La lisina fuertemente conservada 256 de Saccharomyces cereVisiae

La fosfoenolpiruvato carboxiquinasa es esencial para la transferencia de fosforilo

Resumen
La lisina 256, un aminoácido conservado de la fosfoenolpiruvato de fosfaenolpiruvato
(PEP) de Saccharomyces cerevisiae ubicado en la secuencia consenso de la quinasa 1a de la enzima, se cambió a alanina,
arginina o glutamina mediante mutagénesis dirigida al sitio. Estas sustituciones no dieron lugar a cambios importantes
en la estructura de la proteína, como lo indica el dicroísmo circular, la espectroscopía de fluorescencia de triptófano y la
cromatografía de exclusión en gel. Las tres enzimas variantes mostraron casi inalterada K m para MnADP sino de una
disminución del 20 000 veces en V maxpara la reacción de carboxilación de PEP, en comparación con la carboxinasa de
PEP de tipo salvaje. Las enzimas variantes presentaron actividad de descarboxilasa de oxaloacetato a niveles similares a
los de la proteína nativa; sin embargo, carecían de actividad similar a la piruvato quinasa. La constante de disociación
para el complejo enzima-MnATP fue de 1.3 ± 0.3 μM para la carboxinasa PEP de S. cerevisiae de tipo salvaje , y los
valores correspondientes para los mutantes Lys256Arg, Lys256Gln y Lys256Ala fueron 2.0 ± 0.6 μM, 17 ± 2 μM y 20 ± 6
μM, respectivamente. Estos resultados muestran colectivamente que se requiere un residuo cargado positivamente
para la unión adecuada de MnATP y que Lys 256 juega un papel esencial en la estabilización del estado de transición
durante la transferencia de fosforilo para la carboxinasa de PEP de S. cerevisiae .
INTRODUCCION
Fosfoenolpiruvato (PEP) 1 carboxicinasas [ATP / GTP: oxaloacetato carboxilasa (transfosforilación), EC 4.1.1.49/ 30]
catalizan uno de los primeros pasos en la biosíntesis de carbohidratos de precursores C3 y C4 y, dependiendo de la
fuente de la enzima, requieren ATP o GTP como el donante de fosforilo (1). La reacción implica la descarboxilación y
fosforilación de oxaloacetato en presencia de un nucleósido trifosfato y un ión metálico divalente para producir PEP,
CO2 y el correspondiente nucleósido difosfato: además de esta reacción fisiológicamente importante, la
descarboxilación de OAA a piruvato + CO2 y Se ha informado de una actividad similar a la piruvato quinasa en
Saccharomyces cereVisiae y otras PEP carboxicinasas (2-4). En todos los casos examinados, la reacción catalizada por las
PEP carboxicinasas sigue un mecanismo cinético secuencial (5, 6) y se ha propuesto una transferencia directa del fosfato
γ del nucleósido trifosfato a OAA para las enzimas citosólicas mitocondriales del hígado de cobaya y del hígado de rata.
(8, 9).
Se han clonado los ADNc de las carboxicinasas PEP dependientes de ATP de varios microorganismos y plantas, y sus
secuencias de aminoácidos se han derivado de las secuencias de ADNc correspondientes (10, 11). Todas estas secuencias
alineadas exhiben una considerable identidad de aminoácidos. También se encuentra una identidad de secuencia alta
entre las secuencias de aminoácidos derivadas de manera similar de las carboxicinasas PEP dependientes de GTP (12,
13); sin embargo, no se puede encontrar una homología significativa entre este grupo y las carboxicinasas dependientes
de ATP. Sin embargo, la presencia de secuencias consenso para la unión de fosforilo (14, 15) se encuentra
consistentemente en la estructura primaria de todas las carboxicinasas PEP descritas hasta ahora.
Una de estas secuencias (Gly-X-X-X-X-Gly-Lys-Thr) es la quinasa designada por Traut (16). En la estructura primaria de la
enzima S. cereVisiae, la secuencia de la quinasa 1a corresponde a Gly250-Leu-Ser-Gly-Thr-Gly-Lys-Thr257 (17). La
función del residuo de Lys conservado dentro de la secuencia de la quinasa 1a se ha investigado en varias enzimas, y la
opinión general es que participa en la unión de nucleótidos y / o la transferencia de fosforilo entre el nucleótido y el
aceptando nucleófilos (14, 18).
