1.

PRÁCTICA: 14

2. UNIDAD CURRICULAR: UNIDAD 4

3. TÍTULO: Proteínas conjugadas

4. OBJETIVOS:

 Identificar nucleoproteínas y sus elementos de composición mediante diferentes

reacciones químicas.

5. MÉTODOS Y FUNDAMENTOS:

Las proteínas conjugadas (también llamadas heteroproteínas) están formadas por una
fracción proteínica y por un grupo no proteínico, que se denomina grupo prostético. Dicho
grupo prostético puede contener lípidos, metales, vitaminas, etc. Las proteínas conjugadas
también se dividen en: nucleoproteínas, cromoproteínas, glicoproteínas, metal proteínas,
fosfoproteínas, etc. (Cox & Nelson, 2007)

Nucleoproteínas

Las nucleoproteínas constituyen uno de los grupos de proteínas conjugadas. Se

caracterizan por tener un grupo prostético, no proteico (el ácido nucleico), unido a una o
más moléculas de una proteína simple. La proteína simple por lo general es una proteína
básica como la protamina o una histona. Estas proteínas conjugadas se encuentran en
todos los tejidos de los animales y de las plantas, pero pueden ser aisladas con mayor
facilidad de las levaduras o bien de los tejidos que tienen gran número de células con
grandes núcleos, como el timo. (Cox & Nelson, 2007)

Aislamiento de la desoxirribonucleoproteína
Las desoxirribonucleoproteínas son el componente principal de los núcleos de las células.
Se denominan también proteínas de núcleo o nucleoproteínas. Una propiedad
característica de las nucleoproteínas es su capacidad de formar disoluciones muy viscosas
en las disoluciones concentradas de sales (NaCl y otras) y su insolubilidad en las
disoluciones salinas diluidas. Al ser precipitadas desde las disoluciones salinas, las
nucleoproteínas sedimentan en forma de hilos.

Reacciones de Reconocimiento del ADN

El ADN da una serie de reacciones coloreadas con las cuales éste puede ser distinguido
del ARN. Estas reacciones están condicionadas por la presencia en la molécula de la
desoxirribosa. Para descubrir el ADN, se emplea las reacciones con la Difenilamina (C6H5-
NH-C6H5) que da con la desoxirribosa y el ADN una coloración verde.

Obtención de la nucleoproteína a partir de levadura

Las levaduras son ricas en ribonucleoproteínas. Éstas pueden ser extraídas de las células
de levadura destruidas en un medio alcalino de la disolución, y precipitadas por acidulación.
 Hidrólisis de la nucleoproteína
Esta reacción puede verificarse mediante la ebullición de la nucleoproteína con el ácido
sulfúrico al 5% durante 1 hora. La nucleoproteína se desdobla en proteína y ácido nucleico.
Este último se descompone en mononucleótidos individuales, de los cuales luego se
desprende el ácido fosfórico y las bases púricas (adenina y guanina). La proteína mientras
tanto, también se somete a hidrólisis parcial hasta polipéptidos de bajo peso molecular y
aminoácidos. En el hidrolizado pueden ser determinados, la proteína, bases púricas,
pentosa y ácido fosfórico.

Detección de las proteínas sencillas

Para este fin pueden emplearse dos reacciones, la de Biuret y la de Millon. El Reactivo de
Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos
con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida.
Está hecho de hidróxido potásico y sulfato cúprico, junto con tartrato de sodio y potasio. El
reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se
combina con polipéptidos de cadena corta.
El reactivo de Millon es una mezcla de nitrato y nitrito mercúrico disueltos en ácido nítrico
concentrado. La presencia, en la molécula de proteína, de la tirosina produce una coloración
roja que se debe a la formación de nitro tirosina que, por adición de mercurio en el curso
del calentamiento, se transforma en una sal mercúrica de color rojo.

Detección de las pentosas

Los nucleótidos son formaciones de ácido fosfórico, una pentosa y una base. Se realiza
una de las reacciones de oxidación de las aldopentosas. Para ello se realiza la reacción de
Fehling.

Detección de las bases Púricas

La esencia de la reacción se reduce a la formación de sales de plata de la bases púricas,
que se precipitan al fondo del tubo de ensayo.

