Metode de analiza moleculara a genelor – Extractia ADN.

Reactia PCR. Tehnicile de analiza a mutatiilor genetice

cunoscute.
5.1 Extractia ADN-ului
5.1.1. Notiuni generale:
 metoda cloroform-fenol:
o Dezavantaje: tehnica laborioasa, consumatoare de timp, reactivii sunt toxici.
o Avantaje: ieftina, puritatea acizilor nucleici ridicata
Surse de ADN:
 Sange integral
 Celule din cavitatea bucala
 Culturi celulare
 Culturi bacteriene
 Biopsii sau rezectii
 Probe de medicina legala: lichide biologice, materiale textile, fire de par, fragmente de unghii;

Principii:
 Precipitarea, spalarea si apoi rehidratarea ADN-ului(ADN-ul devine vizibil)
 Retinerea ADN-ului intr-o coloana prevazuta cu o membrana silica urmata de eluarea sa intr-un tub
de colectare(ADN-ul nu devine vizibil in nici o etapa a extractiei)
Avantaje peste cele prin precipitare: durata purificarii ADN-ului mult mai mica(30min fata de 2-3
ore); nu are nevoie de alte etape cum este de exemplu rehidratarea;

5.1.2 Etapele extractiei ADN(precipitarea, din sange integral)

1. Liza tuturor membranelor celulare(cu exc: mb. Miticondriale si nucleare): se utilizeaza o solutie cu
rol de detergent, urmata de centrifugare => se sedimenteaza nucleii si mitocondriile
2. Liza membranelor nucleare +- ARN
3. Precipitarea proteinelor: urmata de centrifugare(ADN-ul nu este inca vizibil)
4. Precipitarea ADN-ului cu izopropanol
5. Spalarea ADN-ului cu etanol 70%;
6. Rehidratarea ADN-ului: se rehidrateaza complet in 12-24 ore la temperatura camerei sau 4 grade
sau rapida la 65 grade
5.1.3. Concentratia si puritatea ADN-ului

 Concentratia ADN-ului se masoara spectrofotometric(NanoDrop)

Factori: sange fara coagului, proba proaspata

 Puritatea: se calculeaza cu raportul A260/A280 = 1,6-2

5.2. Reactia PCR

5.2.1. Notiuni generale:
= amplificarea in vitro a fragmentelor ADN.

5.2.2. Materiale necesare

1. Matrita ADN
2. O pereche de primeri, sau amorse(secvente oligonucleotidice)
 3. ADN polimeraza rezistenta la temperaturi inalte de peste 90 grade(Termophilus Aquaticus => Taq
polimeraza)
4. MgCl2(Mg este cofactor pentru Taq polimeraza)
5. Deoxinucleotide trifosforilate(dNTP)(vor fi adaugate doar in directia 5’-3’)
6. Agent ce leaga inhibitorii reactiei de PCR – albumina serica bovina

5.2.3. Etapele reactiei PCR

Volum: 25l.

1. Denaturarea initiala(cateva minute la 94-96 grade): se desfac cele doua catene ale moleculei
matrita
2. Ciclurile propiu-zise de amplificare: 3 etape
a. Denaturare(zeci de secunde, 94-96 grade)
b. Hibridizarea primerilor(annealing)(zeci de secunde, 50-65 grade)
c. Extensie(elongare)(zeci de secunde, 72grade): Taq polimeraza adauga nucleotidele 5’-3’
Sunt necesare in general 30-35 de cicluri
3. Extensia(elongarea) finala(cateva minute la 72 grade)

