Sunteți pe pagina 1din 17

Caracterizarea interacțiunilor

oligonucleotide – ligand prin


electroforeză capilară
Cuprins

INTRODUCERE 17

STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII 19

I. Distrofia musculară de tip 1 21

1. Mecanism genetic 22

2. Forme clinice și abordări terapeutice 22

II. Metode pentru studiul interacțiunilor dintre acizi nucleici și liganzi 25

1. Tehnici de analiză în amestec 26

2. Tehnici separative 27

III. Electroforeza capilară pentru screeningul de liganzi ai acizilor nucleici 29

1. Electroforeza capilară – istoric și concepte generale 29

2. Metodologie pentru screeningul de liganzi ai acizilor nucleici 33

3. Tehnici de electroforeză capilară utilizate în studiile de bioafinitate 34

3.1. Electroforeza capilară zonală 36

3.2. Electroforeza capilară de afinitate 36

3.3. Tehnica Hummel-Dreyer 37

3.4. Tehnica de analiză frontală 38

3.5. Tehnica picului vacant 38

3.6. Electroforeza de afinitate combinată cu tehnica picului vacant 39

4. Tipuri de interacțiuni ai acizilor nucleici analizate prin electroforeză capilară 39

4.1. Interacțiuni de tip acizi nucleici-proteine 39

4.2. Interacțiuni de tip acizi nucleici-molecule mici 41

4.3. Interacțiuni de tip acizi nucleici-acizi nucleici 44

5. Analiza datelor 45

CONTRIBUȚIE PERSONALĂ 47

I. Ipoteza și obiective generale 49

II. Studiul nr. 1 – Familiarizarea cu tehnicile moderne de electroforeză capilară, prepararea


probelor și analiza datelor. Studiu de caz pe separarea ionilor anorganici 51

1. Obiective 51

2. Introducere 51
3. Materiale și metode 53

3.1. Reactivi 53

3.2. Aparatură 54

3.3. Descrierea metodei 55

4. Rezultate și discuții 56

4.1. Tamponul de lucru 56

4.2. Parametrii de detecție 60

4.3. Validarea metodei 61

4.4. Analiza unor probe reale 63

5. Concluzii 65

III. Studiul nr. 2 – Dezvoltarea unei metode de electroforeză capilară pentru screeningul unor agenți
terapeutici 67

1. Obiective 67

2. Introducere 67

3. Materiale și metode 70

3.1. Reactivi 70

3.2. Electroforeza capilară 70

3.3. Electroforeza capilară de afinitate și estimarea constantelor de legare 71

3.4. Electroforeza capilară pentru determinarea stoichiometriei 72

4. Rezultate și discuții 73

4.1. Pentamidina ca și ligand model pentru stabilirea condițiilor electroforetice 73

4.2. Screeningul unei librării de liganzi 76

4.3. Estimarea stoichiometriei 78

5. Concluzii 80

IV. Studiul nr. 3. Selecția, sinteza și purificarea unor fragmente de ADN și ARN relevante
pentru distrofia musculară 81

1. Obiective 81

2. Introducere 81

3. Materiale și metode 83

3.1. Reactivi 83

3.2. Camera de electroforeză preparativă pe gel: asamblare și condiții electroforetice 83


3.3. Sistemul de electrodializă 87

3.4. Tratamentul gelului și măsurarea concentrației ADN-ului 90

3.5. Selecția și sinteza probei de ADN 90

4. Rezultate și discuții 95

4.1. Electroforeza preparativă pe gel 95

4.2. Electrodializa 98

5. Concluzii 100

V. Studiul nr. 4 - Dezvolatarea unei metode de electroforeză pe gel pentru studiul


integrității acizilor nucleici 101

1. Obiective 101

2. Introducere 101

3. Materiale și metode 102

3.1. Reactivi 102

3.2. Electroforeza capilară pe gel 102

4. Rezultate și discuții 103

4.1. Tampon și compoziția gelului 103

4.2. Tipul injecției 105

4.3. Efectul concentrației tamponului 106

4.4. Aditivi organici 106

4.5. Testarea unei probe de ARN 107

5. Concluzii 108

VI. Studiul nr. 5 – Screeningul unor noi liganzi utilizând probele de acizi nucleci nou sintetizați 109

1. Obiective 109

2. Introducere 109

3. Materiale și metode 110

3.1. Reactivi 110

3.2. Electroforeza capilară 111

3.3. Electroforeza capilară de afinitate și determinarea constantei de legare 112

4. Rezultate și discuții 113

4.1. Pentamidină 114


4.2. EBAB 115

4.3. Polimer de guanidină policarbonat 117

5. Concluzii 119

