Facultad de Ciencias Médicas

Escuela Académico Profesional de Medicina

Fundamentos de ayuda diagnostico I

Métodos de diagnóstico e interpretación y factor de virulencia de VIH,

VHB
Autor:
Mendoza Broncano, Sergio Orlando

Trujillo – Perú
2019
I. INTRODUCCIÓN

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un lentivirus de la familia Retroviridae,

causante del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Su característica
principal consiste en un periodo de incubación prolongado que desemboca en
enfermedad después de varios años. Existen dos tipos del VIH, llamados VIH-1 y VIH-2.
El primero de ellos corresponde al virus descubierto originalmente, es más virulento e
infeccioso que el VIH-2 y es el causante de la mayoría de infecciones por VIH en el
mundo. El VIH-2 es menos contagioso y por ello se encuentra confinado casi
exclusivamente a los países de África occidental. El virus ha sido aislado en la saliva, las
lágrimas, la orina, el semen, el líquido preseminal, los fluidos vaginales, el líquido
amniótico, la leche materna, el líquido cefalorraquídeo y la sangre, entre otros fluidos
corporales humanos. El VIH puede transmitirse por las relaciones sexuales vaginales,
anales u orales con una persona infectada (acto sexual sin protección); a través de la
sangre y los hemoderivados en individuos que comparten agujas y jeringas
contaminadas para inyectarse drogas y en quienes reciben transfusiones de sangre o
derivados igualmente contaminados; existe un riesgo laboral pequeño entre los
profesionales sanitarios, el personal de laboratorio y posiblemente otras personas que
manipulan muestras sanguíneas o fluidos de personas con VIH, estudios realizados
indican que el riesgo de transmisión después de una punción cutánea con una aguja o
un instrumento cortante contaminados con la sangre de una persona con VIH es de
aproximadamente 0.3%. Asimismo, puede transmitirse de la madre al hijo durante el
embarazo, el parto y la lactancia. Actualmente en países desarrollados la transmisión
vertical del VIH está totalmente controlada (siempre que la madre sepa que es
portadora del virus)
II. OBJETIVOS
- Determinar los métodos de diagnóstico de VIH y VHB.
- Determinar los factores de virulencia de VIH y VHB.

III. MARCO TEÓRICO

DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR EL VIH

El diagnóstico definitivo de la infección por el VIH sólo puede establecerse por métodos
de laboratorio, ya que en ningún caso las manifestaciones clínicas son lo
suficientemente específicas. Los métodos directos detectan al propio virus o alguno de
sus componentes, como proteínas o ácidos nucleicos, mientras que los indirectos
reconocen los anticuerpos específicos producidos por el sistema inmunitario como
respuesta a la infección vírica. La detección por métodos directos o indirectos del VIH
ha permitido no solo reconocer a las personas infectadas y establecer medidas
preventivas adecuadas, sino que además constituye una ayuda esencial en el
seguimiento de los pacientes para conocer el pronóstico de la enfermedad y la eficacia
del tratamiento utilizado.

1. MÉTODOS INDIRECTOS
La detección de anticuerpos específicos anti-VIH es la forma habitual de diagnosticar una infección
por VIH. Los métodos se dividen en: a) pruebas de screening, diseñadas con un máximo de
sensibilidad para detectar todas las muestras positivas, y b) pruebas confirmatorias, caracterizadas
por su especificidad y que permiten asegurar la positividad de una muestra previamente reactiva con
un test de screening. Ambos ensayos realizados de forma secuencial obtienen resultados excelentes
en cuanto a exactitud y reproducibilidad y tienen más del 99% y 95% de sensibilidad y especificidad
respectivamente.

a. Pruebas de Screening

Las técnicas inmunoenzimáticas (EIA) son las más empleadas debido a su

metodología relativamente simple, alta sensibilidad, nivel de automatización y diseño
para realizar un gran número de tests de forma simultánea. En principio se basaron en
la utilización de lisados víricos (ensayos de primera generación), y fueron de enorme
utilidad para conocer el alcance de la epidemia de SIDA en los primeros años y establecer
las primeras medidas preventivas. Posteriormente fueron sustituidas por EIA que
utilizaban antígenos más específicos obtenidos por recombinación genética o mediante
síntesis (ensayos de segunda generación) utilizando EIA indirectos o competitivos.

