Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
APLICATA
S.l.dr.ing. Alexandra Blaga
Microorganisme & Microbiologie
Microorganisme Microbiologia
• este o ştiinţă fundamentală care studiază
• sunt sisteme cu organizare morfologia, fiziologia şi sistematica
complexă, monocelulare sau microorganismelor, originea şi evoluţia lor,
pluricelulare, cu metabolism propriu fenomenele de ereditate şi variabilitate
şi continuitate genetică, cu o infinită microbiană.
diversitate a caracterelor • Etimologia cuvântului provine din limba
greacă:
morfologice şi fiziologice.
micros = mic; bios = viaţă; logos = ştiinţă.
Medii de cultura
IZOLAREA ŞI IDENTIFICAREA MICROORGANISMELOR
4. sterilizare cu ultrasunetete.
B. STERILIZAREA PRIN FILTRARE
Tipuri de filtre:
Pentru sterilizarea prin agenti chimici este folosit în special termenul de dezinfectie.
Ea are drept scop distrugerea germenilor patogeni în vederea înlaturarii posibilitatilor de infectie.
Se folosesc în mod curent urmatorii agenti chimici sterilizanti, de uz curent:
solutia de sublimat corosiv 0,1%, pentru dezinfectia meselor, mobilierului din sticla si
faianta, pentru dezinfectia mai riguroasa a mâinilor;
solutia de bicromat de potasiu 5%, pentru dezinfectia pipetelor întrebuintate;
alcool etilic 70%, pentru dezinfectia curenta a mâinilor;
formol 40%,
fenolul în concentratie de 5%, pentru dezinfectia diferitelor obiecte din sticla, portelan,
metal;
apa oxigenata în concentratie de 3%, pentru dezinfectia mâinilor si mucoaselor;
solutie de hidroxid de sodiu 20%, pentru sterilizarea mobilierului si dusumelelor;
cloramina 1%, pentru dezinfectia mâinilor, iar în concentratie de 5-6%, pentru
dezinfectia meselor de laborator
clorul pentru dezinfectia apei;
diferiti detergenti, pentru dezinfectia sticlariei si a rufelor.
Sterilizarea prin agenti chimici este folosita în laboratoarele de microbiologie numai pentru
obiectele si materialele întrebuintate. De asemenea, se mai folosesc agenti chimici sterilizanti si
pentru conservarea lichidelor organice (ser sanguin, sânge, urina) si a altor materiale biologice
(seruri imune si vaccinuri).
Un mediu de cultură reprezintă un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie
să asigure microorganismelor cantitatea necesară de apă, sursa de carbon, de
azot, săruri minerale, factori de creştere, deci care să le furnizeze substanţele şi
energia necesare în procesele de creştere, reproducere şi întreţinerea funcţiilor
vitale.
Mediul de cultură trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
să corespundă din punct de vedere nutritiv,
să aibă o concentraţie a substantelor dizolvate care să nu influenţeze
negativ schimburile osmotice ale celulei
să nu conţină substanţe toxice,
să aibă un anumit pH
să fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel încât să se dezvolte numai
celulele introduse prin inocul.
După scopul utilizării lor, mediile de cultură se împart în:
A. medii de cultura de laborator
• medii de cultură simple (generale) care asigură dezvoltarea unui mare număr
de specii
• medii de cultura complexe care sunt utilizate la izolari de microorganisme,
pentru cresterea si pastrarea lor
• medii de cultură speciale:
selective care permit dezvoltarea unui număr restrâns de microorganisme
de diferenţiere care permit separarea speciilor în funcţie de anumite
caractere biochimice
de îmbogăţire destinate separării şi cultivării unor microorganisme
pretenţioase din punct de vedere nutritiv sau care se află în număr redus
de conservare destinate mentinerii in viata si pastrarea proprietatilor
fiziologice si biochimice ale microorganismelor
B. medii de cultură industriale
• De origine latina
e.g. Escherichia coli (E. coli)
- a fost descoperita de : Theodor Escherich
In intestine
- descrie habitatul obisnuit (colon/intestine)
Domeniu
Microorganisme
Include protozoare, alge, virusuri, bacterii
Clasificare
Procariote • Celula procariotă are o organizare simplă. Ea este formată
din perete celular, membrană, citoplasmă şi un nucleu
Bacterii primitiv, atipic, reprezentat de un cromozom gigant ce
pluteşte liber în citoplasmă.Toate celulele procariote nu
Familia Genul au o structurare definită a “nucleului” lor. El este lipsit de
Neisseriaceae Naisseria, Vellonella membrană nucleară, nucleol şi nucleoplasmă. Informaţia
Micrococcaceae Staphylococcus,Gaffkya,Sarcina, genetică este depozitată la nivelul cromozomului şi este
Micrococcus. codificată într-o singură moleculă de ADN. In timpul
Lactobacteriaceae Diplococcus, procesului de multiplicare, în citoplasma nedivizată, pot
(Lactobacillaceae) Streptococcus,Eubacterium,Lacto exista mai mulţi cromozomi care însă sunt identici,
bacillus rezultând din dedublarea cromozomului unic.