VII. Concluzii generale și remarci 121

VIII. Originalitatea tezei și contribuții la stadiul actual al cunoașterii 123

REFERINȚE 125

Keywords.
distrofie miotonică tip 1
screeningul de liganzi
electroforeză capilară de afinitate
pentamidină
EBAB
polimer de guanidină carbonat
sinteza țintelor de ARN
sinteza țintelor de ADN
electroforeză preparativă pe gel
purificare prin electrodializă

INTRODUCTION
Distrofia miotonică de tip 1 este o maladie genetică non-poliglutaminică al carei
mecanism este legat de expansiunea tripletului CTG la nivelul genei DMPK. Afectează în
special muschii striați (miotonie, hipotonie, distrofie musculară), prezentând o variabilitate
mare inter-pacient. Alte simptome includ cataractă, hipersomnie, oboseală accentuată,
anormalități de conducere la nivelul inimii, tulburări respiratorii și endocrine.
Mecanismul patologic nu este complet elucidat, dar se presupune că se datorează în
principal expansiunii (CTG) n la nivelul genei DMPK, care este transcrisă în ARN (CUG) n.
Această secvență de ARN va adopta o structură de tip ”ac de păr” la nivelul nucleului celulei
formând foci care vor sechestra molecule mici și proteine. Toxicitatea poate fi atribuită
sechestrării factorilor de maturare ca MBLN1 și CUBP, rezultând în maturarea incompletă a
ARN-ului mesager și sinteza defectoasa a unor proteine de tip canale de clor.
În prezent nu există tratament pentru această maladie, dar anumite abordări sunt
investigate. Aceastea includ: suprimarea repetiției CTG, suprimarea lanțului toxic de ARN,
distrugerea complexului proteină-ARN și supraexprimarea factorilor de maturare
sechestrați.
Ipoteza de pornire a acestei teze a fost că electroforeza capilară de afinitate poate fi
utilizată pentru screeningul eficient al unui număr mare de liganzi și descoperirea unora cu
potențial terapeutic în distrofia musculară. Datele brute obținute sunt utilizate pentru
calcularea constantelor de legare și estimarea stoichiometriei dintre liganzi si țintele de ADN
sau ARN, estimând în acest fel eficiența lor.
STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII
Această parte a tezei este alcătuită din trei capitole. Primul capitol descrie
particularitațile distrofiei musculare de tip 1, cu mecanismul genetic și formele clinice,
menționându-se totodată principalele direcții terapeutice testate până în prezent.
Al doilea capitol prezintă tehnicile generale pentru studiul interacțiunilor dintre acizii
nucleici și liganzi și particularitățile fiecăreia. Aceste tehnici pot fi împărțite în două
categorii: tehnici în amestec și tehnici separative. Tehnicile în amestec includ metodele
spectroscopice, dializa competitivă și ultracentrifugarea. În acest caz, analiza este făcută pe
soluția totală și compoziția generală a amestecului este evaluată.
Tehnicile separative includ cromatografia de lichide și electroforeza, în special
electroforeza capilară. Cu toate că HPLC a fost prima tehnică separativă utilizată pentru
determinarea constantelor de legare, electroforeza capilară este de mare interes deoarece
necesită volume mai mici de probe și tampon de lucru.
Al treilea capitol prezintă un scurt istoric al electroforezei capilare și principiile de
bază ale acesteia. În prezent, există 6 tipuri de tehnici electroforetice pentru determinarea
constantei de legare, cu nivele diferite de similaritate și care pot fi utilizate în diferite tipuri
de studii de bioafinitate (proteină-medicament, proteină-proteină, proteină-acid nucleic).
Acestea sunt: electroforeza capilară zonală (CZE), electroforeza capilară de afinitate (ACE),
analiza frontală (FA), tehnica picului vancant (VP), electroforeza de afinitate a picului vacant
(VACE) și tehnica Hummel-Dryer(HD). În funcție de tehnica folosită, datele se pot extrage
din aria picului (VP, HD, CZE), înalțimea platoului (FA) sau din modificarea timpului de
migrare (ACE, VACE).