5.3. Tehnici calitative

5.3.1. Tehnica PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism)
 Costuri reduse
 Numar mare de probe analizate

a. Enzimele de restrictie:
 Tehnica se foloseste de anumite enzime de restrictie capabile sa taie secvente specifice de
ADN, deobicei cu structura palindromica
 In genetica moleculara se folosesc enzimele de restrictie de tip II(taie intotdeauna la nivelul
sau in imediata apropiere a situsului de recunoastere)
 Enzimele au primit numele tulpinii bacteriene din care au fost izolate initial( Haemophillus
influenzae tulpina Rf => HinfI, Haemophillus influenzae tulpina Rd => HindIII)
 HaeIII si AluI produc blunt-ends(capete drepte)
 HindIII si MboI produc sticky-ends(caoete lipicioase)
b. Etapele tehnicii PCR-RFLP
1. Amplificarea prin PCR a fragmentului genomic care contine mutatia sau polimorfismul
studiat
2. Digestia ampliconilor cu enzima de restrictie corespunzatoare, timp de 2-16 ore, la 37 de
grade.
3. Electroforeza in gel de agaroza sau poliacrilamida a fragmentelor de restrictie
4. Interpretarea sub UV, dupa marvare cu bromura de etidiu, sau cu alti fluorocromi)

5.3.2. Tehnica ARMS-PCR(Amplification Refractory Mutation System)

 Se mai numeste si AS-PCR(Allele Specific PCR)
 Doar pentru studiul mutatiilor si polimorfismelor punctiforme
 Tehnica simpla
 Reltiv rapida
 Se bazeaza pe amplificarea PCR a fragmentului ADN utilizand 3 primeri; Primii doi sunt specifici
pentru alela normala, respectiv pentru alela mutanta; Al treilea primer hibridizeaza atat cu alela
normala cat si cu alela mutanta;
 Reactia decurge separat in doua eprubete; In prima se afla primerul pentru specific alelei normare
si primerul comun; In a doua se afla primerul pentru gena mutanta si primerul comun;
5.3.3. Tehnica tetra-primer PCR
 A derivat tehnica tetra-primer PCR;
 Se combina in acelasi tub 4 primeri
 2 sunt specifici pentru alela normala respectiv cea mutanta, dar se combina cu ceilalti doi
primeri(primeri externi, comuni);
 Dupa amplificare rezulta fragmente specifice pentru cele doua alele de lungimi diferite,
evidentiabile prin electroforeza.
 Prin compinarea celorlalti doi primeri => un fragment ADN mare cu dublu rol:
o Fragment de control
o Matrita pentru amplificarea fragmentelor specifice
Avantajul major fata de ARMS-PCR este posibilitatea studierii ambelor alele in acelasi tub
reducanduse numarul erorilor.

Avantaje majore ale tehnicilor PCR-RFLP si ARMS-PCR

 Metode relativ simple
 Tehnici robuste, reproductibile
 Costuri reduse

Dezavantaje majore ale tehnicilor PCR-RFLP si ARMS-PCR:

 Permit analiza doar a mutatiilor cunoscute
 Uneori, din cauza dificultatii legate de secventele de ADN, nu pot fi analizate
Metode de analiza moleculara a genelor – Analiza mutatiilor
genetice. Secventierea AND. Alte tehnici de diagnostic
molecular.
6.1. Secventierea AND
6.1.1. Utilizarea secventierii AND: utila cand nu se cunoaste exact mutatia genetica
6.1.2. Tipurile de tehnici de secventare a AND.
 Tehnica degradarii enzimatice
 Tehnica sintezei de AND
6.1.3. Principiul tehnicilor de secventare a AND(Sanger);
1. Se amplifica fragmentul AND care se dorestea a fi studiat prin PCR
2. Se migreaza electroforetic ampliconii si se purifica prin solutie sau prin decupare din gelul de
agaroza)
6.1.4. Necesarul si etapele tehnicii de secventare prin metoda Sanger
 Matrita
 Primer
 Taq polimeraza
 Deoxinucleotide trifosforilate
 Dideoxinucleotide trifosforilate marcate fiecare cu cate un fluorocrom diferit(4 pentru
fiecare tip de baza azotata)
6.1.5. Evaluarea cromatogramelor obtinute
 In timp pe migraeaza, ultimul nucleotid a fiecarui fragment este detectat, fiind marcat cu
un fluorocrom
 Secventele de peak-uri colorate diferit sunt comaparate cu bazele de date;
6.1.6. Avantajele si dejavantajele secventarii AND;
 Avantaje:
o Poate fi utilizata cand exista heterogenitate alelica sau de locus marcata
o Se pot verifica alte tehnici de genetica moleculara
 Dejavantaje:
o Costul ridicat al aparatului dedicat secventarii
o Costul ridicat al reactivilor aferenti
o Mai putin accesibila(nu toate laboratoarele sunt dotate)
6.2. Alte tehnici de diagnostic molecular
6.2.1. Tehnica SSCP(Single Stand Conformation Polymorphism)
 Destul de putin utulizata
 Se bazeaza pe propietatea AND-ului monocatenar de a forma punti de hidrogen
intramoleculare si implicit de a adopta structuri secundare particulare
 Mobilitatea moleculelor de AND depinde si de conformatia lor
 Se poate detecta aproape orice mutatie fara a preciza care este
 Se foloseste ca test de screening inainte de secventare
6.2.2. Tehnici cantitative de analiza a acizilor nucleici
 Relativ recente
 Utila atunci cand nu este suficienta doar amplificarea AND-ului ci este necesara si
cuantificarea lui
a. Tehnica Real-Time PCR:
 este asemanatoare cu amplificarea PCR, dar dupa fiecare ciclu este masurata
cantitatea de amplicon.
 Utilizata mai ales in oncohematoligie si microbiologie
  Se folosesc probe AND oligonucleotidice marcate fluorescent(probele Taqman)
care elibereaza o cantitate de fluorescenta proportionala cu cantitatea de AND
 Proba marcata este degradata de taq polimeraza care are si activitate
exonucleazica;
 Fluorescenta este detectata si convertita grafic intr-o curba de amplificare;
b. Tehnica revers-transcriptazei:
 Informatia poate sa circule si de la ARN la AND prin revers-transcriptie
 Ingrediente:
o Primeri nespecifici(hibridizeaza aleator cu diverse molecule de ARN
o Primeri poli-T(hibridizeaza specific doar speciile de ARN mesager, in
regiunea complementare poli-A a acetora)
o Revers transcriptaza
o Deoxinucleotide trifosforilate
o Inhibitor de RN-aza
 Se obtine AND complementar care poate fi folosit ulterior ca matrita pentru PCR
 ARN este o molecula monocatenara si susceptibila la degradare rapida
 Probele trebuie prelucrate foarte repede
 Solutii de prezervare a probelor biologice(Trizol, PAXgene, RNAShield)
6.3. Mutatiile genetice
 Sunt modificari ale secventei nucleotidice a AND-ului;
 Pot aparea spontan sau pot fi induse de anumiti agenti mutageni
 Mutatiile pot fi constitutionale(in toate celeulele) sau somatice(in unele celule=>
procese tumorale)
 Majoritatea mutatiilor sunt stabile
 Tipuri de mutatii:
o Substitutiile nucleotidice: mutatii puctiforme(inlocuirea unei singure perechi de
baze azotate)
 Cel mai frecvent tip de mutatie la om
 Tipuri:
 Tranzitii(inlocuirea unei baze de acelasi tip)
Apar mai des decat transversiile si se produc mai ales intre
citozina si timina;
 Transversii(inlocuirea unei baze de alt tip)
 Efectul subtisutiei
 La secventele codante(exoni)
- Mutatii silentioase(sinonime) => consecinta nula
- Mutatii cu sens gresit
 Conservative(apare un aa. Inrudit)
 Neconservative => patologie
- Mutaii nonsens => substitutia unui codon sens cu unul stop
- Mai rar apare substitutia unui codon stop cu unul sens =>
proteina mai lunga
 La secventele necodante(introni)
- Mutatii splice site care afecteaza situsurile de decupare a
intronilor, conduc fie la incorporarea unui intron in ARNm
matur fie la pierderea unui exon
- Mai rar pot fi afectate secventele 5’ UTR sau 3’ UTR caz in
care se modifica rata transcriptiei si implicit a sintezei
proteice
 La secventele reglatorii
 - Modifica rata transcriptiei sau stabilizarea moleculei de
ARNm, modificand rata sintezei proteice
o Deletii si insertii nucleotidice
 apar cel mai adesea in regiunile repetitive in tandem
 daca deletia sau aditia se produce in multiplu de 3 se adauga sau se
elimina un aminoacid in proteina codificata
 daca deletiile si insertiile nu sunt. Multiplu de trei, se produce o decalare
a cadrului de legatura cu consecinte nefavorabile
o Expansiunea tripletelor de nucleotide. Mutatiile dinamice
 Produse prin expansiunea insabila a unor repetitii trinucleotidice
 Apare fenotip patoligic numai dupa un anumit numar de repetitii
 Cu cat e mai mare numarul de repetii cu ata varsta de debut este mai
mica
Diagnosticul molecular – Aplicatiile geneticii in medicina legala
7.1. Domeniile de aplicatie ale geneticii in medicina legala

