Sunteți pe pagina 1din 41

Ghid de asigurare / control de calitate pentru

Laboratoare care efectuează analize PCR pe


Probele de mediu

De la izolarea genelor specifice la secvențializarea genomilor întregi, reacția în lanț a polimerazei


(PCR) a devenit una dintre cele mai utilizate tehnologii pentru efectuarea cercetărilor biologice.
Progresele au condus la dezvoltarea de metode PCR specifice și sensibile pentru un randament
ridicat
detectarea unei varietăți de microorganisme și aceste metode sunt aplicate din ce în ce mai mult la
analiza
probe de mediu.
Aplicarea cu succes a PCR necesită utilizarea corectă a tehnicilor și interpretarea rezultatelor.
Multe metode PCR oferă un nivel de sensibilitate egal sau mai mare decât mediul mai tradițional
metode microbiologice. Datorită capacității de a amplifica cantități mici de acid nucleic, PCR
poate fi utilizat
detectați organisme dificil de cultivat in vitro sau care nu pot fi cultivate. Cu toate acestea,
avantajele
aceste tehnici pot fi compensate de protocoalele de testare solicitante și de necesitatea respectării
calității
proceduri de asigurare / control al calității (QA / QC) cu atenție. Aceste proceduri QA / QC sunt
necesare
deoarece capacitatea PCR de a produce multe copii ale ADN-ului țintă creează posibilitatea
contaminarea cu produse amplificate anterior, ceea ce poate duce la rezultate fals pozitive. În plus,
probele de mediu pot inhiba PCR, ceea ce poate duce la rezultate fals-negative. Pe măsură ce se
depun eforturi
pentru standardizarea protocoalelor PCR pentru analizele probelor de mediu, este esențial să se
stabilească
proceduri standardizate de QA / QC.

1.1 Scopul
Acest manual de orientare a fost elaborat pentru a servi drept resursă și referință pentru
următoarele:
• Practici QA / QC de laborator pentru analize de probe de mediu care implică tehnici de PCR
• Practici QA / QC de laborator pentru noua metodă PCR a Agenției pentru Protecția Mediului
(EPA) din SUA
protocoale
• Practici QA / QC de laborator pentru granturi EPA și acorduri de asistență care implică analize
PCR
• O bază pentru cercetători, manageri și ofițeri de asigurare a calității pentru a evalua calitatea
datelor PCR
proiectelor de cercetare și lucrări tehnice

1.2 Domeniul de aplicare


Acest manual este destinat să servească drept ghid general pentru dezvoltarea procedurilor QA /
QC specifice de laborator pentru analiza PCR a probelor de mediu. Cu toate acestea, deoarece analiza
PCR
include o gamă largă de ținte și proceduri de acid nucleic, toate procedurile QA / QC necesare
pentru a
un anumit protocol nu poate fi abordat.
Acest document nu se referă la reglementările federale, de stat și locale care reglementează
gestionarea deșeurilor,materiale periculoase și materiale radioactive; este responsabilitatea laboratorului să
se conformeze cu relevanță
reguli. În plus, această orientare nu abordează problemele legate de siguranță; este laboratorul
responsabilitatea de a stabili practicile de securitate și sănătate adecvate.

În acest manual sunt abordate următoarele subiecte:


• Secțiunea 2. Asigurarea calității de laborator. Această secțiune oferă îndrumări privind
laboratorul general
QA / QC aplicabil analizei PCR a probelor de mediu. Oferă recomandări pentru
personal, proiectare instalație, flux de lucru, echipamente, de unică folosință și curățare.
• Secțiunea 3. Reactivi, truse, seturi de amorsare și enzime. Această secțiune oferă instrucțiuni QA
/ QC pentru
reactivi, truse, seturi de grunduri și enzime utilizate în analiza PCR a probelor de mediu, inclusiv
informațiile pentru aceste materiale care ar trebui să fie înregistrate în jurnale de laborator și
depozitare
Condiții.
• Secțiunea 4. Dezvoltarea și evaluarea metodei. Această secțiune oferă îndrumări privind
dezvoltarea unei metode PCR și a componentelor sale componente, inclusiv factori de luat în
considerare la selectare
tehnici PCR adecvate și confirmarea ampliconilor.
• Secțiunea 5. Eșantioane de control de calitate pentru metodele care utilizează PCR. Această
secțiune oferă un rezumat al
controalele necesare pentru analiza PCR a probelor de mediu. Acțiuni corective recomandate
pentru eșecurile de control și testarea competenței sunt de asemenea acoperite.
• Secțiunea 6. Înregistrarea datelor, păstrarea înregistrărilor și evaluarea datelor. Această secțiune
oferă
îndrumări privind înregistrarea datelor, păstrarea înregistrărilor și interpretarea datelor, inclusiv
variabilitatea, echivocul
rezultate și limitări.

SECȚIUNEA 2. ASIGURAREA CALITĂȚII DE LABORATOR


Laboratoarele care efectuează analize PCR ale probelor de mediu ar trebui să elaboreze un QA
scris
Plan de management care descrie modul în care laboratorul își desfășoară operațiunile de rutină de
zi cu zi. Acest plan ar trebui să descrie organizarea laboratorului și linia de autoritate. Ar trebui să
identifice o calitate de laborator
Assurance Manager și descrieți responsabilitățile și autoritatea Managerului.
Planul ar trebui să descrie cerințe minime pentru personal (secțiunea 2.1), instalații (secțiunea 2.2),
prelevare de probe și manipulare a probelor proceduri (secțiunea 2.3), întreținerea echipamentelor și
verificări de calitate (secțiunea 2.4), consumabile de laborator (Secțiunea 2.5) și reactivi (Secțiunea 3) și
proceduri pentru menținerea curățeniei de laborator (Secțiunea 2.5)
(2.6). Ar trebui să identifice și să descrie procedurile analitice (a se vedea secțiunea 4) și referința
corespunzătoare ,proceduri standard de operare. Implementarea măsurilor de QC adecvate pentru fiecare
metodă
(Secțiunile 4 și 5) ar trebui detaliate. Planul ar trebui să descrie modul în care este exactitatea
datelor brute
menținut, modul în care datele brute sunt convertite în date finale și cum sunt păstrate și stocate
înregistrările (secțiunea
6). În cele din urmă, ar trebui să identifice răspunsul laboratorului și acțiunile corective (secțiunea
5.4) la calitate
eșecuri de asigurare.
Secțiunea 2 oferă îndrumări cu privire la calificările și instruirea recomandate personalului care
efectuează
Analize PCR și utilizarea uzurii de protecție de către personalul laboratorului pentru a preveni
proba
contaminare. Proiectarea instalației și fluxul de lucru sunt luate în considerare, deoarece sunt
esențiale pentru prevenirea ambelor
contaminarea eșantionului și rezultatele eronate. În plus, calibrarea, întreținerea și curățarea
sunt discutate procedurile pentru echipamentele de laborator și standardele pentru laboratorul de
unică folosință.

2.1 Personal
Personalul care lucrează în laborator care efectuează analiza PCR trebuie să îndeplinească
pregătirea și pregătirea
specificațiile prezentate mai jos și ar trebui să urmeze îndrumările furnizate cu privire la
îmbrăcămintea de protecție.

2.1.1 Istoric și instruire


Analiștii implicați în analizele PCR ar trebui să aibă o lucrare de licență în biologie moleculară,
biotehnologie, biochimie, genetică moleculară sau alte activități de curs care acoperă PCR și
recombinant Teoria și practica ADN-ului Cu toate acestea, poate fi o pregătire și o experiență
proporțională legate de locul de muncă substituit. Instruire practică, inclusiv revizuirea procedurilor de
operare standard (POS) sau a manualelor, ar trebui completată pentru fiecare tehnică sub supravegherea
personalului cu experiență (de exemplu, directorul investigator, analist senior sau reprezentant al
producătorilor).
Deși timpul necesar pentru pregătire va varia în funcție de analist și de tehnică, fiecare analist
trebuie să demonstreze că poate efectua metoda cu succes prin analize eșantioane de control pozitiv și
negativ înainte de a avea voie să analizeze probe de mediu fără supraveghere. O demonstrație inițială a
capacității ar trebui să includă cel puțin patru analize replicate ale apă de reactiv însămânțat, două replici
de apă de mediu însămânțate și o metodă goală (vezi secțiunea 5.2.2), precum și testarea competenței (vezi
Secțiunea 5.6).
Aceste recomandări pentru inițială demonstrarea capacității se bazează pe cerințele actuale pentru
EPA microbiologice convenționale metode. Fiecare analist este, de asemenea, de așteptat să fie în
cunoștință de cauză în privința siguranței laboratorului și a procedurilor QA / QC.
Laboratorul trebuie să păstreze un registru de pregătire pentru fiecare analist care documentează
următoarele:
• Datele și sfera de pregătire a metodei PCR
• Demonstrarea inițială a capacității
• Rezultatele testului de competență pentru fiecare tip de analiză
• Datele și sfera de pregătire a QA / QC de laborator
• Datele și sfera de pregătire a securității de laborator
2.1.2 Îmbrăcăminte exterioară
În fiecare cameră de laborator trebuie să fie disponibile haine de laborator dedicate și mănuși fără
pulbere (vezi
descrierea camerelor de laborator din secțiunea 2.2.1). Paltoanele de laborator trebuie îndepărtate
și mănuși
aruncat înainte de a părăsi fiecare cameră. Schimbarea hainelor și mănușilor de laborator reduce
posibilitatea
contaminarea cu șablon (acidul nucleic din care este efectuat PCR) sau nucleic amplificat
acid. Mănușile trebuie schimbate după lucrul cu probe semănate sau de mediu, după manipulare
șablon sau acizi nucleici amplificați și după contactul exterior cu mănuși cu pielea. Acesta din
urmă
previne introducerea enzimelor predominante pe piele, cum ar fi DNazele și RNazele, care
degradează nucleul
acizi. În absența unei hote cu flux laminar sau a unui dulap de siguranță biologic (vezi Secțiunea
2.4.7), de protecție
măști de praf sau măști chirurgicale pot fi purtate pentru a reduce în continuare riscul de
contaminare a nucleelor aeriene
acizi din analist.
Paltoanele de laborator trebuie curățate în mod regulat pentru a reduce posibilitatea contaminării
celor desemnați
spațiul de lucru și reacția PCR. Paltoanele de laborator trebuie separate de hainele care nu sunt de
laborator
(adică, hainele de laborator nu trebuie luate acasă și spălate cu alte haine) și curățate doar cu
alte straturi de laborator care se aflau în aceeași zonă de lucru (de exemplu, straturi de laborator de
la prepararea probei
camera nu trebuie curățată cu straturi de laborator din camera de amplificare și produs). Mulți
regiunile au companii specializate care sunt calificate să curețe straturile de laborator. Aceste
companii deseori
curățați straturile din loturi pentru a preveni amestecarea straturilor dintr-o zonă de laborator
desemnată cu alte straturi sau
materiale dintr-o altă zonă. Frecvența curățării depinde de cantitatea de lucru pe PCR
laboratorul este performant, iar laboratoarele ocupate pot dori să curețe straturile săptămânal sau
zilnic. Laborator
hainele utilizate pentru pregătirea controalelor pozitive ar trebui să fie dedicate acestei sarcini și
curățate mai des. La
elimina nevoia de curățare a straturilor de laborator, pot fi, de asemenea, haine de laborator de
unică folosință

2.2 Proiectarea instalației și fluxul de lucru


Sensibilitatea ridicată a tehnicilor PCR necesită respectarea condițiilor de analiză exigente.
laboratorul trebuie proiectat și operat într-un mod care să prevină contaminarea reacțiilor cu
produse amplificate din analize anterioare și contaminare încrucișată între probe, ambele putând
duce la rezultate fals-pozitive. Îndrumări privind proiectarea laboratorului și fluxul de lucru pentru
atenuarea potențialului
contaminarea și maximizarea calității datelor sunt furnizate în secțiunile 2.2.1 și 2.2.2.

2.2.1 Proiectarea instalației


Contaminarea dintre eșantioane și din ampliconele anterioare de PCR generate în laborator este a
sursă potențială semnificativă de rezultate PCR nevalide. Astfel, separarea spațiului de lucru este
critică.
A analizele PCR de laborator pe probele de mediu trebuie împărțite în cel puțin trei
camere separate fizic:
• Pregătirea reactivilor (folosind presiune pozitivă pentru a preveni introducerea contaminării)
• Pregătirea probelor (folosind presiune negativă pentru a menține acizii nucleici șablon în
încăpere)
• Amplificare și detectarea produsului (folosind presiune negativă pentru a menține acizii nucleici
amplificați în cameră)
Un flux de lucru unidirecțional va reduce posibilitatea producerii contaminării (vezi Secțiunea
2.2.2 și.)
Figura 2-1). Nu trebuie să fie luate în considerare materiale, materiale sau echipamente din camera
de pregătire a eșantionului
sala de pregătire a reactivilor. Nimic din camera de amplificare și detectare a produsului nu trebuie
să fie
preluate în camera de preparare a probelor sau în sala de preparare a reactivului. Pentru a reduce
amenințarea eșantionului
contaminarea din activitățile de prelucrare a eșantioanelor, dulapuri biologice de siguranță separate
(vezi Secțiunea 2.4.7)
ar trebui să fie dedicat controlului pozitiv și procesării probelor de testare. Zonele vacante din
camere pot fi
utilizat pentru activități non-PCR, cum ar fi analiza probelor chimice, dar personalul asociat cu
aceste activități ar trebui să mențină fluxul de lucru unidirecțional și echipamentele nu trebuie să
fie mutate
între încăperile utilizate pentru orice etapă de procesare și analiză a probelor PCR.

2.2.1.1 Sala de pregătire a reactivilor


Sala de preparare a reactivilor trebuie să fie desemnată pentru prepararea și depozitarea reactivilor
PCR,
inclusiv amestecuri principale (amestecuri ale tuturor reactivilor necesari pentru PCR, cu excepția
probei). Adaos de master
amestecurile cu tuburile PCR trebuie efectuate în această cameră. Pentru a preveni contaminarea
încrucișată și pentru a evita
congelarea repetată și decongelarea, soluțiile din stocuri de reactivi ar trebui alocate în
„funcționare” mai mică
volume și depozitate în această cameră pentru utilizare ulterioară. Se recomandă ca camera să fie
sub presiune pozitivă
pentru a descuraja contaminarea.
Sala de pregătire a reactivilor trebuie să aibă pipete reglabile dedicate, cu barieră, cu aerosoli sau
cu barieră
vârfuri de pipet cu deplasare pozitivă, paltoane de laborator și mănuși de unică folosință. Mănuși
proaspete și laborator
hainele trebuie purtate în orice moment pentru a controla contaminarea. Personalul trebuie să
îndeplinească sarcini în această cameră
înainte de a lucra în camerele de prelucrare a probelor sau de amplificare / detectare și nu ar trebui
să se mute de la
aceste încăperi înapoi la sala de pregătire a reactivilor.
Important: materiale din alte încăperi (inclusiv amplificat, șablon și acid nucleic țintă sau
controale, consumabile sau echipamente pozitive) nu trebuie aduse în sala de pregătire a
reactivilor.
2.2.1.2 Sala de pregătire a probelor
Camera de preparare a eșantionului trebuie să fie desemnată pentru prelucrarea eșantionului și
prepararea pozitivă și
controale negative. Prelucrarea eșantionului poate include concentrarea organismelor țintă în
mediu
probe, precum și extracția și purificarea acizilor nucleici din aceste organisme. Procesat
probele și controalele trebuie adăugate la tuburile care conțin amestecul PCR master în această
cameră. Oricând
posibil, tuburile PCR trebuie acoperite imediat ce se adaugă proba. Când utilizați plăci PCR și
învelișurile adezive, controalele pozitive și eșantioanele sămânțate trebuie separate de puțuri cu
probe de câmp
pentru a evita contaminarea în timpul adăugării șablonului.
Sala de pregătire a eșantionului ar trebui să aibă pipete reglabile dedicate, cu vârfuri de barieră
aerosolă, conectate
sau sfaturi de deplasare pozitivă. Mănuși proaspete și paltoane de laborator trebuie să fie purtate în
orice moment pentru a fi controlate
contaminarea din această cameră în orice altă locație. Această cameră trebuie menținută sub
presiune negativă
preveniți contaminarea în afara camerei.
În mod ideal, două dulapuri de siguranță biologice (vezi Secțiunea 2.4.7) ar trebui utilizate în
cameră - una pentru
proba pentru controlul negativ și proba negativă, iar cealaltă pentru pregătirea controlului pozitiv -
pentru a proteja
eșantioane de contaminare încrucișată și pentru a proteja lucrătorii împotriva expunerii la agenți
patogeni. Pipete separate
și haine de laborator ar trebui, de asemenea, să fie desemnate pentru lucrul în fiecare capotă.
Important: nimic din această cameră nu trebuie dus în sala de pregătire a reactivilor.
Pe lângă separarea preparatului de control pozitiv de proba de probă și de control negativ,
laboratoarele pot dori să includă o zonă închisă sau o cameră destinată recepției și depozitării
eșantionului.
Această cameră conține frigidere pentru depozitarea eșantionului și ar trebui izolată de oricare
dintre celelalte
zone. Personalul nu trebuie să se mute din această cameră în sala de pregătire a reactivilor.

