Cromatografia si electroforeza

I. Noţiuni teoretice
1. Cromatografia
Cromatografia reprezintă o tehnică de separare a componentelor unui amestec,
între două faze: una mobilă şi alta staţionară, ca urmare a deplasării fazei mobile de-a
lungul celei staţionare şi a antrenării compo-nentelor amestecului în mişcare, cu viteze
diferite, ocupând astfel poziţii diferite de-a lungul fazei staţionare. În acest mod
componentele sunt separate şi apoi identificate.
În funcţie de natura fazelor se disting următoarele tipuri de cromatografie:
Faza mobila Faza Denumire
staţionara
lichid lichid lichid - lichid (LL)
lichid solid lichid - solid (LS)
gaz solid gaz - solid (GS)
gaz lichid gaz - lichid (GL)

Metodele de separare cromatografice se împart în:

- metode bazate pe afinitatea diferită a componenţilor (repartiţie de fază, adsorbţie,
absorbţie, schimb ionic, afinitate);
- metode bazate pe mărimea diferită a componenţilor (excluziune sferică).
Din punct de vedere practic cele mai utilizate metode de cromatografie sunt:
cromatografia pe coloană, cromatografia pe hârtie, cromatografia în strat subţire, gaz
cromatografia.
Cromatografia pe coloană – Coloanele cromatografice sunt confecţionate din
sticlă. Pentru o bună rezoluţie se folosesc coloane lungi dar în condiţiile în care se doreşte
separarea unei cantităţi mari de substanţe se folosesc coloane cu un diametru mai mare.
În interiorul coloanei se introduce faza staţionară ce trebuie, într-o primă etapă,
echilibrată cu solventul de lucru.
Amestecul ce urmează a fi separat se pipetează în partea superioara a tubului.
Se conectează rezervorul cu solvent (faza mobilă) la coloană şi se aşteaptă până
ce are loc separarea.
 Datorită deplasării fazei mobile de-a lungul celei staţionare are loc antrenarea
componentelor din amestec într-o mişcare descendentă, în lungul coloanei astfel încât în
timp vor ocupa poziţii diferite. Fracţiile sunt colectate în tuburi şi apoi analizate.

Figura 4.1. Cromatografie pe coloană.

Cromatografia pe hârtie - reprezintă una din cele mai simple metode de analiză.
În această metodă faza fixă este reprezentată de o suprafaţă de hârtie specială sau hârtie
de filtru, iar faza mobilă (eluentul) de un lichid ce se deplasează de-a lungul fazei fixe
datorită forţelor de adeziune şi forţelor gravitaţionale. Se împarte în: cromatografie pe
hârtie verticală (ascendentă sau descendentă) şi orizontală (Pfeiffer). În figura 4.2 se
poate urmări diferenţa dintre aceste metode.

Figura 4.2. Cromatografie pe hârtie verticală ascendentă şi descendentă

Identificarea compuşilor izolaţi în timpul cromatografiei se face fie cu ajutorul

spoturilor martor, fie calculând timpul de reţinere al fiecărui component separat (Rj), definit
ca raportul dintre distanţa faţă de linia de start pe care a migrat componentul respectiv
(notată cu Xj) şi distanţa pe care a migrat eluentul (notată cu Y):
 Xj
Rj 
Y
Timpul de reţinere depinde de: natura fazei fixe, natura fazei mobile, natura
substanţei, temperatură; se găseşte tabelat pentru diferite substraturi, eluenţi şi
substanţe, de regulă pentru temperaturi de 200C.
 2. Electroforeza
Reprezintă metoda de separare bazată pe migrarea sub influenţa câmpului electric
a substanţelor încărcate cu sarcină electrică.
Eletroforeza poate fi folosită atât în scop analitic (separarea componenţilor şi
dozarea lor), preparativ (obţinerea unor componenţi în stare pură) dar şi ca metodă de
studiu a proprietăţilor superficiale ale unor celule sau organite celulare.
O particulă încărcata electric, când este dizolvată sau suspendată într-un mediu
lichid, sub influenţa unui câmp electric uniform, atinge o viteză constantă de migrare.
Speciile încărcate pozitiv se vor îndrepta către catod, iar speciile încărcate negativ către
anod. Viteza de migrare a ambelor specii va fi determinată de forţele care acţionează
asupra lor. Aceste forte sunt:
- forţa de atracţie electroforetică: F1  Q  E
- forţa de frecare Stokes: F2  6      r  v
- forţa de frânare electroforetică: F3  Q      r  E
- forţa F4 datorata efectului de relaxare
Imediat după aplicarea câmpului electric, suma vectorială a acestor patru forte
este egală cu zero şi viteza electroforetică devine constantă (figura 4.3). Neglijând efectul
de relaxare şi ţinând cont de direcţiile celor trei forte se obţine viteza electroforetică:
E
v
6

unde: - ε = permitivitatea absolută a mediului

- ξ = potenţialul electrocinetic
- E = intensitatea câmpului electric
- η = coeficientul de vâscozitate
Mobilitatea electroforetică se defineşte ca raportul dintre viteză şi intensitatea
câmpului electric:
v

