Sunteți pe pagina 1din 21

Caracterizarea microbiomului subgingival al femeii

gravide afro-americana
Irene Yang, Anna K. Knight, Anne L. Dunlop, and Elizabeth J. Corwin

ABSTRACT
Obiectiv: generarea datelor preliminare despre microbiomul subgingival al femeilor gravide afro-americane
pentru calcularea puterii pentru un studiu viitor mai mare și pentru a explora asociațiile dintre microbiomul,
inflamația parodontală, și nașterea prematură.
Proiect: Studiu pilot descriptiv comparativ.
Cadru: Zona urbană din sud-estul Statelor Unite.
Participante: Treizeci și patru de femei afro-americane în al treilea trimestru de sarcină.
Metode: Pe baza evaluării vizuale, participanții au fost plasați în două grupuri: gingie sănătoasă și gingivită.
Probele de saliva au fost analizate pentru interleukina-1 b (IL-1b), metaloproteinază-8 matricială (MMP-8)
și proteină C-reactivă (CRP). ADN-ul a fost extras din probe de placă subgingivală și au fost ampliconi
secventiati din a patra regiune hipervariabilă.
Rezultate: Nu am găsit diferențe între diversitatea microbiomului general între gingia sănătoasă (n = 22) și
cea afectata de gingivită (n = 12), deși au fost găsite diferențe semnificative între taxonii bacterieni prezenți.
Grupul gingivitei a avut niveluri mai mari de IL-1b salivar și MMP-8, în timp ce CRP nu a fost diferit între
grupuri. Per total diversitatea microbiomului a fost asociată pozitiv cu nivelul CRP. Nu am găsit relații
semnificative între microbiomul subgingival, inflamație parodontală și naștere prematură.
Concluzie: Gingivita în sarcină nu pare să modifice compoziția generală sau diversitatea microbiomului
subgingival, deși diferențele dintre mai mulți taxoni bacterieni sugerează că gingia inflamată la gravide este
asociata cu o perturbare a stabilității microbiomului subgingival. O corelație între abundența bacteriilor și
CRP sugerează, de asemenea, o asociere între microbiom și inflamația sistemică. Aceste descoperiri pot oferi
sprijin pentru cercetările viitoare cu privire la modul în care microbiomul oral și evoluția bolii parodontale
la gravidă se leagă de efectele adverse ale sarcinii.

Sănătatea orală este obligatorie pentru sănătatea generala și bunăstarea organismului (Petersen,
2009). Femeile gravide sunt în special sensibile la modificări în sănătate orală din cauza unei varietăți de
factori, inclusiv schimburi hormonale care contribuie la inflamație și scăderea imunocompetenței(Steinberg,
Hilton, Iida, & Samelson, 2013); modificări ale obiceiurilor alimentare, cum ar fi frecvente gustări sau
consum crescut de alimente bogate în carbohidrați și care favorizează degradarea; acizi stomacali din greață
și vărsături contribuie la fracturarea smalțului dentar; și scăderea probabilității de a solicita îngrijiri
stomatologice în timpul sarcinii (Detman, Cottrell și Denis-Luque, 2010). În plus, evaluarea și promovarea
sănătatii orale sunt adesea trecute cu vederea de furnizorii prenatali de servicii medicale (George și colab.,
2012). În Statele Unite, se estimează că aproape jumătate din toți adulții mai mari de 30 de ani au parodontită
(Eke și colab., 2015). Gingivita, cea mai frecventă boală orală în sarcină, are o prevalență de 50% la 70%
(Anil și colab., 2015). De obicei, simptomele gingivitei în sarcină apar în primul trimestru (Giglio, Lanni,,

