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Estrés Oxidativo

En organismos aeróbicos, durante diversos procesos


fisiológicos se generan:

Radicales libres de oxígeno ROS


Otras especies reactivas no-radicales

Pero además, numerosas sustancias químicas son


capaces de generar ROS.
Especies Reactivas de Oxígeno (ROS)
Oxígeno

Radicales: No-Radicales:

O2.- Anión Superóxido H2O2 Peróxido de hidrógeno


OH. Hidroxilo HClO ácido hipocloroso
RO2. Peroxilo O3 Ozono
1O Oxígeno singulete
RO. Alcoxilo 2
HO2. Hidroperoxilo
En la literatura científica, los términos “ROS”,
“RNS”, “ESPECIES DERIVADAS DEL OXÍGENO –
ODS-” y “PRO-OXIDANTES” muchas veces son
utilizados indistintamente.

Reductor y oxidante son términos químicos, en


ambientes biológicos se prefiere el uso de pro-
oxidante y antioxidante.
La formación de intermediarios reactivos del
oxígeno es común a todas las células
aeróbicas

Las fuentes endógenas son:

•Metabolismo aeróbico (cadena de transporte de


electrones y la actividad de ciertas enzimas).

•Respuestas a diversos estímulos por reacciones


fisiológicas especializadas (“estallido respiratorio” y
liberación de óxido nítrico por el endotelio).
•El 90% del oxígeno que respiramos
es utilizado en las reacciones
acopladas de la cadena de transporte
de electrones y la síntesis de ATP
•La reducción del oxígeno a agua para
la producción de ATP ocurre en la
mitocondria.
•Durante este proceso se forman
varios intermediarios (especies
reactivas de oxígeno- ROS).
Fuentes endógenas de ROS y RNS

Oxidación microsomal
Flavoproteínas, Mieloperoxidasa
Citocromo P450 (macrófagos)

Xantina oxidasa,
NOS (óxido nitrico Retículo endoplásmico Metales de
sintetasa) transición
Citoplasma Lisosomas
Fe
Cu

Oxidasas, Peroxisomas
Flavoproteínas Mitocondrias

Membrana plasmática
Lipooxigenasas,
Transporte de electrones
Prostaglandina sintetasa
NADPH oxidasa
Generación de HO*

Reacción de Fenton
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH*

Los metales Cu, Cr, Ni son capaces de


participar de una reacción tipo Fenton,
generando radicales OH*
• O2.- + Fe+3 → Fe+2 + O2
• Fe+2 + H2O2 → .OH + OH- + Fe+3

O2.- + H2O2 → O2 + .OH + -OH

Reacción. de Haber-
Weiss
La toxicidad no está necesariamente relacionada con la
reactividad.

En muchos casos, un tiempo de vida media mayor puede


implicar mayor toxicidad ya que le permite difundir y
alcanzar un blanco sensible a gran distancia de donde fue
producido.

Ejemplos:

La relativamente larga vida media del O2.- le permite a éste


difundir desde la membrana mitocondrial, donde es producido, hasta
el genoma mitocondrial.

El OH. por su parte es altamente reactivo pero si no hay un blanco


adyacente a su producción, no va a causar daño.
La producción de ROS está regulada, a fin de
mantener un estado de homeostasis redox.
En las células existen defensas antioxidantes, de
origen enzimático y no-enzimático.

Cuando la generación de ROS no puede ser


contrarrestada por las defensas antioxidantes

procesos de estrés oxidativo


El organismo debe regular la presencia de pro- y anti-
oxidantes todo el tiempo.
Este balance está finamente regulado y es
extremadamente importante para mantener funciones
celulares y bioquímicas vitales.

El balance es específico para cada organela y tejido y


cualquier desequilibrio puede ser dañino para la célula y
el organismo.

Cuando se desequilibra hacia un aumento en la Estrés


concentración de pro-oxidantes superando la capacidad Oxidativo
antioxidante

Cuando el poder reductor, o la concentración de


antioxidantes, supera la concentración de los pro- Estrés
oxidantes, también se puede producir daño Reductor
Para prevenir la interacción entre los radicales y
los blancos biológicos, el antioxidante debe
estar presente en el lugar donde se produce el
radical para poder competir por su sustrato
biológico.

