Yonis Hernández

Arroz (Oryza sativa L.)

Trujillo et al. (1999). Quemazón bacteriana del arroz.
Enfermedad de importancia mundial.
Variedad Cimarrón – Colombia.
La bacteria posee numerosos hospedantes, malezas de
la zona.
Se introdujo por caminos verdes-productores
comprometidos.
 TRABAJO DE DIAGNÓSTICO
 Tiempo de dedicación al problema.

 Recursos disponibles (equipos, reactivos),

laboratorio.

 Preparación del investigador, experiencia.

 Información científica disponible.

Diagnóstico Presuntivo
 Proceso confirmativo

Diagnóstico preciso.
 TRABAJO DE DIAGNÓSTICO

Síntomas no son concluyentes o

determinantes

Pudriciones, agallas, abióticas

(herbicidas, hormonas, altas
temperaturas, radiación, abonamiento,
etc.).

Un mismo síntoma Virus patógenos.

 BACTERIAS QUE PRODUCEN DIFERENTES
QUEMAZONES

 Xanthomonas phaseoli variante fuscans

 Pseudomonas syringae pv. syringae

 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola

 Curtobacterium flaccumfaciens

“Compenetración con el cultivo”

DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES BACTERIANAS

Importancia:
 Venezuela fuerte escuela micológica.

Trabajo de Diagnóstico:
 Tiempo de dedicación
 Preparación del individuo
 Dotación de equipos

Venezuela después de 1980:

 Postgrado
 Nuevos laboratorios
 Personal
 SINTOMATOLOGÍA Y
TOMA DE MUESTRAS

 Descripción detallada de síntomas.

 Identificación exacta del hospedante.

 Recolección de la muestra.

 Examen preliminar al microscopio óptico.

 Flujo bacteriano (ooze).

 Tinción de rojo congo.

 PASOS EN EL DIAGNÓSTICO

1.- Observación de síntomas

2.- Aislamientos

3.- Obtención de cultivo puro

4.- Pruebas de patogenicidad

5.- Reaislamiento

6.- Identificación
Técnicas utilizadas para
observar el signo de las
bacterias.
Técnicas utilizadas para
observar el signo de las
bacterias.

Microcorrida: Se utiliza en el
caso de manchas foliares.
Un pequeño corte de la zona
de avance de la mancha
foliar es colocado en un
portaobjeto se le agrega
uuna gota de agua y es
observado bajo microscopio.
El flujo bacteriano se
observa como una pequeña
nube descargándose desde
el tejido vegetal.
 DETALLES EN LA REALIZACIÓN DE LOS
AISLAMIENTOS
 Tejido foliar (manchas) g desinfección?

 Órganos suculentos (tubérculos, cormos, etc.) alcohol

y flamear

 Medio de cultivo: fresco menos de 4 días, no película

de agua sobre la placa, 20-30ºC.
 DETALLES EN LA REALIZACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS

Observación diaria de la placa

Patógenos se observan rápidamente: 36-72 h.

Excepciones: X. albilineans, X. fragaria, X.

ampelina requieren 4-14 días
B. andropogonis: 4 días

Agentes problemas: Drosophila, ácaros,

hormigas
 PROCEDIMIENTO GENERAL PARA REALIZAR UN
AISLAMIENTO

 Utilización de tubos + buffer fosfato salino (todo

estéril) se agrega corte de lesión (parte aparente
sana + parte aparente con síntomas) 30 – 60 minutos,
siembra en zig-zag, o dilución y siembra.

 Método del macerado.

Diluciones- agotamiento
 Método del punzado.
Estriado por agotamiento

Púrpuras

Rosadas
Amarillas

Naranja
s
 INOCULACIÓN DE DE PLANTAS

 Cultivo puro g Postulados de Köch.

 Cultivo semisólido versus cultivo líquido, cultivo

joven menos de 48 h.

 Concentración de inóculo: Aspersión:107-108

Inyección: 105-106, Heridas.

 Pre-acondicionamiento.

 Post-acondicionamiento: Edad de la planta,

gramíneas, uso de carborundum
 DIAGNÓSTICO PRESUNTIVO

Problema inmediato/inversión de
dinero/la solución no puede esperar.

 Basado en síntomas/Investigador tiene

conocimiento del cultivo y experiencia de
laboratorio.

 Confirmación: Flujo bacteriano, Rojo Congo,

KOH al 3%, otras.
 DIAGNÓSTICO PRECISO

 Hospedante presenta la enfermedad

bacteriana por primera vez en la zona.

 Enfermedad bacteriana nueva.

 Enfermedad nueva, no referencia.

 Diagnóstico preciso

Hernández y Trujillo, 1990, batata

Xanthomonas campestris nuevo patovar.

Harpenden Laboratory.

1991 = Ocumo = Xanthomonas campestris

pv. zantedeschia.

Bacteriosis del lechoso = Soto et al.,1996

= Erwinia sp.
 INSTITUCIONES QUE PUEDEN COLABORAR EN LA
IDENTIFICACIÓN DE ESTAS ENFERMEDADES EN
VENEZUELA

 INIA-MARACAY
 FAGRO-UCV

UCLA
IVIC
SUPER INVESTIGADOR
 Signos de las bacterias (Zoogleas)

Zooglea saliendo de los haces vasculares de una papa afectada por

Ralstonia solanacearum.
Signos de las
bacterias
(Zoogleas)

Zooglea saliendo
de los haces
vasculares de
una planta de
tomate afectada.
 Síntomas

