Sunteți pe pagina 1din 165

MICROBIOLOGIE

APLICATA
S.l.dr.ing. Alexandra Blaga
Microorganisme & Microbiologie
Microorganisme Microbiologia
• este o ştiinţă fundamentală care studiază
• sunt sisteme cu organizare morfologia, fiziologia şi sistematica
complexă, monocelulare sau microorganismelor, originea şi evoluţia lor,
pluricelulare, cu metabolism propriu fenomenele de ereditate şi variabilitate
şi continuitate genetică, cu o infinită microbiană.
diversitate a caracterelor • Etimologia cuvântului provine din limba
greacă:
morfologice şi fiziologice.
micros = mic; bios = viaţă; logos = ştiinţă.

• În sensul acestei definiţii din


imensul grup al microorganismelor
fac parte:
bacterii,
alge microscopice,
fungii (drojdii – levuri şi
mucegaiuri – fungi filamentoşi),
protozoare etc
Microorganismele
• sunt ubicuitare
• majoritatea nepatogene
• unele condiţionat patogene
• un mic procent patogene

În contrast cu dimensiunile atât de mici ale microorganismelor, rolul lor în


natură este imens. Implicate direct în uriaşele transformări ale materiei
organice nevii, prin procese de putrefacţie-putrezire, fermentaţii etc.,
microorganismele asigură în natură un circuit al principalelor elemente
universale ce intră în structura organismelor vii şi au rol vital în menţinerea
ecosistemelor, deoarece fără activitatea lor „pământul s-ar transforma
într-un uriaş cimitir”.
Rolul microorganismelor în viaţa
organismului uman
Microflora normală a organismului uman este complexă şi uneori foarte bine
dezvoltată.
Experimentările făcute pe animale sterile, lipsite de microflora lor normală, aşa
numitele animale „germ free”, arată stări anormale privind evoluţiei lor, constatându-se
că:
• organele lor au mărimi şi capacităţi funcţionale mai reduse;
• intestinul este mai subţire, mai puţin musculos, lipsit de tonus, dar funcţional;
• cecum (un segment a intestinului gros) este foarte dezvoltat;
• dejectele nu au miros fecal şi amoniacal;
• sistemul limfatic este slab dezvoltat;
• fagocitele sunt pasive;
• carne lor este fadă şi lipsită de miros.
Rolul microorganismelor în viaţa
organismului uman
Microflora normală intestinală are asupra organismului gazdă efecte
favorabile funcţionării sale. Aceste efecte favorabile se datoresc faptului că
microorganismele intestinale îndeplinesc următoarele în intestinul uman:
• sintetizează vitamine necesare metabolismului normal a organismului
uman;
• stimulează mecanismele de apărare ale organismului gazdă determinînd
o creştere a imunităţii nespecifice;
• contribuie la dezvoltarea normală a unor organe , cum ar fi : intestin,
organe limfatice, prin acţiunile lor morfogenetice.
• Toate acestea arată că omul poate trăi şi fără multe dintre populaţiile
microbiene, dar se dezvoltă mai bine în prezenţa lor.

MICROFLORA NORMALĂ A ORGANISMULUI
UMAN
• Corpul omului oferă microorganismelor condiţii favorabile de dezvoltare.Ele găsesc pe/în
corpul uman toate componentele de care au nevoie pentru dezvoltare.Cu toate acestea
corpul uman nu reprezintă un mediu uniform în totalitatea sa, deoarece fiecare regiune sau
organ diferă din punct de vedere chimic, fizic şi biochimic de alte regiuni sau organe, ceea ce
facilitează existenţa şi dezvoltarea numai a anumitor specii microbiene.
• La om pielea, caile respiratorii superioare, tubul digestiv şi alte organe şi cavităţi,
constituie o largă varietate de habitate, în care diferitele microorganisme se dezvoltă
selectiv.Intre aceste habitate şi microorganismele ce le populează se stabilesc diferite tipuri
de interrelaţii a căror natură este greu de determinat, datorită faptului că acestea sunt
supuse influenţei factorilor de mediu. In anumite condiţii, o interrelaţie poate fi benefică, în
timp ce în alte condiţii ea devine chiar dăunătoare.
• La om microorganismele se întânlesc pe şi în organism sau organe, fapt pentru care
microflora poate fi analizată zonal, astfel se poate distinge o microfloră a:
• pielii,
• cavităţii bucale,
• căilor respiratorii,
• tubului digestiv, şi a
• căilor geneto-urinare.
• In mod normal microorganismele nu pătrund în intimitatea tesuturilor şi organelor, în sînge
sau limfă.Dacă totuşi ajung în aceste medii în mod accidental ele produc boli infecţioase.
MICROBIOLOGIA PRODUSELOR FARMACEUTICE
1. Contaminarea microbiană a medicamentelor

 Contaminarea produselor farmaceutice cu germeni patogeni, condiţionat patogeni sau


chiar nepatogeni, ridică din ce în ce mai mult probleme de sănătate publică, colectivă sau
individuală.
 Medicamentele contaminate prezintă mare risc în cazul arsurilor, plăgilor şi ulceraţiilor
grave, mai ales când sunt implicate mari suprafeţe epidermice denudate.
 Utilizarea aerosolilor ca vehicul pentru introducerea medicamentului în regiuni lipsite de
germeni, cum ar fi alveolele pulmonare, impune o exigentă puritate microbiană.
 Fabricarea medicamentului pe cale industrială favorizează contaminarea microbiană. Cu
alte cuvinte, controlul microbiologic este şi un indicator calitativ, arătînd acurateţea
respectării procesului tehnologic de fabricare a medicamentului. Procesul se poate urmări
de la materia primă pînă la produsul finit.
 Problema contaminării microbiologice a medicamentului devine şi mai dificilă dacă ne
referim la marea capacitate metabolică a microorganismelor de a se adapta la temperaturi
diferite, pH-uri diferite şi chiar capacitatea de a utiliza anumite substanţe ca unică sursă de
carbon sau azot prezente în medicamente.
Secţia analize microbiologice (ANM)
este parte a Laboratorului pentru Controlul Calităţii Medicamentelor.

Secţia analize microbiologice efectuează următoarele funcţii de bază:

 Controlul microbiologic al materiei prime, medicamentelor indigene şi de


import, în conformitate cu prevederile documentaţiei analitico-normative în
vigoare;
 Determinarea activităţii antimicrobiene a antibioticelor;
 Aprecierea activităţii antagoniste şi activităţii specifice a medicamentelor;
 Controlul ulterior selectiv (prin sondaj) a apei purificate, formelor medica-
mentoase extemporale, a substanţelor medicamentoase, prelevate din
farmacii;
 Acordarea ajutorului consultativ-practic privitor la respectarea regimului
sanitar în unităţile farmaceutice.
CONTROL MICROBIOLOGIC
De la sampon si ruj pana la cremele de fata, produsele cosmetice
sunt folosite pentru a ajuta la mentinerea tenului curat, in stare
proaspata si chiar pentru a etala o alura mai tanara si atractiva.

Cu toate acestea, produsele cosmetice prezinta un risc de


contaminare microbiologica.

Exista multe ocazii in care un produs cosmetic poate fi


contaminat de microorganisme.

Microorganismele se multiplica apoi exponential iar


numarul mare de bacterii pot provoca efecte negative
asupra calitatii produselor si sanatatii consumatorilor,
variind de la infectii la reactii alergice severe.
Calitatea microbiologică a produselor cosmetice
Informațiile sunt esențiale pentru a justifica eficacitatea sistemului de conservare și
pentru a justifica valabilitatea minimă indicată a produsului cosmetic și perioada de
utilizare după deschidere (PAO) a produsului finit

- se acordă o atenție specială specificațiilor microbiologice ale produselor


cosmetice destinate a fi utilizate pe părți sensibile ale corpului și la populații
specifice (la copiii sub trei ani, la persoanele în vârstă sau la persoanele cu
sistem imun compromis), ale produselor cosmetice destinate a fi utilizate în jurul
ochilor, pe mucoase în general, pe pielea care prezintă leziuni (de exemplu,
produsele de îngrijire a pielii utilizabile pe pielea atopicilor sau pe pielea iritată)
Control microbiologic
Identificare
microorganisme

Medii de cultura
IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA MICROORGANISMELOR

Pentru a putea fi studiat un microorganism trebuie


scos din mediul în care trăieşte în mod natural.
Scoaterea unui microorganism din mediul lui natural
de face prin metode de izolare.

Prelevarea (recoltarea probelor) este operaţia prin care specialistul reţine un


eşantion dintr-un mediu natural sau produs ce urmează să fie analizat.
Numărul de probe prelevate, trebuie să varieze în funcţie de obiectivul
urmărit, de densitatea posibilă a microorganismului de izolat sau de
răspîndirea sa într-un anumit interval de timp.
Microorganismele sunt raspândite pretutindeni în natură: aer, apă, sol şi
pe suprafaţa corpului vieţuitoarelor, pe toate obiectele pe care le manipulăm. În
cercetările de microbiologie, este necesar să se asigure sterilitatea mediului de
laborator şi a aparaturii cu care se lucrează. Prin steril în microbiologie se
înţelege lipsa totală a oricăror microorganisme de pe suprafaţa şi din interiorul
obiectelor, dintr-un spațiu sau de pe o suprafaţă. Această condiţie este asigurată
prin operaţiunea numită sterilizare.
Prin sterilizare se înţelege distrugerea sau îndepărtarea tuturor
microorganismelor, atât în formă vegetativă, cât şi sub formă de spori, din
medii sau de pe obiectele supuse sterilizării.
A. STERILIZAREA PRIN AGENŢI FIZICI
Dintre agenţii fizici cu acţiune sterilizantă cei mai importanţi sunt:

1. sterilizare prin caldură uscată:


• sterilizare prin flambare;
• sterilizare prin încălzire la roşu;
• sterilizare prin prin aer cald.

2. sterilizare prin caldură umedă:


• sterilizare prin fierbere;
• sterilizare prin vapori de apă sub presiune;
• sterilizare prin pasteurizare;
• sterilizare prin tindalizare.

3. sterilizare cu razele ultraviolete;

4. sterilizare cu ultrasunetete.
B. STERILIZAREA PRIN FILTRARE

Tipuri de filtre:

• Filtre Chamberland. Sunt confectionate din portelan, având forma


de bujii.
• Filtre BerKefeld, din kiselgur
• Filtre Seitz, din azbest
• Filtre de sticlă - Schott-Jena
• Membrane filtrante: celuloza, PTFE, PVDF.
C. STERILIZAREA PRIN AGENŢI CHIMICI

Pentru sterilizarea prin agenti chimici este folosit în special termenul de dezinfectie.
Ea are drept scop distrugerea germenilor patogeni în vederea înlaturarii posibilitatilor de infectie.
Se folosesc în mod curent urmatorii agenti chimici sterilizanti, de uz curent:
 solutia de sublimat corosiv 0,1%, pentru dezinfectia meselor, mobilierului din sticla si
faianta, pentru dezinfectia mai riguroasa a mâinilor;
 solutia de bicromat de potasiu 5%, pentru dezinfectia pipetelor întrebuintate;
 alcool etilic 70%, pentru dezinfectia curenta a mâinilor;
 formol 40%,
 fenolul în concentratie de 5%, pentru dezinfectia diferitelor obiecte din sticla, portelan,
metal;
 apa oxigenata în concentratie de 3%, pentru dezinfectia mâinilor si mucoaselor;
 solutie de hidroxid de sodiu 20%, pentru sterilizarea mobilierului si dusumelelor;
 cloramina 1%, pentru dezinfectia mâinilor, iar în concentratie de 5-6%, pentru
dezinfectia meselor de laborator
 clorul pentru dezinfectia apei;
 diferiti detergenti, pentru dezinfectia sticlariei si a rufelor.
Sterilizarea prin agenti chimici este folosita în laboratoarele de microbiologie numai pentru
obiectele si materialele întrebuintate. De asemenea, se mai folosesc agenti chimici sterilizanti si
pentru conservarea lichidelor organice (ser sanguin, sânge, urina) si a altor materiale biologice
(seruri imune si vaccinuri).
Un mediu de cultură reprezintă un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie
să asigure microorganismelor cantitatea necesară de apă, sursa de carbon, de
azot, săruri minerale, factori de creştere, deci care să le furnizeze substanţele şi
energia necesare în procesele de creştere, reproducere şi întreţinerea funcţiilor
vitale.
Mediul de cultură trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
 să corespundă din punct de vedere nutritiv,
 să aibă o concentraţie a substantelor dizolvate care să nu influenţeze
negativ schimburile osmotice ale celulei
 să nu conţină substanţe toxice,
 să aibă un anumit pH
 să fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel încât să se dezvolte numai
celulele introduse prin inocul.
După scopul utilizării lor, mediile de cultură se împart în:
A. medii de cultura de laborator
• medii de cultură simple (generale) care asigură dezvoltarea unui mare număr
de specii
• medii de cultura complexe care sunt utilizate la izolari de microorganisme,
pentru cresterea si pastrarea lor
• medii de cultură speciale:
 selective care permit dezvoltarea unui număr restrâns de microorganisme
 de diferenţiere care permit separarea speciilor în funcţie de anumite
caractere biochimice
 de îmbogăţire destinate separării şi cultivării unor microorganisme
pretenţioase din punct de vedere nutritiv sau care se află în număr redus
 de conservare destinate mentinerii in viata si pastrarea proprietatilor
fiziologice si biochimice ale microorganismelor
B. medii de cultură industriale

Din punct de vedere al compoziţiei chimice, mediile de cultură se împart în 3


categorii:
 medii naturale de origine animală sau vegetală;
 medii sintetice;
 medii semi-sintetice.
Un mediu de cultura poate fi definit ca un suport
nutritiv steril, care permite dezvoltarea si studiul unui
microorganism in afara nisei ecologice naturale.

