BEÄNH VIEÄN TRUYEÀN MAÙU HUYEÁT HOÏC

FLOW CYTOMETRY GOÙP PHAÀN

CHAÅN ÑOAÙN BEÄNH LYÙ AÙC TÍNH

DOØNG LYMPHO B
TS.BS. Nguyễn Phương Liên
ThS.BS. Hoàng Thị Tuệ Ngọc
CN. Nguyễn Hồng Điệp
CN.Nguyễn Kim Yến
CN. Nguyễn Chí Anh
1
 Phaân tích keát quaû DAMD
Döïa vaøo 3 ñaëc ñieåm:
1. Noàng ñoä CD:
ñöôïc xaùc ñònh giaùn tieáp thoâng qua noàng ñoä chaát huyønh quang
treân teá baøo (neg, dim, inter, bright).
2. Tæ leä teá baøo mang KN:
soá löôïng teá baøo döông tính vôùi moät KN so vôùi quaàn theå nghieân
cöùu (tæ leä %/ quaàn theå quan taâm).
3. Kieåu hình DAMD:
moâ taû chi tieát veà söï keát hôïp cuûa nhieàu CD trong töøng quaàn theå
teá baøo, bao goàm caû Döông tính vaø Aâm tính.
2
 MUÏC TIEÂU CHÍNH:

SÖÏ BIEÄT HOÙA TEÁ BAØO B BÌNH THÖÔØNG

NORMAL DIFFERENTIATION OF B-CELL

3
Caùc CD xaùc ñònh teá baøo taïo maùu doøng lympho
1. CD34, CD38,
2. CD117 (doøng tuûy),
Caùc daáu aán non
3. TdT vaø CD10 (doøng lympho),
4. HLA.DR (doøng haït vaø lympho T)

CD19, cyCD22, smCD22, CD20, CD5, HLA.DR,

cyCD79a, CD79b,
Doøng lympho B
CD38, CD138, CD23, CD25, CD103, CD11c
sIg/, IgM, FMC7, CD43, CD10, CD30, CD56

CyCD3, smCD3,
Doøng lympho T
CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD1a

NK cell CD56, CD57, CD16, CD2, CD4, CD7, CD8 4

 The B lymphoid precursors

• CD19+ CD22+ cyCD79a+ CD45

• CD10+ CD34 TdT CD38++
• CD20
• HLA.DR ++
• SmIgM CyIg
• CD5–

cyCD79a+ with CD10+  CD34

5
 The mature CD10–CD20+ B cells

• CD19+ CD22bright cyCD79abright CD79bdim

• CD45bright CD20bright
• CD34 – TdT – CD10– CD38dim
• HLA.DR++
• SmIgMbright CyIg–
• CD5+ (on subpopulation)

cyCD79a+ with CD10 – CD20bright

6
 Immunophenotype

Lympho B: cyCD79a+
• precursor B cell: CD19+CD22+CD10++CD34+TdT+CD20± CD45dim
• Hematogones: CD34TdT±CD10+CD19+CD22+CD20±CD45inter

• B lymphocyte: CD19+CD22+CD20++ CD45bright

• Plasmocyte : CD19+CD22-CD20-CD45+CD38++CD138+

döïa vaøo kieåu hình DAMD coù theå phaân bieät

caùc giai ñoaïn tröôûng thaønh khaùc nhau cuûa cuøng 1 doøng teá baøo
7
 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO

NORMAL DIFFERENTIATION OF B-CELL

1. van Lochem EG (2004) Immunophenotypic differentiation patterns of normal

hematopoiesis in human bone marrow: reference patterns for age-related
changes and disease-induced shifts. Leukemia; 60B, pp.1-13.
2. Pirruccello S, Aoun P.(2001) Hematopoietic cell differentiation: Monoclonal
antibodies and cluster designation - defined hematopoietic cell antigens.
Flow cytometry in clinical diagnosis, 3rd edition; ASCP Press, Chicago, USA,
pp.65-98.