1
& Giglio, 2009) și sunt prezente ca margini gingivale rosii ,umflate și sângerare care apare la cea mai mică
provocare (Han, 2011).
Gingivita, care reprezintă forma mai blândă a bolii parodontale, este o afectiune inflamatorie care
afectează structurile moi și dure care susțin dinții; este un răspuns imuninflamator direct la microorganisme
care populează biofilmul (placa) la interfață dintre suprafața dintelui și gingie (Lang, Scha¨ tzle, & Lo¨e,
2009). La baza acestui lucru condiția este o interacțiune complexă între aceste microorganisme și sistemul
de apărare al gazdei. Ca răspuns la agenți patogeni microbieni este distrugerea țesutului parodontal , mediat
de gazdă este cauzată de hiperactivitatea leucocitelor și generarea de citokine, eicosanoide și
metaloproteinaze matriceale(MMPs; AlMoharib și colab., 2014). Acești biomarkeri ai procesului inflamator
pot fi găsiti în lichidul crevicular gingival și in întreagă salivă (AlRowis și colab., 2014). Pentru unii,
gingivita progresivă duce la parodontită, care este o boală inflamatorie polimicrobiană ce presupune
distrugerea ireversibilă a sprijinului țesutului moale și os și, în cele din urmă, conduce la pierderea dinților
(Lang și colab., 2009). Incidența parodontitei la gravide este cuprinsă între 5% și 20% (Polyzos și colab.,
2010).
Boli parodontale și nașterea prematura
În 1996, Offenbacher și colab. au raportat că femeile cu boală parodontală au avut de șapte ori
creșterea riscului de naștere prematură. De atunci, rezultatele altor câteva studii au arătat o asociere între
boala parodontală și nasterea prematura. De exemplu, după controlul pentru alți factori de risc cunoscuți ai
nașterii premature, asociații puternice au fost găsite între boala parodontală și / sau inflamație și naștere
prematură spontană (Guimara ~ s, Silva- Mato, Miranda Cota, Siqueira, & Costa, 2010; Khader și colab.,
2009; Macedo și colab., 2014; Stadelmann et al., 2014). Cu toate acestea, dovezile sunt nu clare (Hunter &
Yount, 2011). În recenzii critice ale literaturii, autorii au avertizat ca aceasta asociere ar trebui să fie luată în
considerare cu un grad ridicat de variabilitate în studiul populației, recrutare și evaluare(Agueda,
Echeverrı´a, & Manau, 2008; Idei &Papapanou, 2013). Mai mult, tratamentul bolii parodontale în timpul
sarcinii a obținut rezultate mixte (Jeffcoat și colab., 2011;Macones și colab., 2010; Polyzos și colab., 2010).
Aceste inconsistențe sugerează un decalaj în cunoaștere în ceea ce privește mecanismele de bază observate
între boala parodontala și nașterea prematură.
Studiul în cursă a microbiomului

Femeile afro-americane prezintă un risc crescut pentru nașterea prematură și boala parodontală
comparativ cu femei albe non-hispanice (Martin,Hamilton, Osterman, Driscoll, & Drake, 2018). Diferențe
socioeconomice legate de practicile prenatale orale de igienă și utilizarea serviciului stomatologic în timpul
sarcinii există (Boggess et al., 2010; Eke,Dye, Wei, Thornton-Evans, & Genco, 2012) și sunt preocupări
majore de sănătate publică. Câtiva factori structurali si de comportament pot fi la locul de muncă, inclusiv
resurse limitate de îngrijire a sănătății (Lee, Milgrom, Huebner, & Conrad, 2010), lipsa de înțelegere despre
importanța prenatală ,practici preventive de sănătate orală (Marchi, Fisher- Owens, Weintraub, Yu, &
Braveman, 2010) și respectarea slabă a recomandărilor medicilor stomatologi și furnizorii de servicii de
sănătate maternă în ceea ce privește îngrijirea sănătății orale (Lee și colab., 2010; George și colab., 2012).
Pentru a investiga rata mare de naștere prematură la femei afro-americane și preventia confundărilor care
pot rezulta din comparații în cadrul grupurilor rasiale,sunt necesare studii care sunt concentrate pe risc în
cadrul unui subgrup rasial.
Legătura dintre boala parodontală și nașterea prematură

O teorie privind legătura de bază dintre boala parodontală și nasterea prematura se referă la un
mecanism imuno-inflamator. Sarcina sanatoasa pare să aibă faze de inflamație unică care corespund cu