Corynebacteriaceae Corynebacterium, Listeria • Citoplasma celulelor procariote este lipsită de curenţi
Bacillaceae Bacillus, Clostridium citoplasmatici. Ea nu conţine organite delimitate de
Enterobacteriaceae Salmonella, Shigella, Escherichia, membrane superior organizate. In interiorul ei nu există un
Klebsiella, Proteus, Cytrobacter, reticul endoplasmatic organizat, ci numai sisteme
Serratia, Hafnia, Aerobacter. membranare izolate.
Bacteroidaceae Capsularis, Zuberella • Membrana plasmatică este bine reprezintată şi are o
Brucellaceae Brucella, Pasteurella, Hemophilus, organizare tipică tuturor membranelor celulare.
Bordetella, Moraxella, • Peretele celular, cu foarte mici excepţii (micoplasmele) este
Acinetobacillus. prezent la toate procariotele. El este un perete rigid,
Pseudomonadaceae Pseudomonas aceasta datorită prezenţei în structura sa a unui polimer
Spirillaceae Vibrio, Spirillum complex, un mucopolizaharid, cunoscut sub numele de
Mycobacteriaceae Mycobacterium peptidoglican. Peptidoglicanul este acea structură
Actinomycetaceae Actinomyces, Nocardia moleculară ce îi conferă rezistenţă peretelui celular.
Treponemataceae Treponema, Leptospira, Borrelia • Celulele procariote se reproduc pe cale asexuată, adică prin
Mycoplasmataceae Mycoplasma diviziune directă sau sciziparitate şi numai excepţional pe
Rickettsiaceae Rickettsia, Coxiella cale sexuată, prin conjugare
Chlamydiaceae Chlamidia
MEMBRANA CITOPLASMATICA
• Din punct de vedere molecular, membrana plasmatică prezintă o structură tipică
membranelor biologice. Ea este formată din: lipide, reprezentate prin fosfolipide,
proteine şi glucide.
• Componenţii moleculari ai membranei plasmatice sunt astfel structuraţi încat să-i
permită acesteia să-şi poată îndeplini rolul său de membrană selectivă.
Fosfolipidele din structura membranei, formează un “film” în care plutesc proteine
globulare în timp ce glucidele interactionează fie cu fosfolipidele, fie cu proteinele.
• Fosfolipidele membranare prezintă o structură moleculară specifică. Ele au o
extremitate polară hidrofilă alcatuită dintr-un radical fosfat (PO43-) şi două lanţuri
de acizi graşi dispuşi divergent, aceştea se leagă de radicalul fosfat printr-o
moleculă de glicerol. Lanţurile de acizi grasi reprezinta extremitatea hidrofoba a
fosfolipidului.
Nucleoid
• Nucleoidul bacterian reprezintă 5-16 % din volumul celulei uscate.
• La cele mai multe bacterii nucleoidul este reprezentat de o moleculă
gigantă de ADN de formă filamentoasă, circulară cu extremităţile
reunite, fapt pentru care el poate fi considerat un cromozom gigant.
Lungimea filamentului este de 1400 μm, iar diametrul său este de 2,5
nm; dimensiune ce corespunde unei molecule de ADN dublu
catenară.
• Structura primitivă a nucleoidului bacterian, precum şi lipsa
membranei proprii, permite un contact direct între molecula de ADN,
ARN şi ribosomii din citoplasmă şi în consecinţă un transfer rapid al
informaţiei genetice.
Clasificarea bacteriilor
d.p.d.v. al afinitatii tinctoriale.
• Pentru a determina afinitatea tinctorială se recurge la colorarea diferenţiată
propusă de Gramm:
Etapele colorării Gramm:
I Executarea frotiului colorat şi uscat
- celulele de bacterii sunt plasate sub formă de suspensie, în
picătură, pe lamă;
- etalarea, deshidratarea şi fixarea bacteriilor prin trecerea lamei prin
flacăra becului de gaz;
II Colorarea cu violet de genţiană şi eliminarea colorantului, adăugarea de
mordant (soluţie Lugol);
III Diferenţierea - pe frotiu se adaugă amestecul de solvenţi - alcool +
acetonă - care solubilizează şi elimină colorantul de celule bacteriene G (-);
IV Colorarea suplimentară cu fuxină ce pătrunde numai în celulele libere de
colorantul anterior, astfel încât într-un frotiu în care avem bacterii cu afinităţi
diferite, prin parcurgerea metodei Gramm, microscopic, bacteriile G(+) se
colorează în violet, iar cele G(-) se colorează în roşu.