8
SÔ ÑOÀ PHAÙT TRIEÅN BÌNH THÖÔØNG CUÛA TEÁ BAØO LYMPHO B

van Lochem EG, (2004) Leukemia; 60B, pp.1-13

9
10
2016
Phaân boá caùc quaàn theå teá baøo bình thöôøng

Những ñaùm maây choàng leân nhau 11

 Ống LST
theo công nghệ Oneflow/EuroFlow
Per.CP-
HV-450 HV-500 FITC PE PE-Cy7 APC APC-H7
Cy5.5

CD20 CD8 & CD56 & CD19

CD45 CD5 CD3 CD38
& CD4 Lamda Kappa & TCR

Mục đích của ống LST:

- Phân biệt TB Lymphocyte bình thường và TB hoạt hóa, phân biệt
TB lymphocyte hoạt hóa với TB ác tính.
- Phân loại các bệnh lý ác tính dòng lympho: giúp chẩn đoán, phân
giai đoạn và phân loại nguy cơ để chọn lựa phác đồ thích hợp.
- Xác định kháng nguyên đích để điều trị trúng đích bằng các thuốc
kháng thể đơn dòng (anti-CD20,…)
- Đánh giá hiệu quả điều trị (tồn lưu tế bào ác tính – MRD) 12
Hình 1: Phân tích B-cell.

A. B-cells (CD19+): 12.5% Lympho. B. Phân biệt B-cells (CD19+ CD20-) và

PC (CD19+, CD38+, CD20-). C. B-cell + Kappa: 7.4% Lympho; B-cell +
Lambda: 5% Lympho.
13
Hình 2: Phân tích T-cell.

A. Phân biệt B-cell (CD19+) và T-cells (smCD3+): 66.5% Lympho. B. Phân

biệt 2 quần thể T-cells: gồm T-cells với TCR âm: 61.5% Lympho T-cells;
và T-cells với TCR dương: 3.5% Lympho. C. Phân biệt 2 nhóm T-cells với
TCR dương (tức TCR âm): 33.5% là T-Helper và 28% là T-Cytotoxic). 14
 Hình 3: Phân tích NK cells.

• NK cells chiếm 23% Lympho. Trong đó có 2 quần thể NK cells: gồm NK cells
(CD56+, CD3-): 21% Lympho và T-NK cells (CD56+, CD3+): 2% Lympho.

15
Hình 4: Phân tích plasma cell.

• A và B. PC hoạt hóa (CD38+ CD19+ K+/L+): 0.08% BC. C.Trong đó: PC

với Kappa+ : 0.05% BC; PC với Lamda+ : 0.03% BC

16
Normal lymphocyte in blood smear

17
Quaàn theå Hematogones

Hematogones Mature B-cells

18
Quaàn theå Hematogones thay đổi theo tuổi

19
 TAÊNG HEMATOGONES LAØNH TÍNH

• Hematogones có thể thấy ở trẻ nhỏ < 2 tuổi, từ 5-10%.

• Có thể tang phản ứng trong một số các trường hợp viêm
nhiễm, suy giảm miễn dịch ở trè con.
• Ở người lớn nó có thể tang đi kèm với bệnh lý viêm nhiễm
mạng tính EBV, HIV, bệnh lymphoma.
• Ở những bệnh nhân sau hóa trị liều cao hoặc sau ghép TBG
cũng thấy rất nhiều do quá trình tái sinh ở tủy xương.