Biosinteza constituentilor celulari este conditionata de


prezenta în mediu a unei surse adecvate de energie
si a unor cantitati convenabile de compusi cu
greutate moleculara mica, utilizati ca precursori sau
ca materiale de constructie, iar rezultatul
metabolismului de biosinteza este cresterea si
multiplicarea celulei.

Desi în practica se folosesc medii de cultura


complexe, incluzând diverse peptone, extracte de
carne sau vegetale, saruri minerale, pentru o serie
întreaga de germeni exista astazi indicatii precise cu
privire la substan]ele de baza utile dezvoltarii, fapt ce
face posibila utilizarea mediilor sintetice. Datorita
folosirii acestor medii, în care formula tuturor
substantelor componente este cunoscuta si, mai ales,
datorita încorporarii de constituenti marcati radioactiv,
s-au putut elucida o serie întreaga de procese
metabolice, aratându-se etapele pe care le parcurg
diversele substante în biosinteza celulara.
Cunoscându-se însusirile germenilor studiati, conditiile lor optime de
dezvoltare, bacteriologul trebuie sa foloseasca mediile cele mai
eficiente si indicate pentru izolare, identificare si crestere, în functie de
specia microorganismului de interes.

Progresele realizate în domeniul biochimiei generale, descoperirea


diverselor cai metabolice si a particularitatilor acestora, evidentierea
diferentelor metabolice între speciile bacteriene, au permis cunoasterea
amanuntita a necesitatilor nutritive ale microroganismelor, care sunt
diferite de la o specie la alta. Exista unele bacterii care se pot înmulti
bine într-un mediu format numai din apa, la care s-a adaugat amoniac,
carbonat si urme de saruri minerale, în schimb altele au nevoie de
substante organice speciale pentru dezvoltare (ser sanguin, sânge total
etc.).

Oricare ar fi însa gradul de complexitate al substantelor necesare


cresterii unei bacterii, se constata întotdeauna ca anumite elemente ca:
apa, substantele minerale, sursele de azot si carbon, sunt
indispensabile tuturor microorganismelor. În afara de aceste necesitati
generale pentru nutritie, unele bacterii, dotate cu o capacitate de
sinteza mai redusa, au nevoie si de anumite substante speciale,
cunoscute sub numele de “factori de crestere” sau “vitamine
bacteriene”.
Pentru a putea fi studiat un microorganism trebuie scos din mediul în care trăieşte
în mod natural.
Izolarea unui microorganism, constă în operaţii de
1. Prelevarea unor probe biologice dintr-un mediu potenţial,
2. Cultivarea eşantioanelor de probă în laborator pe un mediu de cultura steril şi
3. Separarea microorganismelor din probă
4. Identificarea şi caracterizarea microorganismului.
Tehnica plăcilor turnante a lui Koch ne indică că diluţia la care trebuie să se
lucreze în cazul bacteriilor este de 1/100.000, iar în cazul ciupercilor diluţia optimă
este de 1/1.000.

Metodologia de identificare şi caracterizare a unui microorganism cuprinde o serie


de teste:
 morfologice,
 fiziologice,
 biochimice,
 serologice şi genetice.
Microorganisme
• sunt elemente de bază în microbiologie si biologie celulara, sunt
organisme vii, fiind instrumente de cercetare, producatori de
compusi deosebit de importanti pentru industrie, combustibili, si baza
pentru predare si educatie în microbiologie.
• sunt cultivate si utilizate in numar mare, in laboratoarele si industria
din intreaga lume.
• trebuie menținute fara modificari pentru a se asigura
reproductibilitatea si durabilitatea acestor procese.
• microbiologii stabilesc de multe ori colectii proprii de laborator pentru
a se asigura ca tulpinile lor cheie sunt mentinute pentru o utilizare
viitoare si pentru confirmarea rezultatelor.
Colectii de culturi
• Sub formă de culturi pure sunt pastrate microorganismele
aflate in studiu sau care prezinta proprietati de biosinteza
remarcabile, culturi intretinute si înregistrate in colectii
autorizate de microorganisme, denumite micoteci.
• Colectiile de culturi sunt deosebit de importante pentru
comunitatea stiintifica . Prima colectie a fost infiintata de
catre Franticek Kral la Praga spre sfarsitul secolului al
XIX-lea. In anii care au urmat, mai multe colectii de culturi
celulare s-au stabilit la nivel mondial.
• Rolul primordial al acestor colectii a fost de a oferi
comunitatii stiintifice si industriale, acces la culturi
autentice si sfaturi de specialitate cu privire la cultivarea si
conservarea lor.
Organizare
Din punct de vedere organizatoric, susținerea activităților de
colectare se realizeaza la nivel național:
• United Kingdom Federation for Culture Collections - UKFCC,
• United States Federation for Culture Collections - USFCC,
• Japan Federation for Culture Collection - JFCC,
• United Kingdom National Culture Collection - UKNCC,
• Belgium Coordinated Collection of Micro-organisms - BCCM .
la nivel european exista
• Organizația Europeana a Colecțiilor de Culturi (European Culture
Collection Organisation ECCO),
iar la nivel internațional:
• Federația Mondială a Colecțiilor de Culturi (World Federation for Culture
Collections - WFCC),
• Baza de Date de Tulpini Microbiene (Microbian Strain Data Network -
MSDN),
• Centrele de Resurse Microbiene (Microbial Resource Centres -
MIRCENs).
DENUMIREA ȘI CLASIFICAREA
MICROORGANISMELOR

• Sistemul Linnaeus de nomenclatura științifică

• Fiecare organism are doua nume :


1 ) Genul
2 ) Specia
Denumire stiintifica
• Înclinat (italic) sau subliniat.
• Genul este scris cu litera mare, iar specia (denumirea
specifica) este cu litere mici

• De origine latina
e.g. Escherichia coli (E. coli)
- a fost descoperita de : Theodor Escherich
In intestine
- descrie habitatul obisnuit (colon/intestine)

e.g. Staphylococcus aureus (S. aureus)


- Aglomerari (staphylo), sferice (cocci)
- Colinii colorate in auriu(aureus) Pe piele
Principalele categorii de nomenclatură microbiană
• Specia,
• Genul,
• Familia,
• Ordinul,
• Clasa,
• Diviziunea
• Domeniul.
Escherichia coli
Exemplu
Tulpina microbiană,
Specia, coli
Genul, Escherichia
Familia, Enterobacteriaceae
Ordinul, Enterobacteriales
Clasa, Gammaproteobacteria
Diviziunea sau filum Proteobacteria
Domeniul Bacteria
Clasificare
• regnul Monera include organisme monocelulare de tip procariot cu nutriţie
de tip absorbtiv, cu metabolism fotosintetic sau chimiosintetic şi
reproducere prin diviziune asexuată;
• regnul Protista include organisme monocelulare de tip eucariot (inclusiv
drojdii). Modul de nutriţie este diferit de la un grup la altul, prin absorbţie
sau ingestie şi reproducere sexuată/asexuată;
• regnul Fungi cuprinde organisme multinucleate de tip eucariot
(mucegaiuri) cu nuclei dispersaţi în citosolul hifelor adesea septate, lipsite
de plastide şi pigmenţi fotosintetici, cu nutriţie de tip absorbtiv şi
reproducere pe cale sexuată şi asexuată;
• regnul Plantae, cu organisme multicelulare de tip eucariot, cu perete
celulozic, vacuole în citoplasmă şi pigmenţi fotosintetici în plasmide. Modul
principal de nutriţie este cel fotosintetic şi reproducerea predominant
sexuată;
• regnul Animalia, cu organisme multinucleate de tip eucariot fără perete
celular, cu nutriţie predominant prin ingestie şi reproducere sexuată.
Classificare

Domeniu

Bacteria Archaea Eukarya


Plante, Animale, Fungi

Microorganisme
Include protozoare, alge, virusuri, bacterii
Clasificare
Procariote • Celula procariotă are o organizare simplă. Ea este formată
din perete celular, membrană, citoplasmă şi un nucleu
Bacterii primitiv, atipic, reprezentat de un cromozom gigant ce
pluteşte liber în citoplasmă.Toate celulele procariote nu
Familia Genul au o structurare definită a “nucleului” lor. El este lipsit de
Neisseriaceae Naisseria, Vellonella membrană nucleară, nucleol şi nucleoplasmă. Informaţia
Micrococcaceae Staphylococcus,Gaffkya,Sarcina, genetică este depozitată la nivelul cromozomului şi este
Micrococcus. codificată într-o singură moleculă de ADN. In timpul
Lactobacteriaceae Diplococcus, procesului de multiplicare, în citoplasma nedivizată, pot
(Lactobacillaceae) Streptococcus,Eubacterium,Lacto exista mai mulţi cromozomi care însă sunt identici,
bacillus rezultând din dedublarea cromozomului unic.
Corynebacteriaceae Corynebacterium, Listeria • Citoplasma celulelor procariote este lipsită de curenţi
Bacillaceae Bacillus, Clostridium citoplasmatici. Ea nu conţine organite delimitate de
Enterobacteriaceae Salmonella, Shigella, Escherichia, membrane superior organizate. In interiorul ei nu există un
Klebsiella, Proteus, Cytrobacter, reticul endoplasmatic organizat, ci numai sisteme
Serratia, Hafnia, Aerobacter. membranare izolate.
Bacteroidaceae Capsularis, Zuberella • Membrana plasmatică este bine reprezintată şi are o
Brucellaceae Brucella, Pasteurella, Hemophilus, organizare tipică tuturor membranelor celulare.
Bordetella, Moraxella, • Peretele celular, cu foarte mici excepţii (micoplasmele) este
Acinetobacillus. prezent la toate procariotele. El este un perete rigid,
Pseudomonadaceae Pseudomonas aceasta datorită prezenţei în structura sa a unui polimer
Spirillaceae Vibrio, Spirillum complex, un mucopolizaharid, cunoscut sub numele de
Mycobacteriaceae Mycobacterium peptidoglican. Peptidoglicanul este acea structură
Actinomycetaceae Actinomyces, Nocardia moleculară ce îi conferă rezistenţă peretelui celular.
Treponemataceae Treponema, Leptospira, Borrelia • Celulele procariote se reproduc pe cale asexuată, adică prin
Mycoplasmataceae Mycoplasma diviziune directă sau sciziparitate şi numai excepţional pe
Rickettsiaceae Rickettsia, Coxiella cale sexuată, prin conjugare
Chlamydiaceae Chlamidia
MEMBRANA CITOPLASMATICA
• Din punct de vedere molecular, membrana plasmatică prezintă o structură tipică
membranelor biologice. Ea este formată din: lipide, reprezentate prin fosfolipide,
proteine şi glucide.
• Componenţii moleculari ai membranei plasmatice sunt astfel structuraţi încat să-i
permită acesteia să-şi poată îndeplini rolul său de membrană selectivă.
Fosfolipidele din structura membranei, formează un “film” în care plutesc proteine
globulare în timp ce glucidele interactionează fie cu fosfolipidele, fie cu proteinele.
• Fosfolipidele membranare prezintă o structură moleculară specifică. Ele au o
extremitate polară hidrofilă alcatuită dintr-un radical fosfat (PO43-) şi două lanţuri
de acizi graşi dispuşi divergent, aceştea se leagă de radicalul fosfat printr-o
moleculă de glicerol. Lanţurile de acizi grasi reprezinta extremitatea hidrofoba a
fosfolipidului.
Nucleoid
• Nucleoidul bacterian reprezintă 5-16 % din volumul celulei uscate.
• La cele mai multe bacterii nucleoidul este reprezentat de o moleculă
gigantă de ADN de formă filamentoasă, circulară cu extremităţile
reunite, fapt pentru care el poate fi considerat un cromozom gigant.
Lungimea filamentului este de 1400 μm, iar diametrul său este de 2,5
nm; dimensiune ce corespunde unei molecule de ADN dublu
catenară.
• Structura primitivă a nucleoidului bacterian, precum şi lipsa
membranei proprii, permite un contact direct între molecula de ADN,
ARN şi ribosomii din citoplasmă şi în consecinţă un transfer rapid al
informaţiei genetice.
Clasificarea bacteriilor
d.p.d.v. al afinitatii tinctoriale.
• Pentru a determina afinitatea tinctorială se recurge la colorarea diferenţiată
propusă de Gramm:
Etapele colorării Gramm:
I Executarea frotiului colorat şi uscat
- celulele de bacterii sunt plasate sub formă de suspensie, în
picătură, pe lamă;
- etalarea, deshidratarea şi fixarea bacteriilor prin trecerea lamei prin
flacăra becului de gaz;
II Colorarea cu violet de genţiană şi eliminarea colorantului, adăugarea de
mordant (soluţie Lugol);
III Diferenţierea - pe frotiu se adaugă amestecul de solvenţi - alcool +
acetonă - care solubilizează şi elimină colorantul de celule bacteriene G (-);
IV Colorarea suplimentară cu fuxină ce pătrunde numai în celulele libere de
colorantul anterior, astfel încât într-un frotiu în care avem bacterii cu afinităţi
diferite, prin parcurgerea metodei Gramm, microscopic, bacteriile G(+) se
colorează în violet, iar cele G(-) se colorează în roşu.
Coloratia Gram
Creşterea şi reproducerea
Creşterea şi reproducerea
 În condiţii favorabile procesul de reproducere
caracteristic tuturor bacteriilor - sciziune binară

 În condiţii nefavorabile, celulele generează formaţiuni


intracelulare denumite endospori.
Diviziunea binara
BACTERII
Escherichia coli
Clostridium botulinum
Bacterii pe medii agarizate
Caracteristici morfologice
Forma este un criteriu foarte important de clasificare şi
identificare a bacteriilor, aceasta variind în funcţie de
vârstă, factorii ereditari specifici şi mediul de cultură.
Principalele forme de observaţie a bacteriilor sunt:
• sferică;
• cilindrică;
• curbată;
• spiralată;
• iar prin scindare pot rezulta forme derivate.
Caracteristici morfologice

• Forma sferică, specifică cocilor, în cadrul căreia se pot


deosebi şi mai multe varietăţi: sferică (micrococi),
ovoidală (enterococi), lanceolată (pneumococi), reniformă
(gonococi).
Caracteristici morfologice

• Forma cilindrică specifică bacililor şi bacteriilor


nesporulate, ce pot avea capete drepte (ex. Bacillus
antracis), rotunjite (ex. Escherichia coli) sau ascuţite (ex.
Fusiobacterium fusiforme).
Caracteristici morfologice

• Formă spiralat-elicoidală, cu aspect de virgulă (vibro-virgo),


în forma literei S, sau de resort, cu spire neregulate sau
regulate, se întâlneşte mai ales la bacteriile patogene:

vibrio spirilum spirochete


Caracteristici morfologice
• Forme filamentoase care ajunge la zeci de microni lungime,
fără prezenţa unor diviziuni transversale.

