L2.

PREPARAREA SI STERILIZAREA MEDIILOR DE CULTURA

Mediile de cultura sunt necesare pentru izolarea si identificarea microorganismelor, pentru

testarea caracterelor lor morfologice si fiziologice, pentru analiza apei si a produselor alimentare, in
microbiologia industriala si alte activitati. Desi toate microorganismele necesita surse de energie,
carbon, azot, fosfor, sulf si diferite minerale, compozitia precisa a mediului de cultura utilizat
trebuie corelata cu cerintele nutritionale ale speciei ce va fi cultivata.
Mediul de cultura reprezinta un suport nutritiv sterilizat, care permite dezvoltarea unui
microorganism in afara nisei ecologice naturale.
Un mediu de cultura contine un substrat nutritiv complex, care asigura microorganismului
cantitatile necesare de apa, surse de carbon, azot, saruri minerale, factori de crestere, necesare in
procesele de crestere si multiplicare si alte functii ale celulei.
Mediile de cultura pot fi clasificate dupa mai multe criterii.

Din punct de vedere al compozitiei chimice, mediile de cultura se impart in 3 categorii:

 medii naturale (empirice) de origine animala sau vegetala, cu o compozitie chimica
nedefinita in mod exact;
 medii sintetice: acestea sunt solutii de substante chimice pure in apa distilata, cu o
compozitie perfect determinate;
 medii semi-sintetice: sunt constitute din produse chimice bine definite, dar si din
produse de origine naturala (cu compozitie cunoscuta).

Dupa scopul utilizarii lor, mediile de cultura se impart in:

 medii de cultura generale care asigura dezvoltarea unui mare numar de specii
 medii de cultura selective care permit dezvoltarea unui numar restrans de
microorganisme
 medii de cultura de diferentiere care permit separarea speciilor in functie de anumite
caractere biochimice
 medii de imbogatire destinate separarii si cultivarii unor microorganisme pretentioase
din punct de vedere nutritiv sau care se afla in numar redus
 medii de conservare

 medii de cultura industriale.