20
Quaàn theå Hematogones

Hematogones Precursor B-ALL

21
 Hematogones

tb Lympho B non bình thường tái hoạt hóa có kiểu hình

CD34 TdT ± CD10+ HLA.DR+ CD19+ CD22+ CD20± CD45inter

22
Quaàn theå Hematogones

23
PLASMA CELL

1. Bình thường: 1-4% (<1%in FMC sample)

- Hemodilute, focal distribution, adhere to spicules  not well
released, fragile, easily lost during cell processing
- polyclonal cytoplasmic light chain,
- CD45 inter, FSC low SSC low, CD19+ CD22- CD20-,
- CD38 bright CD138 bright,

2. Bất thường: >1%  plasmacytosis

sm/cy light chains  reactive or neoplastic
24
PLASMA CELL

B cells: CD19± CD20- CD22-

cyCD79a+ HLA.DR+
CD38bright CD138bright

25
 TIÊU CHUẨN XÁC ĐỊNH KIỂU HÌNH
TƯƠNG BÀO ÁC TÍNH HAY HOẠT HÓA

* Tương bào bình thường hay hoạt hóa

CD38Mạnh/CD19+/CD45+/CD56
(hoặc CD138+/CD19+/CD45+/CD56)

* Tương bào ác tính

1. CD38Mạnh/CD19/CD45/yếu/CD56±
(hoặc CD138+/CD19/CD45/yếu/CD56±)
2. Monoclonal cytoblasmic Kappa/Lamda Ig
3. Possitive: CD117, CD13, CD20,CD28, CD200

4. Mất hoặc giảm CD27, CD81

2016
26
Nồng độ CD45 thay đổi trên plasma cell

Âm Yếu Trung bình

Nồng độ CD45
27
 Cách khoanh vùng dựa trên CD38 hay CD138

Tương
Dựa bào
hoạt
hóa
vào
CD38 Tương bào ác tính

Tương

Dựa bào
hoạt
hóa
vào
Tương bào ác tính
CD138
28
Đánh giá MRD dựa vào CD19 và CD56

Tương bào
hoạt hóa

Tương bào
ác tính

29

2016
 Phân biệt dựa vào Kappa/Lamda

Bình thường Bất thường

Lamda

Lamda
Kappa Kappa

2016 30
BỆNH ÁN 1

• PHAM M.T. (1956), nam

• TCLS: Đau lồng ngực dọc khung sườn, mệt mỏi, chán
ăn.
• Chẩn đoán sơ bộ: thiếu máu chưa rõ nguyên nhân/Tủy
đồ: AML.M5
• Ngày gửi mẫu: 20/6/2012

KẾT LUẬN: Ghi nhận 1 quần thể bất thường

# 73.4% tủy là plasmocyte. 31
 Chẩn đoán 1 trường hợp Đa u tủy bằng FC

HLA.DR
CD10

CD56
SSC

CD45 CD34 CD22 CD20

Cy Lamda

CD138
CD19

CD33

CD13 CD36 Cy Kappa CD38

cyCD79a
CD138

CD56

CD38 CD38 CD38 32

Bệnh án 2

PHAN THỊ M. (1964), nữ

• TCLS: Sốt 1 tuần, đi khám thấy TC<50.000. được chuyển đến

BV.TMHH cuối tháng 6/2014.

• Tủy đồ: PCs<9%, Sinh thiết tủy: 20% PCs

• FISH* và NST đồ : bình thường.

• Điện di Protein: Beta2 tăng (10,5%)

• Điện di KT MD: IgG, Kappa

• XQ khung xương có ổ hủy xương nhỏ ở bản sọ.