2.2.1.3 Camera de amplificare și de produs


Această cameră ar trebui să fie destinată activităților asociate cu amplificarea PCR și analizele
post-PCR.
Termociclorul trebuie amplasat în această cameră. Mănușile și hainele de laborator trebuie să fie
purtate în permanență și îndepărtate înainte de a părăsi camera pentru a controla contaminarea cu
amplicon din alte locații. Toate
echipamentele utilizate pentru amplificare și detectarea produsului ar trebui să fie dedicate acestei
încăperi, inclusiv
pipete reglabile cu vârfuri de pipetă cu bară, cu aerosoli sau cu bariere de deplasare pozitivă.
Această cameră ar trebui
să fie ținut sub presiune negativă. Deși amplificarea PCR și analizele post-PCR pot fi efectuate
în aceeași cameră, laboratoarele pot dori să separe aceste activități în zone diferite sau în camere
diferite
pentru a reduce riscul de contaminare din produsele amplificate.
Important: nimic din această cameră nu trebuie să fie introdus nici în camera de pregătire a
probelor, nici în camera de pregătire sala de preparare a reactivilor

2.2.2 Flux de lucru


Pentru a reduce potențialul de contaminare trebuie utilizat un flux de lucru unidirecțional.
Codificarea culorilor
echipamentele, reactivii, straturile de laborator și consumabilele pot ajuta la menținerea fluxului de
lucru unidirecțional
desemnând culori specifice fiecărei săli de laborator. Manuale de laborator și caiete, de asemenea,
nu ar trebui
fi mutat din cameră în cameră. Laboratoarele ar putea dori să ia în considerare utilizarea
raportărilor electronice de date pentru a evita
această posibilă sursă de contaminare.
Într-o anumită zi, analiștii nu ar trebui să revină la reactiv sau la sălile de preparare a eșantionului
după ce lucrează
amplificarea și sala de produse. În mod similar, analiștii nu ar trebui să revină la sala de pregătire a
reactivilor
după ce a lucrat în camera de pregătire a probelor. Dacă un analist trebuie să se întoarcă în mod
neașteptat la un amonte
camera în procesul de lucru, analistul ar trebui mai întâi să se ducă și să se schimbe hainele. Dacă o
încălcare în acest sens
procesul de lucru are loc, camerele și echipamentele de laborator afectate trebuie curățate în
funcție de
îndrumările furnizate în secțiunile 2.4 și 2.6, iar rezultatele trebuie monitorizate așa cum sunt
definite în secțiuni
5.2 și 5.4.
O reprezentare schematică a fluxului de lucru este prezentată în figura 2-1.
2.3 Protocolul de acceptare a probelor de mediu
Laboratorul ar trebui să aibă un protocol în vigoare pentru acceptarea eșantioanelor de mediu
pentru PCR
analiză. Acest protocol ar trebui să fie documentat într-un POS de laborator și să includă criterii de
acceptare a eșantionului
și acțiuni corective pentru eșantioane care nu îndeplinesc criteriile (de exemplu, amintirea
eșantionului sau urmărirea cu colectorul de probe pentru a obține informații lipsă). Eșantionul trebuie
evaluat când este
primită la laborator pentru a verifica dacă volumul eșantionului a fost adecvat, proba a fost
manipulată și
păstrat în mod corespunzător (de exemplu, refrigerat și livrat peste noapte), cerința timpului de
păstrare a fost îndeplinită și
că toate informațiile necesare pentru colectarea eșantioanelor au fost înregistrate de colectorul de
probe. Specificații pentru
volumul eșantionului, manipularea eșantionului și timpul de reținere vor depinde de metodă și de
acceptarea eșantionului
criteriile ar trebui să se bazeze pe specificațiile descrise într-un POS pregătit pentru fiecare metodă.
După
eșantionul este evaluat, informațiile privind data și ora primirii eșantionului și starea eșantionului
ar trebui să fie
înregistrate. Eșantionul trebuie marcat, înregistrat și urmărit cu un identificator unic.
2.4 Echipament
Echipamentele utilizate pentru a efectua o metodă PCR ar trebui să funcționeze corect pentru a
genera date fiabile. La
verificați dacă echipamentul funcționează corect, laboratorul ar trebui să aibă un program de
întreținere
echipamente. Programul trebuie să includă configurarea, calibrarea, repararea, păstrarea
înregistrărilor și normal
funcționarea tuturor echipamentelor utilizate în analiza probelor, așa cum se menționează în SOP
pentru fiecare instrument sau metodă individuală. Rezultatele tuturor testelor trebuie documentate într-un
jurnal de echipamente și / sau în format electronic

Bază de date. Jurnalul sau baza de date ar trebui verificate lunar de personalul QC sau de laborator
supraveghetor și orice probleme și acțiuni corective notate. Echipamentele ar trebui să fie dedicate
unui anumit
ar trebui să fie disponibile o cameră de laborator și manualele de instrumente de la producător.
Individual
laboratoarele ar trebui să decidă ce teste trebuie efectuate pentru a evalua funcționalitatea
instrumentelor și
frecvența la care să le testeze. QA recomandat pentru anumite tipuri de instrumente utilizate pentru
PCR
analizele sunt furnizate în secțiunile 2.4.1 până la 2.4.11.

2.4.1 Termociclete și instrumente PCR în timp real


Termocicletele sunt esențiale pentru toate metodele PCR și trebuie să se acorde mare atenție pentru
a se asigura
bine întreținut și de încredere. De obicei, producătorii de instrumente s-au dezvoltat
proceduri recomandate pentru testarea și întreținerea instrumentului. Temperatura de bloc a unui
termocicler
trebuie testat de cel puțin două ori pe an (sau la frecvența specificată de producător) de laborator
sau în baza unui acord de întreținere pentru a asigura încălzirea uniformă pe întregul bloc. Testare
lunară
trebuie efectuate de laboratoare care efectuează un număr mare de reacții.
Temperatura blocului trebuie testată cu o sondă externă care a fost calibrată la o temperatură
standard. Pentru testare, sonda este plasată în mai multe fântâni din periferia și centrul centralei
instrument. Toate temperaturile ar trebui să fie în conformitate cu specificațiile producătorilor.
Amplificarea
programul folosit în fiecare rulare trebuie tipărit pentru a verifica în continuare condițiile PCR.
Acest lucru permite, de asemenea
analistul să stabilească dacă au existat defecțiuni ale instrumentului în timpul reacției. Dacă
termociclorul nu are software cu această capacitate, atunci programul de ciclism utilizat ar trebui
să fie
documentate în POS-ul laboratorului cu rezultate ale verificărilor de calibrare lunare.
Instrumentele PCR în timp real sunt echipate pentru a efectua excitația și detectarea fluorescenței
pentru monitorizare
amplificare pe parcursul ciclurilor PCR. Din acest motiv, designul este adesea diferit de standard
termociclorul și calibrarea pot fi specifice proiectării instrumentului și trebuie efectuate
în conformitate cu specificațiile producătorilor. De exemplu, mai multe platforme în timp real nu
au încălzire
blochează, dar proiectează rotorul, cu probe care se rotesc într-o cameră de aer care este încălzită și
răcită. Temperatura
poate fi calibrat pentru acest tip de instrument folosind un rotor de calibrare furnizat de producător.
De asemenea, trebuie verificate performanțele, alinierea și dispozitivele de siguranță și calibrarea
sistemelor optice.
Aceasta poate implica analiza tăvilor de test fluorescente pentru a confirma detectarea constantă
din fiecare godeu. Pentru
proiectează rotorul, fiecare tub este trecut de același detector, oferind o probă mai mare pentru
consistența eșantionului.
Fișierele de calibrare spectrală pot fi de asemenea recalibrate pentru a confirma că semnalele de
excitație de la
gama de fluorofori folosiți poate fi separată și reglarea setărilor. Analistii pot efectua o parte din
aceasta
calibrare, dar tehnicienii de service instruiți de furnizorul de echipamente vor fi obligați să c

2.4.2 Centrifuge
Centrifugele separate, inclusiv microfugurile, trebuie utilizate pentru procedurile pre și post-PCR.
Centrifugile trebuie să aibă capacități de viteză care să îndeplinească criteriile cerute în diferite
etape din ansamblu
metodă. Trebuie respectate instrucțiunile producătorilor de calibrare. Centrifuga trebuie să fie
echilibrat înainte de utilizare pentru a crește durata de viață a rulmentului și a minimiza vibrațiile
care pot tulbura concentratele.

2.4.3 Camere de electroforeză cu gel


Camerele trebuie inspectate înainte de fiecare utilizare pentru a se asigura că electrozii și
rezervoarele tampon sunt intacte și
că electrozii de alimentare se potrivesc perfect. Camerele de electroforeză cu gel trebuie clătite de
mai multe ori
apă după fiecare utilizare în camera de produse desemnată.

2.4.4 Surse de alimentare


Sursele de alimentare trebuie să furnizeze valori de tensiune și curent. Înainte de utilizare, trebuie
să verificați electrozii
asigurați-vă că se potrivesc perfect. Trebuie verificate cablurile electrice, cablurile electrodului și
conexiunile cablurilor
pentru rupturi, rupere, coroziune sau slăbire, și înlocuit dacă este necesar.

2.4.5 Aparate de hibridizare


Hibridizarea cu sonde oligonucleotide specifice secvenței țintă este o post-PCR obișnuită
etapa de confirmare a produsului. Hibridizările pot fi efectuate în mai multe tipuri diferite de
aparate,
cu toate acestea, cuptoarele de hibridizare sunt din ce în ce mai populare. Cuptoarele de hibridizare
ar trebui să vină
instrucțiuni detaliate ale producătorului privind curățarea și întreținerea de rutină a aparatului.
Întreținerea generală include curățarea incubatorului propriu-zis (interior, exterior și rotator) cu
apă distilată periodic, precum și când s-a produs vreun vărsat în interiorul unității (și în
conformitate cu
protocoale de eliminare a radiațiilor, dacă este cazul). De două ori pe an (sau în funcție de
producătorii
instrucțiuni), temperatura și viteza de rotație / balansare a cuptorului trebuie testate și unitatea
reparate, dacă valorile testate nu corespund valorilor înregistrate indicate pe unitate.
Trebuie să aveți grijă cu sticlele de hibridizare. Aceste sticle trebuie inspectate periodic pentru
jetoane și fisuri și pentru deteriorarea inelului O. Sticlele cernute sau crăpate ar trebui să fie
aruncat și înlocuit. Inelele O deteriorate sau deteriorate trebuie înlocuite imediat. Sticlele și
oringurile care intră în contact cu materialul radioactiv trebuie curățate complet de orice radiație înainte de
a fi
aruncată. De asemenea, aceste sticle trebuie curățate după fiecare utilizare, în conformitate cu
producătorii
specificațiile și în conformitate cu protocoalele de îndepărtare a radiațiilor (dacă este cazul).

2.4.6 Secvențiatori
Succesorii trebuie calibrați în conformitate cu recomandările producătorilor și toate calibrările
ar trebui să fie documentată. Pentru secvențieri care folosesc capilare, poate fi necesar să se
efectueze atât spațial, cât și
calibrări spectrale folosind standardele furnizate de producător. Calibrările trebuie efectuate la
frecvența specificată de producător și în conformitate cu instrucțiunile producătorilor. Dacă
secvențierul folosește blocuri de probă, blocurile trebuie curățate în mod regulat și verificate dacă
există fluorescență
contaminare. Performanța instrumentului ar trebui verificată în mod regulat, utilizând standardele
furnizate de către
producător. Întreținerea preventivă trebuie efectuată anual de către un tehnician calificat.

2.4.7 Hote cu flux laminar / dulapuri biologice de siguranță


Clasificarea și denumirea capotelor (capotelor) și a dulapurilor de siguranță biologice (dulapuri) nu
sunt
în concordanță între furnizori și utilizatorii de laborator ar trebui să acorde o atenție atentă
specificațiilor din
hota sau dulapul pentru a se asigura că este adecvat pentru utilizarea sa desemnată de laborator.
General
clasificările hotei și dulapurilor în sensul prezentului document sunt indicate în tabelul 2-1 și
text de mai jos.

Deși sunt disponibile mai multe tipuri de camere, multe pot să nu ofere contaminanți satisfăcătoare
îndepărtarea pentru prepararea reactivilor și a probelor pentru PCR. Hote cu flux laminar (listate și
de
furnizorii sub formă de „carcase” sau „camere”) asigură un aer mai curat decât aerul de laborator și
reduce cantitatea de aer
șansă de contaminare aeriană. Aceste hote oferă protecție împotriva contaminării exterioare
material în interiorul hotei, dar nu protejați lucrătorul sau mediul, decât dacă au un filtru
epuiza. Dulapurile de siguranță biologice (BSC) au un sistem de clasificare care variază de la clasa
I la clasă
III (33, 47). Dulapurile din clasa I au flux de aer interior și evacuare filtrată HEPA, care asigură un
caracter personal și
protecția mediului, dar nici o protecție a produsului. Clasa II și III BSC filtrează atât admisia de aer
cât și
eșapament și împiedicați contaminanții să intre și să părăsească capota (reducând probabilitatea
eșantionului
și contaminarea zonei de lucru). Laboratoarele care achiziționează BSC-uri din clasa a III-a ar
trebui să fie conștiente de faptul că au nevoie
un aport de aer mai mare decât dulapurile din clasa II. Acest lucru poate produce probleme cu
echilibrul de aer dacă hota este evacuată
într-un mediu exterior.
Pentru prepararea reactivului pot fi utilizate hote fără sistem de curgere a aerului sau cele cu intrare
de aer filtrată,
dacă sunt echipate cu lumini UV. Pentru toate celelalte scopuri, laboratoarele ar trebui să utilizeze
BSC-uri din clasa II sau III
cu lumini UV. Aceste tipuri de hote și dulapuri asigură un flux de aer laminar eficient pentru a
menține
contaminanții care intră în zona de lucru sau în laborator. Alte camere care nu au aceste calități
crește probabilitatea contaminării probelor. O alternativă la CSB recomandate este Fed 209
Cameră curată clasa 100, cu admisie de aer filtrată HEPA și lumină UV corespunzătoare din clasa
ISO.
Înainte de utilizare, hotele trebuie decontaminate folosind lumină UV timp de cel puțin 8 ore (14,
34) și curățate
înălbitor sau alt agent eficient de inactivare a acidului nucleic. După o deversare sau accident (vezi
Secțiunea 2.6 pentru
îndrumări privind curățarea), de asemenea, hote trebuie curățate cu agentul de inactivare a acidului
nucleic și apoi
decontaminat suplimentar folosind lumină UV. Fluxul de aer și filtrarea HEPA în toate hote ar
trebui să fie
monitorizate și certificate după recomandările producătorilor cel puțin anual.

