Enzimología y procesos fermentativos

Integrantes: Bermúdez, S., Sánchez, M., Pérez A., Reinoso, A.

Tema: Inhibidores enzimáticos

Introducción
Las enzimas son catalizadores biológicos que actúan acelerando las reacciones
químicas celulares, además son eficientes y selectivas. Su importancia radica en que se
encuentran en todos los procesos bioquímicos permitiendo su compatibilidad con la vida
(Nelson & Cox, 2009). En las enzimas, una sustancia química llamada sustrato se une a
un sitio específico, denominado sitio activo y genera productos que se pueden utilizar
posteriormente en otras reacciones. El funcionamiento eficiente de la enzima depende de
algunas condiciones tales como pH, temperatura, cantidad de sustrato, inhibidores. Para
observar la eficiencia de las enzimas se estudia la cinética de estas, es decir la velocidad
en la que trabaja la enzima en la cantidad de sustrato que está disponible (Berg, Tymoczko
& Stryer, 2007).

Por otro lado, los inhibidores son moléculas o iones que pueden unirse a la enzima o
al complejo enzima sustrato y modificar la catálisis de esta (Berg, Tymoczko & Stryer,
2007). Son fundamentales en el funcionamiento celular, porque son considerados como
un mecanismo de control de los sistemas biológicos. Los inhibidores enzimáticos
naturales están implicados en la regulación del metabolismo de la célula (Collado,2014).
Los inhibidores pueden encontrarse entre dos grupos grandes los cuales son reversibles e
irreversibles. Siendo los reversibles los que se disocian con mayor rapidez del complejo
enzima-inhibidor, mientras que los irreversibles se disocia muy lentamente (Berg,
Tymoczko & Stryer, 2007).

Existen varios tipos de inhibidores reversibles entre los cuales están los competitivos,
el inhibidor se une al sitio activo de la enzima formando un complejo enzima-inhibidor,
evitando que el sustrato se una con la enzima, pero la enzima no puede unirse con los dos
al mismo tiempo. Al existir el complejo enzima-inhibidor se disminuye la velocidad de
catálisis reduciendo la proporción de moléculas de enzima que quedan ligadas al sustrato.
Otra clase son los no competitivos, en la cual el inhibidor y el sustrato pueden unirse en
diferentes centros de unión y disminuyen el número de recambio del enzima, en lugar de
disminuir la proporción de moléculas enzimáticas que se han ligado al sustrato (Berg,
Tymoczko & Stryer, 2007).

Existen varios métodos para poder determinar la cinética de las enzimas. Uno de ellos
es el método de Michaelis-Menten el cual nos da una gráfica, que linealizándola nos
permite encontrar algunos parámetros cinéticos como km y velocidad máxima (Berg,
Tymoczko & Stryer, 2007). En presencia de un inhibidor la cinética también se verá
afectada por lo cual su linealización también; esta va a depender del tipo de inhibidor
presente en la reacción.

Metodología
Para la realización de esta práctica se utilizó el programa Enzyme Assay y se
escogió la enzima 2. Se colocaron las condiciones óptimas para la catalisis de la enzima
en los siguientes campos como pH de incubación, tiempo de incubación, cantidad de
enzima, temperatura de incuba, todos estos obtenidos de la practica anterior. Al proceder
a hacer la gráfica incluimos la actividad de inhibidores. Como existe la posibilidad de
elegir entre dos inhibidores diferentes se los escogió uno a la vez con concentraciones de
125- 1000 mmol/L.
Se tomó en cuenta el punto en donde la cantidad de producto final era mayor, con
estos parámetros se pudo generar una curva de Michaelis-Menten. El producto obtenido
para cada concentración de sustrato, se lo dividió para el tiempo de incubación óptimo y
se obtuvo la velocidad. Se realizó la linealización de la ecuación de Michaelis-Menten
mediante parámetros cinéticos por el método de Lineweaver-Bark. Para esto se invirtió
la ecuación, obteniendo como resultado una ecuación que graficará 1/v en función de
1/[S].

Se encontraron los valores de km y Vmáx a partir de Excel, y para cada

concentración de cada inhibidor o se usó la línea de tendencia con sus respectivos valores
cinéticos. Con esta ecuación se obtuvo los valores de vmáx y el valor de km, mediante la
comparación de la ecuación (1) ya que las dos ecuaciones son de tipo 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏.
 1 𝑘𝑚 1
(1) = +
𝑉𝑜 𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆] 𝑉𝑚𝑎𝑥

Se despejaron los valores de Vmáx y km de las ecuaciones para después

compararlos y poder identificar qué clase de inhibidor es el que actúa en cada caso.

Resultados
Las figuras 1 y 2 muestran el comportamiento de la concentración de sustrato
versus el producto final formado. Al aplicar los diferentes inhibidores se obtuvieron las
siguientes figuras.