Detección del ácido fosfórico

Los nucleótidos son formaciones de ácido fosfórico, una pentosa y una base. Las
nucleoproteínas, al contener ácidos nucleicos como grupo prostético, contendrán ácido
fosfórico como parte de su estructura total al momento de hacer la prueba, lo que evidencia
y confirma la naturaleza de dicha macromolécula. (Martínez, 2008).
Al reaccionar el ácido fosfórico con el molibdato de amonio se forma un complejo de
fosfomolibdato [(MoO24MoO3)2H3PO4] que en presencia del ácido ascórbico es reducido
a azul de molibdeno y toma una coloración azul. (AOAC, 2012)
GLICOPROTEÍNAS
Son proteínas conjugadas compuestas por las proteínas sencillas y grupo prostético en
cuya composición entran los hidratos de carbono tanto del tipo de homopolisacáridos, como
de heteropolisacáridos.
6. PARTE EXPERIMENTAL

6.1 Instrucciones previas

Es obligatorio el uso de prendas de seguridad: mandil, guantes de nitrilo o látex,
mascarilla en el caso de que los reactivos o las reacciones desprendan gases, y gafas
protectoras.

6.2 Equipos, materiales y reactivos

Materiales y equipos Reactivos Muestra

 Arena de vidrio
 Baño maría
 Centrifugadora
 Matraz 25ml
 Mortero con pistilo
 Papel tornasol
 Probeta 25ml
 Soporte con tubos
ensayo
 Termostato 40°C
 Varilla de agitación
 Vidrio reloj
 Ácido acético 5%  Tejido (hígado de
 Ácido ascórbico 0,04% res, pollo)
 Ácido sulfúrico 5%  5g Levadura
 Agua destilada prensada
 Amoníaco concentrado
 Cloruro de sodio 1N
 Éter dietílico
de  Fehling A
 Fehling B
 Hidróxido de sodio 0,4%
 Hidróxido de sodio 10%
 Molibdato de amonio
 Reactivo de Biuret
 Reactivo de difenilamina
 Reactivo de Millon
 Solución amoniacal de
plata
 Sulfato de cobre 1%

6.3 Procedimiento

 Aislamiento de la desoxirribonucleoproteína
Primero se desmenuzan 2 gramos de tejido con tijeras sobre el vidrio reloj y luego se
trituran en el mortero. En el mortero se añaden, por porciones pequeñas, de 70 a 80 mL de
disolución de NaCl 1 N, triturando el contenido cuidadosamente durante 10 o 15 minutos.
La disolución viscosa obtenida se reparte en las probetas de centrífuga y se lleva a
centrifugar a 2500 o 3000 rpm. Luego el líquido se decanta en la probeta graduada y se
mide su volumen.
Se toma un volumen séxtuplo de agua (con respecto al líquido centrifugado), se vierte en
el vaso y girando lentamente la varilla de madera en el agua, se le agrega el líquido
centrifugado. Los hilos de nucleoproteína formados se arrollan sobre la varilla, se trasladan
con cuidado a un tubo de ensayo y se usan posteriormente para realizar las reacciones de
reconocimiento de ADN.

 Reacciones de Reconocimiento del ADN

Una pequeña cantidad del precipitado de desoxirribonucleoproteína se traslada a un tubo
de ensayo y se disuelve en 1 mL de NaOH. Se añade igual volumen de reactivo de
difenilamina (hasta disolver el precipitado) y el tubo se pone en el baño María hirviendo
donde se mantiene durante 15 o 20 minutos. Se observa una coloración azul.

 Obtención de la nucleoproteína a partir de levadura

En el mortero se colocan 5 g de levadura, se añade 10 gotas de éter y 10 gotas de agua,
una pulgada de arena de vidrio, se tritura cuidadosamente. A la masa homogenizada se le
agregan 30 mL de disolución de NaOH y se sigue triturando durante 15 minutos más. El
contenido del mortero se reparte en 3 probetas de centrífuga, llevando el volumen a 10 mL.
Se centrifugan durante 5 o 10 min a 2500 rpm. El líquido de todas las probetas se decanta
en un vaso donde se vierte la disolución de ácido acético (12 mL) removiendo
constantemente con la varilla hasta la completa precipitación de la nucleoproteína. El
precipitado de la nucleoproteína se separa mediante otra centrifugación y se utiliza para la
reacción de la hidrólisis.