2.4.8 Lumini ultraviolete


Amplasarea luminilor UV în hote este concepută pentru a reduce contaminarea cu acid nucleic și
biologic
prin acizi nucleici de legătură încrucișată (34). Cu toate acestea, trebuie menționat faptul că este
posibil ca UV să nu ofere un nivel adecvat
protecție împotriva contaminării pentru ampliconele PCR care sunt foarte scurte. Becul UV trebuie
șters
o cârpă umedă pentru a îndepărta praful în fiecare săptămână. Luminile UV ar trebui verificate
pentru pierderea intensității folosind o lumină UV
metru o dată pe lună și înlocuit după recomandările producătorilor.

2.4.9 Pipete
Datorită numeroaselor transferuri de volum mic implicate în metodele PCR, pipete automate,
volum fix,
ar trebui să fie utilizate reglaje, deplasare pozitivă și / sau micropipete și trebuie calibrate
trimestrial de către producător sau tehnician folosind sfaturile utilizate în mod obișnuit în laborator.
Ar trebui păstrată documentația cu privire la precizia micropipetei recalibrate. Înregistrări de
calibrare
trebuie păstrată în fișier în jurnalul de bord al laboratorului. Fiecare pipetă trebuie sterilizată
conform
recomandarea producătorilor în mod regulat sau ori de câte ori este suspectată contaminarea.
Calibrarea
din pipetă trebuie efectuată după sterilizare.
În cazul în care se suspectează o problemă de calibrare a micropipetei, laboratorul ar trebui să
tarate un vas de cântărire gol folosind
un bilanț analitic și pipetați următoarele volume de apă de reactiv în barca de cântărire folosind
pipeta în cauză: 100% din capacitatea maximă de distribuire a micropipetei, 50% din capacitate,
și 10% din capacitate (nu depășiți intervalul recomandat al pipetei). Zece replici ar trebui
se efectuează la fiecare greutate. Greutatea apei (presupunem că 1,00 ml de apă reactivă cântăresc
1,00
g) trebuie înregistrată și abaterea standard relativă (RSD) calculată pentru fiecare. Soldul utilizat
trebuie să aibă o precizie suficientă în intervalul care va fi utilizat pentru calibrare (de exemplu,
pentru 1-50 ul volume
echilibrul trebuie să poată cântări cu exactitate 0.0001g). Când se măsoară volume ultra-scăzute, o
umiditate
sursă sau alt dispozitiv trebuie utilizat pentru a preveni evaporarea.
Dacă greutatea apei reactivului se încadrează în limitele recomandate de producători folosind
sfaturi
utilizat frecvent în laborator, apoi pipeta rămâne acceptabilă pentru utilizare. Dacă greutatea
reactivului
apa este în afara limitelor acceptabile, trebuie consultat manualul de instrucțiuni pentru pipetă
determinați ajustările / acțiunile pot fi luate și calibrarea verificată din nou. Dacă
problemele cu pipeta persistă, laboratorul ar trebui să trimită pipeta producătorului pentru
recalibrare. De asemenea, se poate efectua calibrarea spectrofotometrică a pipetelor (1). Truse
pentru acest tip de
calibrarea sunt disponibile de la furnizorii comerciali.

2.4.10 Echipament dependent de temperatură


Termometrele trebuie amplasate în orice echipament pentru care temperatura este esențială pentru
a fi adecvată
performanța unui parametru implicat în metoda de testare sau manipularea reactivilor. Calibrarea
tuturor
termometrele trebuie verificate anual, la temperaturile utilizate, în raport cu un institut național de
referință
de termometru de Standarde și Tehnologie (NIST). Factorul de calibrare trebuie indicat pe
termometru. Laboratorul ar trebui să înregistreze data la care a fost calibrat termometrul și
calibrarea
factor în jurnalul de bord al QC. Dacă un termometru diferă cu mai mult de 1 ° C de termometrul
de referință, acesta
trebuie aruncat. (50). Termometrele de referință trebuie recalibrate la fiecare cinci ani și
factorul de calibrare notat pe termometru. Dacă termometrul de referință diferă cu mai mult de 1 °
C, acesta
trebuie aruncat.
Pentru echipamentele utilizate în analiza PCR, trebuie aplicate următoarele intervale de
temperatură:
• Incubatoare, băi de apă și blocuri de încălzire: ± 0,5 ° C din temperatura cerută de protocol
• Frigidere: 1 ° C până la 5 ° C
• Congelatoare de laborator standard: -20 ° C ± 5 ° C
• Congelatoare ultra-joase: -70 ° C ± 10 ° C
Temperaturile echipamentelor trebuie monitorizate și înregistrate cel puțin o dată pe zi pentru
fiecare zi lucrătoare
utilizare. În mod alternativ, temperaturile pot fi monitorizate continuu folosind un sistem de alarmă
bazat pe computer.
Important: congelatoarele „fără îngheț” nu trebuie utilizate. Fluctuațiile de temperatură duc la
reactive degradare.

Ar trebui să fie frigidere și congelatoare separate pentru eșantioane, reactivi și produse de


amplificare finale
întreținute în camera de laborator desemnată corespunzător. Produsul amplificat trebuie să fie
păstrat întotdeauna
un congelator separat de reactivi (cum ar fi amestecul principal), probe și concentrate de probă.

2.4.11 Spectrofotometre, Luminometre și Fluorimetre


Spectrofotometre, luminometre și fluorimetre sunt frecvent utilizate în metodele PCR pentru a
raporta
concentrații (40). Standardele de spectrofotometru urmărite de NIST pot fi achiziționate comercial
și
constau fie din filtre sau din diferite diluții ale dicromatului de potasiu sau ale ftalatului de
hidrogen de potasiu
(KHP) și filtre de oxid de holmiu. Calibrarea atât a lungimii de undă, cât și a transmisiei /
absorbanței poate fi
efectuate prin comparație cu aceste standarde. Detectoarele fluorescente trebuie calibrate la fiecare
trei până la șase
luni sau mai frecvent dacă este detectată o problemă. Calibrarea se realizează prin calibrare
spectrală
soluții necesare pentru stabilirea spectrelor de coloranți puri. Acești coloranți sunt de spectre
cunoscute și vin cu un
referință de normalizare. Plăcile și tuburile ușoare standard pot fi obținute de la producător pentru
calibrarea luminometrelor care permit reproducerea, sensibilitatea și liniaritatea luminometrului la
fi confirmat. Unele luminometre sunt echipate și cu protocoale de calibrare internă.

2.5 Materiale de unică folosință


Materialele de unică folosință utilizate în analiza PCR includ vârfuri de pipetă, tuburi de probă,
tuburi de PCR și mănuși. La
reduce contaminarea și degradarea acizilor nucleici țintă, materialele de unică folosință ar trebui să
se întâlnească
standardele discutate în secțiunile 2.5.1 până la 2.5.3.

2.5.1 Sfaturi pentru pipete


Sfaturile standard pentru pipete nu sunt adecvate pentru utilizarea PCR, din cauza posibilității de
contaminare transferat de la pipetă la probă sau invers. Furnizorii oferă sfaturi speciale pentru analiza PCR
care poate fi utilizat ca o alternativă la vârfurile și pipetele de deplasare pozitive.
Sfaturi speciale pentru analiza PCR includ vârfuri de barieră și vârfuri rezistente la aerosoli,
ambele reducând la minimum contaminarea încrucișată a probelor în timpul pipetării. Aceste sfaturi pot fi
achiziționate pre-sterilizate și pre-încărcate în rafturi cu balamale pentru a oferi vârful protecție și acces
facil.
Sfaturile pentru pipete pentru analizele PCR ar trebui să fie certificate în lot, fără RNase, fără
DNase, și fără pirogeni.

2.5.2 Tuburi de probă și PCR


Laboratoarele ar trebui să utilizeze tuburi de polipropilenă care sunt certificate DNase, fără RNază
și apirogen.
Dimensiunea și stilul tuburilor PCR sau plăcilor de reacție recomandate de producător pentru
termocicler trebuie selectat pentru a vă asigura că tuburile sunt compatibile cu înălțimea blocului și a
capacului. Cu pereții subțiri tuburile asigură cel mai bun transfer de căldură, asigurând că volumul de
reacție atinge temperatura specificată în cel mai scurt timp, îmbunătățind astfel specificitatea și
reproductibilitatea.
Tuburi care conțin depozitate eșantioanele și reactivii trebuie centrifugați scurt înainte de
deschidere pentru a se asigura că toate lichidele sunt la fundul tuburilor.

2.5.3 Mănuși
Mănuși de unică folosință ar trebui să fie disponibile în fiecare secțiune a laboratoarelor utilizate
pentru analiza PCR. mănuși
trebuie schimbat înainte de a părăsi și de a intra în fiecare secție a laboratorului și de fiecare dată
ADN contaminant este potențial întâlnit. Pe lângă reducerea contaminării potențiale din
eșantioanele, purtând mănuși pot proteja tehnicianul de expunerea chimică potențială și pot preveni
proba contaminarea datorată DNazelor umane și RNazei.

2.6 Curățare laborator


Toate suprafețele de lucru trebuie curățate după fiecare utilizare cu 0,6% hipoclorit de sodiu
(NaOCl). NaOCl
soluția trebuie preparată zilnic proaspăt prin diluarea înălbitorului comercial 1:10 în apă și
ajustarea pH-ului
la 7. Această soluție inactivează agenții patogeni și distruge acizii nucleici. Înălbitor rezidual, care
poate
pot fi îndepărtate cu blaturi și hote de inox, cu un tiosulfat de sodiu 0,1%
soluție și o clătire cu etanol 70% sau echivalent. Produse comerciale special concepute pentru
îndepărtarea acizilor nucleici și nucleazele pot fi de asemenea utilizate pentru curățarea
suprafețelor.
Termocicletele și centrifugele trebuie curățate cu soluția de albire diluată (vezi mai sus) ori de câte
ori
se suspectează contaminarea. Pipetele trebuie curățate conform instrucțiunilor producătorului.
Rack-uri
iar tăvile trebuie înmuiate în soluție de NaOCl 0,6% și clătite complet cu apă după fiecare utilizare.
Tăvile cu gel, piepteni cu gel și articole de sticlă utilizate pentru hibridizarea prin impunere ar
trebui să fie clătite cu apă sau ușor
detergent după fiecare utilizare.

SECȚIUNEA 3. REAGENȚI, KITURI, SETURI PRIMERE ȘI ENZIMI


Această secțiune abordează procedurile generale de control care ar trebui urmate atunci când
lucrați cu reactivi,
kituri, seturi de primer și enzime utilizate în analiza PCR. Indicații privind păstrarea evidenței
pentru reactivi, truse,
seturi de grund și enzime sunt furnizate în secțiunea 6.
3.1 Reactivi
Reactivii folosiți în amplificarea PCR pot fi achiziționate sau preparate în interior. Trebuie avut
grijă
asigurați-vă că reactivii nu sunt contaminanți. Toți reactivii trebuie să fie etichetați clar cu numele,
data de expirare și informațiile de siguranță relevante. Reactivi din diferite numere de loturi nu
trebuie să fie
schimbate fără validare funcțională prealabilă (vezi Secțiunea 3.1.1 până la 3.4).
Pentru toate analizele trebuie utilizată apă de calitate moleculară sau echivalentul acesteia din surse
comerciale.
Laboratoarele pot utiliza, de asemenea, sisteme de purificare a apei care produc pirogen și de înaltă
calitate
Apa fără DNase / RNase. Dacă un laborator utilizează un sistem de purificare a apei, acesta trebuie
instalat într-un
zonă fără acid nucleic (cum ar fi zona de preparare a reactivului) pentru a reduce posibilitatea
contaminării.
Tratamentul cu dietilpirocarbonat (DEPC) poate fi utilizat pentru a elimina RNaza din apa utilizată
în ARN
analiză. Adăugarea DEPC determină modificarea covalentă a nucleazelor (cum ar fi RNaza),
determinând
ei să-și piardă funcția. Apa de reactiv este tratată cu o soluție de 0,1% DEPC timp de câteva ore și
apoi se autoclavează pentru a degrada complet DEPC. Este necesară o autoclavare corectă,
deoarece cantitățile de urme
de DEPC într-o soluție va duce la modificarea reziduurilor de purină în ARN cu
carboximetilare. Aceasta duce la efecte în aval în experimentarea ARN (de exemplu, eliminarea
capacitatea revers transcriptazei de a lega ARN și de a sintetiza ADN-ul dintr-un șablon ARN) (3).
3.1.1 Pregătite comercial
Dacă este disponibil, toți reactivii trebuie să fie de calitate moleculară. Reactivii pregătiți
comercial trebuie depozitați
conform recomandărilor producătorilor. Toți reactivii din loturile noi trebuie testate pentru a se
asigura
că funcționează în mod corespunzător, utilizând un nou control reactiv PCR (Secțiunea 5.1.1).
Dacă
Controlul pozitiv al PCR nu reușește, loturile noi trebuie testate pe loturile vechi.