Filamentous Cyanobacterium
Caracteristici morfologice

Există de asemenea pe lângă aceste forme principale de


obsevaţie şi forme specifice şi anume:
• pedunculare;
• filamentoase neramificate;
• filamentoase pseudoramificate;
• filamentoase ramificate.
Gruparea bacteriană

• Diplococcus

gruparea diplo- este întâlnită atat la coci cât şi la bacili, în


care grupa este formată din două elemente (ex.
Diplococcus pneumoniae, Neiseria gonorhoeae);
Gruparea bacteriană
• Streptococcus

grupare strepto- este o formaţiune rezultată din gruparea în


lanţ a cocilor şi bacililor (ex. Streptococcus lactis,
Streptococcus temaris, Streptococcus citravorus,
Streptococcus paracetivorus, Streptococcus pzogenes –
patogen, Streptococcus agalactiae);
Gruparea bacteriană
• scindare în plan orizontal: Tetrade (genul Pediococcus)

• scindare în ambele planuri: Sarcina

grupările tetrada- şi sarcina caracteristice cocilor, sunt


constituite din 4, respectiv 8 bacterii, cu înmultire într-un
singur plan, dar două direcţii la tetrade şi în două planuri
distincte la gruparea sarcina(ex. tetrada - Gafkia tetragena;
ex. - Sarcina lutea, Sarcina flava);
Gruparea bacteriană
• Stafilococi

gruparea stafilo- este caracteristică cocilor, în care


bacteriile sunt grămezi neregulate sub forma unui ciorchine
de strugure (ex. Staphylococccus aureus, Staphylococcus
albus, Staphylococcus citrinus)
Gruparea bacteriană

• Gruparea în palisadă proprie bacililor, în care aceştia


sunt dispuşi în paralel (formă cilindrică)
Caractere coloniale
În mediu solid
 Profilul coloniei dezvoltate pe un mediu nutritiv
solidificat poate fi lenticular, triunghiular.
 Perimetrul coloniei este fie circular, circular franjurat,
sau rizoidal.
 Tipul Coloniei - de tip S (smooth) - neted, lucios; de tip
R (rough) - aspru, granulat, de tip M (mucoid).

tip S (smooth) tip R (rough)


Clasificarea bacteriilor
Funcţie de nevoia de oxigen se clasifica în:
 aerobe (bacteriile acetice, de putrefacţie) - se dezvoltă la
suprafaţa solului, a alimentelor;
 facultativ aerobe - alterează lichide ca vinul, berea,
laptele;
 anaerobe - degradează în profunzime solul şi alimente
cum ar fi conservele;
Clasificarea bacteriilor
Funcţie de temperatura de dezvoltare bacteriile se clasifică în:
 mezofile (domeniul de temperatură 20 - 40oC) - marea
majoritate;
 termofile - se găsesc în apele termale;
 psihrofile - se găsesc în produsele conservate prin congelare.
Eucariote
Levuri

• Celula levuriană are în general formă


sferică, ovală sau alungită. În afară de
aceste forme tipice levurile mai pot
prezenta şi alte forme: elipsoidale, sferică,
triunghiulară, apiculată şi filamentoasă.
• Forma tipică de celulă levuriană este cea
ovală. Majoritatea levurilor au capacitatea
biochimică şi biologică de aproduce
fermentarea mediilor bogate în substanţe
carbonate. În categoria lor intră şi o serie
de levuri capabile să producă îmbolnăviri
la om sau animale. Sunt bine cunoscute
candidozele produse de mulţi
reprezentanţi ai genului Candida. Toate
levurile au o structură internă de tip
eucariot, celula lor fiind formată din
învelişuri celulare reprezentate de perete
celular şi membrană citoplasmatică, din
citoplasmă şi nucleu cu membrană
proprie, conţinut nuclear şi nucleol
Învelişurile celulare –
• peretele celular
• plasmalema
• sunt structuri ce limitează celula şi determină forma de
bază a acesteia şi intervin în toate procesele biologice
fundamentale care se desfăşoară la nivel celular.
Peretele celular
• Peretele celular are o grosime de aproximativ 250 nm şi poate să reprezinte o
pondere de 5-15 % din biomasa uscată. Din punct de vedere structural, peretele
celular are aspect laminar şi este alcătuit din 2-3 straturi.
• Stratul extern are o suprafaţă rugoasă şi în anumite zone prezintă aşa-numite
cicatrice mugurale, locul de desprindere a celulelor rezultate prin înmugurire. În
componenţa stratului extern predomină mananul cuplat prin legături covalente şi
radicali fosfat din molecule de proteine, formând complexe macromoleculare.
• Stratul intern are o suprafaţă ornamentată cu riduri proeminente, formate din fibre
constituite din molecule liniare de glucan, care formează complexe cu proteine şi
asigură rigiditatea sau elasticitatea peretelui celular.
La nivelul peretelui celular sunt localizate şi
enzime (invertaza, fosfataza, endoglucanaze,
permeaze) implicate în biosinteza compuşilor
peretelui celular şi în procesele de transfer al
substanţelor. Peretele celular are rol esenţial în
asigurarea formei celulei şi de pretecţie faţă de
factorii mediului ambiant. În cooperare cu
plasmalema participă la creşterea şi
reproducerea celulară, în biosinteză şi
catabolism. Prin îndepărtarea peretelui celular,
prin metode enzimatice, se obţin protoplaşti
folosiţi în ingineria genetică pentru obţinerea prin
fuziune a hibrizilor cu importanţă practică. Prin
amplasarea protoplaştilor pe mediu nutritiv, în
timp de 8-12 ore, are loc regenerarea peretelui
celular.
Structura celulei de drojdie
Membrană citoplasmatică
 protejată de peretele celular  asigură schimbul cu mediul exterior (este semipermeabilă);
 reprezintă un strat lamelar cu o grosime de circa 8-9 nm, care delimitează protoplastul la
exterior. Plasmalema este o structură de natură lipoproteică în care lipidele (fosfolipide,
steroli, acizi graşi nesaturaţi) reprezintă 23-30%, iar proteinele (glicoproteine) 30-33% din
masa nativă a membranei.
 Plasmalema este o structură dinamică în care se realizează importante funcţii ale celulei
vii. În primul rând este o barieră osmotică, cu permeabilitate selectivă ce reglează
transferul de substanţe nutritive necesare în celulă pentru a fi metabolizate, precum şi
eliminarea de cataboliţi, iar prin sistemele enzimatice, active la acest nivel, intervine în
reglarea procesului de creştere şi înmulţire: declanşează şi participă la procesul de
înmugurire;
Citoplasma
consistenţă gelatinoasă – menţine forma celulei;
reprezintă o materie fundamentală a celulei vii în care sunt înglobate organitele
subcelulare specifice. Citosolul este un sistem coloidal cu un conţinut de 75-
85 % apă, în care substanţele componente se află sub formă de sol sau gel,
formând micele coloidale. Dintre substanţele organice predomină proteinele
cu rol structural sau catalitic, lipidele cu rol plastic şi glucidele cu rol
energetic.
Nucleul
 conţine cromozomi (elemente care poartă informaţia
genetică);
 reglezează transmiterea caracterelor ereditare;
 responsabil de reacţiile esenţiale care se produc în
interiorul celulei.
Structura celulei de drojdie
Mitocondriile
 organitele de bază sau structurile subcelulare în
care se sintetizează substanţele care
înmagazinează energia chimică a celulei -
veritabile centrale energetice ale celulei care
funcţionează în prezenţa oxigenului;
 organite puternic hidratate, apa reprezentând
până la 70% din masa mitocondriei, ceea ce
reflectă un potenţial fiziologic particular. Substanţa
uscată este constituită în principal din proteine şi
lipide (peste 90%), acizi nucleici, nucleotide, ioni
minerali. Proporţia diferitelor componente variază
considerabil în funcţie de starea fiziologică a
celulei şi de influenţa unor factori de mediu
 rol în utilizarea zaharurilor pentru producere de
energie, asigură astfel creşterea celulei;

Ribozomii
 organite celulare ce se găsesc în citoplasmă, care
au în structură ARN – ribozomal şi proteine
 sintetizează pe baza aminoacizilor proteinele;

Vacuolele
 rol în înmagazinarea substanţelor de rezervă;

Peroxizomii
 structuri sferice sau ovale înconjurate de o
membrană simplă şi cu o matrice fin granulată pe
care sunt localizate oxidaze, cu rol în adaptarea
celulei de drojdie la condiţii aerobe
Structura celulei de drojdie
Reticulul endoplasmatic
 face legătura între nucleu şi vacuom şi reprezintă o reţea de vezicule,
caracterizate printr-o mare plasticitate morfologică.
 sediul unor complexe enzimatice (citocromoxidaza, enzime ale lanţului
transportor de electroni)
 rol în:
 transportul substanţelor nutritive;
 declanşarea procesului de înmugurire,
 biogeneza sferozomilor, vacuolelor, corpilor Golgi;
 participă, de asemenea, la expansiunea învelişului nuclear şi a
plasmalemei în diferite etape de dezvoltare ale celulei.

Aparatul Golgi
 un sistem de endomembrane, alcătuit din unităţi funcţionale – corpi
Golgi sau dictiozomi, care face legătura între reticulul endoplasmatic şi
plasmalemă, între reticulul endoplasmatic şi alte organite celulare.
 este aparatul de sortare şi dirijare a proteinelor şi componentelor
membranare spre locul de destinaţie;
 are rol în expansiunea peretelui celular;

Lizozomii sunt structuri veziculare bogate în enzime: proteaze, fosfataze,


lipaze (peste 40 de tipuri de enzime), active la pH = 5 cu rol în digestia
unor compuşi ai celulei vii, care nu mai funcţionează eficient; în
exteriorul lizozomului, în citosol, enzimele nu sunt active deoarece pH-
ul este de 7,3. Enzimele lizozomale sunt în mod normal inactive, latenţa
lor este dependentă de integritatea membranei lizozomale, care
acţionează ca o barieră ce se interpune între enzimă şi substrat. Când
sub acţiunea unor factori, de exemplu în starea de înfometare, în
absenţa apei care să asigure transportul în exteriorul celulei a
cataboliţilor formaţi, pH-ul în citosol scade, enzimele din lizozomi sunt
activate şi celula moare prin autoliză.
Reproducerea celulelor de drojdie

Reproducerea poate fi:


 asexuată (vegetativă) prin:  înmugurire;
 diviziune directa;
 sexuată (în urma unor procese de copulare);
În general reproducerea drojdiilor  reproducerea
asexuată prin înmugurire.
Înmugurirea
• este principala cale de multiplicare a celulelor vegetative de
drojdii, când condiţiile de creştere sunt optime.
Procesul de înmugurire se desfăşoară în felul următor:
reticulul endoplasmatic emite un semnal chimic care determină o
evaginaţie locală a peretelui celular în care este antrenată masa
protoplasmatică subiacentă. Proeminenţa formată creşte pînă
atinge aproape dimensiunea celulei mame, după care se
produce diviziunea nucleului, iar între celule apare un perete
despărţitor.
Eucariote
Levuri
Fungi