 Hidrólisis de la nucleoproteína
La nucleoproteína obtenida a partir de la levadura a partir de la levadura se traslada al
matraz para hidrólisis y se le añade 15 mL de disolución de ácido sulfúrico al 5%. El matraz
se cierra con un tapón provisto de refrigerante de reflujo y se hierve con cuidado durante 1
hora.
Al enfriarse, el hidrolizado se filtra en el vaso y se utiliza para el análisis de los productos
de hidrólisis.

 Detección de las proteínas sencillas

En un tubo de ensayo se vierte 0,5 mL de hidrolizado filtrado, éste se neutraliza por el papel
tornasol con NaOH y se añade 0,5 mL de NaOH, luego se agregan 2 o 3 gotas de sulfato
cúprico. El tubo de ensayo se agita y se observa la reacción de Biuret positiva (coloración
rosada o violeta).En otro tubo de ensayo se vierte 1 mL de hidrolizado y se añade 0,3 mL
de reactivo de Millon. Se calienta y el precipitado adquiere un color rosado o rojo ladrillo.

 Detección de las pentosas

En un tubo de ensayo se vierte 0,5 mL de hidrolizado filtrado, éste se neutraliza por el papel
tornasol con disolución de álcali. Al hidrolizado neutralizado se añade igual volumen de
reactivo de Fehling, el tubo se agita y la capa superior del líquido se calienta. Se observa la
aparición de un precipitado rojo amarillo de óxido cuproso e hidróxido cuproso.

 Detección de las bases Púricas

En un tubo de ensayo se vierten 2 mL del hidrolizado de la nucleoproteína, se añaden 5 o
6 gotas de amoníaco concentrado hasta la reacción alcalina por el papel tornasol, luego se
agrega 0,5 mL de la disolución amoniacal de plata. Aparece un precipitado en forma de
copos de sales de plata y bases púricas que sedimentan, paulatinamente al fondo.

 Detección del ácido fosfórico

En un tubo de ensayo se vierten 2 mL del hidrolizado de la nucleoproteína, se añaden 3 mL
de molibdato amónico y 1 mL de ácido ascórbico. Se mezcla cuidadosamente y se observa
la aparición de una coloración azul que puede ser acelerada mediante calentamiento en el
baño María hasta 40°C.

 Aislamiento de la mucina de la saliva

En tres tubos de ensayo se colectan 1 ó 2 mL de saliva en cada tubo y se añade, gota a
gota, una disolución de ácido acético al 1% hasta aparecer flóculos de mucina. El
precipitado de mucina se lava cuidadosamente con agua, deteniendo el flóculo con la varilla
de vidrio.
Después del lavado, al flóculo de la mucina en el primer tubo de ensayo se le añade 1 mL
de disolución de hidróxido de sodio al 10%, se mezclan y al diluirse la mucina, se realiza la
reacción de Biuret. Para ello además se añaden 5 ó 6 gotas de hidróxido de sodio y 1 ó 2
gotas de sulfato cúprico. El tubo de ensayo se agita y se observa un cambio de color por el
rosa o violeta.
En el segundo tubo de ensayo se añade 1 mL de disolución de ácido clorhídrico al 0.1%, y
se observa la disolución de la mucina.
Al flóculo de mucina en el tercer tubo se añade 5 ó 6 gotas de α-naftol, se mezcla y se
agrega, con cuidado por las paredes, ácido sulfúrico concentrado. En el límite entre dos
capas del líquido surge una coloración violeta. La reacción es debida a la presencia, en el
grupo prostético, de la mucina de los monosacáridos y sus derivados que bajo la influencia
del ácido sulfúrico se convierten en furfural e hidroximetilfurfural, y estos últimos dan color
con el α-naftol sustancias coloreadas.

7. BIBLIOGRAFÍA

A.V. Chechetkin, V.I. Voroniaski, G.G. Pokusay. (1984) Prácticas de Bioquímica del ganado
y aves de corral. Mir – Moscú.

Cox, M. y Nelson, D. (2007). Principios de bioquímica (Quinta edición). Barcelona:

Ediciones Omega.

Martinez, R & Gragera, M (2008). Fundamentos teóricos y prácticos de la histoquímica.

Madrid:
Consejo Superior de Investigaciones Científicas.

Official Methods of Analysis of AOAC International (2012). “Phosphorus (Total) in Foods”,

Colorimetric Method. 19th edition. Volume II. Editor: George W. Latimer, Jr. Chapter 45 p.
50, (45.4.07) páginas 50 – 52. Método 995.11