3.1.2 Pregătite în casă


Pentru fiecare tip de reactiv preparat în laborator, ar trebui elaborate criterii pentru datele de
expirare,
acceptabilitate funcțională și condiții de păstrare folosind fișe de produse din produse comerciale
similare ca.
orientare. Criteriile trebuie documentate într-un POS de laborator. Amestecurile trebuie utilizate
cel târziu
data de expirare a uneia dintre componente. Tampoanele trebuie inspectate pentru precipitații sau
contaminarea microbiană înainte de fiecare utilizare.
3.2 Truse disponibile comercial
Multe tipuri de kituri comerciale sunt disponibile pentru aplicațiile PCR. Aceste produse
accelerează și simplifică
proceduri, cum ar fi izolarea ADN și ARN și purificarea acizilor nucleici pentru a elimina
contaminanți. O copie a specificațiilor și a procedurilor producătorilor trebuie să fie păstrată în
document
liantul SOP al laboratorului pentru fiecare kit disponibil în comerț utilizat în laborator. Eficiența
kiturilor trebuie evaluată înainte de utilizare pentru analiza eșantioanelor de teren, utilizând o metodă
adecvată
control pozitiv (vezi pct. 5.1).
3.3 Seturi de grund și sonde de hibridizare
Analizele PCR necesită utilizarea unor segmente scurte de ADN sintetizat chimic (care se numesc
oligonucleotide sau, mai frecvent, „oligo”). Seturile de grund sunt oligo cu secvențe de nucleotide
care sunt
proiectat special pentru a amplifica amplificarea unei porțiuni a unui acid nucleic de interes.
Sondele de hibridizare sunt oligo cu secvențe specifice de nucleotide care sunt interne secvențelor
de
primerii și care sunt folosiți pentru a confirma amplificarea țintei. Îndrumări privind proiectarea
primerii și sondele sunt prezentate în secțiunea 4.3.3. Grunduri și sonde, care conțin o secvență
specifică de
nucleotide, pot fi obținute de la un furnizor comercial sau pot fi preparate în casă, dacă este cazul
echipament este disponibil.
3.3.1 Certificarea analizei
Grundurile și sondele trebuie să fie libere de alte secvențe și enzime contaminante. Oligoții impuri
vor
scade specificul procedurii. Certificarea calității oligoților, inclusiv metoda de
purificarea, puritatea și concentrarea ar trebui să fie solicitate de la toți producătorii comerciali.
Puritatea poate fi evaluată prin HPLC sau prin separarea pe un gel de acrilamidă cu concentrație
adecvată (24).
Toate loturile noi de oligo trebuie verificate pentru a fi contaminate prin utilizarea într-un control
negativ PCR
(Secțiunea 5.2.1). Nu trebuie găsite rezultate pozitive. Amorsele și sondele trebuie adăugate la
PCR
amestecul principal în zona de preparare a reactivilor.
Validarea funcțională ar trebui, de asemenea, să fie efectuată pe loturi noi de primer și sonde prin
compararea lor
performanță față de seturi mai vechi de calitate cunoscută (31). Noii oligoți ar trebui respinși sau
concentrarea ajustată, dacă performanța este semnificativ diferită de lotul dovedit. Când PCR în
timp real
se utilizează, validarea seturilor noi se poate face prin compararea eficienței PCR a seturilor vechi
și noi.
Eficiența PCR (E) se calculează pe panta unei curbe standard (S) folosind formula, E = 10-1 / S-1
(36). Probele utilizate pentru generarea curbelor standard trebuie să fie diluate cu grijă ale unui
stoc
soluție conținând un număr cunoscut de acizi nucleici șablon purificați PCR sau acizi nucleici
totali
extras din organismul țintă. O eficiență PCR de 1 (sau 100%) este obținută la fiecare țintă
secvența prezentă în reacția PCR se dublează în timpul fiecărei runde de amplificare. O eficiență
ridicată este
necesare pentru a obține rezultate exacte și reproductibile. O eficiență scăzută indică faptul că
primerii și / sau sondele
performează slab. Nici o eficiență unică (în procente) nu a fost stabilită ca limită pentru a fi date
acceptabil, deși 80% sau mai mare este o normă acceptată.

3.3.2 Depozitare
Majoritatea oligoșilor și șabloanelor ADN trebuie păstrate la -20 ° C sau -70 ° C în orice tampon
TE (10 mM Tris-HCl
și 0,1mM EDTA, pH 8,0) sau apă de grad molecular. Produsele PCR pot fi de asemenea depozitate
la -20 ° C sau -
70 ° C. Șabloanele ARN trebuie alicotate și stocate la -70 ° C. În general, este preferat tamponul
TE
tampon de stocare pentru oligo și șabloane ADN, deoarece poate preveni degradarea ADN-ului,
apa de grad molecular poate fi mai potrivită pentru anumite scopuri, cum ar fi luarea
spectrofotometrică
lecturi. Oligoii concentrați puri trebuie depozitați în tubul original de la producător și
etichetate cu numele primerului și concentrația. Pentru a reduce riscul de contaminare și
degradare, aceste stocuri concentrate nu ar trebui utilizate în mod regulat. Stocuri de lucru diluate
ar trebui să fie făcute pentru fiecare oligo și aceste stocuri de lucru ar trebui utilizate pentru toate
experimentele. Inainte de folosire,
oligoii trebuie dezghețați și amestecați complet. Laboratoarele trebuie să stabilească datele de
expirare ale unuia
an pentru primerii și sondele sau verificați sensibilitatea lor când au un an și apoi în mod obișnuit
bază pentru a vedea dacă s-a produs o degradare. Sensibilitatea primerilor poate fi verificată
folosind un PCR

3.3.2 Depozitare
Majoritatea oligoșilor și șabloanelor ADN trebuie păstrate la -20 ° C sau -70 ° C în orice tampon
TE (10 mM Tris-HCl și 0,1mM EDTA, pH 8,0) sau apă de grad molecular. Produsele PCR pot fi de
asemenea depozitate la -20 ° C sau -
70 ° C. Șabloanele ARN trebuie alicotate și stocate la -70 ° C. În general, este preferat tamponul
TE
tampon de stocare pentru oligo și șabloane ADN, deoarece poate preveni degradarea ADN-ului,
apa de grad molecular poate fi mai potrivită pentru anumite scopuri, cum ar fi luarea
spectrofotometrică
lecturi. Oligoii concentrați puri trebuie depozitați în tubul original de la producător și
etichetate cu numele primerului și concentrația. Pentru a reduce riscul de contaminare și
degradare, aceste stocuri concentrate nu ar trebui utilizate în mod regulat. Stocuri de lucru diluate
ar trebui să fie făcute pentru fiecare oligo și aceste stocuri de lucru ar trebui utilizate pentru toate
experimentele. Inainte de folosire,
oligoii trebuie dezghețați și amestecați complet. Laboratoarele trebuie să stabilească datele de
expirare ale unuia
an pentru primerii și sondele sau verificați sensibilitatea lor când au un an și apoi în mod obișnuit
bază pentru a vedea dacă s-a produs o degradare. Sensibilitatea primerilor poate fi verificată
folosind un control pozitiv PCR utilizând primerii vechi și noi, așa cum este descris în secțiunea 5.1.1.
Sensibilitatea sondelor
poate fi verificat prin compararea sondelor vechi și noi folosind o tehnică de blotare, așa cum este
descris în secțiunea
4.4.2. În mod alternativ, puritatea primerilor vechi poate fi verificată folosind HPLC sau gel de
poliacrilimidă
electroforeză (PAGINA). Dacă s-a produs degradarea, ar trebui să fie pregătiți noi grunduri și
sonde.
3.4 Enzime
Deoarece enzima este adevărata mașină a tuturor procedurilor PCR, enzimele ar trebui să fie
achiziționate de la un
sursă comercială pentru a asigura puritatea. Laboratoarele ar trebui să selecteze furnizorii care
furnizează informații de calitate
enzimele.
3.4.1 Calitate
Producătorul de enzime trebuie să furnizeze documentații privind controlul calității care a fost
efectuat
pentru a asigura puritatea enzimei Informații despre caracteristicile minime ale activității și
condițiile de la
care ar trebui să fie furnizate aceste caracteristici. Această documentație trebuie să fie stocată în
jurnal de enzime pe lângă toate celelalte informații pertinente.
După primirea din surse comerciale, fiecare lot nou de enzimă trebuie comparat cu loturile vechi
folosind
controale cunoscute și probe de mediu (31). Noile enzime trebuie respinse sau
concentrarea ajustată, dacă performanța este semnificativ sub cea a lotului dovedit.
Important: analistul trebuie să aibă un singur recipient deschis la un moment dat când lucrează cu
enzime.
Vârfurile pipetelor trebuie aruncate după fiecare distribuție pentru a preveni contaminarea
încrucișată.
3.4.2 Depozitare
Instrucțiunile producătorilor privind stocarea și utilizarea enzimei trebuie urmate cu atenție.
enzimele
de obicei sunt păstrate la -20 ° C și nu trebuie lăsate niciodată la temperatura camerei în laborator.
Izolat
Racitoarele de bază sau gheața pot fi utilizate pentru a menține rece enzima în laborator, atunci
când sunt utilizate pe bancă
top.
Important: congelatoarele „fără îngheț” nu trebuie utilizate. Fluctuațiile de temperatură duc la
reactiv
degradare.
SECȚIUNEA 4. DEZVOLTAREA ȘI EVALUAREA METODEI
Atunci când dezvoltă o nouă metodă PCR, laboratoarele ar trebui să proiecteze și să selecteze
componentele individuale ale acestora
metoda, inclusiv izolarea acidului nucleic și analiza PCR, pentru a optimiza capacitatea metodei
recuperați și detectați analitul țintă. De asemenea, laboratorul ar trebui să ia în considerare modul
în care se vor recolta probe
și prelucrate pentru metodă și evaluați performanța componentelor individuale ale metodei și
întregul proces analitic înainte de a utiliza metoda pentru analizele de probe de mediu.
Următoarele îndrumări privind elaborarea și evaluarea metodelor sunt furnizate în această secțiune:
• Componentele majore care trebuie luate în considerare la dezvoltarea unei metode PCR pentru
mediu
monitorizare (Secțiunea 4.1 - 4.4)
• Determinarea sensibilității și preciziei metodei (Secțiunea 4.5)
• Factorii care trebuie luați în considerare pentru validarea unei metode după ce a fost dezvoltată și
evaluat intern (Secțiunea 4.6)
4.1 Colectarea și prelucrarea probelor de mediu
Condițiile de colectare și transport a eșantioanelor au impact asupra rezultatelor analizei PCR.
Laboratoarele ar trebui
dezvoltați un SOP de eșantionare și procesare detaliată pentru fiecare nouă metodă. SOP ar trebui
să definească intervalul
a volumelor de probe acceptabile, a protocoalelor de manipulare a probelor și a probelor de timp
pot fi păstrate înainte
începerea procesării eșantionului. De asemenea, ar trebui să descrie utilizarea, curățarea și
sterilizarea oricărei probe
aparat. Procedurile descrise în POS ar trebui să fie concepute pentru a păstra integritatea țintei
secvență de acid nucleic în proba de mediu. Poate fi necesar să se testeze probe însămânțate și
urmați recuperarea lor așa cum este descris în secțiunea 4.5 pentru a dezvolta aceste proceduri.
Componenta de procesare a probelor dintr-o metodă PCR de mediu este realizată pentru a izola
organismul
sau acid nucleic de interes din matricea mediului, reducând în același timp co-purificarea
potențialului
contaminanți și componente ale matricei care pot inhiba PCR. Procedura de izolare ar trebui de
asemenea
stabilizează acidul nucleic țintă de la nucleaze și reduce eșantionul la un volum suficient de mic
pentru a fi
analizat prin PCR. Controale pozitive care demonstrează că organismul țintă sau acidul nucleic a
fost
izolat cu succes și că inhibitorii PCR au fost îndepărtați sunt discutați în secțiunea 5.
4.2 Izolarea acidului nucleic
Unele metode necesită liza organismului țintă și izolarea acidului nucleic anterior
procedând la PCR. Dacă acizii nucleici ai organismului sunt izolați înainte de adăugarea la PCR,
performanța acestei părți a metodei ar trebui, de asemenea, să fie evaluată independent și ca parte a
întregii
proces analitic.
Eficiența izolării acidului nucleic variază în funcție de tipul eșantionului și de procedura de
extracție. În mod ideal, un
tehnica de izolare trebuie să îndeplinească următoarele obiective:
• Demonstrează o eficiență ridicată a recuperării acidului nucleic țintă
• Mențineți integritatea acidului nucleic și minimizați fragmentarea
• Furnizați acid nucleic suficient de pur, fără inhibitori de PCR
• Reduceți la minimum utilizarea substanțelor chimice periculoase
• Fii repetabil
4.3 Amplificarea reacției în lanț a polimerazei
Când se dezvoltă metode de analiză a probelor de mediu folosind PCR, primul pas este selectarea
tipul de PCR care este cel mai potrivit pentru analiza efectuată. Performanța PCR
etapa de amplificare trebuie evaluată mai întâi separat, apoi ca parte a întregii metode analitice. Un
lat
o varietate de tehnici PCR și reactivi sunt disponibili pentru utilizare cu probe de mediu. Aspecte
care
ar trebui să fie luate în considerare în selecția tehnicii corespunzătoare include tip PCR, tip enzimă,
primer
și proiectarea sondei și parametrii de reacție, cum ar fi temperaturile ciclului termic și reactivul
Concentrațiile. Acești factori sunt descriși mai jos, în secțiunile 4.3.1 până la 4.3.4.
4.3.1 Tip PCR
De la înființarea sa în 1985, PCR a fost adaptat pentru a se potrivi cu multe aplicații diferite,
inclusiv detectarea
ADN-ului specific, secvențiere de întinderi de ADN, amplificare directă din colonii bacteriene și
amplificarea și detectarea ARNm-urilor, ARN-urilor ribozomale (ARN) și ARN-urilor virale după
utilizarea inversă
transcriptază pentru a face copii ADN ale șabloanelor ARN. Astfel, există multe tipuri diferite de
PCR care
pot fi utilizate și fiecare este unică pentru aplicația pentru care a fost proiectată. Utilizarea unui
inadecvat
tip ar putea compromite eficacitatea unei metode bazate pe PCR. De exemplu, utilizarea PCR
cuibărit pe
o secvență țintă care nu necesită amplificare secundară poate duce la o creștere inutilă a
potențialul de contaminare din cauza rundei suplimentare de amplificare. Există cinci comune
proiecte sau tipuri de PCR utilizate în analiza probelor de mediu: PCR convențional, multiplex
PCR, transcriere inversă (RT) -PCR, PCR în timp real și PCR cuibărit, fiecare dintre acestea fiind
descrise
de mai jos. Tabelul 4-1 descrie unele dintre aplicații, avantaje și dezavantaje ale acestor comune
tipuri.

4.3.1.1 PCR convențional


PCR convențională utilizează o ADN polimerază termostabilă pentru a amplifica o regiune a
ADN-ului țintă definit la
fiecare capăt printr-un primer specific. Replicarea exponențială a aceleiași secvențe țintă produce
suficient
Produs ADN sau ampliconi pentru utilizare în analizele ulterioare. PCR constă de obicei din trei
etape de bază:
• În prima etapă, denaturarea, proba este încălzită pentru a separa sau denatura cele două fire
ADN-ul. Aceasta se realizează, de obicei, la temperaturi cuprinse între 94 ° C și 97 ° C timp de 15
până la 60 de secunde.
• Denaturarea este urmată de etapa de recoacere, în care temperatura de reacție este scăzută
permițând primerii oligonucleotide să se lege cu catenele unice separate ale nucleului șablon
acid. Aceasta se realizează de obicei la temperaturi cuprinse între 47 ° C și 60 ° C timp de 30 până
la 60 de secunde.
• Ultima etapă este alungirea, în timpul căreia temperatura este ridicată, de obicei la 72 ° C,
permițând
enzime specifice pentru a face o copie complementară a șablonului. Lungimea pasului de alungire
(30 de secunde până la trei minute) este determinată de viteza enzimei, capacitatea acesteia de a
continua
deplasându-se în jos ADN-ul șablon (adică, procesivitate) și lungimea segmentului ADN care
urmează să fie
amplificat.
O repetare sau ciclu termic din aceste trei etape dublează teoretic cantitatea de ADN prezent
reactia. Numărul de repetări necesare pentru o aplicație PCR este determinat de cantitatea de
ADN-ul prezent la începutul reacției și numărul de copii amplicon dorite pentru post-PCR
aplicații. De obicei se efectuează 25 până la 40 de cicluri. (10)
În figura 4-1 este prezentată o reprezentare schematică a evenimentelor care au loc la diferite
temperaturi.
În mod normal, PCR convențional nu este un test cantitativ. Cu toate acestea, este posibilă
generarea cantitativă
rezultate folosind cele mai probabile numere (MPN) sau abordări competitive PCR. Abordarea
MPN este
efectuat prin diluarea serială a unei probe până la limita de detecție a acesteia (vezi Secțiunea 4.5).
Cinci sau mai multe replici sunt
alergați de la fiecare diluție, iar valoarea MPN este determinată folosind un calculator MPN (un
calculator gratuit este
disponibil pe www.epa.gov/microbes). Prin abordarea competitivă a PCR, se realizează un
standard intern
clonarea unei versiuni modificate a ampliconului. Versiunea modificată conține de obicei o mică
ștergere sau
inserție, care produce un produs de lungime diferită și conține adesea o sondă de hibridare
alternativă
secvență de recunoaștere care permite diferențierea produsului de ampliconul normal prin sondă
hibridizare. După preparare, clona modificată este purificată, cuantificată prin spectrofotometrie și
serios diluat. Se amestecă mostrele care conțin acizii nucleici vizați cu care se vor cuantifica
diferite concentrații ale clonei, iar amestecurile sunt amplificate prin PCR. Produsele sunt apoi
rulate pe un
gel și vizualizat prin colorare. Se presupune că concentrația acidului nucleic țintă din eșantion
să fie egală cu numărul copiilor clonului din reacția care produce cantități egale de clonă și
ținta. În această metodă, este important să vă asigurați că secvențele clonă și țintă sunt amplificate
la
aceeași rată. Acest lucru poate fi facilitat prin minimizarea diferențelor de secvență și dimensiune
între țintă
amplicon și clona.
RT-PCR competitiv poate fi, de asemenea, efectuat, dar în acest caz este necesar mai întâi să
genereze și să cuantifice
o transcriere ARN a clonei. Cuantificarea precisă a transcrierii poate fi dificilă din cauza ARN
degradare și din cauza prezenței clonei utilizate pentru a genera transcrierea chiar și după DNază
tratament. Transcripții de lungimi variabile pot fi, de asemenea, generate, ceea ce face mai dificilă
corelarea
citire spectrofotometrică cu numărul de copie adevărat. Prin urmare, rezultatele unui RT-PCR
competitiv
fi interpretat cu prudență.