Coloratia Gram
Creşterea şi reproducerea
Creşterea şi reproducerea
În condiţii favorabile procesul de reproducere
caracteristic tuturor bacteriilor - sciziune binară
Filamentous Cyanobacterium
Caracteristici morfologice
• Diplococcus
Ribozomii
organite celulare ce se găsesc în citoplasmă, care
au în structură ARN – ribozomal şi proteine
sintetizează pe baza aminoacizilor proteinele;
Vacuolele
rol în înmagazinarea substanţelor de rezervă;
Peroxizomii
structuri sferice sau ovale înconjurate de o
membrană simplă şi cu o matrice fin granulată pe
care sunt localizate oxidaze, cu rol în adaptarea
celulei de drojdie la condiţii aerobe
Structura celulei de drojdie
Reticulul endoplasmatic
face legătura între nucleu şi vacuom şi reprezintă o reţea de vezicule,
caracterizate printr-o mare plasticitate morfologică.
sediul unor complexe enzimatice (citocromoxidaza, enzime ale lanţului
transportor de electroni)
rol în:
transportul substanţelor nutritive;
declanşarea procesului de înmugurire,
biogeneza sferozomilor, vacuolelor, corpilor Golgi;
participă, de asemenea, la expansiunea învelişului nuclear şi a
plasmalemei în diferite etape de dezvoltare ale celulei.
Aparatul Golgi
un sistem de endomembrane, alcătuit din unităţi funcţionale – corpi
Golgi sau dictiozomi, care face legătura între reticulul endoplasmatic şi
plasmalemă, între reticulul endoplasmatic şi alte organite celulare.
este aparatul de sortare şi dirijare a proteinelor şi componentelor
membranare spre locul de destinaţie;
are rol în expansiunea peretelui celular;
• Bacteroides,
• Prevotella şi
• Ruminococcus.
• Microbii de tip Bacteroides sunt mai eficienţi în descompunerea carbohidraţilor, ceea ce ar putea explica de ce
persoanele care prezintă acest enterotip sunt mai predispuse la probleme de greutate. Bacteriile de tip Prevotella tind
să descompună mucusul din intestin, iar Ruminococcus facilitează absorbţia zahărului, ceea ce poate favoriza
creşterea în greutate.
• Persoanele ce aparţin enterotipului Bacteroides au un mediu intestinal mai bun la sintetizarea vitaminelor B2, B5, C şi
H, iar cei ce aparţin enterotipului Prevotella prezintă mai multe bacterii eficiente în sintetizarea vitaminei B1 şi a
acidului folic.
• Un studiu desfăşurat in 2011 a arătat că enterotipul Bacteroides este asociat dietelor bogate în grăsimi şi proteine, pe
când enterotipul Prevotella este asociat unei diete bogate în carbohidraţi.
• O altă cercetare efectuată de Oluf Pedersen, specialist în genetică moleculară la Centrul de Diabet Steno din Gentofte,
Danemarca, a arătat că persoanele obeze sau cele care sufereau de afecţiuni metabolice aparţineau de obicei
enterotipului Bacteroides. De altfel, cercetătorii au descoperit că în 90% din cazuri pot deduce dacă o persoană este
obeză sau nu analizând doar microbiomul acesteia.
• Un studiu derulat în Danemarca a arătat că analiza microbiomului permite medicilor să estimeze cu acurateţe dacă un
pacient urmează să sufere de diabet, înmulţirea microbilor din grupul Bacteroides fiind un reper mai bun decât indicele
de masă corporală al persoanei studiate.
Microbiom
• Enterotipurile vor juca un rol important în descoperirea unor
tratamente alternative la antibiotice, care au devenit ineficiente în
ultimii ani, pe măsură ce bacteriile au devenit rezistente. Astfel, în loc
să încerce să elimine toate bacteriile din intestin, inclusiv pe cele
nocive, doctorii vor putea să stimuleze bacteriile utile, pentru a
restabili echilibrul bacterian existent înainte ca afecţiunea să se
dezvolte. Cu timpul, enterotipurile vor permite dezvoltarea medicinei
personalizate, în care fiecare pacient va beneficia de un tratament
conceput în funcţie de nevoile proprii, identificate pe baza
microbiomului său.
MICROFLORA NORMALĂ A ORGANISMULUI
UMAN
• Corpul omului oferă microorganismelor condiţii favorabile de dezvoltare.Ele
găsesc pe/în corpul uman.Cu toate acestea corpul uman nu reprezintă un mediu
uniform în totalitatea sa, deoarece fiecare regiune sau organ diferă din punct de
vedere chimic, fizic şi biochimic de alte regiuni sau organe, ceea ce facilitează
existenţa şi dezvoltarea numai a anumitor specii microbiene.