De acuerdo con la estructura cristalina y molecular de las carboxicinasas PEP de Escherichia coli, la única carboxinasa
PEP para la cual está disponible una estructura tridimensional, los primeros cinco residuos de la secuencia de la quinasa
1a (Gly248-Thr252) están dentro de un bucle formado entre un filamento â y una R-hélice corta, y los residuos restantes
(Gly253-Lys-Thr255) son parte de la R-hélice (10). En esa estructura, el motivo beta-strand-loop-R-helix recubre una cara
de la hendidura del sitio activo, lo que hace que el bucle P quede parcialmente enterrado. La estructura de la enzima E.
coli complejada con ATP-Mg2 + -oxalato ha indicado que la unión de ATP induce una ligera contracción en el bucle de la
quinasa 1a, envolviendo los residuos del bucle firmemente alrededor del grupo ATP trifosfato. En particular, Lys254
inserta su grupo amino cargado positivamente entre los fosfatos γ y γ del nucleótido unido (19).
Varias líneas de evidencia indican importantes similitudes estructurales entre la enzima E. coli y las cuatro subunidades
de carboxinasa PEP de S. cereVisiae idénticas. Las levaduras y las PEP carboxicinasas bacterianas comparten un 45% de
identidad de secuencia (10, 17), y ambas están compuestas de aproximadamente 20-24% de R-hélice (20). Los
experimentos de proteólisis limitada sugirieron una estructura de dominio para ambas enzimas (21, 22), y esto fue
verificado recientemente por los datos de difracción de rayos X para la carboxinasa de E. coli (10). Mediante el uso de
piridoxal 5′-fosfato, Bazaes et al. (23) han identificado los residuos de aminoácidos conservados Lys288 y Lys290 en las
carboxicinasas PEP de E. coli y S. cereVisiae, respectivamente, como dos residuos de alta reactividad química, cuya
modificación condujo a la pérdida de la actividad enzimática La protección observada de la inactivación y el etiquetado
proporcionado por los sustratos concuerda con la observación de que Lys288 se encuentra dentro de aproximadamente
10 Å del sitio activo de la enzima E. coli (10) y sugiere una ubicación similar para el residuo correspondiente en la
carboxinasa de S. cereVisiae.
Recientemente, Chávez et al. (24) han demostrado que el reemplazo Lys290 f Gln dentro de la carboxinasa PEP de S.
cereVisiae genera una enzima variante con valores de Km y Vm ligeramente alterados, como podría esperarse para un
residuo cercano pero no dentro del sitio activo propiamente dicho. De manera similar, la modificación química por el
reactivo específico de histidina dietil pirocarbonato ha demostrado que el modificador inactiva ambas enzimas por
reacción con los residuos conservados His271 y His273 de E. coli y S. cereVisiae PEP carboxicinasas, respectivamente
(25). Todos estos datos apuntan a similitudes estructurales significativas entre estas dos carboxicinasas, y sugieren
además que Lys256 y Lys254 de las secuencias consenso quinasa 1a de S. cereVisiae y E. coli PEP carboxicinasas,
respectivamente, pueden ser estructural y funcionalmente similares o equivalentes. Se han identificado residuos lisílicos
reactivos en la carboxinasa PEP de hígado de pollo mediante técnicas de modificación química; sin embargo, sus
funciones son desconocidas (26,27).
En este trabajo hemos preparado variantes de carboxicinasas PEP de S. cereVisiae en las que Lys256 ha sido
reemplazado por Ala, Arg o Gln. Reportamos un análisis de la cinética de estado estacionario y las características de
unión de nucleótidos de las enzimas nativas y mutantes con el objetivo de investigar el papel de Lys256 en la unión de
sustratos y la catálisis.
MATERIALES Y METODOS:
RESULTADOS:
Expresión, purificación y caracterización estructural de enzimas mutantes Lys256. La expresión de la variante PEP
carboxicinasas se confirmó resolviendo las proteínas del extracto crudo con electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
La carboxinasa de PEP de S. cereVisiae se identificó mediante inmunotransferencia con anticuerpo preparado contra la
enzima de tipo salvaje (no mostrado). Todas las enzimas variantes se expresaron a un nivel similar a la enzima
recombinante de tipo salvaje, en base a los resultados de la inmunotransferencia, y el tamaño aparente de la subunidad
enzimática de las variantes fue el mismo que el de la proteína de tipo salvaje. Las enzimas variantes se purificaron a más
de 95% de homogeneidad de acuerdo con la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, como se muestra en la Figura 2.