• Fam. Endomicetaceae, încadrează levurile care


formează asce cu ascospori, fapt pentru care Sunt micro- sau macroorganisme
mai sunt cunoscute şi sub numele de incluse în Phyllum Mycophyta sau Fungi
Ascomycete. Aici sunt incluşi toţi reprezentanţii
clasei Ascomycetes.Cele mai importante genuri
sunt: Schizosaccharomices, Clavispora, Clasa Genul
Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Phycomicetes Rhisopus, Mucor.
Saccharomyces, Torulaspora,
Zygosaccharomyces, etc. Ascomycetes Penicillium,
• Fam. Sporobolomycetaceae, încadrează levurile Aspergillus, Levuri.
care formează bazidii cu bazidiospori, fapt
pentru care mai sunt cunoscute şi sub numele Basidiomycetes Agaricus, Puccinia
de Basidiomycete. Include toţi reprezentanţii Deuteromyces Thricoderma,
clasei Basidiomycetes. Genurile reprezentative
acestei familii sunt: Rhodotorula, Cryptococcus, Candida,Cephalospor
Sporobolomyces, Kloeckera, Oosporum, ium.
Trigonopsis, Trichoderma, etc..
• Fam. Cryptococcaceae, încadrează levurile care
formează spori speciale cunoscuţi sub numele
de clamidospori.Toţi fungii imperfecţi sunt
încadraţi în această familie. Cele mai importante
genuri ale familiei sunt: Candida, Cryptococcus,
Torulopsis, Trichosporium.
Fungi
• Eucariote
• Prezinta chitina in peretii celulari
• Utilizeaza substante organice pentru a
produce energie
• Fungii si ciupercile sunt multicelulare,
sunt alcatuite din micelii (compusi din
filamente numite hife)
• Drojdiile sunt unicelulare
Organizare celulara
• Nucleul - a fost pus în evidenţă prima
dată de către De Bary (1866).
• Nucleul fungilor este mic având
dimensiuni cuprinse între 0,75 - 20 μm.
• Forma nucleului este sferică sau ovală.
• Nucleul este înconjurat de o membrană
dublă cu numeroşi pori, caracteristică
organismelor eucariote.
• În interior se află nucleoplasma şi unul
sau mai mulţi nucleoli. Substanţa
caracteristică nucleului este cromatina,
alcătuită din acidul dezoxiribonucleic,
acidul ribonucliec şi proteine.
• Numărul cromozomilor variază în funcţie
de specie, fiind în general mic, de
exemplu Penicillium notatum are cinci,
Neurospora crassa are şapte, iar
Aspergillus nidulans are opt cromosomi.
Organizare celulara
• Reticulul endoplasmatic - din celulele fungice este constituit din două membrane unitare
separate printr-un lumen. RE poate avea formă tubulară sau lamelară şi este mai evident în
celulele tinere.
• Ribozomii sunt distribuiţi în mod neuniform în citoplasmă sau sunt ataşaţi de RE.
• Mitocondriile sunt asemănătoare cu cele de la alte organisme, îndeplinind aceleaşi funcţii.
• Complexul Golgi este şi el prezent în celulele fungice. Vacuolele sunt prezente în număr
mare în celulele mature, fiind prevăzute cu o membrană simplă.
• Citoplasma prezintă la exterior o membrană fină lipoproteică - plasmalema, urmată de
hialoplasmă (la periferia celulei), iar în interior este prezentă granuloplasma. Continuitatea
citoplasmei este asigurată de plasmodesme între celule şi anastomoze între hife. În
componenţa citoplasmei intră: glucide (glicogen), proteine, lipide, acid ribonucleic, acizi
organici, enzime, fosfaţi de fitosterine. Citoplasma celuleor fungice este omogenă şi
refringentă.
STRUCTURA MICELIULUI
• Aparatul vegetativ al fungilor este numit miceliu. Miceliul este divers
constituit în funcţie de gradul de evoluţie al fungilor.
• La ciupercile superioare, miceliul este alcătuit din hife septate
transversal, care formează un miceliu pluricelular.
• Celulele pot fi uninucleate, binucleate sau plurinucleate.
• La foarte multe ciuperci hifele sunt incolore, dar odată cu diferenţierea
sporilor miceliul se colorează. La unele specii de fungi, miceliul care
formează corpii sporiferi se colorează în roşu, galben, albastru, ca
urmare a faptului că celulele sintetizează o serie de pigmenţi care
colorează peretele.
CLASIFICARE
• Filum Chytridiomycota
• Filum Zygomycota
• Filum Ascomycota
• Filum Basidiomycota
PENICILLIUM NOTATUM
Aspergillus sp.
• Claviceps purpurea = cornul secarei
Creşterea şi reproducerea mucegaiurilor

• În momentul în care spori sau fragmente de mucegaiuri


ajung pe un mediu nutritiv are loc o germinare şi
creşterea radială a tuburilor germinative care se mai
numesc şi hife – organe ale creşterii vegetative.
Creşterea şi reproducerea mucegaiurilor
• Totalitatea hifelor alcătuiesc un miceliu care poate fi: -
cenocitic – formaţiune în care citoplasma circulă liber,
aseptat, format din hife ce nu prezintă pereţi despărţitori –
tip de miceliu caracteristic mucegaiurilor inferioare;
miceliul septat – formaţiune în care citoplasma circulă
prin pori centrali – caracteristic mucegaiurilor superioare
(la un anumit stadiu de dezvoltare celulele sunt separate
între ele prin septum – por central sub formă de perete
despărţitor).
Creşterea şi reproducerea mucegaiurilor

Hifele îndeplinesc mai multe funcţii:


• funcţia de absorbţie de substanţe nutritive, de fixare a
mucegaiului pe mediu nutritiv – hife care se numesc
rizoizi.
• funcţia de extindere care determină formarea de tuburi
germinative ramificate – hife care se numesc stoloni.
• funcţia de reproducere – hife generatoare de spori, se
formează în centrul coloniei, perpendiculare pe hifa
generatoare şi au o creştere limitată.
Creşterea şi reproducerea mucegaiurilor
Reproducerea mucegaiurilor – este un proces fiziologic
complex şi în cazul mucegaiurilor cunoscute şi studiate se
poate realiza pe două căi:
• prin spori – pe cale
asexuată (prin
sporangiospori sau
conidiospori) sau pe
cale sexuată prin
spori perfecţi
(oospori, zigospori,
ascospori sau
bazidiospori).
• vegetativă – pe cale
sexuată;
NUTRIŢIA
MICROORGANISMELOR
NUTRIŢIA
MICROORGANISMELOR
• Nutriţia este un proces fiziologic complex, prin care
microorganismele îşi procură energia şi toate elementele
necesare creşterii, reproducerii şi întreţinerii funcţiilor
vitale.
• Pentru asigurarea procesului de nutriţie celula microbiană
necesită diferiţi nutrienţi care trebuie să prezinte anumite
dimensiuni care să le permită trecerea prin peretele
celular şi membrana citoplasmatică. Apoi sunt
transformaţi în celulă şi are loc formarea compuşilor
celulari.
NUTRIŢIA
MICROORGANISMELOR
Procesul de nutriţie se realizează în
cadrul metabolismului celular care
cuprinde două laturi esenţiale:
• reacţiile de catabolism care
constau în degradarea secvenţială
a compuşilor macromoleculari prin
acţiunea catalitică a enzimelor.
Degradarea constă în formare de
compuşi cu molecule mici şi se face
secvenţial pe căi biochimice, prin
care se eliberează cuantificat
energia potenţială cuprinsă în
produsul catabolizat. Aceste reacţii
au caracter exergonic.
NUTRIŢIA
MICROORGANISMELOR

• reacţiile de anabolism se desfăşoară


concomitent cu reacţiile de catabolism şi
constau în reacţii de biosinteză catalizate
enzimatic prin care celula vie, folosind
compuşi cu molecule mici şi o cantitate de
energie, clădeşte compuşi
macromoleculari, care intră în structura
celulei cu rol funcţional sau de rezervă.
Totalitatea reacţiilor de anabolism
contribuie la creşterea în dimensiune şi la
reproducerea celulelor şi au caracter
endergonic.
NUTRIŢIA MICROORGANISMELOR
NUTRIŢIA
MICROORGANISMELOR
• În cazul reacţiilor de catabolism, compuşii macromoleculari sunt
conţinuţi de substratul care constituie nutrient pentru celula vie, iar
în cel al reacţiilor de anabolism compuşii macromoleculari se
regăsesc în componenţii celulari esenţiali pentru creştere,
reproducere şi întreţinerea funcţiilor vitale. Compuşii cu molecule mici
care nu mai sunt necesari se elimină sub forma produşilor de catabolism.
NUTRIŢIA
MICROORGANISMELOR
• În procesul de nutriţie se stabileşte o interdependenţă între
microorganisme şi mediu. În această unitate dialectică mediul
are rolul activ iar microorganismele se adaptează la condiţiile
de mediu acţionând şi transformând mediul. Această
interrelaţie a permis ca, în timp, să se realizeze adaptări
specifice ale microorganismelor la cele mai dificile condiţii
oferite de mediul ambiant.
NUTRIŢIA
MICROORGANISMELOR
• Mediul acţionează asupra microorganismelor prin asigurarea
unui substrat nutritiv, temperatură, umiditate, pH, concentraţie
de oxigen favorabile, iar microorganismele acţionează asupra
mediului prin diferite transformări care au loc în procesul de
nutriţie. Astfel prin acţiunea de degradare pe care o exercită
microorganismele asupra mediului, pot avea loc următoarele
transformări: reducerea consistenţei, tulburarea, formarea de
voal, scăderea concentraţiei în extract, acidifierea,
alcalinizarea.
CONDIŢIILE DE DESFĂŞURARE
A PROCESULUI DE NUTRIŢIE
• Prin mediu de cultura înţelegem orice mediu asupra
căruia microorganismele pot să acţioneze şi care să
asigure energia şi toate componentele necesare la
biosinteza componentelor celulare.
• Pentru a folosi aceste medii ca sursă de nutriţie în celula
microbiană, pe cale genetică şi pe cale catabolică, se
reglează metabolismul celulei care îi permite adaptarea la
condiţiile de mediu. În acest sens celula microbiană poate
să sintetizeze enzime adaptive extracelulare care să
producă hidroliza substanţelor nutritive şi să asigure
transportul în celulă al nutrienţilor şi transformarea
acestora.
CONDIŢIILE DE
DESFĂŞURARE A
PROCESULUI DE NUTRIŢIE
Condiţiile pentru desfăşurarea procesului de nutriţie sunt
următoarele:
• în mediul nutritiv, celulele microbiene trebuie să
beneficieze de condiţii compatibile cu viaţa;
• mediul nutritiv trebuie să asigure următoarele
componente: apa, surse hidrocarbonate – principalele
surse furnizoare de energie, surse azotate, surse
minerale, factori de creştere (facultativ).
CONDIŢIILE DE DESFĂŞURARE
A PROCESULUI DE NUTRIŢIE
• în absenţa apei celula nu va putea să se hrănească, apa
fiind cea care solubilizează compuşii din mediu, asigură
transportul şi transformările în interiorul celulei.
• totalitatea substanţelor nutritive solubile în apă trebuie să
se afle într-o concentraţie apropiată celei existente în
citoplasmă, deoarece dacă mediul nutritiv este hipertonic
se produce plasmoliza celulelor. De aceea mediile de
cultură destinate cultivării microorganismelor au o
concentraţie de 3 – 15 % substanţe nutritive solubilizate.
Dacă concentraţia este foarte mică se produce
turgescenţa celulelor.
Microorganismele din corpul uman
Microbii
• Microbii reprezintă forma de viaţă care domină Terra. Organismele
bacteriene care trăiesc pe planeta noastră le depăşesc numeric pe
toate celelalte la un loc.
• Ȋn corpul uman există de 10 ori mai multe celule microbiene decât
celule care compun organismul uman, iar numărul genelor microbiene
îl depăşeşte de 150 de ori pe cel al genelor umane. Toate aceste
fiinţe care trăiesc în corpul nostru şi pe suprafaţa sa formează un
ecosistem ce poartă numele de „microbiom”, iar simbioza acestor mici
fiinţe cu celulele umane dă naştere unui veritabil „super-organism”.

• MICROBIOM - totalitatea microbilor, a elementelor lor genetice şi a


interacţiunilor acestora într-un mediu
Microbiomul
• Bacteriile ce formează microbiomul colonizează tractul nostru digestiv încă din primele 24 de
ore de la naştere şi se stabilizează în jurul vârstei de doi ani, devenind o prezenţă
permanentă în viaţa noastră.
• Microbiomul variază încă de la naştere: bebeluşii născuţi natural sunt acoperiţi cu microbii
existenţi în canalul naşterii, iar cei ce vin pe lume prin operaţie cezariană sunt acoperiţi de
microbii care există în mod normal pe pielea adulţilor.
• Miile de miliarde (100 de trilioane) de microbi ce trăiesc în corpul uman cântăresc în total
aproape 2 kilograme. Cei mai mulţi dintre ei trăiesc în intestine, iar distrugerea lor poate avea
consecinţe neplăcute, precum obezitatea sau dezvoltarea de afecţiuni ale colonului.
• Relaţia cu bacteriile din corpul uman este una simbiotică: în schimbul hranei, ele participa la
digestia alimentelor, produc vitaminele de care are nevoie corpul şi sistemul imunitar. Pentru
a coexista cu microbiomul, sistemul imunitar trebuie să tolereze mii de specii de bacterii
inofensive. În schimb, aceste bacterii joacă un rol important în lupta împotriva agenţilor
patogeni - bacteriile „rele”.
• Cunoscând microorganismele care trăiesc în corpul uman, se pot obtine diete personalizate,
diagnosticarea mai rapidă a afecţiunilor şi tratamentul personalizat al acestora.
Microbiom
• Numeroase cercetări realizate în ultimii ani au arătat că dereglarea microbiomului poate avea
consecinţe neplăcute asupra sănătăţii umane, printre acestea numărându-se alergiile,
eczemele, astmul şi obezitatea.
• În ultimele decenii, s-a observat că în zonele industrializate ale planetei numărul pacienţilor
cu alergii a crescut într-un ritm alert. După ani de studiu, cercetătorii au ajuns la concluzia că
„obsesia curăţeniei” este principala cauză. Ipoteza a fost confirmată de un studiu elveţian
realizat in anul 2011, în cadrul căruia cercetătorii au ajuns la o concluzie fermă: creşterea
dramatică a bolilor alergice în societăţile industriale este legată de dispariţia rapidă a
microorganismelor care populează corpul uman.
Microbiom
• Recent, un amplu proiect european intitulat MetaHIT a dus la descoperirea
faptului că oamenii se deosebesc şi prin bacteriile ce trăiesc prin ei, nu doar prin
elemente de tipul grupei sanguine. Oamenii de ştiinţă au descoperit că există 3
tipuri de populaţii microbiene, fiecare om aparţinând unuia dintre aceste
enterotipuri. Totodată, cercetătorii au descoperit că enterotipurile nu au legătură
cu vârsta, sexul, naţionalitatea sau dieta persoanelor
Microbiom
• Cele 3 enterotipuri au primit numele grupului microbian dominant:

• Bacteroides,
• Prevotella şi
• Ruminococcus.