CONTRIBUȚIA PERSONALĂ
Această parte a tezei conține cinci studii distincte. Primul studiu a fost realizat pentru
acomodarea cu diferitele tehnici electroforetice, prepararea probelor și tipurile de analiză a
datelor. În acest scop a fost realizat un studiu de caz pe separarea unor ioni anorganici.
Metoda dezvoltată a fost propusă ca alternativă la tehnicile ion cromatografice, fiind
utilizată cu succes pentru separarea și cuantificaea unor ioni anorganici mici din apa potabilă
din fântânile din împrejurimile orașului Cluj-Napoca. Datele obținute au fost procesate prin
analiză multivariată (analiza componentei principale) pentru identificarea unor modele sau
corelații intre originea probei și compoziția chimică a acesteia, putându-se oferi astfel soluții
pentru managementul și monitorizarea poluării.
În cel de-al doilea studiu, se prezintă dezvoltarea unei metode eficiente și rapide de
electroforeză capilară pentru identificarea unor potențiali compuși activi cu aplicabilitate în
distrofia musculară de tip 1.
Această metodă, coroborată cu alte teste in vitro și in vivo, poate fi utilizată pentru
îmbunătățirea fluxului de lucru în screningul liganzilor, economisind timp, reactivi și
reducând costurile. O metodă de electroforeză capilară de afinitate, utilizând o capilară
acoperită dinamic cu PEO și tampon HEPES la pH=7.4 a fost propusă. În aceste condiții s-au
evaluat un total de 13 liganzi, dintre care antibiotice și alte molecule mici. Trei liganzi,
neomicina, pentamidina și un analog de pentamidină, EBAB, au manifestat activitate față de
molecula țintă de ARN (CUG) 50, confirmând rezultatele deja prezente în literatură. Cu toate
că neomicina a prezentat cea mai buna activitate, EBAB rămâne candidatul principal
deoarece prezintă activitate și in vivo, menținând o toxicitate celulară redusă.
În al treilea studiu s-a evaluat un flux de lucru pentru sinteza eficientă la nivel de
laborator a unor fragmente de acizi nucleici cu scopul de a fi utilizate în studii de bioafinitate.
O cameră de electroforeză preparativă a fost testată pentru purificarea unui fragment de
ADN (CTG)95. Fragmentul de ADN, are un număr mare de repetiții CTG, iar sinteza a fost
realizată prin amplificare în E. coli. După sinteză și extracție, plasmida conținând fragmentul
de interes a fost digerată cu două enzime de restricție. Produsul de digestie obținut
(aproximativ 5 mL) după diluție) a fost purificat utilizând camera de electroforeză
preparativă. Timpul total de purificare a fost în jur de 3.5 ore, fiind de 5-6 ori mai eficientă
decât electroforeza convențională pe gel. (comparând randamentul cu 2 sisteme
electroforetice care pot purifica împreună 500 plasmidă/pe oră.
În urma electroforezei, fragmentele de ADN au fost complet separate și extrase din
bucățile de gel utilizând o cameră de electrodializă home-made. Randamentul total mediu al
sistemului de electrodializa a fost estimat ca 83% utilizând ADN de somon.
În al patrulea studiu este prezentată dezvoltarea și optimizarea unei metode de
electroforeză pe gel ca și alternativă la electroforeza pe gel convențională, cu scopul de a fi
utilizată pentru evaluarea integrității și calității acizilor nucleici înainte de a fi folosiți la
studii de bioafinitate. Utilizând injecția amplificată în câmp (FASI), în loc înjecția
electrocinetică, s-au putut atinge limite de detecție și cuantificare pentru detecția UV directă
comparabile cu cele din electroforeza pe gel convențională cu agenți intercalanți.
Datele obținute au arătat că cei mai importanți factori în optimizarea metodei de
electroforeză capilară pe gel sunt compoziția gelului, compoziția și concentrația tamponului
și prezența aditivilor organici. Folosind un tampon Tris-borat mM la pH 8.3, dextran 2M Da
10% și glicerol la o concentrație de 10%, s-au putut separa parțial fragmentele de ADN dintr-
o scară de ADN comercială, iar cu o optimizare suplimentară s-ar putea putea separa
complet. S-a mai observat că natura și concentrația tamponului pot influența profilul liniei
de bază și a zgomotului de fond. Natura gelului și a concentrației modificatorului organic au
un efect crucial asupra rezoluției și timpului de migrare a analiților. Tipul injecției
(electrocinetică vs FASI) este esențial în atingerea limitelor detecție și cuantificare dorite. O
optimizare adițională ar putea face această metodă CGE utilă sau chiar superioară
electroforezei pe gel convenționale pentru studierea integrității acizilor nucleici.
În cel de-al cincilea capitol, modelul maladie a fost îmbunătățit utilizând ținte de acizi
nucleici mai diverse si cu lungimi similare cu cele prezente în boală. Dintre liganzii testați,
doar trei (pentamidină, EBAB, GuPol) au manifestat afinitate față de țintele (CUG) 95 și
(CTG)95. Cu toate că în general toți cei trei liganzi au avut afinitate atât față de ARN cât și de
ADN, unii au manifestat selectivitate selectivă față de unul. Spre exemplu, pentamidina și
EBAB au selectivitate crescută față de ținta de ARN, pe când GuPol a prezintă afinitate mai
ridicată față de ADN.
În ceea ce privește interacțiunea liganzilor cu cele două ținte de ADN, plasmidă
linearizată și fragmentul pur (CTG)95, se pot observa două tendințe. Pentamidina și GuPol au
afinitate mai ridicată față de plasmida linearizată comparativ cu fragmentul (CTG)95,
sugerând și prezența interacțiunilor non-specifice. Pe de altă parte, afinitatea EBAB este
similară față de cele două fragmente de ADN, sugerând interacțiuni non-specifice reduse.