 Astfel, dupa complexitatea lor, mediile pot fi:
- Medii definite sau sintetice, care au o compozitie bine cunoscuta (folosite in special pentru
cultivarea microorganismelor fotolitotrofe auxotrofe) si care contin, in general carbonati sau
bicarbonati drept surse de carbon si azotati sau saruri de amoniu drept sursa de azot.
Microorganismele chemoorganotrofe heterotrofe pot fi cultivate pe astfel de medii ce contin
glucoza ca sursa de carbon si saruri cu azot. Acest tip de medii de cultura este utilizat indeosebi in
lucrarile de cercetare.
- Medii de cultura complexe, care contin ingrediente a caror compozitie chimica nu este
cunoscuta cu exactitate. Aceste medii sunt foarte folosite deoarece sunt suficient de bogate si
complete pentru a permite dezvoltarea multor microorganisme. Mediile complexe contin
componente cu compozitie aproximativa ca peptonele, extractul de carne si extractul de drojdie.
Peptonele sunt hidrolizate proteice preparate prin proteoliza partiala a carnii, cazeinei, fainii de
soia, gelatinei sau a altor surse proteice. Peptonele servesc drept sursa de carbon, energie si azot.
In functie de destinatia lor, mediile pot fi:
- Medii de cultura generale, care sunt utilizate pentru cultivarea unui numar mare de genuri si
specii microbiene. Cele mai cunoscute medii folosite in practica de laborator pentru cultivarea
bacteriilor sunt bulionul de carne lichid sau gelozat (agarul nutritiv) sau mediul ce contine triptona,
extract de drojdie, glucoza si agar. In scopul cresterii fungilor sunt recomandate mediile continand
extract de malt sau extract de cartof, glucoza si agar.
- Medii de cultura selective care favorizeaza cresterea unor microorganisme particulare.
Sarurile biliare sau colorantii ca fucsina bazica si cristal violet favorizeaza cresterea bacteriilor
Gram negative, inhiband cresterea bacteriilor Gram pozitive. Un mediu selectiv folosit la
deterrninarea bacteriilor coliforme contine bulion nutritiv, saruri biliare, lactoza si verde briliant, in
care sarurile biliare inhiba alte bacterii, in timp ce coliformii sunt adaptati. Bacteriile pot fi
selectate, de asemenea, in urma incubarii in prezenta de nutrienti pe care ii utilizeaza in mod
specific. De exemplu, un mediu continand celuloza drept unica sursa de carbon poate fi utilizat
pentru izolarea bacteriilor celulozolitice. Modalitatile de selectionare a unor grupe de
microorganisme sunt nenumarate, iar mediile selective de cultura de asemenea.
- Medii de cultura de diferentiere care permit separarea diferitelor grupe de microorganisme in
functie de anumite caractere biochimice, precum si identificarea lor. Agarul cu sange permite
realizarea distinctiei intre bacteriile hemolitice si cele nehemolitice. Bacteriile hemolitice
(streptococi sau stafilococi izolati din caile respiratorii) produc zone clare in jurul coloniilor,
datorita distrugerii celulelor rosii din sange. Daca pe un mediu selectiv s-au izolat, de exemplu,
bacterii coliforme, acestea pot fi diferentiate in speciile componente ale grupului pe medii de
diferentiere.
- Medii de imbogatire (fortifiate) care sunt medii utilizate pentru cresterea si multiplicarea
microorganismelor pretentioase din punct de vedere nutritiv si care se afla in numar mic in produsul
ce trebuie analizat. Microorganismul este insamantat in aceste medii de imbogatire (se folosesc
chiar medii de preimbogatire) unde se multiplica, dupa care este trecut pe medii selective, iar
rezultatul se exprima prin prezenta sau absenta lui. Acest tip de medii este utilizat la deterrninarea
bacteriilor din genul Salmonella in produsele alimentare.
Dupa consistenta lor, mediile de cultura pot fi clasificate in medii: lichide, solide si medii
solidificate.
- Mediile lichide sunt utilizate la nivel de laborator pentru cultivarea unor microorganisme
anaerobe, microaerofile sau facultativ anaerobe si pentru diferite procese de biosinteza in submers,
atat in practica de laborator cat si la nivel industrial.
- Mediile de cultura solide sunt utilizate pentru cultivarea in general a microorganismelor
aerobe (mai ales mucegaiuri) si pot fi felii de legume, boabe de cereale, rumegus, paine etc.
- Mediile de cultura solidificate (folosite pentru prima oara de microbiologul german R.
Koch) au o mare importanta in practica de izolare, numarare si caracterizare a microorganismelor.
La prepararea acestui tip de medii se utilizeaza agenti de solidificare, dintre care cei mai
intrebuintati sunt agarul si gelatina.
Agarul (geloza) este un polimer sulfatat compus in special din D-galactoza, 3,6-anhidro-L-
galactoza si acid D-glucuronic, fiind extras din alge rosii din genul Gelidium. Agarul se adauga
in mediile de cultura de obicei in proportie de 0,5 - 2% si este cel mai utilizat agent de
solidificare deoarece nu este atacat de majoritatea microorganismelor. Agarul se topeste la
temperatura de fierbere a mediului si se solidifica prin racire la 40-42°C. In mediu acid la
temperatura de sterilizare isi pierde capacitatea de a forma gel, de aceea sterilizarea mediilor si a
solutiilor destinate acidifierii se face separat.
Un alt agent de solidificare este gelatina, de natura proteica, extrasa din tesuturile colagenice.
Gelatina prezinta dezavantajul ca este degradata de microorganismele ce produc enzime
proteolitice. Ea se adauga in mediu in cantitate de 12 -15g%, si, dupa solubilizare prin fierbere,
se solidifica lent prin racire la 30-25°C.
In diferite scopuri se mai utilizeaza si alti agenti de solidificare. De exemplu, silicagelul este
utilizat pentru cresterea bacteriilor autotrofe pe medii solidificate in absenta substantelor
organice si, de asemenea, pentru determinarea tipului sursei de carbon pentru bacteriile
heterotrofe.
In procesele de biosinteza la nivel industrial se utilizeaza medii de cultura continand diferite
componente - deseuri si subproduse ale industriei agroalimentare sau altor industrii, cu pret de cost
scazut. Astfel de medii de cultura contin, ca surse de carbon - melasa, lactoza din zer, maltoza din
malt, dextrine, diferite tipuri de fainuri, cereale, tarate, amidon, hidrocarburi. Dintre sursele de azot,
cele mai utilizate in procesele de biosinteza sunt sarurile cu azor, ureea, fainurile de soia, de peste,
extractul de porumb, autolizatele de drojdie, hidrolizatele proteice. Pentru imbogatirea in saruri
minerale se adauga in mediile de cultura fosfati, sulfati, cloruri, azotati etc. Mediile industriale de
cultura mai pot fi suplimentate cu factori de crestere, precursori si inductori ai unor produsi de