• Microbii de tip Bacteroides sunt mai eficienţi în descompunerea carbohidraţilor, ceea ce ar putea explica de ce
persoanele care prezintă acest enterotip sunt mai predispuse la probleme de greutate. Bacteriile de tip Prevotella tind
să descompună mucusul din intestin, iar Ruminococcus facilitează absorbţia zahărului, ceea ce poate favoriza
creşterea în greutate.
• Persoanele ce aparţin enterotipului Bacteroides au un mediu intestinal mai bun la sintetizarea vitaminelor B2, B5, C şi
H, iar cei ce aparţin enterotipului Prevotella prezintă mai multe bacterii eficiente în sintetizarea vitaminei B1 şi a
acidului folic.
• Un studiu desfăşurat in 2011 a arătat că enterotipul Bacteroides este asociat dietelor bogate în grăsimi şi proteine, pe
când enterotipul Prevotella este asociat unei diete bogate în carbohidraţi.
• O altă cercetare efectuată de Oluf Pedersen, specialist în genetică moleculară la Centrul de Diabet Steno din Gentofte,
Danemarca, a arătat că persoanele obeze sau cele care sufereau de afecţiuni metabolice aparţineau de obicei
enterotipului Bacteroides. De altfel, cercetătorii au descoperit că în 90% din cazuri pot deduce dacă o persoană este
obeză sau nu analizând doar microbiomul acesteia.
• Un studiu derulat în Danemarca a arătat că analiza microbiomului permite medicilor să estimeze cu acurateţe dacă un
pacient urmează să sufere de diabet, înmulţirea microbilor din grupul Bacteroides fiind un reper mai bun decât indicele
de masă corporală al persoanei studiate.
Microbiom
• Enterotipurile vor juca un rol important în descoperirea unor
tratamente alternative la antibiotice, care au devenit ineficiente în
ultimii ani, pe măsură ce bacteriile au devenit rezistente. Astfel, în loc
să încerce să elimine toate bacteriile din intestin, inclusiv pe cele
nocive, doctorii vor putea să stimuleze bacteriile utile, pentru a
restabili echilibrul bacterian existent înainte ca afecţiunea să se
dezvolte. Cu timpul, enterotipurile vor permite dezvoltarea medicinei
personalizate, în care fiecare pacient va beneficia de un tratament
conceput în funcţie de nevoile proprii, identificate pe baza
microbiomului său.
MICROFLORA NORMALĂ A ORGANISMULUI
UMAN
• Corpul omului oferă microorganismelor condiţii favorabile de dezvoltare.Ele
găsesc pe/în corpul uman.Cu toate acestea corpul uman nu reprezintă un mediu
uniform în totalitatea sa, deoarece fiecare regiune sau organ diferă din punct de
vedere chimic, fizic şi biochimic de alte regiuni sau organe, ceea ce facilitează
existenţa şi dezvoltarea numai a anumitor specii microbiene.
• La om pielea, caile respiratorii superioare, tubul digestiv şi alte organe şi
cavităţi, constituie o largă varietate de habitate, în care diferitele microorganisme
se dezvoltă selectiv.Intre aceste habitate şi microorganismele ce le populează se
stabilesc diferite tipuri de interrelaţii a căror natură este greu de determinat,
datorită faptului că acestea sunt supuse influenţei factorilor de mediu. In anumite
condiţii, o interrelaţie poate fi benefică, în timp ce în alte condiţii ea devine chiar
dăunătoare.
• La om microorganismele se întânlesc pe şi în organism sau organe, fapt pentru
care microflora poate fi analizată zonal, astfel se poate distinge o microfloră a:
• pielii,
• cavităţii bucale,
• căilor respiratorii,
• tubului digestiv, şi a
• căilor geneto-urinare.
• In mod normal microorganismele nu pătrund în intimitatea tesuturilor şi organelor,
în sînge sau limfă.Dacă totuşi ajung în aceste medii în mod accidental ele produc
boli infecţioase.
Microflora pielii
La nivelul pielii se poate dezvolta
 o microfloră permanentă şi
 o microfloră tranzitorie.
Microflora permanentă, sau normală a organismului uman, este reprezentată de
microorganismele care trăiesc şi se multiplică pe piele în condiţii de viaţă normală. Acest
tip de microfloră este specifică fiecărei porsoane. Ea îşi poate schimba compoziţia în cazul
în care pielea este tratată cu diferite substanţe ce au efecte distructive asupra
microorganismelor. Numărul de microorganisme, precum şi tipurile de microorganisme pot
creşte sau scădea în funcţie de acţiunea stimulatoare sau distructivă a substanţei
administrate.
Reprezentanţii microflorei normale a pielii aparţin la diferite grupe sistematice.Dintre bacterii
cele mai frecvent intînlite pe piele sunt diferitele specii de:
• Stafilococ alb şi citrin,
• bacilli Gram-pozitivi: corinebacterii aerobe şi anaerobe, în special Corynebacterium
acnes,producător al acneei,
• bacili Gram-negativi, în special E.coli şi Proteus vulgaris.
Alte specii de bacterii Gram-negative nu se pot dezvolta pe piele
datorită concurenţei cu bacteriile Gram-pozitive.
Microflora pielii
• Microflora tranzitorie este reprezentată de microorganismele
contaminante ale pielii. Acest tip de microfloră se dobândeşte
în anumite condiţii cînd pielea îşi schimbă pH-ul, compoziţia în
substanţe şi compoziţia microflorei permanente. Prin
tratamente speciale microorganismele care formează
microflora tranzitorie pot fi distruse, deşi nu cu mare uşurinţă.
• Microflora pielii se află într-un echilibru dinamic, datorită
influenţelor reciproce graţie cărora dezvoltarea unei specii se
face numai între anumite limite ceea ce asigură o toleranţă
completă din partea organismului gazdă.
Microflora cavităţii bucale
• Cavitatea bucală reprezintă un habitat foarte complex şi favorabil dezvoltării
microorganismelor. Factorii care favorizează prezenţa şi dezvoltarea
microorganismelor în cavitatea bucală sunt saliva şi prezenţa resturilor alimentare
depozitate în spaţiile dintre dinţi.
• Saliva conţine şi unii factori antimicrobieni dintre care cei mai importanţi sunt
lizozimul şi lactoperoxidaza. Lactoperoxidaza prezentă atât în lapte cât şi în
salivă,omoară bacteriile datorită acţiunii tiocianatului şi apei oxigenate , substanţe
rezultate ca urmare a acţiunii enzimei.
• Bacteriile întâlnite în cavitatea bucală la copii în primul an de viaţă sunt
reprezentate de streptococi lactici şi lactobacili, precum şi de un număr redus de
alte specii aerobe. Apariţia dinţilor determină o adevărată schimbare în echilibrul
microflorei bucale, de la aerobi la anaerobi paralel cu dezvoltarea unor specii care
se localizează pe suprafaţa şi în fisurile dentare. Pe suprafaţa dinţilor se formează
o peliculă continuă, cunoscută sub numele de placă dentară, care aderă foarte
strîns de dinţi şi are o grosime de 60 μm la nivelul coroanei dentare.
Microflora cavităţii bucale
• Placa dentară este formată din bacterii filamentoase gram-pozitive, strâns
aderente între ele şi incluse într-o matrice amorfă:
• Leptotrichia bucalis (Fusobacterium fusiforme), bacterie anaerobă, capabilă să fermenteze
hidraţii de carbon la acid lactic.In asociere cu această bacterie se întâlnesc un număr mic de
streptococi, coci Gram-negativi şi alte tipuri de microorganisme.
• E.coli,
• diferite specii de Proteus şi Pseudomonas aeruginosa, microorganisme a căror activitate
proteolitică este inhibată de bacteriile care formează microflora lactică, producătoare de acid
lactic.
• Streptococcus salivarius, unele levuri, sarcine, spirili şi spirochete, precum şi unele specii
saprofite, condiţionat patogene, cum ar fi streptococi hemolitici, pneumococi, meningococi,
Klebsiella, Micrococcus cataralis, şi bacili difterici.
Aceste microorganisme sunt, în mod obişnuit, în echilibru datorită competiţiei ce ia naştere între
specii şi concurenţei pentru sursele nutritive. Conţinutul microflorei bucale este influenţat şi de
compoziţi şi proprietăţile fizico-chimice ale salivei şi resturilor alimentare.
Microflora tubului digestiv
• Tubul digestiv constituie un mediu favorabil dezvoltării microorganismelor dat fiind
abundenţa substanţelor nutritive şi temperaturii constante. Totuşi, în diferitele
segmente ale tubului digestiv microflora variază cantitativ şi calitativ. Astfel,
stomacul, din cauza acidităţii sucului gastric a cărui pH este de 2 are un conţinut
relativ steril sau conţine un număr foarte mic de microorganisme
acidorezistente cum ar fi lactobacili şi streptococi, strâns asociate de epiteliu
mucoasei stomacale.
• Ȋn cazuri anormale, de scădere a acidităţii gastrice şi de creştere a pH, în stomac
se poate dezvolta o microfloră constituită din levuri, sarcine şi lactobacili.
• Intestinul subţire conţine o microfloră mai bogată dar neuniform repartizată,
datorită neuniformităţii conţinutului său. In intestinul subţire se constată un
gradient de pH care influenţează microflora atât cantitativ cât şi calitativ.
• La nivelul duodenului, din cauza pH acid, microflora nu diferă de cea din
stomac, dar lipsesc microorganismele asociate epiteliului mucoasei.
Microflora tubului digestiv
• Intestinul gros conţine un număr enorm de bacterii care se dezvoltă utilizând
produşii rezultaţi din procesul de digestie. La nivelul intestinului gros se găseşte o
microfloră de fermentaţie şi una de putrefacţie, care în mod normal se găsesc în
echilibru dinamic.
• Predominante sunt
• Klebsiella sp.: 40-80%,
• Clostridium perfrigens: 25-35%,
• Bifidobacterium bifidum: 30-70%,
• Lactobacillus: 20-60%,
• Enterococcus faecalis: 100%,
• Peptococcus, Peptostretococcus, Staphylococcus aureus: 30-50%,
• Enterobacter sp.: 40-80%, Bacteroides fragilis
In ultimul segment al intestinului gros, segmentul rectal, fecalele conţin microorganisme până la
aproximativ 25 % din greutatea lor uscată. Această microfloră desfăşoară o activitate metabolică
considerabilă. Ea fermentează celuloza şi alţi hidraţi de carbon nedigeraţi, cu producerea de CO2,
H2 şi acizi organici. Concomitent are loc şi o hidroliză enzimatică a unor proteine nedigerate în
segmentele superioare, cu producere de indol, scatol sau alţi compuşi.
Un catalog de gene microbiene
ale intestinului uman stabilit prin
secvențiere metagenomică
Microflora tubului digestiv
• Bacteriile din intestinul gros sintetizează şi pun în libertate cantităţi importante de:
• vitamine din grupul B,
• vitamina K,
• vitamina PP,
• acid pantotenic,
• acid folic,etc.
Acestea se absorb parţial în sânge, acoperind cel puţin o parte din necesarul organismului în unele vitamine.
Bacterii cum ar fi: Bacillus mesentericus, E.coli, Proteus vulgaris, Aerobacter aerogenes,etc.,
sintetizează cantităţi suficient de mari de vitamina K pentru a asigura complet necesarul organismului uman
în acastă vitamină. In general, bilanţul vitaminic la nivelul intestinului gros este influenţat de raportul cantitativ
dintre microflora producătoare şi cea consumatoare de vitamine (lactobacili), de tipul de hrană şi chiar de
cantitatea de vitamine din hrană.Importanţa microorganismelor în nutriţia vitaminică a omului este cu atît mai
mare cu cît, în mod normal, prin hrană, nu se satisfac niciodată toate nevoile vitaminice.
• Relaţiile dintre microflora intestinală şi organismul uman sunt de tip mutual-benefica pentru
ambii parteneri. Uneori, în mod special, în urma unor tratamente cu antibiotice cu spectru
larg,administrate per os (tetraciclină, eritromicină, cloramfenicol) microflora intestinală este
distrusă. In aceste condiţii intestinul poate fi colonizat de o altă microfloră reprezentată de specii
rezistente la antibiotice cum ar fi:
• Staphylococcus,
• Proteus,
• Candida albicans, care de obicei nu se dezvoltă în din cauza competitivităţii microflorei normale intestinale.
Această schimbare de microfloră poate altera funcţiile digestive producând tulburări mai mult sau mai puţin
grave. După o anumită perioadă de timp, microflora normală se reface şi echilibrul se restabileşte.
Microflora căilor respiratorii
• Căile respiratorii fiind în raport direct cu aerul atmosferic, aspiră odată cu acesta şi
microorganismele pe care le conţine.Majoritatea microorganismelor din aer sunt
însă oprite în fosele nazale datorită acţiunii de filtru a cililor epiteliului nazal şi apoi
lizate de lizozimul din secreţiile mucoasei nazale.Totuşi, în căile respratorii se pot
întâlni un număr de bacterii potenţial patogene ca:
• Staphylococcus aureus,
• Diplococcus pneumoniae,
• Corynebacterium diphteriae,
• Neisserie intracelularis,
• Haemophillus influenzae,
• Streptococcus pyogenes.
• Căile respiratorii inferioare: trahee, bronhii şi bronhiole, practic sunt sterile
deoarece majoritatea bacteriilor sunt reţinute de filtrul căilor respiratorii superioare.
Microflora căilor genito-urinare
• Uretra, la femeie, este în mod normal sterilă, în timp ce la bărbat, ea conţine, în
treimea sa inferioară, coci Gram-pozitivi.
• Vaginul conţine o microfloră specifică. Inainte de pubertate microflora vaginală este
săracă şi reprezentată numai de cîteva tipuri de coci, în special de stafilococi şi
streptococi.
• La maturitate, microflora vaginală conţine un număr mare de bacili lactici, în special
Lactobacillus acidophilus, cunoscut şi sub numele de bacilul Doderlein. Aceşti
bacili metabolizează glicogenul secretat de celulele mucoasei vaginale sau
provenite din secreţiile uterului, producând acid lactic. In felul acesta bacilii
Doderlein crează în vagin condiţii de aciditate corespunzătoare ( pH = 4-4,7 ), care
inhibă dezvoltarea altor microorganisme, în mod deosebit a microflorei proteolitice.
Totuşi, pe lîngă aceşti bacilii, în vagin, adesea se mai întânlesc stafilococi, levuri şi
colibacili.
• După menopauză secreţiile şi eliminarea de glicogen încetează, bacilii Doderlein
dispar şi se reinstalează microflora de înainte de pubertate
Rolul microorganismelor în viaţa
organismului uman
Microflora normală a organismului uman este complexă şi uneori foarte bine
dezvoltată.
Experimentările făcute pe animale sterile, lipsite de microflora lor normală, aşa
numitele animale „germ free”, arată stări anormale asupra evoluţiei lor,
constatându-se că:
• organele lor au mărimi şi capacităţi funcţionale mai reduse;
• intestinul este mai subţire, mai puţin musculos, lipsit de tonus, dar funcţional;
• cecum (un segment a intestinului gros) este foarte dezvoltat;
• dejectele nu au miros fecal şi amoniacal;
• sistemul limfatic este slab dezvoltat;
• fagocitele sunt pasive;
• carne lor este fadă şi lipsită de miros.
Rolul microorganismelor în viaţa
organismului uman
Microflora normală intestinală are asupra organismului gazdă efecte
favorabile funcţionării sale. Aceste efecte favorabile se datoresc faptului că
microorganismele intestinale îndeplinesc următoarele în intestinul uman:
• sintetizează vitamine necesare metabolismului normal a organismului
uman;
• stimulează mecanismele de apărare ale organismului gazdă determinînd
o creştere a imunităţii nespecifice;
• contribuie la dezvoltarea normală a unor organe, cum ar fi: intestin,
organe limfatice, prin acţiunile lor morfogenetice.
• Toate acestea arată că omul poate trăi şi fără multe dintre populaţiile
microbiene, dar se dezvoltă mai bine în prezenţa lor.
CONTROL
MICROBIOLOGIC
Microorganismele sunt prezente peste tot
– apă, aer, pe obiecte, pe mâini.