• La om pielea, caile respiratorii superioare, tubul digestiv şi alte organe şi
cavităţi, constituie o largă varietate de habitate, în care diferitele microorganisme
se dezvoltă selectiv.Intre aceste habitate şi microorganismele ce le populează se
stabilesc diferite tipuri de interrelaţii a căror natură este greu de determinat,
datorită faptului că acestea sunt supuse influenţei factorilor de mediu. In anumite
condiţii, o interrelaţie poate fi benefică, în timp ce în alte condiţii ea devine chiar
dăunătoare.
• La om microorganismele se întânlesc pe şi în organism sau organe, fapt pentru
care microflora poate fi analizată zonal, astfel se poate distinge o microfloră a:
• pielii,
• cavităţii bucale,
• căilor respiratorii,
• tubului digestiv, şi a
• căilor geneto-urinare.
• In mod normal microorganismele nu pătrund în intimitatea tesuturilor şi organelor,
în sînge sau limfă.Dacă totuşi ajung în aceste medii în mod accidental ele produc
boli infecţioase.
Microflora pielii
La nivelul pielii se poate dezvolta
o microfloră permanentă şi
o microfloră tranzitorie.
Microflora permanentă, sau normală a organismului uman, este reprezentată de
microorganismele care trăiesc şi se multiplică pe piele în condiţii de viaţă normală. Acest
tip de microfloră este specifică fiecărei porsoane. Ea îşi poate schimba compoziţia în cazul
în care pielea este tratată cu diferite substanţe ce au efecte distructive asupra
microorganismelor. Numărul de microorganisme, precum şi tipurile de microorganisme pot
creşte sau scădea în funcţie de acţiunea stimulatoare sau distructivă a substanţei
administrate.
Reprezentanţii microflorei normale a pielii aparţin la diferite grupe sistematice.Dintre bacterii
cele mai frecvent intînlite pe piele sunt diferitele specii de:
• Stafilococ alb şi citrin,
• bacilli Gram-pozitivi: corinebacterii aerobe şi anaerobe, în special Corynebacterium
acnes,producător al acneei,
• bacili Gram-negativi, în special E.coli şi Proteus vulgaris.
Alte specii de bacterii Gram-negative nu se pot dezvolta pe piele
datorită concurenţei cu bacteriile Gram-pozitive.
Microflora pielii
• Microflora tranzitorie este reprezentată de microorganismele
contaminante ale pielii. Acest tip de microfloră se dobândeşte
în anumite condiţii cînd pielea îşi schimbă pH-ul, compoziţia în
substanţe şi compoziţia microflorei permanente. Prin
tratamente speciale microorganismele care formează
microflora tranzitorie pot fi distruse, deşi nu cu mare uşurinţă.
• Microflora pielii se află într-un echilibru dinamic, datorită
influenţelor reciproce graţie cărora dezvoltarea unei specii se
face numai între anumite limite ceea ce asigură o toleranţă
completă din partea organismului gazdă.
Microflora cavităţii bucale
• Cavitatea bucală reprezintă un habitat foarte complex şi favorabil dezvoltării
microorganismelor. Factorii care favorizează prezenţa şi dezvoltarea
microorganismelor în cavitatea bucală sunt saliva şi prezenţa resturilor alimentare
depozitate în spaţiile dintre dinţi.
• Saliva conţine şi unii factori antimicrobieni dintre care cei mai importanţi sunt
lizozimul şi lactoperoxidaza. Lactoperoxidaza prezentă atât în lapte cât şi în
salivă,omoară bacteriile datorită acţiunii tiocianatului şi apei oxigenate , substanţe
rezultate ca urmare a acţiunii enzimei.
• Bacteriile întâlnite în cavitatea bucală la copii în primul an de viaţă sunt
reprezentate de streptococi lactici şi lactobacili, precum şi de un număr redus de
alte specii aerobe. Apariţia dinţilor determină o adevărată schimbare în echilibrul
microflorei bucale, de la aerobi la anaerobi paralel cu dezvoltarea unor specii care
se localizează pe suprafaţa şi în fisurile dentare. Pe suprafaţa dinţilor se formează
o peliculă continuă, cunoscută sub numele de placă dentară, care aderă foarte
strîns de dinţi şi are o grosime de 60 μm la nivelul coroanei dentare.
Microflora cavităţii bucale
• Placa dentară este formată din bacterii filamentoase gram-pozitive, strâns
aderente între ele şi incluse într-o matrice amorfă:
• Leptotrichia bucalis (Fusobacterium fusiforme), bacterie anaerobă, capabilă să fermenteze
hidraţii de carbon la acid lactic.In asociere cu această bacterie se întâlnesc un număr mic de
streptococi, coci Gram-negativi şi alte tipuri de microorganisme.