50
45
40
Producto formado

35
30
25
20
15
10
5
0
0 50 100 150 200 250
Concentración de sustrato

sin inhibidor 125mM 250mM 500mM 1000mM

𝑚𝑚𝑜𝑙
Figura 1. Enzima 2 en presencia del inhibidor A en concentraciones 125 – 1000 𝐿
 50
45
40
35
Producto formado

30
25
20
15
10
5
0
0 50 100 150 200 250
Concentración de sustrato

sin inhibidor 125 mM 250 mM 500 mM 1000 mM

𝑚𝑚𝑜𝑙
Figura 2. Enzima 2 en presencia del inhibidor B en concentraciones 125 – 1000 𝐿

En las figuras 3 y 4 se observa el comportamiento del inverso del sustrato versus

el inverso de la velocidad de la enzima 2 en presencia las diferentes concentraciones de
los inhibidores A y B.
5.50
5.00
4.50
4.00
3.50
1/v

3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.0030 0.0080 0.0130 0.0180 0.0230 0.0280 0.0330 0.0380
1/[S]

Sin inhibidor 125mM 250mM 500mM 1000mM

Figura 3. Curva de doble recíproca de la enzima 2 en presencia del inhibidor A

 80.00

70.00

60.00

50.00
1/v

40.00

30.00

20.00

10.00

0.00
0.00350 0.00850 0.01350 0.01850 0.02350 0.02850 0.03350 0.03850
1/[S]]

sin inhibidor 125 mM 250 mM 500 mM 1000 mM

Figura 4. Curva de doble recíproca de la enzima 2 en presencia del inhibidor B

Tabla 1. Enzima 2 en presencia del inhibidor A

Sin inhibidor [125mM] [250mM] [500mM] [1000mM]
Km 45.454 50.82 68.02 89.28 119.33
Vmáx 1.13 1.15 1.137 1.135 1.072

Tabla 2. Enzima 2 en presencia del inhibidor B

Sin inhibidor [125mM] [250mM] [500mM] [1000mM]
Km 50 20.0 20 20 17.54
Vmáx 1.1414 0.1483 0.0788 0.0417 0.0209

Discusión
En las figuras 1 y 2 se puede evidenciar que la velocidad de formación de producto
final disminuye a medida que se incrementa la concentración del inhibidor. La figura que
se obtiene con este comportamiento es una curva hiperbólica. Al comprar las dos figuras
se puede observar que el inhibidor B tiene mayor efecto en el producto final que el
inhibidor A dado que la velocidad disminuye casi de manera inmediata.
Para poder observar el efecto de la cinética enzimática se realiza la curva de doble
recíproco de Lineaweaver-Burk. Esta curva representa el inverso del sustrato versus el
inverso de la velocidad inicial y nos ayuda a determinar la manera en la que actúa un
inhibidor en una enzima (Hames & Hooper, 2014). En la figura 3 se observa que esta
curva tiende a intersecarse en un punto. Al analizar los valores de Vmáx, tabla 1, se puede
evidenciar que tienen valores similares, por otro lado, los valores de Km tienden a
incrementarse. Según Hames & Hooper (2014) este comportamiento es propio de un
inhibidor competitivo. El comportamiento de un inhibidor competitivo según Hames &
Hooper (2014) se puede observar en la curva de doble recíproco, pues la pendiente del
inhibidor es mayor que la pendiente del sustrato sin inhibidor. Si analizamos la figura 3
se observa un comportamiento similar al mencionado por el autor. Un inhibidor
competitivo es similar estructuralmente al sustrato de la enzima, por ende, este inhibidor
compite con las moléculas del sustrato para unirse al sitio activo, pero la enzima no puede
unirse al inhibidor y al sustrato al mismo tiempo (Hames & Hooper, 2014; Berg,
Tymoczko & Stryer, 2007).
Por otro lado, en la figura 4 se puede observar que las curvas en diferentes
sustratos son casi paralelas, por lo que no pueden unirse en un punto en concreto.
Observando los datos de la tabla 2, los valores de Km como de Vmáx son diferentes y no
se puede observar un comportamiento bien definido en estos. Al no tener una relación en
estos, se puede decir que este inhibidor es un inhibidor irreversible. No lo consideremos
como un inhibidor no competitivo ya que el Km no se mantiene igual (Hames & Hooper,
2014; Nelson & Cox, 2009).
Conclusión
Conocer los tipos de inhibidores nos permite conocer el mecanismo para
recuperar la funcionalidad de una enzima. Un inhibidor competitivo muestra una
variación en un Km al disminuir su valor, mientras que su Vmáx es constante. Por otro
lado, una variación en el Km (disminución al agregar un sustrato) y Vmáx no forma parte
de los inhibidores reversibles. Los valores de Km y Vmax se pueden obtener gráficamente
a través del diagrama de doble recíproco de Lineaweaver-Burk.
Referencias
Berg, J., Tymoczko, J., & Stryer, L. (2007). Bioquímica (6ta ed.). Barcelona: Reverté.

Collado, M. (2014) Diseño y Síntesis de Compuestos Orgánicos Bioactivos. OCW-

Universidad de Málaga. Recuperado de: https://ocw.uma.es/ciencias/diseno-y-
sintesis-de-compuestos-organicos-
bioactivos/miasignaturaocw/docs/Tema5_02_doc.pdf
Hames, D., & Hooper, N. (2014). Bios. Notas instantáneas de bioquímica. México D.F.:
McGraw-Hill Interamericana. Recuperado a partir de
http://ZV4FY5PR5L.search.serialssolutions.com/?V=1.0&L=ZV4FY5PR5L&S
=JCs&C=TC0001491075&T=marc&tab=BOOKS
Nelson, D. L., Cox, M. M., (2009). Lehninger principios de bioquímica. Barcelona:
Omega.