 Chẩn đoán sơ bộ: Smoldering Myeloma 33

SSC

CD45
CD45 CD38

PCs bình thường : 1.8%

CD117

CD56
PCs ác tính: 0,7%

CD38 CD38
CD panel:
CD45, CD56, CD138,
CD38, CD19, cyIg, cyIg,
cyLamda

cyLamda

CD117, CD13

cyKappa cyKappa
34
Lành tính Ác tính
Tổng số lượt gửi mẫu cho Flow Lab of BTH

Năm 2010 2011 2012 2013 2014 2015 TỔNG

Normal PCs - 5 4 8 14 31

PCs ác tính - - 25 20 30 38 123

TỔNG SỐ CA 1 10 30 24 38 52 155

35
 Tỉ lệ % PCs trên mẫu chẩn đoán ác tính

Tỉ lệ PCs / mẫu phân tích Số ca Tỉ lệ%

PCs < 10% 64 54,2%

PCs ≥ 10% 54 45,8%

Tổng số ca 118

Tại HN. EMN 2008: Giới hạn duy nhất của FC trong phân tích MM
là sự không nhất quán về số lượng PCs vs các KT hình thái truyền
thống. Lý do: PCs dễ bị tác động của ly tâm
 Giải pháp: xử lý bằng KT lysing-no-wash 36
Thống nhất các chỉ định lâm sàng đối với FC
Chỉ định Thông số

Chẩn đoán pb giữa MM, MGUS, và - Tỉ lệ % PCs / WBCs

các trường hợp phản ứng - Kiểu hình PCs
- Tính đơn dòng dựa vào Kappa/Lamda
- Tỉ lệ PCs bất thường/ WBCs

Dấu ấn tiên lượng trong bệnh MM Dựa vào các dấu ấn đặc trưng cho sự bất
thường. Vd: CD45/CD56/CD117/CD28

Tiên lượng kết quả đv MGUS và MM Dựa vào tỉ lệ PCs bất thường / tổng PCs
không đặc hiệu

Phát hiện MRD trong MM sau điều - PCs bất thường

trị và xác định đáp ứng CR - Tỉ lệ % PCs bất thường/ tổng WBCs 37
European Myeloma Network 2008
- Tỉ lệ % PCs bất thường / tổng PCs
38
Plasmocyte

39
 Immunophenologic classification of

B-lineage leukemia/lymphoma

40
 Marker Pro-B-ALL Common Pre-B-ALL Transitional Mature
ALL Pre-B-ALL B.ALL

CD34 + + + + -
TdT ++ ++ ++ ++ -
CD10 - ++ ++ ++ 
CD19 ++ ++ ++ + +
CD20 - + + ++ ++
CD22 ++ ++ ++ ++ ++
CyCD79a ++ ++ ++ ++ ++
HLD-DR ++ ++ ++ ++ +
SmIg- - - - ++ +
CD79b

CyIg - - ++ ++ ++ 41
SÔ ÑOÀ PHAÙT TRIEÅN BÌNH THÖÔØNG CUÛA TEÁ BAØO LYMPHO B

van Lochem EG, (2004) Leukemia; 60B, pp.1-13

42
43
2016
COMMON B-ALL (90% BLAST)

44
COMMON B-ALL (90% BLAST)

45
PRO B-ALL (BLAST 73%)

46
Scoring system for The definition of Biphenotypic
Acute Leukemias (EGIL)

Points B- lineage T- lineage Myeloid

2 CD79a Cy CD3 Anti MPO
Cy IgM SmCD3 (anti lysozyme)
Cy/sm CD22 Anti - TCR
Anti - TCR
1 CD19 CD2 CD117 (2003)
CD10 CD5 CD13
CD20 CD8 CD33
CD10 CDw65
0.5 TdT TdT CD14
CD24 CD7 CD15
CD1a CD64
CD11b, CD11c
 48

Depth of respone
 KIEÅU HÌNH AÙC TÍNH

1. KN khaùc doøng (cross-lineage).

2. Söï bieåu hieän caùc KN khoâng ñoàng boä (asynchronous).
3. Söï hieän dieän quaù möùc (overexpression).
4. Vaéng maët 1 KN (antigen absent expression).
5. KN laïc choã (etopic antigen expression).
6. Kieåu phaùt xaï baát thöôøng (aberrant light-scatter patters).
7. Nhöõng protein ñaëc hieäu töø toå hôïp NST baát thöôøng.