Estas técnicas tenían una mejor especificidad, pero planteaban problemas de

sensibilidad en el diagnóstico de la infección aguda, debido a que detectaban la
seroconversión de seis a doce semanas después de producirse la infección. Para resolver
esta cuestión se han diseñado técnicas que detectan en una misma prueba anticuerpos
de distinta clase (IgG, IgM ó IgA) mediante un diseño de tipo sándwich o de
inmunocaptura, utilizando como antígenos proteínas recombinantes o péptidos
sintéticos específicos del VIH-1 (a veces asociados con otros específicos del VIH-2). De
este modo se consigue reducir el periodo ventana a tres semanas (ensayos de tercera
generación). Los EIA de cuarta generación permiten la detección simultánea de antígeno
y anticuerpos. Tienen como ventaja reducir en una semana el periodo ventana,
estableciéndolo en dos semanas desde el inicio de la infección. Aunque estos ensayos
tienen una excelente sensibilidad para la detección de casos de infección aguda, pierden
algo de sensibilidad analítica en cada uno de sus componentes, de modo que el umbral
de detección de antígeno es mayor, y lo mismo ocurre con los anticuerpos,
observándose una reducción en la señal de reactividad en las muestras en las que el
antígeno desciende o desaparece. De cualquier modo, en la comparación con EIA de
tercera generación en paneles de seroconversión demuestra una sensibilidad del 100%
y una especificidad del 99,7-100%. Existen otras pruebas de screening caracterizadas por
la obtención de resultados en menos de 30 minutos. Son muy útiles aplicados en
situaciones que requieren un resultado inmediato, como trasplantes, accidentes
laborales o antes del parto en una embarazada que no ha sido controlada con respecto
a la infección por el VIH. Suele tratarse de técnicas en dot blot que, realizadas
correctamente, ofrecen una gran seguridad en el resultado. En el caso de las técnicas
inmunocromatográficas se requiere simplemente la adición de la muestra que
reaccionará con los distintos reactivos al ser arrastrada por una solución tamponada en
una tira de papel. Aunque estas técnicas son simples de ejecución y no requieren
instrumentación, su coste no es adecuado para países en desarrollo y en estos casos
resulta más convenientes utilizar técnicas simples como la aglutinación (con hematíes,
látex o partículas de gelatina) que muestran también una excelente sensibilidad y
especificidad. Los tests de screening también pueden ser realizados a partir de muestras
de saliva y orina, para lo cual existen métodos adaptados, con la ventaja que supone
sobre la muestra de suero en cuanto a facilidad en la obtención, menor riesgo de
contagio accidental y coste económico.

b. Pruebas de Confirmación

Las muestras positivas en la prueba de screening requieren ser confirmadas con

un test muy específico, empleándose el Western blot (WB), la inmunofluorescencia
indirecta (IFI) o la radioinmunoprecipitación (RIPA). El WB es el método recomendado y
permite discriminar, por la aparición de bandas reactivas, frente a qué antígenos víricos
se dirigen los anticuerpos presentes en la muestra. La interpretación del WB se puede
realizar según diversos criterios aunque el más aceptado es el de la OMS que exige la
presencia de al menos dos bandas de la envoltura. La muestra negativa implica una
ausencia de bandas reactivas y cualquier situación intermedia se interpreta como
reacción indeterminada.