biosinteza, detergenti (cu rol de emulgatori), agenti de antispumare, antiseptice etc. Nu in ultimul
rand, calitatea si compozitia apei reprezinta un factor important al mediilor de cultura.
Mediul de cultura trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii:
• sa corespunda din punct de vedere nutritiv,
• sa aiba o concentratie a substantelor dizolvate care sa nu influenteze negativ schimburile
osmotice ale celulei
• sa nu contina substante toxice
• sa aiba un anumit pH
• sa fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel incat sa se dezvolte numai celulele introduse
prin inocul.
Sterilizarea mediilor de cultura se poate realiza prin metode fluido-dinamice (filtrare,
flotatie, centrifugare, termice, chimice si fizice (unde electroamgnetice)).
Cea mai utilizata metoda de sterilizare este sterilizarea cu abur pentru ca este usor de realizat si
permite obtinerea unui inalt grad de sterilitate. Inconvenientele procedeului sunt generate de
reactiile secundare pe care le sufera componentele mediului de cultura (hidrati de carbon,
aminoacizi, proteine) in timpul sterilizarii si anume:
a) denaturarea proteinelor si inactivarea enzimatica
b) degradarea partiala a vitaminelor si a anumiti factori de crestere
c) supraincalzirile pot initia reactii de oxidare a fenolilor si a acidului ascorbic, de
polimerizare a aldehidelor nesaturate, de caramelizare a hidratilor de carbon,
brumificarea mediului sau de condensare a gruparilor aldehidice din zaharuri
reducatoare cu grupele aminice libere din aminoacizi sau proteine.
Produsii rezultati in urma reactiilor secundare sunt toxici pentru majoritatea
microorganismelor si trebuie ca formarea lor sa fie evitata in timpul sterilizarii. Din acest motiv se
recomanda sterilizarea separata a hidratilor de carbon si a compusilor cu azot si amestecarea
ulterioara a lor.
Compozitia mediului de cultura
Cerintele nutritionale ale celulelor de cultura depind de metabolismul lor. Una din ideile de
baza, ale logicii viului general valabila pe Pamant este ca biochimia tuturor entitatilor vii are la baza
chimia carbonului.
Nutrientii ce constituie mediul de cultura sunt cunoscuti sub denumirea consacrata de
substrate. Dupa aportul in constituienti celulari se numesc si surse de: C, H, N, O, P, microelemente
si altele. Evident ca un substrat poate fi concomitent sursa de C si N si similar.
In ceea ce priveste microorganismele, majoritatea celor cu aplicatii industriale obtin carbonul
celular din compusi organici (de unde denumirea de heterotrofe). Pe langa rolul lui esential de
constituent major al materialului celular, carbonul din compusii organici este folosit si ca sursa de
energie.
Ca sursa de material celular, carbonul formeaza. cca 50% din masa celulara uscata a
bacteriilor si fungilor. Domeniul compusilor organici cu carbon care pot fi utilizati este vast, iar
versatilitatea lumii microbilor se manifesta, prin faptul ca toti compusii cu carbon sintetizati sunt la
randul lor biodegradabili. Zaharurile si in mod special glucoza sunt sursele de carbon si energie
cele mai folosite in mediile de cultura ale microorganismelor, dar in functie de necesitatile
nutritionale speciale ale altor celule se mai folosesc derivati de zaharuri, alcooli, acizi grasi, acizi
organici, hidrocarburi si compusi organici cu azot.
La randul sau azotul reprezinta 8-14% din masa moleculara uscata a bacteriilor si fungilor.
Majoritatea microorganismelor pot utiliza in primul rand ionul de amoniu ca sursa de N.
De aceea in majoritatea mediilor de cultura de laborator sau industriale se folosesc saruri de
amoniu ca sursa de N. In functie de nevoile metabolice existente mai pot fi folosite ca surse de N
nitratii (desi se acumuleaza adesea nitrati toxici) uneori chiar N gazos sau produsi organici cu azot
(proteine sau peptide). De obicei mediile de cultura contin o sare de amoniu ca sursa de N
anorganic si un derivat industrial cu continut de N organic. Sursele de N organic (derivat de soia,
extract de drojdie, extract de porumb, sange uscat, extract de seminte de bumbac, fractii solubile de
la distilarea alcoolului si altele) aduc si un aport suplimentar in mediul de cultura de factori de
crestere, ce vor fi prezentati ulterior.
Sursa de Hidrogen, este de obicei concomitenta cu sursa de C in produsele organice. Sunt
foarte rare cazurile de folosire a H gazos.
Oxigenul este prezent si el in toti compusii organici celulari si apa celulara. El este obtinut
din majoritatea compusilor organici ai mediului de cultura, dar in cazul metabolismului aerob este
absolut necesar oxigenul din aer.
Prezenta Fosforului este esentiala pentru cresterea culturii si pentru o serie de alte procese
metabolice, sursa consacrata fiind constituita de fosfati si uneori de unii derivati organici.
Sulful se obtine de obicei din sulfati, iar Potasiul (principalul cation al celulei) este introdus
de asemenea sub forma de sulfati sau de fosfati. Sursa importanta de Magneziul este sulfatul
respectiv.
 In mediul de cultura se introduc adesea microelemente, solutii de saruri minerale care contin
ionii metalici de care au nevoie metaloenzimele din celula. Concentratiile acestor saruri sunt
extrem de reduse in mediu. In functie de cerintele unor microorganisme se mai introduc vitamine si
uneori amino acizi.
Odata stabilita formula mediului de cultura in functie de cerintele nutritionale ale celulelor,
urmatoarea etapa este prepararea acestuia. Este numai aparent o operatie simpla, pentru ca cere
totusi elaborarea unei proceduri dedicate, astfel ca fiecare cantitate de mediu preparata sa fie
identica cu celelalte, deci asigurarea unui inalt grad de reproductibilitate a compozitiei. Aceasta
inseamna ca trebuie urmarite cu atentie conditiile de conservare si manipulare a componentelor la
temperaturi si umiditate control etc. In special in cazul mediilor pentru instalatia industriala,
protocoalele de lucru trebuie sa contina instructiuni cat mai clare, astfel incat sa se evite producerea
unor reactii nedorite intre componentele mediului, cand ingredientele sunt introduse intr-o ordine
gresita (se poate ajnnge la precipitarea unor componente, care odata scoase din solutie nu mai sunt
accesibile celulelor de cultura, sau la eliminarea unor componente volatile, de exemplu amoniacul;
de asemenea, se poate realiza complexarea unor saruri sau reactii de condensare intre
componentele organice, mai ales in timpul sterilizarii mediului).
Este important ca mediul sa fie suficient agitat in timpul prepararii, astfel incat sa se
solubilizeze toate componentele iar limitele de solubilitate ale substantelor sa fie avute in vedere.