4.3.1.2 PCR în timp real


PCR în timp real este numit astfel, deoarece detectează și măsoară amplificarea acizilor nucleici
vizați ca
ele sunt produse. PCR în timp real necesită utilizarea primerilor similare cu cele utilizate în PCR
convenționale.
Cu toate acestea, spre deosebire de PCR convențional, PCR în timp real folosește o sondă
oligonucleotidică marcată cu fluorescent
coloranți sau o chimie alternativă de detecție fluorescentă (vezi mai jos) și un termociclu echipat
cu
capacitatea de a măsura fluorescența. De obicei, legarea unei sonde marcate cu colorant la secvența
șabloanelor
determină creșterea fluorescenței în proporție directă cu concentrația produsului PCR care se
formează.
Un computer este utilizat pentru a monitoriza creșterea fluorescenței și pentru a calcula un prag de
ciclu (CT)
) valoare. Acest
valoare, care reprezintă primul ciclu în care există o creștere detectabilă a fluorescenței deasupra
valorii
nivel de fundal, este utilizat pentru a măsura cantitățile de țintă relative sau absolute. În lipsa unui
absolut
standard, numărul de copii de pornire a țintelor de acid nucleic (sau numărul de organisme țintă) de
la diferite
probele pot fi determinate într-un sens relativ (de exemplu, eșantionul unu are de 20 de ori mai
multe organisme țintă decât
proba a doua). Dacă un standard absolut, care conține cantități cunoscute de acid nucleic țintă sau
organismul și care determină concentrațiile găsite în eșantioanele de testare este generată pentru a
genera o curbă standard,
se poate estima numărul de copie de pornire în eșantioanele de testare. (8, 46)
PCR-ul în timp real diferă, de asemenea, de PCR-ul convențional, prin faptul că selecția țintă
pentru PCR în timp real este mai mare
restricționat datorită cerințelor unui fragment țintă mai mic și nevoii de a selecta sonde cu o
valoare mai mare
temperatura de topire decât primerii pentru a se asigura că sonda este complet hibridizată în timpul
extinderii primerului.
În plus, temperaturile de recoacere și alungire sunt de obicei combinate într-un proces PCR în două
etape
care se efectuează la o temperatură intermediară (de exemplu, 60 ° C) timp de una până la două
minute.

Există mai multe chimicale de detecție fluorescentă diferite utilizate pentru PCR în timp real,
inclusiv
ca urmare a:
• Sondele de oligonucleotide fluorogene cu etichetă dublă sunt utilizate cel mai frecvent. Aceste
sonde (de exemplu,
TaqMan®
sonde) au un colorant fluorescent raportor la capătul 5 'și un colorant întins la capătul 3'.
sondele sunt adăugate la amestecul principal PCR împreună cu primerii PCR. În timpul PCR, dacă
ținta
secvența este prezentă, sonda se anexează în aval de un situs primar și este scindată de nuclează 5 '
activitatea ADN polimerazei Taq în timpul polimerizării (formarea produsului PCR). Această
clivaj
eliberează colorantul reporter din sondă și se îndepărtează de colorantul întins, rezultând
fluorescență
care este detectat de instrument. Atât activitățile de polimerizare cât și 5 'nuclează ale Taq
polimeraza sunt utilizate în acest proces.
• Sondele de transfer de energie prin rezonanță fluorescentă (FRET) implică hibridizarea a două
sonde la
secvențe adiacente în cadrul produsului amplificat. Sonda din amonte are un colorant fluorescent la
3'
capătul și sonda adiacentă are un colorant fluorescent la capătul de 5 '. Hibridizarea corectă a
acestor sonde
aduce cei doi coloranți în apropiere. Laserul excită primul colorant fluorescent, care emite lumină
la o lungime de undă diferită. Această lumină excită apoi cel de-al doilea colorant fluorescent de
către FRET între
sonde adiacente. Mașina PCR în timp real detectează lungimea de undă a luminii emise de al
doilea
colorant fluorescent.
• Sondele de baliză moleculară utilizează o variație a aceluiași procedeu, în care coloranții reporter
și zimțitori
sunt ținute împreună de o structură de ac de păr în sonde, dar devin suficient separate de
liniarizarea sondei după garnitură cu șablonul pentru a permite raportorului să coloreze
fluorescența
fi detectat.
• SYBR®
Green I, un colorant fluorescent, este o altă chimie de detecție în timp real folosită frecvent. Cand
acest colorant se intercalează în ADN dublu-catenar, inclusiv produse PCR, fluorescența acestuia
crește
foarte mult, iar această creștere poate fi detectată de termocicletele PCR în timp real. Deoarece
această detectare
chimia nu este specifică secvenței țintă, este mai versatilă decât detectarea bazată pe sondă, ci este
sensibile la falsuri pozitive datorate formării de produse PCR nespecifice sau dimer-primer.
Analizele curbei de topire (secțiunea 4.4.5) sunt adesea folosite ca confirmare suplimentară a
produsului
proceduri folosind SYBR®
Verde.
4.3.1.3 PCR multiplex
Multiplex PCR este o modificare a PCR convențională sau în timp real în care două sau mai multe
PCR diferite
produsele sunt amplificate în cadrul aceleiași reacții. Acest tip de PCR constă în aceiași pași ca și
PCR convențional, cu excepția faptului că se utilizează mai multe seturi de primer în fiecare
reacție. Multiplex PCR necesită
mai puțin timp și efort în amplificarea mai multor șabloane sau regiuni țintă decât reacțiile
individuale și pot
fi un test de screening util. (28)
În timp ce multiplex PCR oferă un potențial economisire de timp, permițând detectarea simultană a
mai multor
ținte, este necesară o optimizare semnificativă pentru a obține toate produsele cu o eficiență egală
și
sensibilitate (vezi Secțiunea 4.5). Trebuie luate o precauție suplimentară pentru proiectarea
primerilor care nu au efecte adverse
interacțiuni cu primer (vezi Secțiunea 4.3.3). Trebuie să fie cele mai bune raporturi de concentrație
ale diferitelor seturi de primer
hotărât cu atenție. Chiar și cu precauție și optimizare suplimentară (16, 26), amplificarea țintelor
nespecifice și sensibilitatea redusă pentru unele seturi de grund pot fi problematice (24, 28). Optimizarea
PCR este discutat în secțiunea 4.3.4.

4.3.1.4 Transcriere inversă (RT) -PCR


RT-PCR este utilizat pentru a amplifica secvențele țintă ARN (8), cum ar fi ARN-ul mesager și
genomul ARN viral.
Acest tip de PCR implică o incubare inițială a eșantionului de mediu sau ARN de control cu a
enzimă inversă transcriptază și un primer ADN. Primeri de ADN care sunt folosiți în mod obișnuit
includ oligo dT (un oligo format din reziduuri de timidină), hexameri aleatori (primerii din șase aleatori
nucleotide) sau un primer specific. Oligos dT se hibridizează cu coada poli-A de mesager și sigur
ARN virale și ADN prim din capătul 3 'al moleculei ARN. Este posibil ca această abordare să nu
fie adecvată
amplificarea segmentelor ARN în apropierea capătului 5'al moleculei. Hexamerele aleatorii
funcționează cu orice ARN,
dar necesită o incubație inițială suplimentară la 25 ° C. Primeri specifici pot fi fie primer PCR care
hibridizează la ARN în partea de 3 'a regiunii de amplificare sau un primer care hibridizează în
continuare
în aval de primerii PCR. Inhibitorii RNazei trebuie adăugați la reacțiile de RT pentru a preveni
degradarea secvenței țintă ARN de RNază prezentă în eșantion sau introdusă sub formă de
contaminare.
Transcrierea inversă și amplificarea PCR pot fi realizate într-un proces în două sau două etape. În
general, procesul în două etape este mai sensibil, în timp ce reacțiile cu o singură etapă sunt mai
puțin susceptibile să fie
contaminat, deoarece tubul nu este deschis după transcrierea inversă. Determinarea care
procesul trebuie utilizat depinde de nivelul de sensibilitate necesar și de probabilitatea
contaminării.
Există multe tipuri de transcriptază inversă disponibile pentru RT-PCR. Caracteristicile enzimelor
faceți unele mai potrivite pentru reacții cu un pas sau în două etape și alte aplicații din aval. niste
caracteristicile enzimelor care afectează tipul de transcriptază inversă utilizat pentru RT-PCR
includ: prezența
sau absența activității RNazei H care degradează ARN-ul într-un ARN: hibrid de ADNc,
procesivitatea enzimei,
cerințe ionice divalente, specificitate și sensibilitate, capacitatea de a încorpora dUTP pentru
reportarea UNG
contaminarea (vezi pct. 5.5.1) și temperatura optimă pentru funcționare. (7)
4.3.1.5 PCR cuibărit
Pentru analiza eșantioanelor de mediu cu populații microbiene complexe, este posibil să nu fie
PCR convențional
prezintă suficientă specificitate sau sensibilitate pentru anumite secvențe țintă și organisme.
Specificitate redusă
poate duce la falsuri pozitive dacă sunt fragmente nespecifice care au aceeași dimensiune cu
produsul de interes
amplificat. Sensibilitatea redusă poate provoca fals-negative, dacă eșantionul analizat conține
reziduale
inhibitori care reduc numărul de ampliconi la niveluri care nu pot fi detectate. Pentru a le minimiza
probleme, PCR cuibărit sau semi-cuib au fost utilizate pentru a crește specificitatea și sensibilitatea
țintei
detectarea secvenței (51).
PCR cuibărit este un PCR convențional cu o a doua rundă de amplificare folosind un alt set de
grunduri.
Acest al doilea set de primer este specific unei secvențe găsite în ADN-ul PCR-ului convențional
inițial
amplimerul. Utilizarea unei a doua etape de amplificare cu setul de grund „imbricat” are ca rezultat
reducerea
fundal de produse amplificate în timpul PCR inițială datorită primerilor cuiburi suplimentare
specific pentru regiune. Cantitatea de amplicon produsă este crescută ca urmare a celei de-a doua
runde
amplificare și datorită reducerii concentrațiilor de inhibitori. Prezența a doua așteptată
Ampliconul PCR este de obicei privit ca o confirmare a prezenței organismului țintă într-un
eșantion.
Folosite corect, mai multe runde de PCR cuibărit ar trebui să crească atât sensibilitatea cât și
specificitatea
PCR. Cu toate acestea, există o șansă crescută de transfer sau contaminare încrucișată atunci când
luați produsul
din prima rundă a PCR și punerea lui în tuburi pentru a doua rundă a PCR. Pași suplimentari și
ar putea fi necesar să fie luate măsuri de precauție pentru a reduce riscul de contaminare a
eșantionului și fals-pozitiv,
inclusiv următoarele:
• Nu deschideți niciodată mai mult de un tub simultan
• Utilizarea unui termocicler separat pentru prima și a doua amplificare
•Adăugarea de controale negative suplimentare peste cele recomandate în secțiunea 5.2.1.
Adițional oalele trebuie intercalate cu tuburi care conțin probe
• Includerea controalelor negative din prima rundă în a doua rundă de amplificare pentru a verifica
existența falsurilor pozitive
• Desemnarea unei a patra încăperi sau a unei zone separate pentru pregătirea probei după prima
amplificare

4.3.2 Tip enzimă


ADN polimeraza Taq, care este izolată de bacteria termofilă Thermus aquaticus, este
enzimă primară folosită în amplificarea ADN-ului în aproape toate procedurile. Modificări ale
acestei enzime
sau alte ADN polimeraze cu funcții specifice și proprietăți unice, inclusiv extindere diferită
rate, procesivitate (capacitatea ADN-polimerazei de a amplifica secțiuni mai lungi de ADN), mai
mare
abilitatea de corectare și toleranțe diferite de temperatură, exprimate în general ca timp de
înjumătățire la
temperatura de denaturare, poate fi mai potrivită pentru unele aplicații PCR. ADN-polimeraze la
pornire la cald
sunt de asemenea utilizate frecvent. Aceste enzime sunt inactive până la atingerea unei temperaturi
specificate (de obicei
mai mare decât temperaturile de recoacere ale primerilor; vezi Secțiunea 5.5.1.3). Utilizarea
enzimelor de pornire la cald reduce
producerea de produse nespecifice prin prevenirea alungirii primerilor care au nespecific
anexat la șablon la temperaturi mai scăzute de recoacere (care se poate întâmpla în timpul
amestecului principal
pregătire sau în prima etapă a ciclului PCR).
Atunci când selectează un tip de enzimă pentru o metodă sau studiu, analistul trebuie să evalueze
diferitele puncte forte
și slăbiciunile ADN polimerazelor disponibile pentru a determina care polimerază individuală sau
combinație de polimeraze, va funcționa cu acidul nucleic șablon. Înainte de a comuta producătorul,
tipul de enzimă sau numărul lotului, eficacitatea noii enzime ar trebui să fie testată în funcție de
enzimă
folosit inițial pentru validarea PCR folosind atât QC și probe de mediu, cât și rezultatele
documentate.
4.3.3 Designul și specificitatea grundului și sondei
Proiectarea și selecția setului de amorsare și sondă specifice care vor fi utilizate pentru un
experiment se bazează pe
aplicația, tipul de PCR și hibridizarea care va fi efectuată și segmentul țintei
secvență de acid nucleic care este cunoscută. Grundurile trebuie concepute pentru a amplifica doar
ADN-ul sau ARN-ul
interes. De regulă generală, primerii se caracterizează prin următoarele:
• Lungimea de 18 până la 27 de perechi de baze
• Nu există omologie în interior sau între primer, în special la 3'end pentru a evita formarea primer-
dimer
• Nici o guanină-citozină (GC) nu se întinde mai mult de patru perechi de baze
• Conținut GC de 40% la 70%
• Temperaturile de topire (Tm) cât mai aproape
• Nu are bucle de păr cu o energie de -0,5 kcal / mol sau mai puțin
O varietate de programe de calculator sunt disponibile pentru a ajuta la crearea celor mai bune
primeruri posibile și
sonde. De asemenea, aceste programe pot ajuta la determinarea temperaturii optime de recoacere
pentru nou-creat
oligo și verificați formarea dimerelor intra și intermoleculare și a buclelor de păr. laboratoare
ar trebui să ia în considerare repetarea procesului de proiectare cu mai multe programe de
computer, deoarece acestea
programele reprezintă un mediu simulat care poate să nu includă toate variabilele care afectează
designul oligo.
Pentru laboratoarele care efectuează PCR în timp real, software-ul este furnizat cu PCR în timp
real
instrumentul poate fi utilizat pentru proiectarea grundului. Ar trebui să se testeze întotdeauna
primerii și sondele noi
pentru sensibilitate experimentală descrisă în secțiunea 4.5 și specificitate înainte de utilizare în
orice metodă (10,
22).
Specificitatea unei secvențe alese trebuie evaluată folosind BLAST (Basic Local Alignment
Search)
Instrument) (32) sau echivalentul său. Versiunile de BLAST sunt disponibile pe WEB la o serie de
site-uri, inclusiv
www.ncbi.nlm.nih.gov și www.embl-heidelberg.de. BLAST compară secvențele de oligo
proiectate cu
baze de date cunoscute de acid nucleic precum GenBank și EMBL. Căutarea determină potențialul
hibridizarea oligiei alese cu secvențe din alte organisme.