A lo largo del proceso de purificación, las tres proteínas mutantes se comportaron de manera similar a la PEP
carboxinasa de tipo salvaje. Los tamaños aparentes de las enzimas variantes fueron los mismos que los de la enzima de
tipo salvaje, según lo determinado por exclusión de gel en una columna Superose-12 calibrada (R) 0.995) (resultados no
mostrados). En esta columna, el peso molecular calculado de la PEP carboxinasa de tipo salvaje fue 267 × 103, y el peso
molecular de las enzimas mutadas varió de 259 × 103 a 267 × 103 Estos valores coinciden bien con el peso molecular
esperado de 244 × 103 para el enzima tetrámero (17) y están en el rango de los determinados por otros autores para
esta misma proteína (40, 41).
Para examinar si las mutaciones en la posición 256 interrumpieron la estructura secundaria de la enzima, se compararon
los espectros de dicroísmo circular de UV lejano de mutantes Lys256 con el espectro de tipo salvaje. La carboxinasa PEP
de S. cereVisiae de tipo salvaje tiene 20% de hélice R (20), y el espectro de CD de la enzima de tipo salvaje exhibe un pico
negativo a 208 nm y un hombro negativo a 222 nm. Los espectros de CD de los tres mutantes de las carboxicinasas PEP
de S. cereVisiae son muy similares a los de la enzima de tipo salvaje (Figura 3), lo que indica que la estructura secundaria
no se vio muy alterada por las mutaciones en el residuo 256. El espectro de fluorescencia intrínseca ( λexc) 287 nm) de
todos los mutantes fueron superponibles con la de la enzima nativa, con un máximo de emisión a 334 nm (no
mostrado), lo que indica microambientes de triptófano similares dentro de las estructuras de proteínas. Caracterización
cinética de las enzimas mutantes Lys256. La enzima recombinante de tipo salvaje provocó una actividad específica de 55
μmol min-1 mg-1 en el ensayo estándar en la PEP
FIGURA 2: electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de carboxiquinasas PEP de S.
cereVisiae de tipo salvaje y mutantes. Carril 1, tipo salvaje; carril 2, K256A; carril 3,
K256R, carril 4, K256Q. Se indica la migración de los patrones de MW desde un gel
separado. Se cargaron aproximadamente 6 μg de proteína en cada carril.
 FIGURA 3: Espectros de dicroísmo circular ultravioleta lejano de
carboxicinasas PEP de S. cereVisiae de tipo salvaje y mutantes. Los
espectros se ejecutaron cinco veces y los datos se promediaron para las
nativas, Lys256Arg (- -
-), Lys256Ala (‚‚ ‚) y
Lys256Gln (-‚ ‚-) PEP
carboxykinases. La
concentración de
proteína fue de 0,18
mg / ml. Todas las
demás condiciones
fueron como se
describe en Materiales
y Métodos.

dirección de carboxilación (ecuación 1), similar a la reportada previamente (17). En condiciones normales de
ensayo, las enzimas mutadas parecían inactivas. Todas las variantes se concentraron a 4-8 mg mL-1 y luego se añadió
una cantidad de enzima más de 5000 veces mayor que la utilizada habitualmente para el ensayo estándar a la mezcla de
ensayo para aumentar la sensibilidad de la prueba. De esta manera, pudimos medir la actividad enzimática y
determinamos los parámetros cinéticos aparentes que se muestran en la Tabla 1. A partir de los datos en la Tabla 1, está
claro que todas las enzimas mutantes muestran valores de Km inalterados para MnADP, mientras que los valores de
Vmax se reducen en aproximadamente 20 000 veces por debajo del valor de la enzima de tipo salvaje.