Constituent principali ai mediilor de cultura intalniti in laboratorul de Microbiologie sunt:

-
1. Extracte de carne si macerate
Aceste produse, comercializate in forma concentrata sub denumirea de "extracte de carne",
contin in principal proteine putin hidrolizate, glucide, saruri minerale, vitamine hidrosolubile.
Compozitia lor variaza in functie de carnea utilizata pentru preparare.
2. Extracte de drojdie
Aceste extracte, comercializate sub forma deshidratata, sunt preparate din drojdia de bere,
fiind utilizate ca sursa de aminoacizi si de vitamine hidrosoiubile (vitamine din complexul B).
3. Peptone si hidrolizate
Peptonele reprezinta un amestec de compusi solubili in apa care provin in urma actiunii
enzimelor asupra materialului proteic. Pot fi: peptona pepsica din carne, peptona tripsica din
cazeina (cu continut crescut in triptofan), peptona pancreatica de cazeina, peptona tripsica de carne,
peptona papainica de soia, peptone compuse.
Hidrolizatele sunt peptone obtinute in urma actiunii compusilor anorganici asupra proteinelor
(acid clorhidric de ex.). Cel mai des intrebuintat este hidrolizatul acid de cazeina, continand
aminoacizii constitutivi ai cazeinei din lapte.
 4. Agar-agarul sau geloza
Agar-agarul denumit si geloza este un extract de alge rosii (Rhodophyceae) din genul
Gelidium si Gracilaria, recoltate in marile Japoniei sau ale Noii Zeelande. Se dizolva in apa la o
temperatura in jur de 90°C si se solidifica sub 45°C, fiind utilizat pentru solidificarea mediilor de
cultura. Nu este degradat de microorganismele obisnuite. Este comercializat in forma sa initiala
deshidratata, numit "agar fibre" (foarte impur), sub forma de paiete (mai putin impur), sau sub
forma de pulbere.
Numeroase firme sunt specializate in producerea si comercializarea mediilor de cultura de
laborator (firma Difco, Merck, Biokar, Oxoid).
Mediile fermentative sunt medii de cultura industriale destinate producerii unor cantitati
mari de celule sau produsi de metabolism. In compozitia acestor medii intra ca surse de carbon:
melasa, produs secundar rezultat la fabricarea zaharului si care contine 45 - 55% zaharoza, diferite
tipuri de fainuri, cereale boabe, zer bogat in lactoza, tarate etc. Dintre sursele de azot cel mai des
folosite sunt: fainurile proteice de soia, sulfatul de amoniu, ureea, ingrasamantul complex. Ca saruri
minerale se adauga fosfati, sulfati, cloruri etc. Pentru cultivarea microorgamsmelor care necesita
factori de crestere, se adauga extract de porumb (obtinut prin concentrarea apelor rezultate la
inmuierea porumbului, bogat in aminoacizi, vitamine, acid lactic, microelemente), extract de
drojdie, extract din radicele de malt si germeni de grau si porumb.
 PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA PENTRU INTRETINEREA
BACTERHLOR, DROJDIILOR s1 MUCEGAIURILOR