2
implantarea și dezvoltarea fetală (Mor, Aldo, &Alvero, 2017). Aceste faze inflamatorii pot fi perturbate de
stimuli externi precum infecțiile (Mor et al., 2017) care plasează fătul și sarcina la risc (Han, 2011). Deși
infecțiile vaginale care apar în timpul sarcinii sunt gândite să fie cea mai comună sursă de inflamație
sistemică (Romero, Dey, & Fisher, 2014), infecțiile parodontale care inițiază inflamația sistemică sau agenții
infecțioși care se translocă efectiv prin fluxul sanguin până la uter pot de asemenea crește riscul în timpul
sarcinii (Madianos, Bobetsis, & Offenbacher, 2013). In perioada dintre implantarea cu succes și debutul
travaliului, femeia, placenta și fătul sunt simbiotici, iar mediul predominant este mutat spre o stare
antiinflamatoare (Moret al., 2017) mediata de citokine antiinflamatorii cum ar fi interleukina (IL) -4, IL-5,
IL-10 și IL-13 și stimularea granulocitelor-macrofage. Această schimbare este considerată critică pentru a
preveni respingerea alogrefei fetale (Challis și colab., 2009). Dezlegarea acestui status antiinflamator ar fi
reprezentat printr-o schimbare către citokine proinflamatorii reprezentate de IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15,
IL-18, interferon-g și factorul de necroză al tumorii (Challis și colab., 2009). O creștere a citokinelor
proinflamatorii cauzate de boala parodontala ar putea atunci să joace un rol important în această regregare a
starii imunologice normale în timpul sarcinii (Han, 2011). Susținand această teorie, concluziile obținute din
studii care arată că femeile gravide cu boli parodontale au niveluri crescute de proteina plasmatica C-reactiva
(CRP), care indică un inflamatie sistemica crescuta (Sharma, Ramesh și Thomas, 2009). Dovada sugerează,
de asemenea, că boala parodontală este asociata cu un nivel crescut de proinflamatoare citokine în circulația
periferică (Andrukhov și colab., 2011).
Microbiomul Subgingival

În ciuda conexiunii suspectate între boala parodontală și nașterea prematură, cunoștințele curente
despre mediul bacterian subgingival cel mai strâns legat de boala parodontala la gravide sunt incomplete. Ca
rezultat, capacitatea noastră de a înțelege relația sa cu inflamația și pentru a evalua sau trata semnele precoce
ale infecției parodontale/ inflamație ca potențial factor de risc modificabil pentru nașterea prematură este
limitat. Se crede că mai mulți agenți patogeni joacă roluri în infecția parodontală și inflamație în indivizi
nepregătiți, inclusiv Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tanerella forsythia (Lamont, Koo și
Hajishengallis, 2018) și Prevotella intermedia (Lima și colab., 2015). Dovada implică aceste organisme în
boala parodontala in sarcina, dar este incoerenta (Adriaens, Alessandri, Spo¨ri, Lang, &Persson, 2009;
Carrillo-de-Albornoz, Figuero,Herrera, & Bascones-Martı´nez, 2010; Novakși colab., 2008; Vettore, Leao,
Leal, Tarife și Sheiham,2008). Acest lucru se poate întâmpla din cauza metodologiilor mai vechi în care
numai periopatogeni specifici au fost vizați dar nu erau suficient de capabile pentru identificarea altor sute
specii de bacterii în cavitatea bucală (Dewhirst și colab., 2010).
Cercetari mai recente despre microbiomul oral bazat pe secvențierea generației următoare în
populații care nu sunt însărcinate sugerează că înțelegerea noastră despre infecție / inflamație trebuie să
treacă de la un accent pe agenții patogeni individuali la contextul ecologic al unui anumite comunitati
microbieme(Abusleme et al., 2013; Duran-Pinedoși colab., 2014; Griffen et al., 2012). De asemenea, o stare
de inflamație parodontală poate reprezenta o schimbare în echilibrul ecologic general al florei microbiene.
Lipsa de cunoștințe despre microbiomul subgingival din sarcina limitează înțelegerea inflamatiei
parodontale ca factor de risc potențial modificabil pentru nastere prematura,mai degrabă decât apariția
agenților patogeni individuali. Având în vedere acest lucru, este esențial să investigați microbiomul
subgingival al femeilor însărcinate pentru identificarea asociațiilor dintre microbioame, inflamație și naștere
prematură. Acest lucru este în special cazul femeilor afro-americane care prezintă un risc crescut de boală
parodontală și nașterea prematură (Eke și colab., 2015; Martin și colab., 2018). Prin urmare, obiectivul
principal al acestui studiul pilot urma să genereze date preliminare despre caracterizarea microbiomul
subgingival al femeilor afro-americane gravide care ar putea fi folosit pentru a calcula puterea pentru un