El mecanismo de reacción propuesto para las fosfoenolpiruvato carboxicinasas implica la formación transitoria de
enolpiruvato y su fosforilación en PEP (4, 12, 42). Según este mecanismo, es concebible que Lys256 pueda desempeñar
un papel en la reacción de descarboxilación, en la reacción de fosforilación o en ambas. Como una forma de probar el
efecto de la sustitución Lys256 en la reacción de descarboxilación, se determinó la actividad de descarboxilasa OAA
(piruvato OAA f + CO2) de la carboxinasa PEP de S. cereVisiae tanto para las enzimas de tipo salvaje como para las
variantes. Un artículo anterior había informado de la ausencia de actividad descarboxilante OAA de la carboxinasa PEP
de S. cereVisiae (7); sin embargo, ahora hemos encontrado que esta actividad está presente en la enzima de tipo salvaje,
aunque a un nivel bajo. La baja actividad de descarboxilasa de OAA impidió su detección en las condiciones de ensayo
previamente empleadas. Una comparación de la cinética.
Los parámetros de esta reacción para las carboxiquinasas PEP
de tipo salvaje y variantes se muestran en la Tabla 2. Se ve que
todas las enzimas mutadas muestran valores aumentados de
Km, mientras que Vmax aumenta 3 veces en la carboxiquinasa
Lys256Ala y disminuye 2.4 y 4 veces en los mutantes
Lys256Gln y Lys256Arg, respectivamente.
La relevancia de Lys256 para la reacción tipo piruvato quinasa
2 de la carboxinasa PEP de S. cereVisiae de tipo salvaje y
mutada también se abordó en este trabajo. En las condiciones
de ensayo descritas en los Procedimientos experimentales, la
enzima de tipo salvaje mostró una actividad específica de 0,68
μmol min-1 mg-1 para esta reacción.2 Sin embargo, esta actividad no pudo detectarse en las Argcarboxiquinasas
Lys256Ala, Lys256Gln y Lys256, incluso cuando se analizó a concentraciones de 2.4, 2.5 y 6.0 mg mL-1, respectivamente.
Estas concentraciones son 53-130 veces más altas que las empleadas para la enzima de tipo salvaje en este ensayo.
ATP vinculante por S. cereVisiae PEP carboxiquinasa nativa y mutante

DISCUSIÓN DE RESULTADOS:
En este trabajo hemos preparado carboxiquinasas PEP de S. cerevisiae mutadas en las que Lys256 fue reemplazado por
Ala, Arg o Gln. Las enzimas mutadas se comportaron de manera similar a la enzima recombinante de tipo salvaje a lo
largo de los procedimientos de purificación. En particular, su comportamiento similar en la etapa de cromatografía de
afinidad AMP-Sepharose indicó que las características esenciales del sitio de unión a nucleótidos permanecieron
inalteradas. Además, las mutaciones introducidas no alteraron las estructuras cuaternarias de las proteínas, y los análisis
de espectroscopía de CD y fluorescencia no mostraron evidencia de cambios conformacionales graves. Por lo tanto,
concluimos que el reemplazo de Lys256 por Ala, Arg o Gln en la carboxinasa PEP de S. cerevisiae no perturba la
estructura general de la proteína.
La disminución de 20 000 veces en Vmax para la reacción de carboxilación de PEP detectada en las enzimas mutadas
indica claramente un papel catalítico esencial para el grupo amino de Lys256, un papel que no puede ser reemplazado
por el grupo guanidinio cargado positivamente de un residuo arginilo. Se cree que el mecanismo catalítico de la PEP
carboxiquinasa implica la descarboxilación de OAA para enolpiruvato y la fosforilación de este intermedio transitorio a
PEP (4, 12, 42). Esta propuesta está respaldada por las observaciones de que varias PEP carboxicinasas exhiben OAA
descarboxilasa (OAA f piruvato + CO2) y actividades similares a la piruvato quinasa (2-4). Los cambios relativamente
menores en Km para OAA y Vmax para las enzimas mutadas indican claramente que Lys256 no realiza una función
esencial para la actividad descarboxilasa de OAA de la carboxinasa PEP de S. cereVisiae. Sin embargo, es obvio que el
cambio de Lys256 a Arg, Ala o Gln condujo a modificaciones activas del sitio que afectan esta actividad, una situación
similar a la reportada para una variante Asp268Asn de la carboxinasa PEP de E. coli, que ha aumentado la actividad de
descarboxilasa OAA (45 ) Tomando estos resultados junto con la ausencia de actividad similar a la piruvato quinasa y la
alteración sustancial de la actividad PEP carboxiquinasa normal de los mutantes Lys256, concluimos que Lys256
desempeña una función esencial en la transferencia de fosforilo en la carboxinasa PEP de S. cerevisiae.