Materiale utilizate:
- balanta cu precizie de 0,1 g;
- pahare Berzelius;
- sita metalica;
- agar nutritiv pulbere;
- medii de cultura;
- eprubete cu dop, sterile;
- pipetede l0 mL;
- flacoane Erlenmeyer;
- bec de gaz si autoclav cu gaze.

Mod de lucru:
Conform indicatiilor de pe flacoanele continand mediile de cultura pulverulente, se vor cantari
cantitatile necesare pentru a obtine cate X litri din fiecare tip de mediu de cultura pentru eprubete si
cate Y mL mediu pentru baloanele Erlenmeyer. In cazul in care nu exista medii deshidratate,
procurate de la firme specializate, mediile se vor prepara prin cantarirea componentelor pentru
volumul final dorit.
Mediul de cultura se aduce la fierbere in paharele Berzelius, pana la completa dizolvare a
agarului, apoi se repartizeaza cate 10 mL in Z eprubete sterile, prevazute cu dop de vata, care se
aseaza in cosuri metalice si se acopera cu hartie. In mediu se determina pH-ul si, daca este necesar,
se ajusteaza la valoarea dorita. Mediile cu agar nu trebuie sa fie aduse la un pH mai mic de 6,
deoarece agarul este partial hidrolizat in timpul sterilizarii la pH acid si nu se mai solidifica la
racire. Cand sunt necesare astfel de medii, pH-ul trebuie ajustat dupa sterilizare.
Baloanele Erlenmeyer se astupa cu dop de vata invelit in tifon, se leaga la gura cu hartie si
sfoara. Cosurile si baloanele Erlenmeyer se introduc in autoclavul cu abur, iar sterilizarea se face
conform instructiunilor afisate langa aparat.
Se include capacul autoclavului, se verifica nivelul apei in vasul de nivel, se aprinde gazul si
se asteapta aparitia jetului de abur viu care este eliminat prin purja.
Dupa 10-15 minute de purjare se inchide robinetul purjei, iar presiunea indicata de
manometru va urca pana la valoarea 1.2, unde va fi mentinuta timp de 20 min. prin micsorarea
flacarii.
Intre presiune si temperatura din autoclav exista o corelatie, asa cum se prezinta in tabelul
urmator:

Tabel 2. Corelatie intre presiunea si temperatura din autoclav

Dupa acest interval se opreste gazul, se asteapta scaderea presiunii pe manometru, se deschide
purja si dupa 5 minute se poate deschide capacul autoclavei.
In general, mediile de cultura trebuie sa ofere o suprafata de dezvoltare suficienta pentru
microorganisme. De aceea, dupa sterilizare tuburile cu mediu se inclina pentru ca sa ramana cu o
suprafata mare de crestere. Inclinarea se face prin sprijinirea eprubetelor pe o bagheta suficient de
groasa, tinand seama ca mediul negelificat sa nu ude dopul de vata, ci sa se opreasca la 2 - 3 cm de
acesta. Prin racire, vaporii ce ies din mediul cald, se condenseaza pe peretii mai reci ai eprubetelor
si cad sub forma de picaturi pe mediu, adunandu-se pe fundul eprubetei. Din aceasta cauza,
eprubetele cu mediul racit nu se aseaza in pozitie orizontala, ci verticals, in cosuri de sarma. Acestea
se acopera apoi cu o hartie si se leaga cu sfoara.
Pentru a nu prepara in fiecare zi medii sau, daca este nevoie de mai multe feluri de medii in
acelasi timp, acestea se pregatesc o data si apoi se depoziteaza pentru pastrare. Sticlele cu medii se
eticheteaza, notandu-se tipul mediului si data prepararii. Pentru evitarea uscarii se recomanda
pastrarea mediilor nutritive in frigider.