Pentru a determina calitatea unui produs


(corespunzătoare sau nu) se fac anumite
examene:

a) examen organoleptic sau senzorial

b) examen chimic – ce indică prezenţa sau


absenţa unor produse chimice

c) examen microbiologic care constă în


determinarea numărului total de germeni sau
prezenţa unor specii care sunt admise numai
într-o anumită cantitate sau sunt interzise în
anumite produse.
Secţia analize microbiologice (ANM)
este parte a Laboratorului pentru Controlul Calităţii Medicamentelor.

Secţia analize microbiologice efectuează următoarele funcţii de bază:

 Controlul microbiologic al materiei prime, medicamentelor indigene şi de


import, în conformitate cu prevederile documentaţiei analitico-normative în
vigoare;
 Determinarea activităţii antimicrobiene a antibioticelor;
 Aprecierea activităţii antagoniste şi activităţii specifice a medicamentelor;
 Controlul ulterior selectiv (prin sondaj) a apei purificate, formelor medica-
mentoase extemporale, a substanţelor medicamentoase, prelevate din
farmacii;
 Acordarea ajutorului consultativ-practic privitor la respectarea regimului
sanitar în unităţile farmaceutice.
MICROBIOLOGIA PRODUSELOR FARMACEUTICE
1. Contaminarea microbiană a medicamentelor

 Contaminarea produselor farmaceutice cu germeni patogeni, condiţionat patogeni sau


chiar nepatogeni, ridică din ce în ce mai mult probleme de sănătate publică, colectivă sau
individuală.
 Medicamentele contaminate prezintă mare risc în cazul arsurilor, plăgilor şi ulceraţiilor
grave, mai ales când sunt implicate mari suprafeţe epidermice denudate.
 Utilizarea aerosolilor ca vehicul pentru introducerea medicamentului în regiuni lipsite de
germeni, cum ar fi alveolele pulmonare, impune o exigentă puritate microbiană.
 Fabricarea medicamentului pe cale industrială favorizează contaminarea microbiană. Cu
alte cuvinte, controlul microbiologic este şi un indicator calitativ, arătînd acurateţea
respectării procesului tehnologic de fabricare a medicamentului. Procesul se poate urmări
de la materia primă pînă la produsul finit.
 Problema contaminării microbiologice a medicamentului devine şi mai dificilă dacă ne
referim la marea capacitate metabolică a microorganismelor de a se adapta la temperaturi
diferite, pH-uri diferite şi chiar stabilitatea de a utiliza anumite substanţe ca unică sursă de
carbon sau azot prezente în medicamente.
MICROORGANISMELE CONTAMINANTE A MEDICAMENTELOR
pot fi împărţite în două mari grupe:
 microorganisme patogene
 microorganisme saprofite.
Intre cele două grupe se pare că nu există o graniţă clară, deoarece unele microorganisme
pot fi condiţionat patogene, iar unele microorganisme saprofite pot deveni patogene, după
cum şi unele microorganisme patogene, în condiţii de inadaptabilitate devin inactive.
Microorganismele saprofite prezente frecvent în mediul înconjurător, reprezintă numărul şi
frecvenţa cea mai mare de germeni izolaţi din produsele farmaceutice. Prezenţa lor în aceste
produse conduce într-un timp mai scurt sau mai îndelungat la degradare sau schimbarea
proprietăţilor terapeutice.
Indubitabil, prezenta microorganismelor patogene sau conditionat patogene exprima existenta
unor conditii precare de igiena.
Gradul de contaminare este mult mai redus pentru materiile prime realizate prin sinteză sau
semisinteză, sau pentru substanţele izolate în stare pură. Purificarea cu solvenţi organici
pune la adăpost substanţele de contaminare microbiană. Substanţele cu grad ridicat de
puritate chimică prezintă un număr redus de microorganisme.
GERMENI CONTAMINANŢI A PRODUSELOR FARMACEUTICE
Din produsele farmaceutice au fost izolate numeroase specii de bacterii aerobe,
microaerofile, anaerobe, patogene, condiţionat patogene, sau nepatogene pentru
om: Microorganismul Produsul farmaceutic
Bacillus spiralis Pilule preparate mecanic,colire
Clostridium perfringens Fiole cu adrenalină sau cu ser fiziologic
Clostridium tetani Alcool medicinal, talc pudră
Candida albicans Unguente cu corticosteroizi, antibiotice
Citrobacter sp. Colire
Enterobacteriaceae (în general) Produse chimice organice şi micerale de proces, pudre, granule
medicamentoase, comprimate, geluri, pomezi, supozitoare.
E.coli Colire, produse suport a unor medicamente ca: amidon, celuloză pudră.
Haemophylus cojuctivitidis şi H. influenzae Colire
Hafnia sp. Colire
Klebsiella Unguente cu corticosteroizi, antibiotice, aerosoli.
Micrococcus urae Colire
Moraxella lacunata Colire
Penicillium notatum Unguente cu corticosteroizi, antibiotice.
Pseudomonas sp. Apă sterilă, soluţie de clorhexidină, colire, unguiente cu antibiotice.

Staphylococcus sp. Colire cu pilocarpină sau fluoresceină, unguente cu corticoizi, antibiotice.


Sarcina lutea Unguente cu corticosteroizi, antibiotice.
Serratia sp. Colire
Saccharomyces cerevisae Unguente cu corticosteroizi, antibiotice.
Shigella sp. Colire
Salmonella sp. Extract titoidian, produse apoterapeutice.
ORIGINEA CONTAMINĂRII PRODUSELOR FARMACEUTICE

Există mai multe căi de contaminare a produselor farmaceutice:

 materia brută folosită la prepararea produsului, cum ar fi: substanţe sintetice,


semisintetice, substanţe de origine animală sau vegetală, substanţe adjuvante
introduse în formula de medicament, apa;
 echipamentul şi recipientele utilizate în timpul procesului de obţinere a
medicamentului;
 aerul şi în general mediul înconjurător;
 operatorul;
 ambalajele pentru produsul finit;
 modul de manipulare al medicamentului.
Norme microbiologice pentru produsele farmaceutice
Pentru produsele farmaceutice obligatoriu sterile nu se admite nici un
microorganism aerob, microaerofil, sau anaerob contaminant. Farmacopeele naţionale şi
internaţionale prevăd acest lucru.
Produsele farmaceutice nesterile sunt încă în discuţie cu privire la normarea
încărcăturii bacteriene, majoritatea recomandand încărcătura cu germeni cat mai redusă. De
fapt, expresia „nesteril” a fost înlocuit cu termenul “puritatea medicamentului”.
Produselor farmaceutice nesterile trebuie să li se aplice normele de calitate
microbiologică propuse de Buttiaux şi Morsel pentru produsele alimentare. Ei propun:

 absenţa germenilor patogeni dintr-un gram de produs, mai ales Enterobacteriaceae;


 absenţa bacteriilor anaerobe toxigene cum ar fi: Clostridium botulinum şi Clostridium
perfringens, în 5 g produs;
 absenţa dintr-un gram de produs a germenilor “ indicatori ai poluării”, germeni care aparţin
florei intestinale;
 germenii saprofiţi să nu depăşească numărul de 100.000 în proba analizată.
Norme microbiologice pentru produsele farmaceutice
Normele de puritate microbiologică trebuie să se adapteze
particularităţilor produselor, în raport cu materiile prime folosite în procesul de
fabricaţie. Exigenţile trebuie să fie mai mari pentru preparatele de uz local decât
pentru preparatele de uz oral. In această situaţie trebuie respectate următoarele
reguli:
 preparatele de uz local nu trbuie să conţină mai mul de 100 germeni la un gram
de produs analizat. Bacteriile Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus
şi Enterobacteriiaceaele trebuie să lipsească din produs.
 preparatele de uz oral nu treduie să conţină mai mult de 100 germeni, ciuperci şi
levuri, la un gram de produs. Enterobacteriaceaele trebuie să lipsească din
produs.
Norme microbiologice pentru produsele farmaceutice

Comitetul laboratoarelor pentru controlul medicamentului analizand


puritatea microbiologică a formelor farmaceutice, propune împărţirea lor patru
categorii, fiiecare cu exigenţele sale:

Preparatul Exigenţe
I. preparate injectabile sterile
II. preparate oftalmice, preparate Absenţa germenilor viabili într-un gram sau mililitru de produs.
aplicate pe arsuri sau ulceraţii
III. preparate medicamentoase pentru Maxim 100 germeni la gram sau mililitru.
aplicaţii locale, nas, gât, urechi. Enterobacteriaceaele, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus - lipsă.
IV. alte preparate Maxim 1000 germeni la g sau ml.
Enterobacteriaceaele, Ps. aeruginosa şi Staphylococcus
aureus - absenţi.
Ciuperci şi levuri, max. 100 /g sau ml.
CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL PRODUSELOR FARMACEUTICE

Farmacopeele naţionale obligă ca produsele farmaceutice administrate


parenteral, sau cele utilizate la tratarea arsurilor, rănilor deschise sau cele care
se aplică aseptic în secţiile de chirurgie, ginecologie, urologie, să fie lipsite de
bacterii, ciuperci, levuri, virusuri, microorganisme capabile să se dezvolte în
organismul uman.
Componentele produsului final farmaceutic etichetat şi “steril” este
necesar să fie chiar din faza iniţială cat mai aproape de sterilitate sau chiar
lipsite total de microorganisme pentru a se evita apariţia substanţelor pirogene
de natură microbiană. Se cercetează prezenţa microorganismelor aerobe,
microaerofile, anaerobe şi ciupercilor, prin însămînţarea probelor în sau pe medii
de cultură specifice care trebuie să rămană sterile după o anumită perioadă de
trmostatare, la temperaturi caracteristice pentru fiecare grup de microorganisme.
CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL PRODUSELOR FARMACEUTICE

PRELEVAREA CONTROLUL Interpretarea


PRECONTROL MICROBIOLOGIC
PROBELOR rezultatelor

• 5-40 probe • Insamantarea • Determinarea


• Precontrolul în funcţie de mediilor NTUFC
mediilor de mărimea • Incubarea • Reluare control
cultură lotului sau probelor cu identificare
cantitatea de contaminanti
produs
• Determinarea
activităţii
bacteriostatice
şi fungistatice

Determinarea numărului total de unităţi formatoare de colonii ( NTUFC).Se poate efectua prin
trei metode:
- metoda plăcilor turnante pentru probele solubile şi probele cu aspect clar;
- metoda diluţiilor în tuburi sau metoda MPN ( most probable number) pentru probe soluţii
neclare, opalescente şi probe cu număr redus de germeni;
- metoda membranei filtrante pentru probele solubile, clare sau cu inhibitori bacteriologici.
PRECONTROLUL MEDIILOR DE CULTURĂ

Este o operaţie obilgatorie care se efectuează la fiecare tip de mediu de cultură.

Precontrolul începe cu mediile de cultură care vor fi folosite pentru controlul sterilităţii.
Se controlează sterilitatea mediilor de cultură, ca şi capacitatea mediilor utilizate de a
permite dezvoltarea optimă a microorganismelor test. Se controlează un procent de 10
% din mediile de cultură care vor intra în lucru.
Testare
Farmacopeea românească recomandă pentru testare trei medii de cultură (mediile
1,2,3) , repartizate câte 15 ml în fiecare eprubetă. In eprubetele cu mediile 1 şi 3 se
însămânţează 0,1 ml dintr-o suspensie de spori de Clostridium sporogenes, cultură de
24 ore în diluţie de 1: 200 000. Separat, aceleaşi medii se incubează cu 0,1 ml dintr-o
cultură de 24 ore de Staphylococcus aureus diluată 1: 1000. Mediile 2 şi 3 se
însămînţează cu 0,1 ml cultură de Candida albicans de 24 ore la o diluţie de 1: 10
000. In alte trei eprubete se introduce aceeaşi cantitate de mediu, dar care nu se mai
inoculează cu microorganisme test. Acestea sunt probe martor. Probele martor ne
indică gradul de sterilitate a mediilor utilizate în testare.
CONTROLUL MICROBIOLOGIC
Tehnica de lucru.