CONCLUZII GENERALE ȘI REMARCI


Metoda ACE dezvoltată s-a dovedit a fi o alternativă robustă și eficientă la tehnicile
convenționale de screening ai potențialilor agenți terapeutici în distrofia musculară de tip 1.
Experimentele au confirmat unele rezultate prezente în literatură pentru pentamidină și
neomicină, subliniind doi noi liganzi eficienți, EBAB și polimerul de carbonat de guanidină,
cel din urmă fiind o moleculă complet nouă.
Această lucrare demonstrează că ACE poate fi utilizată cu succes pentru screeningul
unor agenți terapeutici pentru DM1, permițând evaluarea unui număr mare de liganzi într-
un timp scurt cu consum redus de reactivi.

ORIGINALITATEA TEZEI ȘI CONTRIBUȚIILE SPECIFICE LA STAREA CURENTĂ A


CUNOAȘTERII
1. Dezvoltarea unei metode de afinitate pentru screeningul unor molecule cu
potențial terapeutic în distrofia musculară de tip 1
2. Designul unui protocol simplificat și a unui model in vitro pentru screeningul
potențialilor agenți terapeutici pentru distrofia musculară de tip 1
3. Screeningul eficient a unei librării de liganzi pentru DM1 și confirmarea
activității pentamidinei și neomicinei pentru prima dată prin electroforeză
capilară
4. Descoperirea a doi liganzi noi cu potențial terapeutic în DM1, unul fiind o
moleculă complet nouă
5. Dezvoltarea unei metode simple, eficiente și ieftine pentru sinteza și purificarea
acizilor nucleici la scală de laborator
6. Designul și construcția unei camere electroforetice simple pentru purificarea
acizilor nucleici la scală de laborator
7. Designul și construcția unui sistem de electrodializă simplu pentru extracția
eficientă a acizilor nucleici din gelul de agaroză după purificare
8. Dezvoltarea unei metode de electroforeză capilară pe gel cu scopul de a
investiga integritatea acizilor nucleici și urmărirea principalilor factori care
influențează rezoluția și limitele de detecție
9. Utilizarea unei abordări multidisciplinare implicând metode din chimia
analitică, microbiologie și biologie molecular
Characterisation of oligonucleotide –
ligand interaction by capillary
electrophoresis
Table of contents