Esta información se debe tener en cuenta


cuando se diseña una terapia antioxidante.
Defensas antioxidantes

Enzimáticas No enzimáticas

• Superóxido dismutasa • GSH


(SOD) • Vit A
• Catalasa (CAT) • Vit C
• Glutatión peroxidasas • Vit E
(GPX)
• y otros…
SOD
O2-* + O2-* + 2 H+ H2O2 + O2

CAT
2 H2O2 2 H2O + O2

GPX
H2O2 + 2 GSH 2 H2O + GSSG
Defensas no-enzimáticas (LMWA)

La célula produce sólo un número limitado de


ellas

Ninguna de las LMWA producidas


endógenamente puede ser considerada puramente
antioxidante ya que cumplen muchos otros roles
biológicos

Muchos de los antioxidantes provienen de la


dieta.
Defensas no-enzimáticas: GSH

Para radicales O2-*, OH*, RO*, ROO*

R* + GSH → RH + GS*

2 GS* → GSSG → (GSH reductasa)


Ácido ascórbico: Vit C (hidrosoluble)

OH* + AscH2 → H2O + AscH*


O2-* + H+ + AscH2 → H2O2 + AscH*
2 AscH* → Asc + AscH2
α-tocoferol: Vit E (liposoluble)
OH
OH
CH3
H3 C O CH2- [CH2-CH2-CH(CH3)-CH2]3H
CH3

ROO* + VitE-OH → ROOH + VitE-O*


VitE-O* + GSH → VitE-OH + GS*
VitE-O* + AscH2 → VitE-OH + AscH*
β-caroteno: Vit A

Se encuentra en la membrana de ciertos


tejidos (retina) en altas [ ].
Secuestra al oxígeno singlete.
Además actúa en forma similar a la Vit E
frente a radicales peroxilos.

CH2OH
¿Qué pasa cuando la generación de pro-oxidantes
sobrepasa las defensas celulares?

•Se produce daño oxidativo a macromoléculas y este daño


estimula la actividad de enzimas de reparación “segunda
línea de defensa”
•Se produce la inducción de varias proteínas conocidas
como “proteínas inducibles por estrés oxidativo” (algunas
son antioxidantes como CAT, otras son de reparación)

Los daños serán reparados por mecanismos


celulares específicos. Si no se recupera el
equilibrio se producirán disfunciones que pueden
desembocar en la muerte celular.
Fuentes exógenas de radicales libres

• Radiación
UV, rayos X, rayos γ
• Compuestos que reaccionan para formar peróxidos
Ozono y oxígeno singulete
• Compuestos que promueven la formación de anión
superóxido
Quinonas, nitroaromáticos, herbicidas bipiridilos
• Compuestos que se metabolizan a radicales
Alcanos polihalogenados, fenoles, aminofenoles
• Nanomateriales
Radiación UV
UVA = 320-400 nm
UVB UVB = 290-320 nm
H2O2 OH. + OH. UVC = 100-290 nm
• Piel y ojos.
• Puede formar oxígeno singulete en presencia de un sensibilizante

Radiación ionizante
γ-rays
2H2O H2O.+ + e- + H2O*

H2O* H + .OH
Compuestos que promueven la formación de O2.-
Paraquat

H3C N+ N+ CH3

1,1´dimetil-4,4´-
bipiridilo

Herbicida sintético no selectivo que actúa por contacto, de rápida


acción sobre los tejidos verdes de las plantas.

Los efectos herbicidas de paraquat fueron descubiertos a finales


de los años 50 y el producto fue vendido por primera vez en 1962.
Hoy es el segundo herbicida mas vendido en el mundo y está
registrado y es utilizado en mas de 100 países.
Mecanismo de acción tóxica
En humanos, la absorción ocurre a nivel de la mucosa gástrica y la
del intestino delgado.

Luego es distribuído via torrente sanguíneo.

Se acumula en los pulmones por un proceso de


transporte activo: transportador de poliaminas.

La alta concentración de paraquat una vez acumulado en el


pulmón o en las células renales resulta en una reducción cíclica y
generación de especies tóxicas de oxígeno reactivo
A través de este mecanismo de reducción cíclica, una molécula de pq puede
generar muchas moléculas de anión superóxido

NAD(P)H NAD(P)+

Flavoprotein

H3C N+ . CH3
H3C N+ N+ CH3 N

Paraquat Paraquat
radical
cation

O2.- O2
Las proteínas, los lípidos insaturados y los ácidos nucleicos son los
blancos fundamentales de las reacciones de los radicales libres.
Peroxidación de lípidos

Catalizada por metales


El proceso de peroxidación lipídica comienza cuando el radical libre quita un
átomo de hidrógeno de uno de los carbonos metilenos de la cadena carbonada
para rendir un radical libre lipídico (L.).