Pentru testarea sterilităţii se utilizează trei categorii de medii de cultură:

 mediul universal aerob-anaerob lichid cu tioglicolat, termostatat 7 zile la 30-35


grade C, după însămânţarea lui cu produsul farmaceutic;
 mediul lichid Sabouraud glucoză-maltoză ( ambele zaharuri sunt necesare
pentru a favoriza dezvoltarea levurilor şi ciupercilor); după însămânţare,
termostatarea se efectuează 7 zile la 20-25C; produsele uleioase se
termostatează 14 zile;
 bulion-glucozat, pentru dezvoltarea germenilor aerobi şi favorizarea germinării
sporilor. Acest mediu se însămînţează cu produsul farmaceutic în dublu exemplar
şi se termostatează 7 zile la 30-35 C şi respectiv la 20-25 C, pentru a înregistra
o gamă cît mai mare de germeni aerobi.
Pentru produsele farmaceutice insolubile, se recomandă înlocuirea mediului aerob-
anaerob fluid cu bulion-tioglicolat, ultimul permiţând vizualizarea creşterii
bacteriene.
CONTROLUL MICROBIOLOGIC

Tehnica de lucru.
Mediile de cultură sunt pregătite şi repartizate în eprubete şi flacoane de
mărimi diferite ( 10, 40 şi 100 ml ), pentru a permite însămânţarea lor cu cantităţi
diferite de produs farmaceutic, conform schemelor de lucru.
Pentru a controla sterilitatea mediilor folosite şi acurateţea tehnicii microbiologice
este obligatoriu să se termostateze concomitent câte o eprubetă sau flacon cu
mediu neînsămînţat.

Testarea sterilităţii prin metoda membranelor filtrante se practică în cazul


simplificării metodei sau ca o probă în paralel, dar mai ales pentru produsele
uleioase, alifii, produse care în mediile de cultură se solubilizează greu sau prin
compoziţia lor au activitate bacteriostatică sau bactericidă. Membrana filtrantă prin
care s-a filtrat produsul se introduce în mediile lichide de cultură recomandate de
farmacopeele naţionale şi europene sau se depun pe mediile solide.
In cazul anaerobilor se utilizează medii speciale, termostatate în condiţii de
anaerobioză.
DETERMINAREA ACTIVITĂŢII BACTERIOSTATICE ŞI FUNGISTATICE
Este o operaţie de precontrol a sterilităţii produselor farmaceutice.Precontrolul se va
efectua pe două tipuri de medii: un mediu de cultură în care se va introduce o
anumită cantitate din produsul de analizat şi un mediu lipsit de produsul de analizat.
Mediile de cultură utilizate la testare nu trebuie să conţină substanţe inhibante. Se
va testa efectul bacteriostatic sau fungistatic faţă de Staphylococcus aureus,
Escherichia coli,Candida albicans sau alţi germeni.

Odată stabilită prezenţa activităţii bacteriostatice sau fungistatice, se trece la


îndepărtarea acestora utilizând una din metodele menţionate mai jos:

 metoda diluţiilor: se diluează produsul până la o diluţie care asigură


îndepărtarea efectului inhibant;
 metoda inactivării directe prin adăugarea inactivantului potrivit;
 metoda aplicării membranei filtrante: se filtrează produsul de cercetat prin
membrana filtrantă (pori 0,45 micro metri) urmat de spălări repetate (2-5 ori) cu
amestec special pentru spălare.
PRELEVAREA PROBELOR
Farmacopeea romănă recomandă prelevarea a 5-40 probe în funcţie de
mărimea lotului sau cantitatea de produs. Cantitatea de produs ce se însămînţează
în mediile de cultură variază în funcţie de volumul sau cantitatea din fiole sau flacon,
starea fizică a produsului: lichidă sau solidă, şi nu de neglijat normele recomandate
de farmacopeele naţiaonale.
Farmacopeea românească pentru produsele lichide recomandă:

Volumul preparatului Cantitatea de produs Volumul mediului de


pe recipient inoculat cultură
1-10 ml 1 ml 15 ml
10-15 ml 5 ml 40 ml
Peste 50 ml 10 ml 40-100 ml
Pentru produsele solide se recomandă
Cantitatea pe recipient Cantitatea deprodus Volumul mediului de
inoculat cultură
pînă la 50 mg tot conţinutul 40 ml
50-100 mg 50 mg 40-100 ml
100-200 mg Jumătate de conţinut 40-100 ml
Peste 200 mg 100 mg 100 ml
PRELEVAREA PROBELOR
Farmacopeea internaţională recomandă
Cantitatea probei Contaminare bacteriană Contaminare fungică
Lichide
Sub 1 ml Tot conţinutul Tot conţinutul
1-20 ml Jumătate din conţinut Jumătate din conţinut
20 ml sau mai mult 10 % din conţinut 10 % din conţinut
Solide
Sub 50 mg Tot conţinutul Tot conţinutul
50-200 mg Jumătate din conţinut Jumătate din conţinut
200 mg sau mai mult 100 mg 100 mg

Pentru a evita contaminarea în timpul recoltării, prelevarea probelor se


va efectua aseptic.Transportul probelor pînă la laborator se efectuează cât mai
rapid şi în condiţii optime, pentru a se evita contaminarea şi deteriorarea lor.
Dacă proba nu se poate introduce imediat în lucru, se va păstra la
temperatura şi condiţiile recomandate de producător. In anumite situaţii
temperaturile scăzute modifică calitatea produsului.
PRELEVAREA PROBELOR
Tehnica de lucru.
Probele se însămânţează în condiţiile recomandare de farmacopeea europeană, direct
în mediile de cultură, cu sau fără adaos de diluent sau emulgator (se poate folosi Tween 80), în
funcţie de starea fizico-chimică a produsului:

• lichidele, soluţiile, suspensiile se trec direct în mediile de cultură, cele uleioase primind 10
% Tween 80 înainte de însămînţare,
• pulberele sau comprimatele se diluează direct cu apă sterilă sau ser fiziologic tamponat
steril, mojarându-se în prealabil dacă este cazul.
• Cremele sau unguentele încălzite la 40 C se amestecă cu Tween 80 ( cca 1-5 g sau ml )
încălzit şi el la 40 C, după care se completează cu soluţie de tampon fosfat sterilă pH 7,
încălzită la 40C, pînă la obţinerea proporţiei finale de 10 %.
• Antibioticele se diluează cu apă sterilă sau ser fiziologic steril până la îndepărtarea efectului
bacteriostatic, cu excepţia penicilinelor care sunt tratate cu penicilinaze.
• Din fiecare eşantion de pansament se taie în condiţii de sterilitate 1 cm pătrat, apoi este
introdus în 100 ml mediu de cultură, iar din materialele de sutură chirurgicale se iau cîte 12
fiole din fiecare serie pentru 100 ml mediu de cultură.
Interpretarea rezultatelor.

Probele se consideră sterile, dacă toate eprubetele cu medii însămînţate păstrează


transparenţa iniţială pe toată perioada de incubare.
In cazul apariţiei unor modificări de transparenţă în perioada de observaţie, se
însămânţează cel puţin câte 1 ml în 2 eprubete cu mediu semisolid şi alte 2
eprubete sau plăci Petri cu mediu solid.Eprubetele şi plăcile Petri se termostatează
la temperatura de lucru. După trei zile de termostatare produsul este considerat steril
dacă nu au apărut germeni pe unul din aceste medii de transfer ( în acest caz
transparenţa a fost modificată de alte procese fizico- chimice sau modificări de
structură).
Interpretarea rezultatelor.

Dacă se constată creşteri de microorganisme în una sau mai multe eprubete


însămânţate dintr-o serie, controlul sterilităţii se repetă pe un număr dublu de probe.
Dacă la al doilea control, în una sau mai multe eprubete se constată creşterea unor
microorganisme identice cu acelea din primul control, proba se consideră nesterilă.In
plus, dacă la al doilea control, în una sau mai multe eprubete se constată creşterea
altor microorganisme diferite de cele din primul control, se va repeta controlul pe un
număr identic de probe.
Dacă la al treilea control se constată din nou creşterea unor bacterii şi fungi, chiar
numai într-o singură eprubetă, probele se consideră nesterile.
Controlul purităţii microbiologice a produselor farmaceutice

Controlul purităţii microbiologice urmăreşte stabilirea numărului total de


microorganisme aerobe şi prezenţa germenilor patogeni în preparatele farmaceutice
nesterile. Prin preparat farmaceutic nesteril se înţelege materia primă, produsul în
curs de fabricaţie şi produsul farmaceutic.

Riscul contaminării materiilor prime cu germeni patogeni, condiţionat patogeni sau


nepatogeni poate fi de trei feluri:
• risc de gradul 1: înseamnă o încărcătură mare de germeni. Este specific materiilor
prime de origine animală: extract de ficat, tiroidă pulbere, făină de carne, praf de
ouă, făină de oase, caseină, peptone, gelatină, lapte praf, extract de placentă, etc.
• risc de gradul 2: înseamnă încărcare medie sau parţială de germeni. Este specific
materiilor prime de origine vegetală: gumă arabica, gumă tragacanta, făină de
porumb, cacao pulbere, digitală pulbere, amidon, extract de drojdie, agar-agar.
• risc de gradul 3: înseamnă o încărcare microbiană redusă. Materiile prime de
origine minerală sau sintetică prezintă, în general o contaminare secundară.

O atenţie deosebită trebuie acordată şi apei deionizate, apei distilate care adeseori au
fost contaminate cu unii germeni, în special Pseudomonas sp. şi adesea ori cu
Pseudomonas aeruginosa, implicat mai ales în infecţiile interioare de spital.
Prelevarea probelor
Probele prelevate trebuie să fie reprezentative.
Laboratoarele de specialitate, pot recolta probe din depozite, farmacii sau din
unităţile sanitare ori de câte ori există o suspiciune de produse contaminate sau
suspicionate ca sursă a unor infecţii endemice sau epidemice. Aceste controale
devin obligatorii şi pentru firmele producătoare care vor utiliza în acest scop
laboratorul propriu.
Tehnica de recoltare este aceeaşi ca pentru produsele sterile, adică operaţia se
efectuează cu instrumente sterile, personal trebuie să fie instruit şi calificat, probele
se păstrează la temperatura recomandată de producător iar laboratorul de analiză
trebuie să fie pregătit corespunzător. Cantitatea de probă prelevată este stipulată
în farmacopee. Pentru produsele finite cantitatea de probă prelevat pentru control
trebuie să fie de minimum 5 g sau 5 ml. Această cantitate se va reţine din
cantitatea rezultată din omogenizarea a două ambalaje.
Determinarea numărulu total de unităţi formatoare de colonii ( NTUFC).

Se poate efectua prin trei metode:


- metoda plăcilor turnante pentru probele solubile şi probele cu aspect clar;
- metoda diluţiilor în tuburi sau metoda MPN ( most probable number) pentru probe
neclare, opalescente şi probe cu număr redus de germeni;
- metoda membranei filtrante pentru probele solubile, clare sau cu inhibitori
bacteriologici.
Suspensiile şi soluţiile apoase sau
alcoolice-apoase (cu concentraţia
în alcool sub 30 %) se analizează
prin metoda plăcilor turnante, mai
ales suspensiile care prin starea lor
fizico-chimică nu sunt potrivite
filtrării prin membrane filtrante.
Substanţele finite, în mare parte,
sunt solubile în apă, dar cele care
sunt insolubile şi au aspectul unor
granule mai mari sau mai mici se
macină în prealabil la un mixer sau
mojar şi eventual dacă este posibil
se aduc în faza apoasă cu ajutorul
unei soluţii intermediare.
Metoda plăcilor turnante.

Pentru fiecare diluţie se folosesc 3 plăci Petri.În fiecare placă se introduce câte 0.1
ml din diluţia respectivă. Plăcile 1 şi 2 se amestecă cu geloză nutritivă ( cca. 15 ml)
răcită la 45C, din care una se termostatează la 20-25 C , iar cealaltă la 30-35 C,
timp de 48 ore. Placa 3 se amestecă cu mediu Sabouraud gelozat şi răcit la 45C,
iar după omogenizare şi solidificare se depune la termostat la 20-25C pentru 7 zile.
Omogenizarea amestecului este de mare importanţă deoarece asigura răspândirea
uniformă a coloniilor pe toată suprafaţa plăcii.
Interpretare:
se iau în considerare plăcile
Petri cu numărul de colonii
contabilizabile, de preferat
numărul de colonii între 30 şi
300. După calcularea numărului
de colonii pentru fiecare diluţie
în parte se calculează NTUFC
raportat la g sau ml de produs
analizat.
Metoda diluţiei în tuburi ( MPN )

se practică de obicei în cazul numărului redus de germeni sau când materialul de


analizat are un aspect fizic care nu permite citirea coloniilor în placa Petri turnată.
Pentru fiecare probă se utilizează 20 eprubete cu mediu, în general bulion nutritiv.
15 eprubete se însămânţează cu probele de analizat (câte 5 eprubete pentru
fiecare diluţie ), iar ultimele 5 eprubete nu se însămânţează fiind considerate martor
de sterilitate.
Metoda membranei filtrante pentru unităţi formatoare de colonii.