Rezultatele acestei căutări ar trebui utilizate pentru a defini orice secvențe relevante, strâns
potrivite pentru testarea specificității. Testarea specificității trebuie
se efectuează așa cum este descris pentru controlul pozitiv al PCR (secțiunea 5.1.1) prin
substituirea heterologului
eșantion în locul organismului țintă sau acid nucleic. Grundurile și / sau sondele ar trebui să fie
reproiectate dacă există
proba heterologă este pozitivă.
Nu este întotdeauna posibilă proiectarea primerilor și sondelor perfecte. Trebuie selectate grunduri
și sonde
pe baza celor mai bune considerații teoretice, iar caracteristicile negative ar trebui documentate și
rezultatele
interpretată în consecință.
4.3.4 Selectarea parametrilor de procedură
Parametrii exacti ai PCR trebuie selectați pe baza acizilor nucleici vizați
amplificat. Parametrii care trebuie evaluați pentru amplificarea PCR de succes includ
termociclarea
condițiile, volumele de reacție, concentrația șablonului și concentrația reactivilor PCR, inclusiv
cea a primerilor. Poate fi necesar să se utilizeze condiții mai puțin decât optime pentru un primer
amorsa individual
seturi (de exemplu, când utilizați mai multe seturi de primer într-un format multiplex). După
stabilirea condițiilor optime,
acestea trebuie documentate într-un SOP pentru metodă și urmate ulterior.
4.3.4.1 Condiții de termociclare
Timpurile și temperaturile optime de denaturare, recoacere și alungire ar trebui să fie determinate
pentru fiecare
set de grund / șablon, deși în practică, utilizarea unei singure condiții de termociclare PCR este mai
mare
convenabil și poate fi adesea acceptabil pentru utilizarea cu diferite seturi de grund cu optime ușor
variabilă.
Numărul ciclului PCR trebuie evaluat cu atenție. A avea prea puține cicluri poate duce la fals
negativ
eșantioanele în timp ce prea multe pot crește potențialul de rezultate false pozitive și pot afecta
cuantificarea (24).
4.3.4.2 Volume de reacție
Volumele de PCR variază de obicei între 10 și 100 pL și pot depinde de tipul de ciclism termic
instrument folosit. Majoritatea termociclelor moderne nu sunt concepute pentru a se potrivi cu
volumele de reacție
mai mare de 100 ul datorită dificultății de încălzire și răcire uniformă în toată reacția.
Creșterea volumului de eșantion adăugat la o reacție poate crește probabilitatea unui rezultat
pozitiv la
concentrații țintă scăzute, deoarece mai multe probe pot fi testate pe reacție, dar pot crește și ele
inhibitie.
4.3.4.3 Concentrații de grund și șablon
Concentrațiile de primer utilizate în fiecare test PCR nou dezvoltat ar trebui să fie optimizate
pentru a obține
eficiență maximă de amplificare. Optimizarea concentrațiilor de primer este deosebit de importantă
atunci când
efectuarea PCR multiplex (vezi Secțiunea 4.3.1.3). Adaosul de prea mult ADN (fie șablon, fie
nemodificat) la reacție poate fi inhibitor (29). Detectarea a două sau mai multe ținte într-un format
multiplex
poate fi problematic, dacă există diferențe de concentrare între ținte. Când proiectați
reacții multiplex, efectele diferitelor niveluri de ținte trebuie testate pentru a determina impactul
acestora
la analiză.
4.3.4.4 Reactivi PCR și Master Mix Preparation
Reactivii cheie care pot necesita optimizare includ concentrațiile de transcriptază inversă și RNasin
pentru RT-PCR și concentrațiile de ADN polimerază, magneziu și dNTP pentru PCR. Tamponare
capacitatea, pH-ul și concentrațiile de KCl pot fi, de asemenea, necesare pentru a fi optimizate
pentru unele tipuri de probe, dar acest lucru
ar trebui să fie rar. Seturile PCR care conțin toți reactivi, cu excepția primerilor și șabloanelor, pot
fi achiziționate de la
surse comerciale și acestea pot fi utilizate dacă se găsește unul care se potrivește cu rezultatele
laboratorului
studii de optimizare.
În plus față de reactivii necesari, pot fi adăugați suplimentari care acționează asupra diferitelor
aspecte ale reacției
PCR master mix. Acestea includ clorura de dimetil sulfoxid (DMSO), betaina, clorura de
tetrametilamoniu
(TMAC) și albumină serică bovină (BSA) (25, 27). Alte substanțe de îmbunătățire și aditivi sunt
disponibil de la diverse fabrici. Unii dintre potențiatori acționează prin creșterea termostabilității
polimeraza și unele, dând polimerazei o mai mare procesivitate prin regiunile bogate în GC.
Efectele
dintre multe altele nu sunt complet înțelese și, deși pot fi benefice în unele reacții,
efectul lor asupra tuturor reacțiilor nu poate fi prezis. Fiecare aditiv trebuie testat empiric cu
fiecare
combinație de șablon și primer.
În sala de pregătire a reactivilor trebuie să fie preparat un amestec principal care conține reactivi
optimizați.
amestecul principal conține toți reactivii necesari pentru ca reacția să aibă loc, cu excepția
șablonului, astfel
minimizarea potențialului de variație reacție la reacție asociată cu conducta acestor reactivi.
În timpul pregătirii amestecului principal, vârfurile pipetei trebuie schimbate după manipularea
fiecărui reactiv. Maestrul
amestecul trebuie preparat pe gheață, cu excepția cazului în care instrucțiunile producătorilor
specifică în mod specific că reactivii
poate fi amestecat la temperatura camerei. Datorită potențialei interferențe a soluției de glicerol în
care
unele enzime sunt stocate, volumul enzimei utilizate în reacție nu trebuie să depășească 10% din
total
volumul de reacție (9). Amestecul principal trebuie alicotat în tuburi de reacție în prepararea
reactivului
cameră. Dacă doriți, laboratoarele pot pregăti o cantitate mare de amestec mixt și pot stoca alicote
la -20 ° C după
demonstrând că înghețarea / dezghețarea alicotelor nu reduce sensibilitatea.
4.4 Detectare și confirmare amplicon
Rezultatele PCR trebuie confirmate. Se poate realiza confirmarea faptului că obiectivul specific a
fost amplificat
în timpul PCR utilizând hibridizarea cantitativă bazată pe sondă în timp real sau în urma PCR
folosind gel
electroforeză; hibridizare blot; maparea restricțiilor; analiza curbei de topire; și / sau secvențiere.
Rezumările fiecărei tehnici determinante sunt prezentate în secțiunile 4.4.1 - 4.4.6 și sunt rezumate
în
Tabelul 4-2. Sunt discutate recomandările privind etapele QC și raportarea datelor pentru fiecare
din aceste proceduri
în secțiunile 5 și respectiv 6.
Deși secvențarea oferă cea mai fiabilă confirmare a unui rezultat PCR, utilizarea a două sau mai
multe
alte tehnici determinante crește încrederea în rezultat. Utilizarea inerentă a interiorului
sondele de hibridizare în procedurile PCR în timp real oferă un grad de confirmare a ampliconului
care este
similar cu utilizarea hibridizărilor dot blot în PCR convenționale (secțiunea 4.4.2.2.). Confirmare
suplimentară
din produsele acestei metode prin electroforeză pe gel și secvențiere pot fi încă necesare. Unele în
timp real
Termocicletele PCR sunt echipate cu capacități pentru a determina curbele punctelor de topire ale
produselor care
poate fi folosit și pentru confirmarea lor.
Notă: Datorită dimensiunilor reduse ale unor ampliconi, în special în detectarea PCR în timp real,
confirmarea prin
secvențarea poate să nu fie posibilă.
4.4.1 Electroforeza gelului
Electroforeza cu gel este cea mai obișnuită metodă utilizată pentru detectarea produselor din PCR
convenționale.
Electroforeza este separarea moleculelor încărcate într-un câmp electric. Mișcarea acidului nucleic
prin gel este dependent de sarcina electrică; separarea depinde de forma și dimensiunea
ampliconului.
Moleculele de acid nucleic poartă o încărcătură negativă uniformă pe toată lungimea lor și forma
tuturor
ADN-ul amplificat va fi liniar. Prin urmare, factorul principal care rezultă în separarea ADN-ului
amplificat este
mărimea.
Cel mai comun mediu utilizat pentru separarea ADN-ului este agaroza, un polimer liniar care
formează un gel solid
de densitate uniformă. Un mediu alternativ este acrilamida, care poate avea ca rezultat un gel de
poliacrilamidă
de reticulare covalentă a moleculelor de acrilamidă. Acest tip de mediu oferă o rezoluție mai mare
decât agaroza. Pentru a vizualiza ADN-ul, gelurile sunt colorate cu coloranți fluorescente, cum ar
fi bromura de etidiu sau
SYBR®
Verde I, după electroforeză. Bromură de etidiu, dar nu și SYBR Green, poate fi de asemenea
adăugată la
agaroză înainte de electroforeză. Se pot adăuga diverse coloranți de rulare împreună cu ADN-ul
într-o încărcare
tampon pentru a monitoriza migrarea ADN-ului prin gel.
Multe tampoane și concentrații diferite de matrice sunt utilizate pentru a face și pentru a rula
geluri. Diferit
combinațiile pot oferi mai mult sau mai puțin rezistență la ADN-ul separat pentru a atinge dorința
rezolvare și separare.
Notă: De obicei, electroforeza nu este suficientă pentru a confirma produsele PCR, deoarece nu are
legătură
pot fi detectați ampliconi de dimensiuni similare cu ținta de interes.
4.4.2 Sondarea hibridizării (blots)
Cea mai obișnuită procedură pentru confirmarea ampliconilor este hibridizarea unei sonde marcate
la produsele PCR
care au fost transferate pe un suport solid, cum ar fi nitroceluloza sau membranele de nailon.
Produsele sunt
transferat pe un suport solid folosind una din mai multe tehnici de blotare. Sonde de hibridizare,
care sunt
de obicei, oligoii care au o secvență complementaritate cu ampliconul țintă, sunt apoi hibridizați la
ampliconi legați. Sondele de hibridizare nu pot avea secvențe care să se suprapună cu primerul
PCR.
4.4.2.1 Southern Blot
Hibridizarea sudică este o metodă prin care produsele PCR sunt transferate dintr-un gel în urma
electroforeză pe un suport solid, cum ar fi o membrană de nailon. Produsele PCR acum legate de
membrană
sunt hibridizate la o sondă oligonucleotidă care conține radioactiv, flourescent, biotină,
digoxigenină sau
alte etichete. Legarea sondei la produsul PCR permite vizualizarea ampliconului și
determinarea faptului că ampliconul este de dimensiunea preconizată pentru setul de grund /
șablon. Aceste sonde sunt și ele
capabil să detecteze ampliconi care sunt prezenți în concentrații prea mici pentru a fi vizibili pe un
gel.
4.4.2.2 Dot Blot
Un punct blot se realizează prin transferul direct al ampliconului de la un test PCR la un suport
solid fără
mai întâi efectuând electroforeza. Hibridizarea punctelor oferă o confirmare mai rapidă decât
Southern
blotting, dar nu oferă o confirmare suplimentară a dimensiunii ampliconului.

4.4.3 Cartografierea restricțiilor


Cartografierea restricțiilor folosește situri de restricție inerente (secvențe specifice de nucleotide)
în secvența ADN la
determinați dacă ADN-ul amplificat este ampliconul țintă. Hărțile de restricție sunt create prin
digerare
ampliconul folosind endonucleaze de restricție. Deoarece secvența acidului nucleic țintă este de
obicei
cunoscute și locurile unde enzima de restricție digeră ampliconul, dimensiunile
bucățile de ADN rezultate pot fi prezise. Trebuie folosit un gel care confirmă digestia. Rezultatele
pe
gelul trebuie comparat cu harta de restricție prevăzută pentru a determina dacă ampliconul tăiat
produce benzi
de mărimea prevăzută. Dacă cantitatea de amplicon este limitată, ampliconul poate fi donat înainte
de restricție
cartografiere.
4.4.4 PCR cantitativ bazat pe sonde
PCR-ul cantitativ bazat pe sondă în timp real este o metodă de confirmare atât cât fluorescența
detectat este corelat direct cu prezența (confirmarea) unui produs specific. Ca și în cazul altor
metode de confirmare probebased, precizia acestei metode depinde de specificul sondei pentru
secvența țintă dorită (vezi Secțiunea 4.3.1.2).
4.4.5 Analiza curbei de topire
Unele termociclatoare PCR în timp real sunt echipate cu proceduri de confirmare care determină
topirea
curbe punctuale. Temperatura de topire a acizilor nucleici este afectată de lungime, conținut de GC
și nucleotide
nepotriviri de bază (dacă sunt prezente). Dacă se poate demonstra că ampliconii din țintele
nespecifice nu au
aceleași temperaturi de topire ca țintele specifice, poate fi luată în considerare confirmarea prin
temperatura de topire
echivalent cu confirmarea bazată pe sondă. (38)
4.4.6 Secvențiere ADN
Secvențierea ADN-ului determină secvența de nucleotide a unui produs PCR folosind fie automat,
fie manual
protocoale. Instrumentele de secvențiere automate detectează nucleotide sau primeri cu
fluorescență modificate
determinați secvența de nucleotide. Secvențializarea manuală (care nu este recomandată) necesită
patru
reacții separate pentru a determina secvența. Secvențializarea ADN este adesea efectuată ca reacție
PCR folosind
un singur primer. De obicei nu este adecvat să efectuați secvențiere direct pe o secvență
amplificată PCR,
deoarece probele de mediu conțin adesea amestecuri de analit de interes (de exemplu, nespecifice
amplicons; specii multiple, dar înrudite; diferite sero- sau genotipuri ale unui virus). În cel mai bun
caz, direct
secvențarea detectează doar analitul care a fost prezent în cea mai mare concentrație. În schimb,
purificat cu gel
Produsele PCR trebuie clonate într-o plasmidă cunoscută urmată de secvențarea mai multor clone
(colonii). Secvențele produsului PCR trebuie validate prin secvențializarea ambelor direcții ale
PCR
produs folosind grunduri înainte și invers. Cele două secvențe sunt comparate între ele, editate și a
succesiunea consensului este determinată. Pe lângă secvențializarea ambelor fire, amplificări
multiple de PCR
pot fi executate și produsele secvențiate și comparate pentru consecvență.
Instalațiile de secvențiere comerciale care au echipamentul și expertiza necesară pot fi utilizate
pentru ADN
secvențiere. Aceste facilități ar trebui să fie prevăzute cu forme adecvate de ADN amplificat pentru
acestea
secvențiere platformă și tehnologie. Dacă se anticipează confirmarea unui amplicon prin analiză de
secvență,
cerințele instalației de secvențare ar trebui luate în considerare în dezvoltarea PCR
cerere.