• E.coli,
• diferite specii de Proteus şi Pseudomonas aeruginosa, microorganisme a căror activitate
proteolitică este inhibată de bacteriile care formează microflora lactică, producătoare de acid
lactic.
• Streptococcus salivarius, unele levuri, sarcine, spirili şi spirochete, precum şi unele specii
saprofite, condiţionat patogene, cum ar fi streptococi hemolitici, pneumococi, meningococi,
Klebsiella, Micrococcus cataralis, şi bacili difterici.
Aceste microorganisme sunt, în mod obişnuit, în echilibru datorită competiţiei ce ia naştere între
specii şi concurenţei pentru sursele nutritive. Conţinutul microflorei bucale este influenţat şi de
compoziţi şi proprietăţile fizico-chimice ale salivei şi resturilor alimentare.
Microflora tubului digestiv
• Tubul digestiv constituie un mediu favorabil dezvoltării microorganismelor dat fiind
abundenţa substanţelor nutritive şi temperaturii constante. Totuşi, în diferitele
segmente ale tubului digestiv microflora variază cantitativ şi calitativ. Astfel,
stomacul, din cauza acidităţii sucului gastric a cărui pH este de 2 are un conţinut
relativ steril sau conţine un număr foarte mic de microorganisme
acidorezistente cum ar fi lactobacili şi streptococi, strâns asociate de epiteliu
mucoasei stomacale.
• Ȋn cazuri anormale, de scădere a acidităţii gastrice şi de creştere a pH, în stomac
se poate dezvolta o microfloră constituită din levuri, sarcine şi lactobacili.
• Intestinul subţire conţine o microfloră mai bogată dar neuniform repartizată,
datorită neuniformităţii conţinutului său. In intestinul subţire se constată un
gradient de pH care influenţează microflora atât cantitativ cât şi calitativ.
• La nivelul duodenului, din cauza pH acid, microflora nu diferă de cea din
stomac, dar lipsesc microorganismele asociate epiteliului mucoasei.
Microflora tubului digestiv
• Intestinul gros conţine un număr enorm de bacterii care se dezvoltă utilizând
produşii rezultaţi din procesul de digestie. La nivelul intestinului gros se găseşte o
microfloră de fermentaţie şi una de putrefacţie, care în mod normal se găsesc în
echilibru dinamic.
• Predominante sunt
• Klebsiella sp.: 40-80%,
• Clostridium perfrigens: 25-35%,
• Bifidobacterium bifidum: 30-70%,
• Lactobacillus: 20-60%,
• Enterococcus faecalis: 100%,
• Peptococcus, Peptostretococcus, Staphylococcus aureus: 30-50%,
• Enterobacter sp.: 40-80%, Bacteroides fragilis
In ultimul segment al intestinului gros, segmentul rectal, fecalele conţin microorganisme până la
aproximativ 25 % din greutatea lor uscată. Această microfloră desfăşoară o activitate metabolică
considerabilă. Ea fermentează celuloza şi alţi hidraţi de carbon nedigeraţi, cu producerea de CO2,
H2 şi acizi organici. Concomitent are loc şi o hidroliză enzimatică a unor proteine nedigerate în
segmentele superioare, cu producere de indol, scatol sau alţi compuşi.
Un catalog de gene microbiene
ale intestinului uman stabilit prin
secvențiere metagenomică
Microflora tubului digestiv
• Bacteriile din intestinul gros sintetizează şi pun în libertate cantităţi importante de:
• vitamine din grupul B,
• vitamina K,
• vitamina PP,
• acid pantotenic,
• acid folic,etc.
Acestea se absorb parţial în sânge, acoperind cel puţin o parte din necesarul organismului în unele vitamine.
Bacterii cum ar fi: Bacillus mesentericus, E.coli, Proteus vulgaris, Aerobacter aerogenes,etc.,
sintetizează cantităţi suficient de mari de vitamina K pentru a asigura complet necesarul organismului uman
în acastă vitamină. In general, bilanţul vitaminic la nivelul intestinului gros este influenţat de raportul cantitativ
dintre microflora producătoare şi cea consumatoare de vitamine (lactobacili), de tipul de hrană şi chiar de
cantitatea de vitamine din hrană.Importanţa microorganismelor în nutriţia vitaminică a omului este cu atît mai
mare cu cît, în mod normal, prin hrană, nu se satisfac niciodată toate nevoile vitaminice.
• Relaţiile dintre microflora intestinală şi organismul uman sunt de tip mutual-benefica pentru
ambii parteneri. Uneori, în mod special, în urma unor tratamente cu antibiotice cu spectru
larg,administrate per os (tetraciclină, eritromicină, cloramfenicol) microflora intestinală este
distrusă. In aceste condiţii intestinul poate fi colonizat de o altă microfloră reprezentată de specii
rezistente la antibiotice cum ar fi:
• Staphylococcus,
• Proteus,
• Candida albicans, care de obicei nu se dezvoltă în din cauza competitivităţii microflorei normale intestinale.