Această metodă se practică în cazul unor produse farmaceutice care conţin substanţe
bacteriostatice sau fungistatice sau în cazul unui număr redus de germeni ori ca metodă de
elecţie pentru unele laboratoare.
Pentru produsele farmaceutice farmacopeea recomandă următoare tehnică de lucru: soluţia se
împarte în trei părţi egale şi se filtrează printr-o membrană cu porozitate de 45 micrometri. După
filtrare, filtrele se spală cu apă distilată sterilă, apoi cu apă peptonată sterilă.
Două dintre membranele filtrante se aşază pe suprafaţa mediului geloză nutritivă turnat în plăci
Petri. Una dintre plăci se termostatează la 35-37C, iar cealală la 24C. Ambele plăci se
termostatează timp de 24 ore.
A treia membrană filtrantă se aşază pe suprafaţa mediului Sabouraud turnat în plăci Petri . Se
tremostatează la 20-25 C.
Citirea rezultatelor se face după 2 zile pentru bacterii şi levuri şi după 3-5 zile pentru fungi.
CONTROL MICROBIOLOGIC
De la sampon si ruj pana la cremele de fata, produsele cosmetice
sunt folosite pentru a ajuta la mentinerea tenului curat, in stare
proaspata si chiar pentru a etala o alura mai tanara si atractiva.

Cu toate acestea, produsele cosmetice prezinta un risc de


contaminare microbiologica.

Exista multe ocazii in care un produs cosmetic poate fi


contaminat de microorganisme.

Microorganismele se multiplica apoi exponential iar


numarul mare de bacterii pot provoca efecte negative
asupra calitatii produselor si sanatatii consumatorilor,
variind de la infectii la reactii alergice severe.
Calitatea microbiologică a produselor cosmetice
Informațiile sunt esențiale pentru a justifica eficacitatea sistemului de conservare și
pentru a justifica valabilitatea minimă indicată a produsului cosmetic și perioada de
utilizare după deschidere (PAO) a produsului finit

- se acordă o atenție specială specificațiilor microbiologice ale produselor


cosmetice destinate a fi utilizate pe părți sensibile ale corpului și la populații
specifice (la copiii sub trei ani, la persoanele în vârstă sau la persoanele cu
sistem imun compromis), ale produselor cosmetice destinate a fi utilizate în jurul
ochilor, pe mucoase în general, pe pielea care prezintă leziuni (de exemplu,
produsele de îngrijire a pielii utilizabile pe pielea atopicilor sau pe pielea iritată)
Calitatea microbiologică a produselor cosmetice
Calitatea microbiologică a materiilor prime (substanțe sau amestecuri)
- Principalii parametri ai calității microbiologice sunt:
- nivelul inițial de contaminare și
- posibilitatea multiplicării microbiene.
Se acordă o atenție deosebită materiilor prime care sunt cele mai
susceptibile la multiplicarea microbiană (de exemplu, amestecurile pe bază
de apă, materiile bogate în proteine, materiile prime de origine vegetală sau
animală). Pe de altă parte, există materii prime care nu favorizează
multiplicarea microbiană, de exemplu solvenții organici. Pentru acestea nu
sunt necesare specificatii de calitate microbiologica.
Calitatea microbiologică a produsului cosmetic
finit
Există trei categorii de produse:
1. produsele cu risc microbiologic mic (de exemplu, cele cu conținut de alcool >
20 %, cele pe bază de solvenți organici, cele cu pH mare/mic), pentru care nu
sunt necesare nici testul de verificare a conservabilității, nici teste de verificare a
calității microbiologice. Totuși, e necesară o justificare științifică;
2. produsele de unică folosință și cele care nu pot fi deschise (de exemplu, cele
pentru care ambalajul permite dozarea produsului fără a intra în contact cu
aerul), pentru care sunt necesare numai testele de verificare a calității
microbiologice. Totuși, este necesară o justificare științifică;
3. toate celelalte produse, pentru care sunt necesare atât testul de verificare a
conservabilității, cât și teste de verificare a calității microbiologice efectuate pe
produsul finit.
Calitatea microbiologică a produsului
cosmetic finit
Acestea se impart un 2 subcategorii:

- Produse de categoria 1, destinate: copiilor sub 3 ani, aplicarii pe piele, aplicarii


perioculare si aplicarii pe mucoasa
→ numarul total de microorganism mezofile aerobe viabile nu trebuie sa
depaseasca 102 ufc/g sau 102 ufc/ml din produs (ufc = unitati formatoare de
colonii).
→ Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus si Candida albicans
nu trebuie sa fie detectabile in 1 g sau 1ml produs finit

- Produse de categoria 2: alte produse (ex. produse care se indeparteaza prin


clatire)
→ numarul total de microorganism mezofile aerobe viabile nu trebuie sa
depaseasca 103 ufc/g sau 103 ufc/ml din produs
→ Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus si Candida albicans
nu trebuie sa fie detectabile in 0.1 g sau 0.1 ml produs finit
Calitatea microbiologică a produsului
cosmetic finit - Standarde

https://www.iso.org/standard/72240.html
Controlul microbiologic a produselor cosmetic

Controlul microbiologic a oricărui produs cosmetic trebuie să se desfăşoare în mai


multe etape:
1) recoltarea şi pregătirea probelor;
2) pregătirea produsului cosmetic în funcţie de consistenţă şi starea fizică
3) analiza microbiologică propriu-zisă.
RECOLTAREA ŞI PREGĂTIREA PROBELOR

Numărul de probe recoltate trebuie să fie statistic reprezentativ:

 cantitatea necesară pentru analiza microbiologică este în jur de 10 g sau ml; dacă produsul
analizat este sub 10 g,ml se recoltează toată cantitatea;
 produsul se analizează imediat ce a intrat în laborator; dacă cercetarea microbiologică
nu se poate efectua imediat, produsul se depozitează la temperatura camerei (15-20°C),
sau la temperatura indicată de producător. Se va evita termostatarea, refrigerarea sau
îngheţarea produsului înainte sau după analiză;
 proba se inspectează macroscopic şi se vor face observaţii specifice referitoare la
culoarea produsului dacă este corespunzătoare sau modificată, consistenţa, continuitate la
scurgere, miros specific sau nespecific (alterare), aspectul şi integritatea ambalajului;
 înainte de deschidere, ambalajul este supus dezinfecţiei exterioare cu o mixtură apoasă
alcool etilic 80% (V/V) şi 1% HCl (V/V); după dezinfecţie se usucă suprafaţa prin ştergere
cu un tampon steril;
 dacă din aceeiaşi probă se cer multiple analize (microbiologice, toxicologice, chimice etc.),
examenul microbiologic are prioritate. În acest caz, cantitatea utilă diagnosticului
microbiologic este dependentă de celelalte examinări, însă pe buletinul de analiză se va
menţiona cantitatea care se foloseşte pentru examenul microbiologic. De exemplu, dacă
proba conţine 5 g/ml, cel puţin 1/5 din probă, deci 1-2 g/ml se utilizează pentru examenul
microbiologic.
PREGĂTIREA PRODUSULUI COSMETIC

Pregătirea produsului cosmetic se face în funcţie de natura lui:


 produsele lichide
• se vor dilua astfel: la 10 ml probă se adaugă 90 ml soluţie diluantă. Dacă analizăm o cantitate inferioară
se respectă raportul probă/diluant, deci 1/10. De exemplu, la 5 ml probă se adaugă 45 ml lichid de diluţie.
• produsele de consistenţă solidă şi pulberile se cântăresc aseptic într-un mojar steril. Astfel, se
cântăresc 10 g probă în condiţii sterile, se supun mojarării adăugând picătură cu picătură 10 ml Tween 20
sau Tween 80 steril până la obţinerea unei paste omogene care se diluează cu diluant la diluţia 1/10.
Omogenitatea probei de analizat este esenţială în analiza microbiologică.
 produsele uleioase (creme şi uleiuri).
• Aproximativ 10 g produs se intoduce într-un mojar steril. Se mojarează cu insistenţă adăugînd picătură
cu picătură 1,0 ml ulei de parafină steril şi apoi 1,0 ml Tween 20 sau 80 steril. Se continuă adăugarea de
diluanţi pînă la obţinerea în final a unei diluţii de 1/10.

 aerosolii sub formă de pulberi, săpunuri, lichide şi alte produse similare


• după desinfectarea ambalajului se preia în mod steril într-un flacon steril 10 g din probă. Operaţia se
efectuează la balanţă şi proba se diluează la o diluţie de 1/10. Dacă această operaţie nu este posibilă, cum
este cazul deodoranţilor se sifonează produsul timp de 30 sec într-un vas cu soluţie diluantă sterilă. Produsul
din flaconul steril se amestecă bine.Cantitatea de soluţie diluantă din flacon trebuie să fie de 90 ml.
Indiferent de natura produsului probele vor fi supuse diluţiilor zecimale pînă la obţinerea unor diluţii cu
un domeniu de 10-4/10-8.
ANALIZA MICROBIOLOGICĂ PROPRIU-ZISĂ

Analiza microbiologică a produselor cosmetice trebuie să ia în considerare


următoarele aspecte:

- încărcătura microbiană a probei, respectiv numărul total de unităţi


formatoare de colonii (NTUFC);
- analiza spectrului microbiologic al produsului cosmetic;
- prezenţa unor germeni de interes medical.
ANALIZA NUMĂRULUI TOTAL DE UNITĂŢI FORMATOARE DE COLONII
(NTUFC),

este operaţia ce urmăreşte punerea în evidenţă a formelor microbiene de natură


bacteriană levuriana şi fungică prezente într-o probă.
Metodologia cuprinde:
 pregătirea mediilor de cultură,
 inocularea,
 termostatarea şi
 analiza unităţilor formatoare de colonii. (citirea probelor).

Mediile de cultură utilizate sunt: geloza simplă, nutritivă pe bază de peptonă triptică,
în cazul bacteriilor şi mediul de cultură Sabouraud, pentru levuri şi fungi.
ANALIZA SPECTRULUI MICROBIAN AL PRODUSULUI COSMETIC.

In produsele cosmetice pot fi prezenţi diferiţi germeni, patogeni sau nepatogeni,


bacili sau coci, germeni sporulaţi sau nesporulaţi, Gram negativi sau Gram pozitivi,
aerobi, microaerofili sau anaerobi.

Pentru evidenţierea acestora este util să se folosească mai multe sortimente de


medii de cultură, începînd cu mediile simple, cum ar fi:
• bulion nutritiv sau geloză nutritivă,
• medii nutritive pe bază de peptone triptice bogate în acizi aminici şi
• medii îmbogăţite prin adaosul de produse biologice, cum ar fi: sînge, ser, factori
hemoglobinici.
• Se pot folosi de asemenea medii speciale pentru anaerobi, universale sau
specifice pentru un anumit grup microbian.

In analiza spectrului microbian se pot folosi diferite tehnici de lucru, dupa realizarea
culturilor Petri.
ANALIZA SPECTRULUI MICROBIAN AL PRODUSULUI COSMETIC.

Pentru examinarea coloniilor care au crescut se vor urmări aspectele


morfologice, comportamentul enzimatic, serologic, genetic,etc:

- se efectuează un frotiu Gram din coloniile izolate;

- se selectează coloniile Gram-negative şi Gram-pozitice şi se repică pe


mediile specifice care să nu modifice proprietăţile morfologice şi biochimice;

- se fac testele biochimice:


 testul oxidazei,
 testul catalazic,
 testul indologenazei,
 testul de reducere a nitraţilor,
 producerea de hidrogen sulfurat,
 descompunerea zaharurilor sau alcoolilor cu formare sau nu de gaze,
 metabolizarea unor aminoacizi,
 precum şi alte teste considerate ca fiind necesare.
ANALIZA GERMENILOR PATOGENI

Sunt supuse acestei analize în special bacteriile ce aparţin genului


 Salmonella,
 Staphylococcus aureus, şi
 Pseudomonas sp.

Salmonella sunt bacterii mult implicate în patologie şi au o largă


răspîndire în mediul extern. Pentru analiza diferitor specii se poate folosi o
metodologie specifică.
Coloniile obţinute pe mediul McConkey se repică şi se trec pe mediul TSI şi mediul
AABTL, iar după crestere se testează:
- creşterea spcifică pe mediul TSI, se urmăreşte descompunerea glucozei cu
formare sau nu de gaze şi producerea de hidrogen sulfurat;
- aglutinarea cu ser polivalent H;
- aglutinarea cu ser polivalent O;
- aglutinarea cu ser polivalent specific de grup zero;
- fermentarea dulcitolului;
- decarboxilarea lizinei;
- testul ureazei care trebuie să fie negativ.
ANALIZA GERMENILOR PATOGENI

Staphilococcus aureus se analizează după schema:


- medii de cultură: Vogel-Johson sau Chapman;
- din diluţia 1/10 şi 1/100 efectuate pentru NTUFC se repartizează cîte 0,5 ml în
fiecare placă Petri cu mediul Vogel-Johnson sau Chapman;
- se răspîndeşte cultura uniform pe toată suprafaţa mediului;
- se termostatează la 35-37 C, timp de 48 ore;
- după 48 ore de termostatare se citesc plăcile, observîndu-se coloniile
caracteristice: colonii negre cu luciu metalic cu sau fără zonă galbenă pe mediul
Vogel-Johnson sau colonii galbene cu zonă galbenă pe mediul Chapman.;
- se repică pe geloză nutritivă 10 colonii caracteristice;
- se termostatează coloniile repicate 24 ore la 35-37 C ;
- cocii Gram-pozitivi, cu aspect specific la examenul microscopic se testează
pentru evidenţierea activităţii coagulazei;
- se calculează numărul de colonii coagualazo- pozitive.Se notează cîte colonii din
10 au fost coagulazo-pozitive şi se raportează la numărul total de colonii cu aspect
caracteristic de pe fiecare placă Petri.