La reactividad indeterminada del WB puede ocurrir en determinadas situaciones

relacionadas con la infección por el VIH. En casos de seroconversión reciente en las que
aún no han aparecido todas las bandas, en recién nacidos de madres seropositivas, estén
infectados o no, y en pacientes con enfermedad avanzada y grave deterioro
inmunológico. También hay que valorar la posibilidad de presentar una infección por el
VIH-2 (algunos tests llevan adherida una banda de antígeno específico del VIH-2) o por
un subtipo del VIH-1 distinto al habitual. La hipergammaglobulinemia frecuente en
individuos africanos, por estimulación antigénica inespecífica, es causa de patrones
indeterminados en WB no relacionados con infección por VIH, así como también es
posible la reactividad cruzada en pacientes con enfermedades autoinmunitarias,
embarazadas y en algunos donantes de sangre. Un resultado indeterminado en WB
obliga a un control del paciente y a la repetición de la determinación a los 3-6 meses
siendo recomendable utilizar métodos de diagnóstico directo para resolver el problema.
Una alternativa al WB es el inmunoensayo lineal, consistente en pegar a una tira de
nitrocelulosa diversos antígenos del VIH. Su sensibilidad es similar al WB y presenta
menos reacciones cruzadas por la presencia de productos celulares propios del proceso
de fabricación de WB. Las técnicas de IFI y RIPA, debido a su subjetividad y complejidad
técnica, respectivamente, no se consideran adecuadas para el uso rutinario como
método confirmatorio

2. MÉTODOS DIRECTOS
Están basados en la detección del virus o alguno de sus componentes. Incluye el cultivo
vírico, la determinación de antígeno p24 en plasma o suero y la demostración de
genoma vírico mediante técnicas moleculares.

a. Cultivo celular
Aunque es la técnica más específica para el diagnóstico de la infección su
utilización suele reservarse para estudios básicos de variabilidad genética,
epidemiología molecular, patogénesis vírica o resistencia a fármacos, debido a la
complejidad y riesgo que supone su realización. El método consiste en un cocultivo de
células mononucleares de sangre periférica del paciente junto a otras del mismo tipo
procedentes de donantes. El cultivo se considera positivo por la demostración del efecto
citopático o la detección de productos víricos como el antígeno p24 o la transcriptasa
inversa.

b. Antigenemia de p24

El antígeno p24 de la cápside del VIH (core), detectado en suero o plasma

mediante una reacción de EIA, es un marcador precoz de infección aguda por VIH. A lo
largo de la infección su detección es variable debido al incremento de anticuerpos anti-
p24 neutralizantes o a la escasa replicación del virus. Las técnicas que rompen los
inmunocomplejos formados por el antígeno p24 y su anticuerpo aumentan la
sensibilidad de a determinación y ha sido propuesto para monitorizar el tratamiento
antirretroviral en países en desarrollo
La detección de antígeno p24 puede ser de utilidad en el screening de donantes,
combinado con la detección de anticuerpos (ensayos de cuarta generación), diagnóstico
de la infección aguda y del recién nacido, monitorización de la terapia (especialmente
en infecciones por subtipos no-B del VIH-1) y como confirmación del crecimiento del
virus en los cultivos celulares.

c. Técnicas moleculares

Aunque el diagnóstico de la infección por el VIH debe establecerse mediante la

detección de anticuerpos específicos del virus, puede ser conveniente la utilización de
técnicas moleculares basadas en el reconocimiento de fragmentos del genoma del virus.
Estas situaciones especiales se producen en casos de hipogammaglobulinemia, infección
perinatal, infección silente o infección por variantes del virus que pueden escapar a la
detección con las técnicas habituales serológicas, como son el VIH-2 y el subtipo O del
VIH-1. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es el método de elección para el
diagnóstico molecular de la infección por el VIH. Puede aplicarse directamente a la
detección de ADN provírico a partir de células del paciente, o bien mediante una
reacción de retrotranscripción previa (RT-PCR), realizada habitualmente en plasma,
cuando la diana que se pretende localizar son las partículas de ARN vírico. Su utilización
es imprescindible para el diagnóstico de VIH en los niños recién nacidos de madres
seropositivas y en los pacientes con patrones serológicos atípicos. La conveniencia de
utilizar técnicas moleculares en el screening de donantes es discutida aunque es
indudable que reduce aún más el periodo ventana previo a la seroconversión, de forma
que podría diagnosticarse a un paciente infectado tan solo una semana después de su
contacto con el virus. Con una aplicación diagnóstica enfocada a bancos de sangre se ha
desarrollado recientemente un método basado en amplificación mediada por
transcripción (TMA) que detecta de forma simultánea desde 100 copias/ml de VIH-1 y
virus de la hepatitis C, con una sensibilidad y especificidad >99,5%
 FACTORES DE VIRULENCIA DEL VIH