Această schimbare de microfloră poate altera funcţiile digestive producând tulburări mai mult sau mai puţin
grave. După o anumită perioadă de timp, microflora normală se reface şi echilibrul se restabileşte.
Microflora căilor respiratorii
• Căile respiratorii fiind în raport direct cu aerul atmosferic, aspiră odată cu acesta şi
microorganismele pe care le conţine.Majoritatea microorganismelor din aer sunt
însă oprite în fosele nazale datorită acţiunii de filtru a cililor epiteliului nazal şi apoi
lizate de lizozimul din secreţiile mucoasei nazale.Totuşi, în căile respratorii se pot
întâlni un număr de bacterii potenţial patogene ca:
• Staphylococcus aureus,
• Diplococcus pneumoniae,
• Corynebacterium diphteriae,
• Neisserie intracelularis,
• Haemophillus influenzae,
• Streptococcus pyogenes.
• Căile respiratorii inferioare: trahee, bronhii şi bronhiole, practic sunt sterile
deoarece majoritatea bacteriilor sunt reţinute de filtrul căilor respiratorii superioare.
Microflora căilor genito-urinare
• Uretra, la femeie, este în mod normal sterilă, în timp ce la bărbat, ea conţine, în
treimea sa inferioară, coci Gram-pozitivi.
• Vaginul conţine o microfloră specifică. Inainte de pubertate microflora vaginală este
săracă şi reprezentată numai de cîteva tipuri de coci, în special de stafilococi şi
streptococi.
• La maturitate, microflora vaginală conţine un număr mare de bacili lactici, în special
Lactobacillus acidophilus, cunoscut şi sub numele de bacilul Doderlein. Aceşti
bacili metabolizează glicogenul secretat de celulele mucoasei vaginale sau
provenite din secreţiile uterului, producând acid lactic. In felul acesta bacilii
Doderlein crează în vagin condiţii de aciditate corespunzătoare ( pH = 4-4,7 ), care
inhibă dezvoltarea altor microorganisme, în mod deosebit a microflorei proteolitice.
Totuşi, pe lîngă aceşti bacilii, în vagin, adesea se mai întânlesc stafilococi, levuri şi
colibacili.
• După menopauză secreţiile şi eliminarea de glicogen încetează, bacilii Doderlein
dispar şi se reinstalează microflora de înainte de pubertate
Rolul microorganismelor în viaţa
organismului uman
Microflora normală a organismului uman este complexă şi uneori foarte bine
dezvoltată.
Experimentările făcute pe animale sterile, lipsite de microflora lor normală, aşa
numitele animale „germ free”, arată stări anormale asupra evoluţiei lor,
constatându-se că:
• organele lor au mărimi şi capacităţi funcţionale mai reduse;
• intestinul este mai subţire, mai puţin musculos, lipsit de tonus, dar funcţional;
• cecum (un segment a intestinului gros) este foarte dezvoltat;
• dejectele nu au miros fecal şi amoniacal;
• sistemul limfatic este slab dezvoltat;
• fagocitele sunt pasive;
• carne lor este fadă şi lipsită de miros.
Rolul microorganismelor în viaţa
organismului uman
Microflora normală intestinală are asupra organismului gazdă efecte
favorabile funcţionării sale. Aceste efecte favorabile se datoresc faptului că
microorganismele intestinale îndeplinesc următoarele în intestinul uman:
• sintetizează vitamine necesare metabolismului normal a organismului
uman;
• stimulează mecanismele de apărare ale organismului gazdă determinînd
o creştere a imunităţii nespecifice;
• contribuie la dezvoltarea normală a unor organe, cum ar fi: intestin,
organe limfatice, prin acţiunile lor morfogenetice.
• Toate acestea arată că omul poate trăi şi fără multe dintre populaţiile
microbiene, dar se dezvoltă mai bine în prezenţa lor.
CONTROL
MICROBIOLOGIC
Microorganismele sunt prezente peste tot
– apă, aer, pe obiecte, pe mâini.
Preparatul Exigenţe
I. preparate injectabile sterile
II. preparate oftalmice, preparate Absenţa germenilor viabili într-un gram sau mililitru de produs.
aplicate pe arsuri sau ulceraţii
III. preparate medicamentoase pentru Maxim 100 germeni la gram sau mililitru.
aplicaţii locale, nas, gât, urechi. Enterobacteriaceaele, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus - lipsă.
IV. alte preparate Maxim 1000 germeni la g sau ml.
Enterobacteriaceaele, Ps. aeruginosa şi Staphylococcus
aureus - absenţi.