4.5 Metodă Sensibilitate, precizie și recuperare


După ce componentele individuale ale metodei au fost optimizate, întreaga metodă ar trebui să fie
evaluat pentru a determina limitele de detecție (sensibilitate), precizie și recuperare ale metodei,
așa cum este discutat în
Secțiunile 4.5.1 - 4.5.3.
4.5.1 Limitele de detectare
Organismele țintă sunt deseori prezente la niveluri scăzute în mediu, iar unele dintre acestea pot fi
capabile
produce infecție la concentrații mici. Prin urmare, o metodă acceptabilă de PCR ar trebui să poată
detecta o
nivelul organismelor semnificativ din punct de vedere biologic. Nivelul poate fi bazat pe niveluri
de risc acceptabile,
concentrații previzionate de mediu sau concentrații care produc o doză infecțioasă. Pentru a
să știți dacă poate fi detectat un nivel acceptabil, trebuie stabilită limita de detecție a unei metode.
Limita de detecție a metodelor cantitative este definită în această orientare ca fiind concentrația
minimă a
substanță care poate fi măsurată cu un anumit nivel de încredere că concentrația analitului este mai
mare
decât zero (nivelul de încredere ar trebui, de obicei, să fie de la 95% la 99%, dar limitele analitice
ale unora
metodele pot necesita utilizarea nivelurilor inferioare). Pentru metode de prezență / absență, limita
de detecție ca
definit în această orientare este concentrația minimă de analit care produce un răspuns pozitiv cu a
nivel de încredere dat. Limita de detecție poate fi exprimată fie ca număr minim de
organisme sau din numărul de copiere al secvenței țintă într-un volum dat. Există multe
incertitudini care pot
afectează limita de detecție. Unii dintre ei sunt:
• Tipul de acid nucleic țintă detectat (de exemplu, ADN, ARNm, ARNt, ARN, etc.)
• Structura secundară și conținutul de GC al moleculei țintă de acid nucleic
• Matricea din care este izolat organismul
• Detectarea microbilor care sunt inactivi de dezinfectanți fizici și chimici
Există două limite diferite de detectare care sunt de interes atunci când se analizează utilizarea
eșantioanelor de mediu
PCR: limita de detecție a procedurii PCR și limita de detecție a întregii metode. Pentru bacterii,
protozoare și ciuperci aceste limite de detecție sunt adesea măsurate în ceea ce privește numărul
minim detectabil
sau unități formatoare de colonii (CFU). În cazul virusurilor, limita de detecție trebuie măsurată în
funcție de
numărul minim de particule virale fizice detectabile, dacă este posibil.
Cele două tipuri de limite de detecție sunt determinate prin analiza eșantioanelor care conțin replici
niveluri din ce în ce mai mici ale organismului țintă sau ale acidului nucleic țintă. Un mod de a
realiza acest lucru este să
pregătește diluții seriale ale unei suspensii enumerate a organismului țintă. Concentrații celulare în
suspensia stocului poate fi determinată prin contorizarea directă a filtrelor sau într-un
hematicometru sub un
microscop; prin metode automate de numărare directă, cum ar fi numărarea Coulter sau citometrie
în flux; sau, pentru
organisme care pot fi cultivate, prin numărarea unităților de formare a coloniilor (CFU) după
placare pe un material adecvat
mediu de creștere. Numărul de particule fizice pentru unii virusuri poate fi determinat
spectrofotometric (16).
Dacă nu este disponibilă o metodă pentru a determina particulele fizice, enumerarea poate fi
realizată prin unități infecțioase (de ex.
unități de formare a plăcii [PFU]). Cu toate acestea, laboratoarele ar trebui să recunoască faptul că
un număr de virusuri animale
au un raport fizic cu particule infecțioase ridicate, iar pentru acești viruși, PCR detectează mai
multe particule de virus în
o probă decât poate detecta o analiză infecțioasă (16). Numărul de replici care trebuie analizate la
fiecare nivel de diluare va depinde de variabilitatea procedurii, de exactitatea și variabilitatea
enumerarea vârfurilor, nivelul dorit de încredere în limita de detectare și aplicarea
metodă. În funcție de aplicarea metodei, poate fi de dorit să se determine limita de detecție
pentru apa reactivă și o varietate de matrice de probă pentru a determina efectul inhibării matricei
asupra substanței
limita detectiei.
Trebuie menționat că pot fi vârfuri enumerate manual care conțin un număr redus de organisme
inexacte, iar rezultatele obținute din astfel de vârfuri trebuie interpretate cu atenție. Erori asociate
cu diluții seriale trebuie reduse la minimum prin utilizarea unor volume adecvate care pot fi
măsurate cu exactitate
și prin omogenizarea completă a stocurilor imediat înainte de îndepărtarea unei alicote pentru
următoarea diluție. Dacă
este posibil să fie enumerate multiple replici ale fiecărei diluări, independent de analiza PCR
evaluați acuratețea diluțiilor.
Limita de detecție poate fi, de asemenea, exprimată în termeni de număr de copii ale secvențelor
țintă (41). Este nevoie de
ca secvența de interes a acidului nucleic să fie amplificată și clonată într-un vector adecvat și că
concentrația acestor molecule trebuie determinată, așa cum este descris mai jos. Acest lucru este
util în special atunci când
organismul nu poate fi cultivat. Cel mai mic număr de copie a fragmentului de acid nucleic care
poate fi detectat
metoda PCR poate fi calculată din cea mai mică concentrație de ADN detectată în g / ml. În mod
ideal,
limita de detecție trebuie să se încadreze într-un interval de copie unică.
Următoarea formulă poate fi utilizată pentru a calcula numărul de copie (CN):
Unde:
M = concentrația minimă de acid nucleic detectat (g / ml)
N = numărul lui Avogadro (6.022 × 1023 molecule / aluniță)
L = lungimea acidului nucleic în perechi de kilobază (lungimea totală a plasmidei + insertului)
D = factorul de conversie de la 1 Kb de acid nucleic la daltoni
ds ADN = 6,6x105
g / mol / Kb
Concentrațiile de acid nucleic (M) pot fi măsurate folosind trei abordări:
• Spectrofotometria
• Fluorimetrie
• Transiluminare UV
Folosind spectrofotometria, se calculează concentrația aproximativă a acidului nucleic în grame
măsurarea densității optice (OD) pe 1 cm de cale luminoasă, conform următoarei relații:
1 OD de ADN ds la 260 nm = 50 pg / ml (5 × 10-5 g / mL)
Concentrațiile de acid nucleic pot fi estimate prin măsurarea fluorescenței după colorare cu un
fluorescent
colorant, cum ar fi Hoechst 33258. Concentrațiile de acid nucleic pot fi, de asemenea, calculate
prin măsurarea indusă de UV
fluorescență emisă de coloranți intercalatori, cum ar fi bromura de etidiu. Atât fluorimetria, cât și
metodele UVtransiluminare necesită pregătirea și măsurarea standardelor (40). Un rezumat al
trei abordări sunt prezentate în tabelul 4-3.
Limitele de detectare pot fi, de asemenea, exprimate în termeni de unități PCR sau RT-PCR (16),
în special pentru analiza
organisme (de exemplu, anumiți viruși) care nu pot fi enumerați. Unitățile PCR sunt determinate
prin efectuarea PCR
pe diluții seriale ale organismului sau acidul nucleic din organism. O unitate este definită în
termeni de
cel mai mic nivel de vârf sau cea mai mare diluție (concentrația cea mai mică) care dă un rezultat
pozitiv. Aceste limite
ar trebui estimată din analiza a cel puțin cinci replici la fiecare diluție și exprimată folosind cele
mai multe
statistici cu număr probabil (MPN). Trebuie menționat că această metodă de exprimare a limitelor
de detecție poate
se utilizează numai pentru comparații relative ale eșantioanelor folosind același set de grund, mai
degrabă decât cel absolut
valori.
Când raportați limitele de detecție pentru întreaga metodă sau procedura PCR, procedura de calcul
limita de detecție trebuie descrisă în mod clar, inclusiv unitățile, dacă limita de detecție este
integrală
organisme sau număr de copie și limitele de încredere asociate. Unitățile utilizate pentru a raporta
detectarea
limita trebuie să se bazeze pe procedura utilizată pentru enumerarea vârfurilor (de exemplu, dacă
se utilizează numărul de plăci bacteriene
pentru a determina CFU, atunci trebuie indicată limita de detectare a metodei în termeni de CFU).
4.5.1.1 Limita de detecție a PCR
Limita de detectare a PCR reflectă sensibilitatea procedurii PCR, care include sensibilitatea
grunduri și sonde, precum și prepararea amestecului principal și optimizarea termociclării
Condiții. Nu include reducerea sensibilității prin procedurile utilizate pentru concentrarea
organismelor
în probă și izolați acizii nucleici. Din acest motiv este adesea determinat pe baza acidului nucleic
mai degrabă concentrații decât concentrații de organism.
4.5.1.2 Limita de detectare a metodei
Limita de detectare a metodei este cea mai mică cantitate de țintă care poate fi detectată în mod
reproductibil de către întreg
metodă. Acesta reflectă nu numai sensibilitatea PCR, dar și eficiența procedurilor utilizate pentru
recuperare
organisme din eșantionul de mediu și eficiența procedurilor de recuperare a acidului nucleic
șabloane de la organisme. Astfel, limita de detectare a unei metode va depinde de o serie de
factori,
inclusiv eficiența colectării, concentrării, izolării organismelor întregi de
proba de mediu și liza organismelor pentru eliberarea acidului nucleic, pe lângă limita de detecție
a PCR în sine.
Limita de detectare a metodei poate fi determinată prin procesarea apei reactivului, a matricei
standardizate sau a câmpului
probe care au fost însămânțate cu diferite concentrații ale organismului țintă înainte de orice probă
prelucrare. Nu este neobișnuit ca limita de detectare a metodei să fie mai mare decât limita de
detecție PCR,
în funcție de eficiența etapelor de concentrare și purificare, inhibitori prezenți pe teren
eșantion și alte variabile de procesare a eșantionului.
4.5.2 Precizia
Metodele analitice bune vor avea o precizie ridicată. Precizia este o măsură a cât de strâns
valorează
reproduceți măsurătorile unui eșantion de acord între ele.1
Pentru analize PCR cantitative pe
eșantioane de mediu, precizia metodei poate fi exprimată ca abaterea standard relativă (RSD) sau
diferență procentuală relativă (RPD). RSD este abaterea standard de la trei sau mai multe probe
replicate
împărțit la medie și înmulțit cu 100%. RPD este diferența absolută a eșantioanelor duplicate
împărțit la medie și înmulțit cu 100%. RSD sau RPD scade odată cu creșterea preciziei și
crește cu o variabilitate crescută.
Variabilitatea (de exemplu, precizia scăzută) poate rezulta din diferențele de performanță ale
analistului, reactivi sau
caracteristicile echipamentului sau matricei. Precizia unei metode trebuie testată la nivelurile la
care
organismul țintă va fi găsit în mediu. Dacă nivelurile de mediu nu sunt cunoscute, precizia
trebuie testate la niveluri de 10 până la 100 de ori mai mari decât limita de detecție. Numărul,
intervalul, valoarea medie,
și RSD sau RPD din replicile analizate pentru a determina precizia ar trebui să fie documentate, iar
natura
de orice imprecizie caracterizată.
4.5.3 Recuperare
Pe lângă precizia înaltă, metodele analitice bune vor avea prejudecăți reduse. Prejudecata este o
măsură a
dezacord între concentrația unui analit măsurată printr-o metodă și concentrația adevărată
în proba de mediu care a fost testată. Recuperarea unei metode PCR a secvenței țintă de interes
este un factor important pentru caracterizarea prejudecății metodei la niveluri mai mari decât limita
de detecție. Bias poate
apar la orice componentă a unei metode PCR. Dacă o metodă este proiectată pentru a detecta un
grup de organisme conexe,
membrii grupului pot avea recuperări diferite și astfel prejudecăți diferite prin eșantionare
protocolul, extracția acidului nucleic și etapele PCR. Pregătirea la nivelul PCR poate apărea din
favorizarea
amplificarea anumitor secvențe țintă datorită proprietăților țintei, secvențelor de flancare sau
genomul general (35). Pregătirea PCR poate fi văzută pentru PCR-uri cu șablon mixt, inclusiv
reacții care utilizează interne
controlează și poate îngreuna interpretarea rezultatelor, deoarece rezultatele finale nu reflectă
machiaj original al șabloanelor țintă. Pregătirea rezultă de obicei atunci când eficiența amplificării
secvențele țintă nu sunt aceleași. Secvențele țintă se pot amplifica la eficiențe diferite, deoarece
secvențele nu sunt la fel de accesibile pentru hibridizarea primerului după denaturare, hibrizii cu
primer-șablon
nu se formează cu eficiență egală pentru toate șabloanele și / sau polimeraza acționează asupra
șabloanelor cu
eficiențe diferite (42). Unul dintre factorii care pot afecta hibridizarea primer-șablon este
conținutul de GC al
șablonul (35, 42). Pregătirea PCR poate fi redusă prin rularea unui număr scăzut de cicluri PCR și
prin utilizarea
concentrații mari de șabloane, când este posibil (35).
Recuperarea analizei PCR și a întregii metode poate fi evaluată prin analiza probelor însămânțate.
Pentru analizele PCR cantitative, recuperarea este determinată ca cantitatea totală de analit găsită
într-o sămânță
eșantion minus fundalul (adică, cantitatea detectată în eșantionul fără sămânță) împărțit la valoarea
cantității
analiza însămânțată în eșantion. Pentru a determina recuperarea pentru metode de prezență /
absență, diluții seriale ale
proba trebuie însămânțată și cinci replici la fiecare diluție analizată. Cantitatea de
analizat în eșantioanele însămânțate și fără sămânță trebuie apoi calculat folosind analiza MPN
descrisă în
Secțiunea 4.3.1.1. Recuperarea va fi apoi calculată similar analizei cantitative prin scăderea
concentrația de fond estimată de MPN din concentrația estimată de MPN a semănatului
proba și apoi împărțirea la cantitatea însămânțată (secțiunea 5.1).
Rezultatele obținute folosind metode care au recuperări reduse ar trebui să fie calificate drept
potențial părtinitoare.
Laboratoarele ar trebui să fie, de asemenea, conștiente de recuperarea organismelor țintă care sunt
endogene pentru o matrice (de ex.
agenți patogeni asociați cu materialul fecal din apa râului) nu pot fi aceiași măsurați cu
probe însămânțate (de exemplu, în cazul în care organismele nu sunt asociate cu alt material). Dacă
nu poate fi arătat
că recuperarea organismelor endogene și semănate sunt similare, rezultatele eșantionului ar trebui
înregistrate
ca părtinitoare.
4.6 Validarea metodei
Deși proiectarea și coordonarea studiilor de validare a metodei cuprinzătoare nu se aplică
din acest document de orientare, validarea metodei optimizate este ultimul pas în dezvoltarea
metodei
proces. Pentru metodele PCR dezvoltate pentru utilizarea într-un laborator și pentru o matrice
unică, validarea metodei
trebuie să fie condus doar de acel laborator. Dacă o metodă PCR este dezvoltată pentru utilizare pe
scară largă, a
studiul coordonat de validare ar trebui efectuat în mai multe laboratoare pentru a evalua în mod
adecvat
robustetea și aplicabilitatea metodei la o gamă reprezentativă de matrice și capacitatea de a fi
utilizate
în mod constant de laboratoare multiple. Indiferent dacă este valabil unic laborator sau
interlaborator
vor fi efectuate, următorii parametri trebuie evaluați în caracterizarea metodei
performanţă:
• Specificitate
• Limita de detectare (sensibilitate)
• Precizie intra și interlaboratorie
• Recuperare (părtinire)
Orientări privind evaluarea performanței metodei microbiologice în raport cu acești parametri sunt
prevăzut în proiectul Protocolului de testare alternativă microbiologică EPA (ATP) al EPA pentru
apa potabilă,
Metode de monitorizare a apei uzate și a apelor uzate (EPA-821-B-03-004) (48). Îndrumări
suplimentare sunt
disponibil prin standarde de la ASTM International, Organizația Internațională pentru
Standardizare,
AOAC și alte organizații de standarde de consens.
Rezultatele acestor studii ar trebui luate în considerare cu atenție înainte de utilizarea metodei
pentru mediu
monitorizarea probelor. Dacă datele studiului de validare indică faptul că metoda nu este suficient
de consistentă pentru
utilizarea de rutină într-un singur laborator sau nu poate fi efectuată de alte laboratoare calificate,
metoda
nu trebuie utilizat până când nu este standardizat. Dacă datele studiului de validare indică faptul că
metoda nu
efectuați acceptabil în multe dintre matricile în care ar fi utilizat pentru monitorizarea de rutină,
suplimentar
lucrările de dezvoltare sunt necesare pentru a aborda interferențele matriceale. Dacă rezultatele
unui singur laborator sau
Studiul de validare interlaboratoare demonstrează că metoda poate fi realizată în mod constant și
este
caracterizat prin precizie, sensibilitate și specificitate acceptabile, atunci poate fi utilizat pentru
monitorizare.
SECȚIUNEA 5. Eșantioane de control de calitate pentru metodele de utilizare
PCR
Laboratoarele care folosesc PCR ar trebui să analizeze probe de QC pozitive și negative, în mod
regulat
demonstrează performanța adecvată a metodelor bazate pe PCR. Orientări generale atât asupra
pozitivului, cât și
Tipurile de control negativ și frecvența în care trebuie efectuate sunt prevăzute în Secțiunile 5.1
și 5.2. Numărul real de controale va depinde de proiectarea experimentală și de variabilitatea
preconizată. A
rezumatul acestor controale este oferit atât în tabelele 5-1 cât și în 5-2 și în figura 5-1. Un rezumat
al QC
probele pentru procedurile de detectare și confirmare sunt furnizate în secțiunea 5.3. Acțiuni
corective pentru QC
Eșecurile eșantionului și prevenirea falsă pozitivă / falsă negativ sunt discutate în secțiunile 5.4 și
5.5,
respectiv. Îndrumări pentru participarea la studiile de testare a competenței sunt sugerate în
secțiunea 5.6.
Protocolul metodei trebuie documentat în POS-urile laboratorului și versiuni concise ale POS
o anumită parte a metodei ar trebui să fie postată pe banca unde se vor efectua procedurile.
SOP-urile de postare oferă tehnicienilor acces facil la procedurile de metodă și ajută la promovarea
coerența dintre analiști. POS-urile pentru o anumită metodă, de asemenea, ar trebui să
documenteze procedurile de calitate, cum ar fi
tipurile și frecvența controalelor QC și acțiuni corective pentru eșecurile pozitive și negative ale
controlului.
5.1 Controale pozitive
Controalele pozitive sunt analizate pentru a verifica dacă metoda este capabilă să se recupereze în
mod adecvat și
amplificând ținta. Concentrația secvenței de interes pentru aceste controale pozitive ar trebui să fie
10
până la 100 de ori mai mare decât limita de detecție definită a PCR (Secțiunea 4.5.1.1). Un control
pozitiv este
considerat acceptabil dacă ADN-ul de interes a fost amplificat de PCR, determinat de același lucru
tehnica de confirmare (secțiunea 4.4) folosită pentru probele analitice. Ghid privind controlul
pozitiv
eșantioanele care ar trebui incluse pentru analizele PCR sunt furnizate în secțiunile 5.1.1 - 5.1.4.
Măsuri de precauție
ar trebui să fie luate pentru a evita contaminarea probelor de câmp cu șablonul de control pozitiv.
Pozitiv
pregătirea controlului trebuie să fie separată fizic de proba de câmp și de preparatul de control
negativ și
eșantioanele de control pozitiv ar trebui să fie tratate ultimul. Un rezumat al probelor de QC
pozitive recomandate este
prevăzut în tabelul 5-1.
5.1.1 Control pozitiv PCR
Controalele pozitive PCR sunt utilizate pentru a verifica dacă amestecul principal de PCR și
reactivii au fost pregătiți corect în
pentru a produce amplificarea acidului nucleic țintă. Acest tip de control pozitiv se execută cu
fiecare
Lot PCR. Un lot PCR este definit ca un grup de eșantioane care sunt procesate și amplificate în
același timp
timp în aceleași condiții, folosind același amestec master PCR și în același termocicler.
Controalele pozitive PCR sunt preparate prin adăugarea unui control exogen la amestecul
principal. exogen
controalele pot fi oricare dintre următoarele:
• Un extract de acid nucleic total purificat din organism care conține secvența de interes.
• Întregul organism, care poate fi utilizat atunci când ținta de interes a acidului nucleic poate fi
eliberată
organismul însămânțat prin încălzire înainte sau în timpul PCR.
• Un fragment specific de acid nucleic care conține întreaga secvență de amplificat, inclusiv primer
site-uri de legare (de exemplu, o concentrație scăzută a unui fragment ADN amplificat anterior și /
sau un fragment de ADN clonat care
a fost secvențiat pentru confirmare).
• Un fragment de ADN clonat care conține o formă modificată a secvenței țintă (vezi Secțiunea
4.3.1.1).
Formele modificate produc produse PCR care pot fi diferențiate de secvența țintă după mărime, cu
maparea restricțiilor și / sau printr-o secvență alternativă de recunoaștere a sondei. Forme
modificate, care de asemenea
se numesc „controale interne”, sunt preparate prin generarea in vitro de inserții, ștergeri sau altele
modificări de secvență.
Notă: Formele modificate ale țintei care diferă semnificativ de secvența țintă în lungime sau GC
conținutul va avea eficiențe de amplificare diferite față de secvențele țintă și astfel nu sunt
adecvat pentru utilizare ca controale pozitive.
• O secvență heterologă care s-a dovedit anterior amplificată cu o eficiență care este
comparabil cu secvența țintă.
• ARN transcris dintr-un fragment de ADN clonat care conține secvența țintă sau o țintă modificată
secvență (pentru utilizare în aplicații RT-PCR).
Pentru metodele PCR cantitative, controlul pozitiv al PCR este evaluat determinând cantitatea
totală de
acidul nucleic țintă sau organismul din control împărțit la cantitatea adăugată la reacție sub formă
de vârf.
Pentru metodele PCR calitative, controlul pozitiv al PCR este evaluat în mod obișnuit în termeni
de „detectare” sau „nedetectare” (deși un semnal de detectare mai slab decât normal poate indica încă o
problemă).
5.1.2 Controale pozitive de inhibare a PCR
Controalele pozitive de inhibiție sunt utilizate pentru a verifica dacă componentele care
interferează dintr-o matrice de mediu,
care pot fi reportate în timpul izolării acizilor nucleici sau a organismelor în timpul procesării
eșantionului, nu
inhiba PCR. Șabloanele de control pozitiv de inhibare pot fi pregătite adăugând oricare dintre cele
exogene
controale de la secțiunea 5.1.1 la un eșantion prelucrat sau folosind un control endogen.
Controalele endogene sunt secvențe țintă care se așteaptă să fie întotdeauna prezente în eșantion
(de ex.
ADN ribosomal sau ARN). Aceste controale ar trebui utilizate numai dacă se demonstrează că
există
apariția și recuperarea consecventă a șabloanelor de control endogene în diferite eșantioane și dacă
testele de control și țintă arată o sensibilitate comparabilă la inhibiție în diferite matrici. Sunt
frecvent utilizate pentru analizele probelor clinice, dar este puțin probabil să fie aplicabile pentru
analizele majorității
probe de mediu.