CONFORMACIÓN ESTRUCTURAL DEL VIH

La microscopia electrónica de alta resolución ha revelado que el virión del VIH-1 es una
estructura icosahédrica que contiene 72 protrusiones (glicoproteínas) y que es
característicamente cubierta por una capa lipídica. Cada partícula viral del VIH-1 está
compuesta de dos copias idénticas de RNA de una sola cadena, el cual se encuentra
empacado en una cubierta proteica o cápside (denominada en inglés "core"). Esta
cápside forma parte de un complejo proteico en el interior o centro de la partícula viral,
el cual está conformado por tres proteínas estructurales mayores. Dentro de la cápside
encontramos todos los productos de otro gene estructural denominado pol, los cuales
son básicos para los pasos tempranos del ciclo vital del virus, así como para la
conformación final de las partículas virales antes de salir de la célula huésped. La cápside
está rodeada de una cubierta lipídica que es derivada de la membrana celular de la célula
huésped infectada, cubierta en la que están embebidas las glicoproteínas de membrana
gp120 y gp41, que derivan del tercer gene estructural o env y que se encuentran
abundantemente glicosiladas, un factor que es de gran importancia para el
reconocimiento de los receptores de las células blanco. Como consecuencia lógica de la
adquisición de la cubierta lipídica en ella protruyen varias moléculas de origen celular,
incluyendo antígenos de histocompatib ilidad clase I y clase II
EL CICLO VITAL DEL VIH-1

El VIH-1 es capaz de infectar

diferentes células del
cuerpo humano. Sus
blancos principales son el
linfocito T CD4+ y los
macrófagos, aunque es
capaz de infectar otros
linfocitos, células de
sostén(glía) del sistema
nervioso central y neuronas,
células enterocromafines
del intestino y células
dendríticas incluyendo las
células de Langerhans, así como precursores de médula ósea. La entrada a estas células
depende de la identificación de receptores específicos entre los que destaca la molécula
CD4 y los más recientemente descubiertos correceptores, como CCR5, y CXCR4, el
primero correceptor en macrófagos y el segundo correceptor en linfocitos T. El contacto
del VIH-1 con el receptor y correceptor origina una serie de cambios en la estructura
viral, a nivel de las glicoproteínas de superficie que desemboca en la fusión de las
membranas viral y celular y la internalización del virión. Por otra parte, el mejor
entendimiento del proceso de fusión que es un mecanismo independiente de pH y
mediado por un polipéptido (trimérico) de la gp41 ha permitido el desarrollo de
inhibidores de fusión (que impiden la unión de las membranas), uno de los nuevos
armamentarios en contra de esta infección, aun cuando hasta este momento se ha
enfrentado a un problema importante de desarrollo de resistencia, incluso rápidamente
en vista de que se relacionan con una de las regiones virales más variables como es la
de las glicoproteínas de cubierta.
Integración, latencia y regulación genómica

Después de la internalización se realiza la transcripción reversa con la formación de DNA

del RNA viral. La transcriptasa reversa es la enzima que no sólo hace la copia del material
genético viral RNA y lo convierte a una cadena simple de DNA, sino que también
complementa esta cadena para crear un DNA de doble cadena, que pueda incorporarse
al material genético de la célula huésped (integración) en donde se denomina provirus.
La transcriptasa reversa es uno de los blancos terapéuticos más usados al momento
actual, ya que es la enzima que es inhibida competitivamente por los análogos
nucleósidos (AZT, ddI, ddC, 3TC, d4T y abacavir) y no competitivamente por los no
nucleósidos (efavirenz, nevirapina y delavirdina). La enzima transcriptasa reversa al
realizar estas copias comete un error de copia (mutación) en cada genoma que copia
generando poblaciones virales cada vez más diferentes de la cepa predominante inicial
a la cual se le denomina silvestre. A las diferentes variantes presentes en un individuo
se les denomina cuasiespecies, pudiendo existir cientos de miles de variantes
coexistentes en un solo organismo, las cuales están relacionadas con patogenicidad y
resistencia a antirretrovirales.