E
Datorită încărcării electrice nete de la suprafaţa particulelor biologice, în acestă
regiune se organizează, se structurează, un strat dublu electric alcătuit dintr-o zonă
compactă de grosime (a) şi una difuză, în care pentru simplitate, suprafaţa de demarcare
a particulei faţă de mediu este considerată plană (figura 4.3).
Când particula este pusă în mişcare de către câmpul electric aplicat, aceasta
antrenează o dată cu ea un strat de lichid mai gros decât cel compact, notat cu (b). Planul
care se află la distanţa ba de particulă se numeşte plan hidrodinamic de alunecare, iar
potenţialul în acest plan se numeşte potenţial electrocinetic (ξ). Valoarea potenţialului
electro-cinetic se poate determina indirect pe baza măsurării mobilitătii electroforetice a
particulei în câmp electric.

Figura 4.3. Forţele ce acţionează asupra unei particule încărcate cu sarcină electrică
suspendată într-un mediu lichid. Distribuţia ionilor în stratul dublu electric de la suprafaţa
unei particule scufundate într-un electrolit.
Metoda microscopică de electroforeză - acestă metodă este singura tehnică
disponibilă pentru determinarea vitezei electroforetice a particulelor mari, cum ar fi
celulele sanguine, microorganisme, particule coloidale, etc. Se bazează pe observarea
directă, la microscop a migrării particulelor suspendate într-o soluţie tampon adecvată ca
urmare a aplicării unui câmp electric creat de un curent continuu.
Pentru această tehnică este necesară o celulă electroforetică (figura 4.4),
prevăzută cu doi electrozi, un sistem de umplere şi golire, ce se poate introduce în
câmpul unui microscop. Celula poate fi plană sau cilindrică (capilară).

Figura 4.4. Electroforeza microscopică: cuva electroforetică folosită şi imaginea

observată la microscop prevăzut cu micrometru ocular.
 Electroforeza la joasă tensiune – Este o metodă ce permite separarea proteinelor
plasmatice. Dispozitivul experimental folosit este prezentat în figura 4.5.
Ca suport al electrolitului (al soluţiei tampon) se foloseşte atât hârtie specială
pentru electroforeză (de tip Whatman) cât şi membrane de celuloză. Dintre avantajele
utilizării membranelor de celuloză amintim, în primul rând: rezoluţia mult mai bună şi un
timp de migrare mai mic.

Figura 4.5. Electroforeza la joasă tensiune – dispozitiv experimental.

După separarea proteinelor urmează un procedeu de fixare şi colorare. În primul

rând, mediul suport este fixat prin introducere în etanol, metanol sau acid, ori prin încălzire
făcând astfel proteinele insolubile.
Benzile sunt colorate cu ajutorul unor coloranţi specifici proteinelor (albastru de
brom fenol), se spală în mai multe băi cu acid acetic 2% şi sunt trecute prin vapori de
amoniac pentru regenerarea colorantului (figura 4.6).

Figura 4.6. Electroforeza – mediul suport după procedeele de fixare şi colorare.

După aceste procedee benzile sunt scanate cu ajutorul unor densitometre prin
reflexie, transmisie sau combinate, ce permit trasarea spectrelor caracteristice probelor
oferind totodată cantitatea în g/100ml.
 Electroforeza pe un mediu suport acetat de celuloză a serului uman este
prezentată în figura 4.7.

Figura 4.7. Electroforeza pe un mediu suport acetat de celuloză a serului uman.