 ÑAÙNH GIAÙ MRD 49

KN khaùc doøng (83%)

45.0%
40.8%
40.0% p<0.05
35.5%
35.0% 31.6%

30.0%

25.0%
21.1%
20.0% 15.8%
13.2%
15.0%
10.5%
7.9%
10.0%
6.3%
5.3%
5.0% 2.2%

0.0%
CD14 CD7 CD117 CD2 CD3 CD15 CD36 CD4 CD13 CD33 CD56

Nhöõng KN khaùc doøng treân beänh BCC doøng lympho B

50
Lymphoblast coù CD45 aâmyeáu
38.46
40

30

20

5.13 6.41
10 0

0
Pr o B-ALL Common B-ALL Pr e B-ALL Mautr e B-ALL

51.3% (39/76) coù CD45 aâm  yeáu

51
Moät tröôøng hôïp Common B-ALL

52
Kieåu hình KN khoâng ñoàng boä

Kieåu hình Taàn suaát Tæ leä %

CD34+CD20+ 17
22.37
CD34+TdT+CD20+ 12
15.79
TdT+CD20+ 4
5.26
Toång coäng 33
43.42
(P=0.01)

53
B-cell maturation in normal BM

54
 Kieåu hình coù 1 KN taêng cao noàng ñoä

A B

Kieåu hình n %
- CD10 maïnh 16 21.05
- CD20 maïnh 5 6.58
Toång coäng 21
C D
27.63

MAÏNH TRUNG BÌNH

55
Maát moät KN ñaëc hieäu doøng B

Maät ñoä CD19 CD22

10% 5 0
10 – 25% 2 2
25 – 50% 8 6
50 – 75% 5 6
> 75% 56 62
Toång coäng 76 76

56
COMMON B-ALL (90% BLAST)

57
PRO B-ALL (95% BALST)

58
PRO B-ALL

59
Lymphoproliferative disorder
(LPD)

60
Low Grade Mature B cell Lymphomas
• Chronic lymphocytic leukemia (CLL)
• Mantle cell lymphoma (MCL)
• Follicular lymphoma (FL)
• Marginal zone lymphoma (MZL)
• Extranodal marginal zone lymphoma (EMZL; “MALT”)
• Splenic marginal zone lymphoma (SMZL)
• Nodal marginal zone lymphoma
• [Lymphoplasmacytic lymphoma]
• [marginal zone lymphoma of bone marrow?]
• Hairy cell leukemia (HCL)
• Plasma cell disorders
 Lymphoproliferative disorder (LPD)
MARKER CLL PLL HCL SLVL FL MCL
SmIg w ++ ++ ++ ++ ++
CD5 + -/+ - - - +
CD10 - -/+ - - + -
CD19 ++ ++ ++ ++ ++ ++w
CD20 - ++ ++ ++ ++ ++b
/++w
CD22 -/w ++b ++ ++b ++/- +
CD23 ++ -/+ - +/- -/+ -
CD25 +/- - ++ -/+ - -
CD79b w/- ++ + ++ ++ ++
FMC7 -/+ + + ++ ++ ++
CD103 - - + -/+ - -
Cyclin D1 - + -/w - - ++ 62
63
64
 Tieâu chuaån B-CLL
(1) relative small cells (slightly bigger than a normal cells)
(2) weak to absent surface light chain (smIg /)
(3) CD5+ CD23+ coexpression is usually positivity
(4) Negative to weak CD79b
(5) weak CD22
(6) hetogeneous CD20 / weak CD20,
(7) FMC7 negativity.
 at least 4 - 5 features of B-CLL score

Increased CD38 expression is high risk

Szczepanski T (2003) Classification systems for acute and chronic leukaemia. Best
Practice Research Clinical Hematology, vol 16, no.4, pp. 561-582 66
 Tieâu chuaån B-LPD
Mature B-cells: CD19, CD20, CD22, HLA.DR, CD79b

 Monoclonal light chain Ig: Ig or Ig (or Ig–/Ig–)

