y Matanza-Riachuelo y de

la zona costera del Río de la Plata se aislaron 14 comunidades bacterianas degradadoras de
cloruro de benzalconio y una de triclosán.
No pudo correlacionarse la presencia de microorganismos biodegradadores con la contaminación

fecal en los puntos de muestreo o con otros parámetros como la DQO o DBO.
En la mayoría de los sitios la concentración en ensayo de 20 mg L-1 de los distintos desinfectantes

no fue capaz de inhibir las poblaciones de bacterias del agua. Esto ocurrió en el 94% de los sitios
para cloruro de benzalconio, en el 67% para triclosán y en el 56% para clorhexidina.
La cepa aislada de Punta Lara demostró la mayor capacidad degradativa y fue utilizada en los
siguientes ensayos. Fue identificada como perteneciente al género Pseudomonas.
La cepa autóctona seleccionada fue capaz de biodegradar una concentración de 100 mg·L -1 de
BKC en un tiempo de 12 horas y 200 mg·L-1 en 25 horas. La máxima concentración que fue capaz
de degradar fue de 500 mg·L-1 en un tiempo de 46 horas. La eficiencia de los procesos fue
respectivamente 99,5%; 99,0% y 98%, en términos de remoción de compuesto, y de 93,8% 90,3%
y 89,1%, expresado como remoción de DQO.
Los bioensayos de toxicidad realizados con Pseudokirchneriella subcapitata, Vibrio fischeri y

Lactuca sativa realizados al final del proceso batch demostraron la detoxificación total del
compuesto como consecuencia de la biodegradación.
La bacteria fue utilizada en un reactor de película biológica de flujo ascendente y lecho expandido
con recirculación. El reactor estuvo en funcionamiento durante 67 semanas en condiciones
ambientales y fue utilizado para tratar un efluente que contenía cloruro de benzalconio. La
concentración de BKC en el efluente fue aumentada progresivamente desde 81 hasta 1172 mg·L-
1. Esta concentración representó una carga orgánica de 146,5 g m3 día-1, teniendo en cuenta un
flujo de entrada de 1 L día-1. La eficiencia de remoción de compuesto para esta carga máxima fue
de 99,6% con un 99,3% de remoción de DQO.
Los bioensayos de toxicidad realizados con Pseudokirchneriella subcapitata, Vibrio fischeri y

Lactuca sativa demostraron una remoción de toxicidad superior en todos los casos al 97%
expresado en función de las unidades tóxicas determinadas a la entrada en cada ensayo.
80
Con el objeto de facilitar la medición del compuesto en los ensayos de biodegradación se
desarrolló una técnica colorimétrica sencilla para la determinación de cloruro de benzalconio que
no necesita del empleo de solventes orgánicos y que puede ser aplicada en otras áreas.
El reactor de lecho expandido desarrollado podría ser una alternativa adecuada para tratar bajos
caudales de efluentes parciales conteniendo este u otros compuestos que, por su toxicidad,
podrían representar un efecto inhibitorio para las plantas de tratamiento secundario.
La alta resistencia a cloruro de benzalconio de la cepa de Pseudomonas aislada, asociada a su

alta capacidad de degradación posibilitaría su empleo en procesos de tratamiento de efluentes o
aguas contaminadas con este desinfectante.
81
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Acetoclor 1.0 x10-1 2.0 x10-1

DDT 1.8 x10-1 9.0 x10-1

Bentazona 4.0 x10-3 2.5 x10-1

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Usado como preservante de

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