INTRODUCTION 17

STATE OF THE ART 19

I. Myotonic dystrophy type 1 21

1. Genetic mechanism 22

2. Clinical forms and therapeutic approaches 22

II. Methods for studying nucleic acids ligand interactions 25

1. Mixture based techniques 26

2. Separation based techniques 27

III. Capillary electrophoresis for nucleic acids ligand screening 29

1. Capillary electrophoresis – history and general concepts 29

2. Methodology for nucleic acids ligand screening 33

3. CE techniques for bioaffinity studies 34

3.1. Capillary zone electrophoresis (CZE) 36

3.2. Affinity capillary electrophoresis (ACE) 36

3.3. Hummel-Dreyer (HD) technique 37

3.4. Frontal analysis (FA) technique 38

3.5. Vacancy peak (VP) technique 38

3.6. Vacancy affinity capillary electrophoresis (VACE) 39

4. Types of interactions involving nucleic acids analyzed by CE 39

4.1. Nucleic acid-protein interactions 39

4.2. Nucleic acid-small ligand (small molecules) interactions 41

4.3. Nucleic acid–nucleic acid interactions 44

5. Data analysis 45

PERSONAL CONTRIBUTION 47

I. Hypothesis and general objectives 49

II. Study no.1 - Familiarizing with modern CE techniques, sample preparation and data analysis. A case
study on inorganic ions separation 51

1. Objectives 51

2. Introduction 51
3. Material and methods 53

3.1. Reagents 53

3.2. Instruments 54

3.3. Method description 55

4. Results and discussions 56

4.1. Running buffer 56

4.2. Detection parameters 60

4.3. Method validation 61

4.4. Analysis of real samples 63

5. Conclusions 65

III. Study no. 2 - Development of an affinity capillary electrophoresis procedure for drug screening 67

1. Objectives 67

2. Introduction 67

3. Materials and methods 70

3.1. Reagents 70

3.2. Capillary electrophoresis 70

3.3. Affinity capillary electrophoresis and the assessment of binding constant 71

3.4. Capillary zone electrophoresis for stoichiometry determination 72

4. Results and discussions 73

4.1. PTMD as a model ligand to set up ACE conditions 73

4.2. Screening of a small library of ligands 76

4.3. Estimation of the interaction stoichiometry 78

5. Conclusions 80

IV. Study no. 3 - Selection, synthesis and purification of DNA and RNA relevant to DM1 81

1. Objectives 81

2. Introduction 81

3. Materials and methods 83

3.1. Material and reagents 83

3.2. Preparative gel electrophoresis chamber: system assembly and purification conditions 83

3.3. Electrodialysis device 87


3.4. Gel treatment and DNA concentration measurement 90

3.5. Selection and synthesis of the DNA target probe 90

4. Results and discussions 95

4.1. Preparative gel electrophoresis 95

4.2. Electrodialysis 98

5. Conclusions 100

V. Study no. 4 - Development of a capillary gel electrophoresis method to study the integrity of nucleic
acids 101

1. Objectives 101

2. Introduction 101

3. Materials and methods 102

3.1. Reagents 102

3.2. Capillary gel electrophoresis 102

4. Results and discussions 103

4.1. Buffer and sieving matrix composition 103

4.2. Injection type 105

4.3. Effect of the buffer concentration 106

4.4. Organic additives 106

4.5. Testing a RNA sample 107

5. Conclusions 108

VI. Study no. 5 - Screening of potential ligands using the newly synthesized nucleic acid targets 109

1. Objectives 109

2. Introduction 109

3. Materials and methods 110

3.1. Reagents 110

3.2. Capillary electrophoresis 111

3.3. Affinity capillary electrophoresis and the assessment of binding constant 112

4. Results and discussions 113

4.1. Pentamidine 114

4.2. EBAB 115


4.3. Guanidine polycarbonate polymer 117

5. Conclusions 119

VII. General conclusions and remarks 121

VIII. Originality of the thesis and specific contribution to the current state of knowledge 123

REFERENCES 125

Keywords.
myotonic dystrophy type 1
ligand screening
affinity capillary electrophoresis
pentamidine
EBAB
guanidine carbonate polymer
RNA target synthesis
DNA target synthesis
preparative gel electrophoresis
electrodialysis purification