Los ácidos grasos poliinsaturados de membrana son especialmente


susceptibles de ser atacados por radicales libres, puesto que contienen
grupos metilenos separados por dobles enlaces que debilitan el enlace C-H
metileno.

Cuando el radical lipídico se origina, sufre inmediatamente un reajuste


molecular, produciéndose un dieno conjugado que puede reaccionar con el O2
y formar un radical hidroperoxilo. Este radical libre da lugar a endoperóxidos, o
bien, puede tomar un átomo de hidrógeno de un carbono metileno de otro
ácido graso poliinsaturado adyacente para formar, de nuevo, un radical libre
lipídico y un hidroperóxido. El radical lipídico se combina con otra molécula de
oxígeno y así se establece una cadena de propagación del daño peroxidativo.

Por su parte, el hidroperóxido, que es un compuesto estable, si entra en


contacto con iones metálicos de transición, producirá más radicales libres que
iniciarán y propagarán otras reacciones en cadena.
Una sola iniciación puede dar lugar a una
reacción en cadena que peroxide todos los
PUFAs de la membrana.

Los ácidos grasos sin dobles enlaces o con un


solo doble enlace pueden oxidarse pero no
reaccionar en cadena.
En las últimas etapas del proceso los peróxidos se
descomponen a aldehídos. También se puede
producir etano
Consecuencias de la peroxidación lip
peroxidación ídica
lipídica

• Cambios estructurales en las membranas

Alteración de la fluidez y de los canales

Alteración de las proteínas de señalización


asociadas a la membrana

Incremento de la permeabilidad
Otras consecuencias de la peroxidación lip
peroxidación ídica
lipídica

Los productos de la
peroxidación pueden:

• Formar aductos con


proteínas y DNA
• Causar toxicidad
directa

4-HNE: 4-hidroxi nonenal


MDA: Malondialdehído
13(S)-Hydroperoxyoctadeca-9Z,11E-dienoic acid
(producto de oxidación del ácido linoleico
18:2∆9,12
Método de detección de peroxidación lipídica
Malondialdehido (MDA)

La cuantificación de la concentración de MDA con el ácido


tiobarbitúrico es la técnica más utilizada para evaluar daño
oxidativo a lípidos.
No es específico para MDA, por ello lo correcto es hablar de
especies reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS).

Espectrofotométricamente
Fluorométricamente
Por HPLC
Da ño a prote
Daño ínas
proteínas

El estrés oxidativo puede causar


modificaciones reversibles
o irreversibles en las proteínas.

•Peroxidación
•Daño a aminoácidos específicos
•Cambios en la estructura ternaria
•Degradación
•Fragmentación
Modificaciones reversibles:

Las ROS modulan el estado de oxidación del azufre en


residuos cisteína específicos de las proteínas.

Estas modificaciones reversibles en los residuos de


cisteína, pueden ser reparadas mediante enzimas
específicas como las glutaredoxinas o tioredoxinas.

De la misma manera, la metionina se oxida fácilmente a


metionina sulfóxido pudiendo ser reducida por la enzima
metionina sulfóxido reductasa.
Modificaciones irreversibles:

Las modificaciones irreversibles no pueden ser reparadas, de forma


que las proteínas inactivas se acumulan o son degradadas. Un
ejemplo de modificación irreversible es el caso de la carbonilación de
las proteínas.

Cuando las proteínas se oxidan se producen grupos carbonilos


(aldehídos y cetonas) en las cadenas laterales
(Especialmente Pro, Arg, Lys y Thr)
Existen también otros mecanismos como la reacción con productos
generados durante la peroxidación lipídica como 4-hidroxinonenal, 2-
propenal (acroleina) y malondialdehido. Este tipo de reacción
denominada “Adición de Michael”, conlleva la adición de grupos
aldehídos reactivos a las cadenas laterales de los residuos de
cisteína, histidina o lisina.
Método de detección de daño a proteínas
Reacción con la 2,4-dinitrofenilhidracina.

La dinitrofenilhidrazona se puede medir


espectrofotométricamente a 365-375 nm o se
pueden utilizar anticuerpos contra el grupo
dinitrofenilo.
Western blot, inmunohistoquímica, ELISA.
Da ño a DNA
Daño

Daño a las bases

Daño en el azúcar
Oxidación de la desoxirribosa (esqueleto)
O B O B B
O O O
O
. .
H
. O O O
R Ruptura
O P OR O P OR O P OR de la
cadena
O- O- O-

O2
O
O O B B
O O
. OO O
O +B +
O
O P OR O P OR
.O O
O
O- O-

Sitios apurínicos/apirimidínicos
Aldehídos
Método de detección de daño a DNA