Ciuperci şi levuri, max. 100 /g sau ml.
CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL PRODUSELOR FARMACEUTICE
Determinarea numărului total de unităţi formatoare de colonii ( NTUFC).Se poate efectua prin
trei metode:
- metoda plăcilor turnante pentru probele solubile şi probele cu aspect clar;
- metoda diluţiilor în tuburi sau metoda MPN ( most probable number) pentru probe soluţii
neclare, opalescente şi probe cu număr redus de germeni;
- metoda membranei filtrante pentru probele solubile, clare sau cu inhibitori bacteriologici.
PRECONTROLUL MEDIILOR DE CULTURĂ
Precontrolul începe cu mediile de cultură care vor fi folosite pentru controlul sterilităţii.
Se controlează sterilitatea mediilor de cultură, ca şi capacitatea mediilor utilizate de a
permite dezvoltarea optimă a microorganismelor test. Se controlează un procent de 10
% din mediile de cultură care vor intra în lucru.
Testare
Farmacopeea românească recomandă pentru testare trei medii de cultură (mediile
1,2,3) , repartizate câte 15 ml în fiecare eprubetă. In eprubetele cu mediile 1 şi 3 se
însămânţează 0,1 ml dintr-o suspensie de spori de Clostridium sporogenes, cultură de
24 ore în diluţie de 1: 200 000. Separat, aceleaşi medii se incubează cu 0,1 ml dintr-o
cultură de 24 ore de Staphylococcus aureus diluată 1: 1000. Mediile 2 şi 3 se
însămînţează cu 0,1 ml cultură de Candida albicans de 24 ore la o diluţie de 1: 10
000. In alte trei eprubete se introduce aceeaşi cantitate de mediu, dar care nu se mai
inoculează cu microorganisme test. Acestea sunt probe martor. Probele martor ne
indică gradul de sterilitate a mediilor utilizate în testare.
CONTROLUL MICROBIOLOGIC
Tehnica de lucru.
Tehnica de lucru.
Mediile de cultură sunt pregătite şi repartizate în eprubete şi flacoane de
mărimi diferite ( 10, 40 şi 100 ml ), pentru a permite însămânţarea lor cu cantităţi
diferite de produs farmaceutic, conform schemelor de lucru.
Pentru a controla sterilitatea mediilor folosite şi acurateţea tehnicii microbiologice
este obligatoriu să se termostateze concomitent câte o eprubetă sau flacon cu
mediu neînsămînţat.
• lichidele, soluţiile, suspensiile se trec direct în mediile de cultură, cele uleioase primind 10
% Tween 80 înainte de însămînţare,
• pulberele sau comprimatele se diluează direct cu apă sterilă sau ser fiziologic tamponat
steril, mojarându-se în prealabil dacă este cazul.
• Cremele sau unguentele încălzite la 40 C se amestecă cu Tween 80 ( cca 1-5 g sau ml )
încălzit şi el la 40 C, după care se completează cu soluţie de tampon fosfat sterilă pH 7,
încălzită la 40C, pînă la obţinerea proporţiei finale de 10 %.
• Antibioticele se diluează cu apă sterilă sau ser fiziologic steril până la îndepărtarea efectului
bacteriostatic, cu excepţia penicilinelor care sunt tratate cu penicilinaze.
• Din fiecare eşantion de pansament se taie în condiţii de sterilitate 1 cm pătrat, apoi este
introdus în 100 ml mediu de cultură, iar din materialele de sutură chirurgicale se iau cîte 12
fiole din fiecare serie pentru 100 ml mediu de cultură.
Interpretarea rezultatelor.
O atenţie deosebită trebuie acordată şi apei deionizate, apei distilate care adeseori au
fost contaminate cu unii germeni, în special Pseudomonas sp. şi adesea ori cu
Pseudomonas aeruginosa, implicat mai ales în infecţiile interioare de spital.
Prelevarea probelor
Probele prelevate trebuie să fie reprezentative.
Laboratoarele de specialitate, pot recolta probe din depozite, farmacii sau din
unităţile sanitare ori de câte ori există o suspiciune de produse contaminate sau
suspicionate ca sursă a unor infecţii endemice sau epidemice. Aceste controale
devin obligatorii şi pentru firmele producătoare care vor utiliza în acest scop
laboratorul propriu.
Tehnica de recoltare este aceeaşi ca pentru produsele sterile, adică operaţia se
efectuează cu instrumente sterile, personal trebuie să fie instruit şi calificat, probele
se păstrează la temperatura recomandată de producător iar laboratorul de analiză
trebuie să fie pregătit corespunzător. Cantitatea de probă prelevată este stipulată
în farmacopee. Pentru produsele finite cantitatea de probă prelevat pentru control
trebuie să fie de minimum 5 g sau 5 ml. Această cantitate se va reţine din
cantitatea rezultată din omogenizarea a două ambalaje.