Manchas Tizones
Cancros

Marchitamiento Hiperplasias Pudriciones

Figure 1. Síntomas Figure 2. Tumores en
característicos de agallas rodajas de zanahoria
de corona en albaricoque inoculadas con
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium rubi en Agalla de corona en plantas
frambuesa (Rubus spp.). de tomate: Agrobacterium
tumefaciens
Agalla de corona en uva (Agrobacterium vitis)
 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS
FITOPATÓGENAS
Pruebas morfológicas, fisiológicas y bioquímicas
Aislamiento – Cultivo puro--- Pruebas de patogenicidad

Serología
Electroforesis
Análisis de ácidos grasos
Pruebas de ácidos nucleicos
Secuenciación del ARN
Bacteriófagos
 ESQUEMA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACERIAS FITOPATOGENAS
REQUISITO = FORMA DE BASTON, (PATOGENICA) (POSTULADOS DE KOCH)
REACCIÓN DE GRAM O KOH AL 3%
- +
Rhodococus
Arthrobacter
Xanthomonas, Pseudomonas, Erwinia, Pantoea, Agrobacterium, Grupo Coryneformes, Clavibacter
Ralstonia, Acidovorax, Burkholderia, Pectobacterium Streptomyces, Clostridium, Curtobacterium
Bacillus Leifsonia

Producción de Colonias amarillas en YDCA

+ - Presencia de Endospora
Pseudomonas,Pantoea, Agrobacterium,
Xanthomonas, Ralstonia, Acidovorax, Burkholderia, + -
Pantoea Erwinia, Pectobacterium, Dickeya,
Brenneria Clostridium, Bacillus Grupo Coryneformes,
Streptomyces
Requerimientos de O2 Requerimientos de O2
Crecimiento aeróbico
+ - + -
+ - Micelio aéreo
Pseudomonas,
Erwinia, Pantoea + -
Xanthomonas Pantoea Pectobacterium Bacillus Clostridium
Agrobacterium, Ralstonia,
Brenneria Streptomyces Grupo
Acidovorax, Burkholderia
Dickeya Coryneformes

Producción de Agallas en plantas de tomate,

berenjena, pimentón
+ - - Pudrición de la papa
+
Agrobacterium Pseudomonas
Pectobacterium
, Ralstonia, Erwinia,
Brenneria
Acidovorax, Pantoea
Dickeya
Burkholderia Brenneria

Elaborado por Gustavo Trujillo y

Fluorescencia en medio B de King Yonis Hernández
+ -
Esquema basado en la experiencia del
Pseudomonas Ralstonia, Acidovorax, Burkholderia, Laboratorio y revisión de literatura
Pseudomonas
 Requerimientos de oxígeno

Forma de la bacteria ADRF

 Hidrólisis del almidón Pudrición de la papa

Medio SX Medio Tween 80

 Medio TZC

Prueba
de
ELISA

Inmunofluorescencia Electroforesis
 Bacteriofagos

Observe las placas de lisis

Xanthomonas.

Pseudomonas

Erwinia Agrobacterium
8. Métodos basados en DNA

DNA
genes conocidos o
fragmentos de secuencia
Son biomoléculas y función desconocida
relacionadas con un rasgo
genético o correspondientes
a una región del genoma
Extracción de DNA nuclear y separación por
electroforesis en gel de agarosa

DNA
Nuclear
 PCR convencional

Extracción y purificación

Amplificación de un
Detección de los segmento del genoma
fragmentos amplificados
Ribosomas

La estructura del 16S está Esta característica ha hecho que

compuesta por cuatro los ribosomas sean
dominios de RNA que llevan considerados como un reloj
información genética biológico y como un parámetro
correspondientes a universal para la clasificación de
regiones conservadas y los organismos vivos.
variables de genoma.
 ANTISUEROS Y KITS DE ELISA

 Se pueden comprar en el exterior.

 American Type Culture Collection, USA.

 Sanofi, Francia.

 En USA muchas entidades y universidades.

 El Commonwealth Mycological Institute, Inglaterra.

 LAS NUEVAS TECNOLOGIAS A NIVEL DE
PUERTO GARANTIZAN CONFIABILIDAD

Pruebas serológicas: tecnologías rápidas

y precisas.

Precipitación:
tubos, microprecipitación
Difusión en agar/Doble difusión.
ELISA.
Inmunofluorescencia
 LAS NUEVAS TECNOLOGIAS A NIVEL DE PUERTO GARANTIZAN CONFIABILIDAD

El estado debe fomentar la producción de

todas las tecnologías necesarias en el país
por razones evidentes:

Alto costo de estos insumos comprados en

el exterior.

Aumenta la dependencia tecnológica.

Retrasa la preparación de nuestro personal.

 SITUACIÓN EN VENEZUELA

Leguminosas
Caraota (Phaseolus vulgaris L.) Xanthomonas phaseoli, X.
phaseoli var. fuscans
 Todas las semillas en el país están contaminadas con
esas bacterias.
 Continua entrando material del exterior.
 Se vende grano por semilla.
 Se puede generalizar a todas las leguminosas
comestibles.
 Se ha informado en diferentes oportunidades a las
autoridades competentes.
 SITUACIÓN EN VENEZUELA

Hortalizas
Conocimiento al respecto.

 1986. Caso lechuga variedad White Boston.

 Caso tomate, Xanthomonas vesicatoria.

Pseudomonas syringae pv. syringae
 Interrogante: ¿Qué sucede con la semilla
importada?
Pino (2001) Erwinia rhaponticii en repollo
Erwinia amylovora var. alfalfae en alfalfa

1998-2002 Semilla de hortalizas estudiadas

resultaron infectadas con bacterias a diferentes
niveles.

Cebolla de Quíbor, estado Lara.

10 materiales diferentes infectados
Xanthomonas campestris, Pseudomonas,
Pectobacterium, Erwinia
GRACIAS