Este cunoscut faptul că scăderea albuminelor survine de regulă în toate

disproteinemiile, fiind însă mai accentuată în cazul unui deficit în aportul de proteine, în
deficitul de sinteză (ciroză hepatică), sau în pierderi de proteine (sindrom nefrotic, arsuri).
Creşterea α1, α2 – globulinelor se însoţeşte de regulă de o creştere a fibrinogenului
şi a glicoproteinelor şi de o accelerare a VSH-ului. O creştere marcantă a α2 – globulinelor
se întâlneşte în sindromul nefrotic.
Modificările β – globulinelor au o importanţă mai redusă, dar creşterea γ –
globulinelor indică prezenţa unor inflamaţii cronice, sau sugerează o proliferare reactivă
sau tumorală a imunocitelor producătoare de imunoglobuline. Scăderea γ – globulinelor
survine în sindromul nefrotic, malnutriţie.
Toate aceste modificări au ca rezultat forme diferite ale spectrlor
electroforegramelor analizate (figura 4.8).

Figura 4.8. Tipuri de disproteinemie: (A) Inflamaţie acută, (B) Inflamaţie cronică, (C)
Sindrom nefrotic, (D) Enteropatie exudativă, (E) Ciroză hepatică, (F) Mielom multiplu, (G)
Hipogamaglobulinemie.
 Focalizarea izoelectrica (electrofocusing) - reprezintă o metodă de separare a
particulelor cu puncte izoelectrice diferite într-un gradient de pH sub acţiunea unui câmp
electric omogen.
Punctul izoelectric al unei particule (sau molecule) corespunde valorii pH-ului la
care sarcina electrica netă este nulă.
Dispozitivele de electrofocusing folosesc o coloana în care se realizează un
gradient natural de pH prin utilizarea unor amfoliţi transportori cu următoarele proprietăţi:
bună capacitate de tamponare şi bună conductivitate la punctul izoelectric, masă
moleculară mică, solubilitate bună la punctul izoelectric, absorbţie mică a luminii peste
260nm, nu reacţionează chimic cu componenţii amestecului ce urmează a fi descompus.
Cei mai utilizaţi sunt acizii poliaminopolicarboxilici având masa moleculară între
300-1000D şi puncte izoelectrice situate în domeniul de pH=3-10.
 II. Parte experimentală
A. Separarea clorofilelor prin cromatografie pe hârtie
Materiale necesare: hârtie de cromatografie, vas de croma-tografie, micropipete,
benzen, eter etilic, ciclohexan, alcooletilic 98%, apă distilată, stativ, mojar.
Mod de lucru: Se mojarează câteva frunze într-o soluţie de 80% alcool etilic şi 20%
apă după care se lasă într-un loc întunecat 30 min. Se trasează foarte fin cu creionul linia
de start pe hârtie şi cu ajutorul unei micropipete se pun spoturile de substanţa (o cantitate
de 0.1-1l având grijă ca aceasta să nu se întindă).
Se pregăteşte într-un pahar Berzelius eluentul format din 50% eter etilic, 40%
ciclohexan, 8% benzen şi 2% apă, se agită bine şi apoi se toarnă în vasul de
cromatografie astfel încât să acopere fundul vasului cu cel mult 2-3mm.
Se introduce hârtia de cromatografie fixată în stativ 1mm în lichid. Se acoperă
vasul şi se aşteaptă 45min după care se trece la identificarea componentelor şi la calculul
timpilor de reţinere pentru fiecare component.

B. Determinarea vitezei electroforetice a eritrocitelor

Materiale necesare: cuvă de electroforeză, microscop Biorom, suspensie de
eritrocite, sursă de tensiune, soluţie izotonică, micrometru ocular, cronometru.
Mod de lucru: Se conectează cuva de electroforeza la microscop şi se umple cu
soluţie izotonică după care se aşteaptă 1-5min până eritrocitele difuzează în toată cuva.
Se pune la punct imaginea astfel încât să se observe cu micrometrul ocular o hematie.
Se conectează sursa de tensiune şi se măsoară timpul (t) în care o celulă se deplasează
între două repere ale micrometrului ocular (d). Datele se trec în tabelul de mai jos.

No. t(s) v (m/s) vmed(m/s) n-1

1
....

Figura 4.9. Imaginea observată prin micrometrul ocular

(după aplicarea câmpului electric hematiile se află în miscare cu viteză v)
 Deoarece distanţa (d) văzută pe micrometrul ocular şi parcursă de celulele în
mişcare este în diviziuni, trebuie ca aceasta să fie transformată în microni (m) pentru a
putea fi calculată valoarea vitezei de deplasare.
1
D  d 100 m
g ob

D m
v
t s
Să se calculeze intervalul de confidenţă şi să se compare valorile obţinute cu cele
din literatură.
m
v  (vmed  n 1, vmed  n 1 )
s