 Homogeneous CD20: weaker or brighter than benign
 Mantle Cell Lymphoma (MCL): small to medium sized,
CD5+, CD23–
 Folicular Lymphoma: smIg+, CD10+, CD43–
 Burkitt‘s: CD10+, CD5-, CD43+,
BCL.2- BCL.6+, Ki67 100%,
 Hairy cells: CD103+, CD25+, CD11c+ 67
 Case reports
 Baïch caàu caáp doøng lympho B (B-ALL)
 Baïch caàu maïn doøng lympho B (B-CLL)
 Mantle Cell Lymphoma (MCL)
 Folicular Lymphoma
 Burkitt lymphoma
 Hairy cell lymphoma
 Plasmocyte

68
Common B-ALL (90%)

69
Common B-ALL (25%)
CLL
CLL (30%)

72
MCL Lymphoma (37%)

73
 Follicular Center Lymphoma (FL)
CD19+ (60%) : Large amount of B-cells
CD19+/CD5+ (<5%): Negative
CD19+/CD10+ (53%): Possitive

Tube has CD19, CD20, CD5, CD10, CD45 (FCL)

 Follicular Center Lymphoma (FL)

Tube has CD19, FMC7, CD23, CD5, CD45 (FCL)

FMC7 (58%) : Possitive

CD23 (<5%) : Negative
Lamda LC (90%): Possitive
BURKITT’S LYMPHOMA (ALL-L3)

FCI (+): CD19, CD20, CD22, CD79a, CD10+, CD43+++, sIg,

HCI (+): BCL.6+, BCL.2 -, Ki67~100%, IgM+

76
Burkitt (50%) CD10+ CD43+++ FMC7+/- CD5-CD23-CD24+

77
HAIRY CELLs

(+): CD19, CD20, CD22, CD79a, CD103, CD25, CD11c

78
Hairy Cell Lymphoma (7%)

79
Hairy Cell Lymphoma (13%)

80
Plasmocyte

81
Plasmocyte ác tính (77% plasmocyte)

89% cyKappa

82
Hạch có 53% monocyte

83
References:
• Flow cytometric analasis of leukemia and Lymphoma – The Basics
(Roman von H.Kohlmann, 2009)
• Classification systems for acute and chronic leukemias (Tomasz
Szczepanski, 2003)
• Immunophenotyping of acute leukaemias (Marie C. Bene, 2004)
• Immunophenotypic differentiation patterns of normal hematopoiesis in
human bone marrow: Reference patterns for age-related changes and
disease-induced shifts (E.G. van Lochem,… 2004)
• Bone Marrow pathology (K. Foucar, K.Reichard, D. Czuchlewski, 2010)
• Flow cytometry in Hematopathology: a visual approach to data analysis
and interpretation (D. Nguyen, L.W. Diamond, R.C. Braylan, 2007)
• Flow cytometry in clinical Diagnosis (D.F. Keren, J.P. McCoy, J.L.
Carey, 2001)
• Atlats of Differential diagnosis in neoplastic hematopathology
(Wojciech Gorczyca, 2008)

84
 Bộ phận DAMD - BV.TMHH
chân thành cám ơn sự lắng nghe của quí vị đại biểu.

85
CÂU HỎI ÔN TẬP

• Kể tên 5 CD liên quan đến dòng B?

• Liệt kê các đặc điểm kiểu hình DAMD tế bào plasmocyte hoạt hóa?
• Cách nhận biết B-ALL?
• Cách nhận biết các bệnh lý nhóm B-LBD?
• Một trường hợp có kiểu hình monoclonal B-cell với CD5+ CD10-, bạn
nghĩ có thể hướng tới những bệnh nào?
• Một trường hợp có kiểu hình monoclonal B-cell với CD5- CD10+, bạn
hướng tới những bệnh nào?
• Liệt kê các đặc điểm DAMD của bệnh B-CLL?
• Liệt kê các đặc điểm DAMD của bệnh Hairy cell?

86