Controalele exogene pot fi utilizate pentru a analiza inhibarea PCR în mai multe moduri:
• În alicote separate din același extract de acid nucleic din același eșantion
• În extracte din separat, reproduceți eșantioanele prelucrate în paralel
• În aceeași alicot din același eșantion folosind controale interne modificate
Lipsa produsului PCR detectabil din acest control semnalează inhibarea PCR. Pentru PCR
cantitativ
metode, diferite grade de inhibare pot fi evaluate direct prin compararea rezultatelor de la control
cu rezultatele controlului pozitiv PCR (secțiunea 5.1.1). Totuși, acest lucru necesită ca ambele
controale să fie
modificat cu aceeași sumă a modelului de control pozitiv. Pentru metode PCR calitative, PCR
controlul pozitiv al inhibiției este evaluat în termeni de detectare sau non-detectare (deși un semnal
de detecție care
este mai slab decât cel al controlului pozitiv al PCR poate indica încă o problemă).
Evaluarea diferitelor grade de inhibiție poate fi dificilă folosind vârfurile șablonului în sine ca
pozitive
control deoarece acest șablon poate fi prezent în diferite concentrații în proba de testare. Utilizarea
unui modificat
forma șablonului țintă, deoarece controlul pozitiv este în general recunoscut drept abordarea
preferată,
pentru că este probabil ca secvențele aproape identice ale șablonului țintă și control să ofere egal
susceptibilitatea la inhibarea PCR. Cu toate acestea, această abordare necesită proiectarea și
pregătirea personalizată a
șablon de înlocuire pentru fiecare set de grunduri. Analizele pentru un model de control heterolog
adăugat sunt în general
mai ușor de realizat, dar este deosebit de important să se demonstreze că susceptibilitatea acestor
analize
inhibarea PCR este comparabilă cu cea a secvenței țintă la toate probele. Seturi de grund pentru
heterolog
controale exogene ar trebui, de asemenea, să fie verificate pentru compatibilitatea cu primerii de
secvență țintă, atunci când sunt utilizate
în aceleași reacții tubulare. Trebuie să aveți grijă atunci când proiectați reacții cu același tub,
deoarece acestea sunt diferite
testele vor concura pentru aceiași reactivi (de exemplu, dNTP, enzime și, în cazul țintei modificate
șabloane, primer) și sensibilitatea de detectare a țintei pot fi afectate negativ.
Deoarece matricile de mediu, cum ar fi apa râurilor, sunt în continuă schimbare, inhibând controale
pozitive
trebuie efectuat pentru fiecare eșantion și pentru fiecare țintă. Dacă nu există efecte matrice asupra
țintelor de interes
detectată, apoi frecvența cu care se efectuează acest control poate fi redusă la o verificare periodică
la
evaluați modificările potențiale ale matricei în timp.
5.1.3 Metoda controlului pozitiv
Metoda de control pozitiv este utilizată pentru a verifica dacă întreaga metodă funcționează corect.
Acest control
trebuie efectuată prin analizarea unei probe de apă de reactiv însămânțate cu cantități cunoscute ale
țintei
organisme înainte de începerea procesării probelor. Pentru metode PCR cantitative, recuperarea
metodei
controlul pozitiv este determinat ca cantitatea totală a analitului găsit în eșantion împărțit la
cantitatea de analit de control adăugată în eșantion sub formă de vârf. Recuperarea trebuie
exprimată în termeni
dintre unitățile utilizate pentru a măsura concentrația vârfului (de exemplu, CFU, PFU, număr
etc.). Pentru calitativ
Metode PCR, metoda de control pozitiv este evaluată în termeni de detectare sau non-detectare
(deși a
Semnalul de detecție mai slab decât cel normal poate indica încă o problemă). Cel puțin, metoda
pozitivă
controale ar trebui să fie efectuate pentru fiecare lot de probă. Un lot de eșantion este definit ca un
set de probe de configurare instalate și prelucrate împreună prin toate etapele metodei care duce la PCR.
5.1.4 Spike matricial
Spike matricial este utilizat pentru a determina efectul matricei asupra recuperării generale a
metodei. Acest control
poate fi efectuată prin analiza unui eșantion duplicat colectat în același timp și locație cu
proba de mediu și însămânțate cu cantități cunoscute ale organismului țintă înainte de prelucrarea
eșantionului
(secțiunea 5.1). Eșantionul semănat trebuie prelucrat în același timp și în același mod ca și
eșantion de mediu fără sămânță și metoda de control pozitiv (secțiunea 5.1.3), dacă este posibil.

aboratoare
Cu toate acestea, ar trebui să fie precaut atunci când prelucrați probe de matrice semințate, în
același timp cu eșantioane de mediu fără sămânță pentru a preveni contaminarea încrucișată. Recuperarea
SM este determinată ca total
cantitatea de analit găsită în eșantion minus fundalul (determinat în nesămânțare
eșantion de mediu) împărțit la cantitatea de analit țintă adăugată în eșantion ca pic
Secțiunea 4.5.3). Dacă se crede că matricea eșantionului inhibă izolarea organismului țintă sau
acid nucleic, diluții din cea mai mare cantitate sau eșantion prelucrat pot fi efectuate pentru a
determina dacă semnalul
devine mai puternic pe măsură ce proba este diluată. Trebuie menționat că, în timp ce diluați proba
pentru a reduce
inhibarea, concentrația țintei este de asemenea redusă. Prin urmare, este posibil ca această tehnică
să nu fie
adecvat pentru probele în care concentrația țintei este scăzută.
O a doua abordare a vârfului matricei este sămânța eșantionului de mediu cu un alt organism decât
organismul țintă. Această abordare elimină nevoia de a procesa și analiza eșantioane duplicate,
deoarece
Acizii nucleici ai organismului țintă și surogat pot fi analizați independent în același eșantion. Ar
trebui
se utilizează numai dacă surogatul are proprietăți similare cu organismul țintă și dacă nu este
prezent în
testat cu matrice. Aceleași cantități de organism surogat ar trebui să fie adăugate și cu organismul
țintă la
metoda de control pozitiv (secțiunea 5.1.3) pentru compararea rezultatelor cu probele de vârf de
matrice.
Cu toate acestea, această abordare nu trebuie utilizată decât dacă se arată că inhibitorii de mediu ai
PCR
afectează în mod similar detectarea substanțelor surogat și a organismelor țintă. În plus, trebuie
arătat că
recuperările organismelor surogat și țintă ale întregii metode sunt similare. Utilizarea unui
un organism diferit de ținta controlului poate fi, de asemenea, limitat dacă prelucrarea eșantionului
front-end
tehnicile sunt specifice pentru țintă (de exemplu, separarea imunomagnetică care utilizează
margele magnetice acoperite
cu anticorpi specifici țintei) sau dacă există concurență între țintă și surogat
organism.
Procesarea și analiza probelor suplimentare necesare pentru vârfurile matricei pot fi reduse la
minimum
analizând acest control numai pentru primul eșantion analizat dintr-o anumită matrice. Așa cum s-a
descris mai sus pentru
controale de inhibiție, cu toate acestea, unele matrici de mediu sunt în continuă schimbare. Drept
urmare, SM
eșantioanele trebuie efectuate în mod regulat pe o anumită matrice pentru a evalua dacă există
eventuale modificări în
matricea a afectat performanța metodei sau până când se poate documenta că variabilitatea
recuperările într-o anumită matrice de mediu sunt acceptabile.

5.2 Negative Controls pag 38