Determinarea numărulu total de unităţi formatoare de colonii ( NTUFC).
Pentru fiecare diluţie se folosesc 3 plăci Petri.În fiecare placă se introduce câte 0.1
ml din diluţia respectivă. Plăcile 1 şi 2 se amestecă cu geloză nutritivă ( cca. 15 ml)
răcită la 45C, din care una se termostatează la 20-25 C , iar cealaltă la 30-35 C,
timp de 48 ore. Placa 3 se amestecă cu mediu Sabouraud gelozat şi răcit la 45C,
iar după omogenizare şi solidificare se depune la termostat la 20-25C pentru 7 zile.
Omogenizarea amestecului este de mare importanţă deoarece asigura răspândirea
uniformă a coloniilor pe toată suprafaţa plăcii.
Interpretare:
se iau în considerare plăcile
Petri cu numărul de colonii
contabilizabile, de preferat
numărul de colonii între 30 şi
300. După calcularea numărului
de colonii pentru fiecare diluţie
în parte se calculează NTUFC
raportat la g sau ml de produs
analizat.
Metoda diluţiei în tuburi ( MPN )
Această metodă se practică în cazul unor produse farmaceutice care conţin substanţe
bacteriostatice sau fungistatice sau în cazul unui număr redus de germeni ori ca metodă de
elecţie pentru unele laboratoare.
Pentru produsele farmaceutice farmacopeea recomandă următoare tehnică de lucru: soluţia se
împarte în trei părţi egale şi se filtrează printr-o membrană cu porozitate de 45 micrometri. După
filtrare, filtrele se spală cu apă distilată sterilă, apoi cu apă peptonată sterilă.
Două dintre membranele filtrante se aşază pe suprafaţa mediului geloză nutritivă turnat în plăci
Petri. Una dintre plăci se termostatează la 35-37C, iar cealală la 24C. Ambele plăci se
termostatează timp de 24 ore.
A treia membrană filtrantă se aşază pe suprafaţa mediului Sabouraud turnat în plăci Petri . Se
tremostatează la 20-25 C.
Citirea rezultatelor se face după 2 zile pentru bacterii şi levuri şi după 3-5 zile pentru fungi.
CONTROL MICROBIOLOGIC
De la sampon si ruj pana la cremele de fata, produsele cosmetice
sunt folosite pentru a ajuta la mentinerea tenului curat, in stare
proaspata si chiar pentru a etala o alura mai tanara si atractiva.
https://www.iso.org/standard/72240.html
Controlul microbiologic a produselor cosmetic
cantitatea necesară pentru analiza microbiologică este în jur de 10 g sau ml; dacă produsul
analizat este sub 10 g,ml se recoltează toată cantitatea;
produsul se analizează imediat ce a intrat în laborator; dacă cercetarea microbiologică
nu se poate efectua imediat, produsul se depozitează la temperatura camerei (15-20°C),
sau la temperatura indicată de producător. Se va evita termostatarea, refrigerarea sau
îngheţarea produsului înainte sau după analiză;
proba se inspectează macroscopic şi se vor face observaţii specifice referitoare la
culoarea produsului dacă este corespunzătoare sau modificată, consistenţa, continuitate la
scurgere, miros specific sau nespecific (alterare), aspectul şi integritatea ambalajului;
înainte de deschidere, ambalajul este supus dezinfecţiei exterioare cu o mixtură apoasă
alcool etilic 80% (V/V) şi 1% HCl (V/V); după dezinfecţie se usucă suprafaţa prin ştergere
cu un tampon steril;
dacă din aceeiaşi probă se cer multiple analize (microbiologice, toxicologice, chimice etc.),
examenul microbiologic are prioritate. În acest caz, cantitatea utilă diagnosticului
microbiologic este dependentă de celelalte examinări, însă pe buletinul de analiză se va
menţiona cantitatea care se foloseşte pentru examenul microbiologic. De exemplu, dacă
proba conţine 5 g/ml, cel puţin 1/5 din probă, deci 1-2 g/ml se utilizează pentru examenul
microbiologic.
PREGĂTIREA PRODUSULUI COSMETIC
Mediile de cultură utilizate sunt: geloza simplă, nutritivă pe bază de peptonă triptică,
în cazul bacteriilor şi mediul de cultură Sabouraud, pentru levuri şi fungi.
ANALIZA SPECTRULUI MICROBIAN AL PRODUSULUI COSMETIC.
In analiza spectrului microbian se pot folosi diferite tehnici de lucru, dupa realizarea
culturilor Petri.
ANALIZA SPECTRULUI MICROBIAN AL PRODUSULUI COSMETIC.