INTRODUCTION
Myotonic dystrophy type 1 is a non-polyglutamine genetic disorder whose
mechanism is related to the CTG expansion at the site of the DMPK gene. It affects mainly the
muscle functions (myotonia, hypotonia, muscular dystrophy) and has a wide interpatient
variability. Other symptoms include cataract, hypersomnia, fatigue, conductivity
abnormalities, respiratory problems and endocrinal dysfunctions.
The pathological mechanism is not completely elucidated yet but implies the (CTG)n
repeat expansion which is transcribed into toxic RNA with (CUG)n repeats. This RNA
sequence will adopt a hairpin structure in the cell nucleus forming RNA foci which
sequestrate small molecules and proteins. The toxicity can be attributed to the sequestration
of splicing factors such as MBLN1 and CUBP, resulting in RNA mis-splicing and defective
protein synthesis.
For the moment, there is no available treatment for the disease, but several
approaches are currently investigated. Some of these include: suppressing the repeat
expansion in DNA, suppressing the toxic RNA and/or its structural hairpin, targeting the
protein-RNA interactions and overexpressing the sequestered splicing factors.
The hypothesis of the study was that affinity capillary electrophoresis can be used
efficiently for the screening of a large number of ligands with therapeutic potential in
myotonic dystrophy type. The obtained raw data will be used calculate the binding constants
and stoichiometry of the ligands vs. the DNA/RNA targets and to estimate their efficiency.
STATE OF THE ART
This part of the thesis is made up of 3 chapters. The first chapter describes
particularities of myotonic dystrophy type 1 including genetic mechanism and clinical forms,
along with some of the therapeutic approaches that were tested until now.
The second chapter presents the general techniques employed for the study of nucleic
acids – ligand interactions and particularities. These techniques can be roughly divided in
two categories: mixture-based techniques and separation-based techniques. The mixture-
based techniques include: spectroscopy, competition dialysis and ultracentrifugation. The
analysis is done in solution and complete composition of the system is evaluated.
Separation based techniques include liquid chromatography and electrophoresis,
mainly capillary electrophoresis. While HPLC was one of the first separative technique for
the determination of binding constants, CE is a good alternative due to its low sample and
buffer requirements.
The third chapter begins with a short history of capillary electrophoresis and its core
principles and phenomenon. There are currently six types of CE techniques sharing various
levels of similarity, that can be used for the determination of binding parameters in
bioaffinity studies (i.e. drug-protein, protein-protein, protein-nucleic acid, etc.): capillary
zone electrophoresis (CZE), affinity capillary electrophoresis (ACE), frontal analysis
techniques (FA), vacancy peak technique (VP), vacancy affinity electrophoresis (VACE) and
Hummel-Dreyer technique (HD). Depending on the employed technique, the binding
information can be extracted from the peak area (VP, HD, CZE), the height of the peak or
plateau (FA) and from the change of the migration time (ACE, VACE).