Domeniul:
 Civil:
o Analiza filiatiei -- stabilirea paternitatii: probe de la mama, tata, copil
o Analiza filiatiei – stabilirea inrudirii dintre indivizi cand se doreste identificarea unor resturi
umane
 Penal
o Identificarea resturilor umane direct prin obiecte personale sau indirect prin analiza filiatiei
o Identificarea persoanei utilizand probe biologice diverse precum pete de sange, lichid
soermatic, fire de par, saliva, fragmente de os, tegument
o Analiza filiatiei atunci cand vine vorba de acte pedepsite de legea penala(infanticid, incest)
Reguli:
 Evitarea contaminarii probelor de AND strain la recoltare
 Prevenirea contaminarii probelor de catre personalul de laborator
 Obtinerea unei cantitati mari de material biologic la recoltare, de calitate cat mai buna
 Evitarea confudarii unor probe printr-o etichetare si evidenta foarte clara
 Efectuarea analizei a tot personalului implicat in recoltarea si analiza probelor, urmata de insertia
profilului in baza de date

Tipuri majore de secvente variabile:

 VNTR(variable number of tandem repeats)

 STRs(short tandem repeats sequences)

Determinarea numarului de repetitii ale unei secvente aflata pe un locul specific

 Se utilizeaza PCR utilizand primeri specifici ce flancheaza zona in care se afla repetitia pentru a
amplifica secventa de interes
 Digestia de AND cu enzime de restrictie; Are loc o denaturare a AND bicatenar, obtinandu-se
fragmente de AND monocatenar; Se hibridizeaza cu fregmente VNTR specifice, marcate radioactiv;
Se reface AND-ul pe baza de complementaritate, iar apoi fragmentele obtinute se analizeaza pe gel
de electroforeza
 Secventele STR sunt mult mai scurte si cu un grad de heterogenitate ridicat; Fiecare persoana are
pe un locus un numar de repetitii matern si pe celalalt locus un numar de repetitii patern;
Denumirile alelelor STR au denumiri codificate D3S135(perechea a 3a de cromozomi)

Efectuarea analizei STR pentru determinarea profilului ADN

 Se face automatizat
 Se utilizeaza PCR dupa care se transfera automat proba amplificata intr-un secventiator
 Se secventeaza 9, 15 sau 15 loci STR
 Marker STR ideal:
o Secventele care flancheaza regiunea sa fie inalt conservate si specifice pentru a permite
legarea specifica a acelorasi amorse
o Secventa care se repeta sa fie constituita din 3-5pb
o Produsul de amplificare sa die mai mic de 350pb
o Frecventa heterozigotilor pentru un locus dat sa fie crescuta la nivelul populatiei
o Sa existe o stabilitate a alelelor in decursul generatiilor(conditie esentiala)
o Transmiterea sa fie independenta fata de alti markeri in decursul generatiilor
 In ceea ce priveste interpretarea profilul genetic trebuie sa se potriveasca in totalitate
 Uneori analiza nu se face la nivelul autozomilor ci la nivelul microsatelitilor de la nivelul
cromozomului Y => SRT-Y
 Analiza SRT-Y are si unele dezavantaje: pe linie paterna indivizii de sex masculin prezinta acelasi
cromozom Y(se reduce puterea de discriminare intre frati sau frati si tata)
 Se practica si analiza AND-ului mictocondrial in cazul in care nu se poate obtine o proba
suficient de buna
 La nivelul AND-ului micocondrial exista doua secvente varibile HV1 si HV2 ce prezinta mutatii
specifice la fiecare individ