El provirus es el encargado de dirigir la creación de nuevas partículas virales, lo cual

ocurre en la mayor parte de las células infectadas permitiendo la producción de un billón
de partículas virales por día, en contra de lo que se pensaba previamente en relación
con la latencia virológica en conjunto con la latencia clínica. Sin embargo, vale la pena
mencionar que desde el primer momento de la infección por VIH-1 se forma un
reservorio de células T latentemente infectadas que probablemente y por razones
desconocidas replican virus sólo en forma esporádica permaneciendo por largo tiempo
latentes y constantes en un "pool" de aproximadamente un millón de células.

Este reservorio es probablemente la causa principal del fracaso terapéutico de los

antirretrovirales para lograr la cura, ya que aun cuando se haya mantenido a un paciente
indetectable por un periodo largo, al suspender el tratamiento siempre habrá un rebote
viral que proviene importantemente de estas células T latentes.
REPLICACIÓN VIRAL Y DESTRUCCIÓN LINFOCITARIA

La infección por VIHes un proceso crónico que implica una producción elevada y
constante de nuevos viriones, acompañada de la consecuente destrucción de linfocitos
CD4+ (efecto citopático). Esta destrucción celular es compensada durante varios años,
hasta que las reservas corporales se agotan, lo que desemboca en una depleción de
estos linfocitos, que son las células coordinadoras de la respuesta inmune, razón por la
cual se produce una inmunodeficiencia adquirida. El evento cardinal en la progresión a
enfermedad es la replicación viral mientras que el evento determinante del desarrollo
de inmunodeficiencia es la destrucción celular linfocitaria.

Desafortunadamente el o los mecanismos específicos que producen este efecto no son

adecuadamente conocidos, aunque varios son los postulados. Si se imagina la exocitosis
masiva de miles de viriones, cada uno con una porción de membrana celular es posible
pensar que por el simple efecto mecánico y la pérdida de regulación osmótica la célula
podría destruirse. Otra posibilidad ya mencionada es la acumulación de moléculas
nocivas para la célula como podría ser el DNA viral no integrado. In vitro , la fusión de
células gracias a la presencia en la superficie celular del receptor CD4 y de la gp120/gp41
que permanece después de la entrada del virus a la célula, con la formación de sincicios
o grandes acúmulos de células fusionadas que se destruyen es una clara explicación del
efecto citopático viral; sin embargo, este fenómeno ha sido muy raramente
observado in vitro . Otros mecanismos propuestos son la apoptosis o muerte celular
programada originada o estimulada en la producción viral y la consecuente
susceptibilidad a ciertos mediadores como Fas 24 y la destrucción autoinmune de la
célula mediante un efecto de citotoxicidad mediada por anticuerpos, así como el arresto
del ciclo celular en fase G2 como efecto de otra proteína regulatoria viral
denominada vpr. Será muy importante trabajar en la precisión de estos mecanismos
puesto que el bloquearlos se convertiría en uno de los acercamientos más interesantes
en la terapia antirretroviral.

Las variantes presentes en la mayoría de los individuos al principio de la enfermedad

son macrofago-trópicas, lo que les da la ventaja de permanecer por largo tiempo y de
"esconderse" del sistema inmune, mientras que cuando existe un cambio de tropismo,
a mayor afinidad por células T se incrementan los efectos citopáticos en los linfocitos
originando la inmunodeficiencia.

El huésped participa activamente en la selección natural que se establece de variantes

virales a través de la expresión de diversos receptores y correceptores para el virus, así
como de la selección constante de variantes que se escapan de la respuesta inmune
generada. La respuesta inmune generada por el huésped es variada, pero se considera
que la más importante es la citotóxica mediada por linfocitos CD8+ (linfocitos T
citotóxicos). La generación de una respuesta citotóxica adecuada depende de la
presencia de células CD4+, por lo que la disminución de estas células afecta
importantemente también la capacidad del organismo de luchar contra el virus.