PERSONAL CONTRIBUTION
This part of the thesis encompasses five studies. The first study was performed in
order get used to the various capillary electrophoresis techniques, sample preparation and
various types of data analysis. It was done as a case study on the separation of inorganic ions.
The developed CZE method, was proposed as an alternative to ion chromatographic
techniques and was successfully employed for the fast separation and quantification of small
inorganic ions present in drinking water from wells from the surroundings of Cluj-Napoca,
Romania. The obtained results were further processed using multivariate analysis (Principal
Component Analysis) to identify any existing patterns, correlations between the sample’s
chemical composition and its geographical origin, which eventually could offer multiple
applications in water quality management and pollution monitoring.
In the second study, it is presented the development of a fast and efficient CE
screening method the identification of new potentially active compounds for DM1 treatment.
The method, in conjunction with other in vitro and in vivo tests, may be used to improve the
workflow of ligand screening, saving time, costs and materials. An ACE method using a
dynamically coated capillary and HEPES buffer at pH 7.4 as background electrolyte was
proposed, simulating physiologically relevant experimental conditions. A total of 13 ligands,
including antibiotics and other small molecules, were screened. Only three ligands,
neomycin, PTMD and a PTMD analogue, EBAB, exhibited high affinity for the CUG50 RNA
repeat motif. Even though neomycin shows the highest affinity confirming some of the
previously published data, EBAB remains the prime drug candidate due to its high affinity
for the CUG probe, while maintaining a low cellular toxicity
In the third study was evaluated a general workflow for the efficient synthesis and
cost-effective, lab-scale purification of high amounts of specific nucleic acid fragments
intended for use in affinity studies. A home-made working electrophoresis chamber was
tested for the recovery of significant amounts of pure DNA fragment (CTG repeat) in the
pathology of myotonic dystrophy type 1. Since the targeted DNA fragment contained a
relatively high number of repeating units, for higher yields bacterial amplification using E.
coli was employed. After synthesis and extraction, the plasmid containing the fragment of
interest was double digested using appropriate restriction enzymes.
The obtained digestion product (measuring around 5 mL after dilution) was purified
using the home-made preparative chamber in just two runs. The total purification time
totaled around 3.5 hours and should be 5-6 times more efficient compared to using a classical
gel electrophoresis system (estimated by comparing with 2 classical gel electrophoresis
systems that can together purify about 500 μg plasmid/per hour).
After electrophoresis, the two DNA fragments were completely separated and the gel
pieces containing the fragment of importance were easily retrieved using a DIY
electrodialysis system. The average yield of electrodialysis system estimated using salmon
DNA was 83%.
In the fourth study it is presented the development and optimization of a capillary gel
electrophoresis method as alternative to conventional slab gel electrophoresis for evaluation
of nucleic acids’ quality and integrity prior to bioaffinity studies. By using field amplified
sample stacking instead of the conventional electrokinetic injection in CGE with UV
detection, limits of detection and quantification comparable or even lower to those
encountered by using a staining dye may be achieved.
The obtained data showed that the most important factors in method optimization of CGE are
the sieving matrix, buffer composition and concentration and the addition of organic additives. Using
a Tris-borate buffer 200 mM at pH 8.3, dextran 2M Da as sieving matrix and 10% glycerol as additive
the partial resolution of the DNA fragments of a commercial ladder was achievable and potential
optimization could fully resolve the DNA fragments.
The performed experiments highlighted several important parameters essential for the
method’s resolution and the achieved limit of detection. The nature and concentration of the buffer
can influence the profile of the baseline and the acquired noise during UV detection. The nature of
the sieving matrix and the organic additive has a crucial effect on the resolution and the migration
time of the analytes. The type of injection (electrokinetic vs. FASI) is essential in achieving low limits
of detection and quantification. Thus, additional optimization steps on these variables could make
this CGE method useful and superior to gel electrophoresis for the assessment of nucleic acids
degradation prior to bioaffinity studies or during the digestion of the plasmid .
In the fifth chapter, the model of the disease was improved by using more diverse target
probes and with lengths closer to the ones in the disease. Out of several ligands, only three
(pentamidine, EBAB, GuPol) manifested affinity towards the (CUG) 95 and (CTG)95 targets.
While in general all the three ligands had affinity towards both the RNA and DNA targets,
some manifested interesting selectivity towards one. For example, pentamidine and EBAB
had higher affinity towards the RNA target, while the GuPol preferred the DNA target.
Regarding the interaction of the ligands with the two targets of DNA, the linearized
plasmid containing the (CTG) 95 fragment and the pure (CTG)95 fragment, again two trends
could be observed. Pentamidine and GuPol had a higher affinity for the linearized plasmid
compared to the pure (CTG) 95, suggesting a high degree of non-specific interactions. On the
other hand, the affinity of EBAB towards the two DNA targets was similar, showing that the
non-specific interactions in this case was negligible.

GENERAL CONCLUSIONS AND REMARKS


The developed method proves to be an efficient and robust alternative to the
conventional analytical methods currently used for the screening of potential therapeutic
agents for DM1. The experiments confirmed some of the results already known for
pentamidine and neomycin, while highlighting two efficient ligands, namely EBAB and
guanidine carbonate polymer. The latter being first time tested for this purpose.
This work demonstrates that ACE can be successfully used for drug screening in DM1,
allowing a large number of ligands to be evaluated in a short period of time with minimum
consumption of reagents.

ORIGINALITY OF THE THESIS AND SPECIFIC CONTRIBUTION TO THE CURRENT STATE


OF KNOWLEDGE
1. The development of an affinity capillary method for the screening of drug
candidates in myotonic dystrophy type 1
2. The design of a streamlined protocol and in vitro model for the screening of drug
candidates in myotonic dystrophy type 1
3. The efficient screening of a library of ligands for DM1 and the confirmation of
activity of pentamidine and neomycin for the first time by affinity capillary
electrophoresis
4. The discovery of two ligands with potential therapeutic effect in MD1, one
previously unknown
5. The development of a simple, efficient and cost-effective protocol for the
synthesis and purification of large scale nucleic acids in the lab
6. The design and construction of a simple and cost-effective preparative gel
electrophoresis chamber for the purification of nucleic acids at lab scale
7. The design and construction of simple and easy to assembly electrodialysis
system for the extraction of nucleic acids from the agarose gel after purification
8. Development of a capillary gel electrophoresis for the fast estimation of nucleic
acids purity and integrity prior to the affinity tests and investigation of the main
factors influencing the resolution in capillary gel electrophoresis
9. Use of a multidisciplinary approach involving methods from analytical chemistry,
microbiology and molecular biology