3
studiu mai mare. Obiectivul secundar a fost să exploreze asociații între microbiomul subgingival matern,
indicatori inflamatori ai bolii parodontale și naștere prematură.
Metode
Proiect

Am folosit un design descriptiv comparativ pentru acest studiu pilot și a obținut aprobarea din partea
comitetetului de revizuire instituțională la Universitatea Emory înainte de începerea activităților de studiu.
Setare și probă

Am înscris 34 de femei afro-americani însărcinate din două clinici prenatale situate în Atlanta, GA,
între decembrie 2016 și Februarie 2017. Participanții au fost recrutați dintr--o investigație continua a
asociațiilor printre microbiomul oral, vaginal și intestinal ale unei femei în timpul sarcinii și la nașterea
prematură (Corwin și colab., 2017). Criterii de incluziune pentru un studiu mai mare al părinților a inclus
autoidentificarea ca Afro-american, cu vârsta cuprinsă între 18 și 40 de ani, capacitate de a vorbi și citi limba
engleză, gestatie singulara,numarul de probleme medicale cronice și fără utilizarea de medicamente fara
reteta. Recrutarea femeilor participante la acest studiu pilot a avut loc în timpul celui de-al treilea trimestru
al sarcinii când participanții în studiul părintesc au fost întrebați dacă ar fi, de asemenea, dispuși să permită
inspecția țesut gingival al acestora , colectarea salivei si probe de microbiom subgingival. Pentru a fi incluse,
femeile trebuiau să aibă cel puțin 20 de dinți naturali și nici o curățare dentară profesională în ultimele 3
luni.
Lipsa de cunoștințe despre microbiomul subgingival din sarcina limitează înțelegerea inflamatiei
parodontale ca factor de risc potențial modificabil pentru nasterea prematura.
Rezultate din două studii recente efectuate în populații nepregătite (Abusleme și colab., 2013;Griffen
et al., 2012) au indicat că dimensiunile efectului pentru diferențele dintre indicii Shannon și Chao (folosit
pentru a măsura bogăția și egalitatea comunități microbiene) variază de la mari la foarte mari (.82–1.4).
Analiza puterii estimează din G * Versiunea 3.1 a software-ului de putere (Faul, Erdfelder, Buchner, &
Lang, 2009) au indicat că 40 participanții în total (20 pe grup) au fost obligați să detecteze dimensiuni mari
de efect cu o putere de 80%. Dat fiind constrângerea de 1 an a mecanismului de finanțare și natura pilot a
acestui studiu, am stabilit că un studiu cu 30 de participanți în total (15 pe grup) ar produce un efect suficient
de mare cu dimensiuni cu 70% putere pentru ca datele de bază sa sprijine proiectarea viitorului studiu de
microbiom subgingival.
Proceduri

Trei dinți (# 25, 28 și 30) din cadranul din dreapta jos din gura fiecărui participant au fost evaluati
pentru semne vizuale de inflamație gingivală folosind Indicele Gingival Modificat (IMG; Lobene,
Weatherford, Ross, Lamm, & Menaker, 1985) de un examinator unic instruit. Scorurile IMG pentru au fost
mediate pentru trei dinți, iar participanții cu media scorurilor IMG mai mici sau egale cu 1 au fost plasat în
grupul sănătos; cei cu scoruri mai mare de 1 au fost repartizați in grupul gingivitei. Probele de salivă și placă
subgingivală au fost apoi colectate de la participanții ambelor grupuri și au fost evaluate vizual folosind
metoda punctului de hârtie steril (Zhou & Li, 2015). Placa supragingivală a fost eliminată pentru prima dată
folosind tifon steril și fiecare suprafata de dinte păstrat uscat cu rulouri de bumbac în timp ce un punct steril
de hârtie este introduse in buzunarul fiecărui dinte timp de 20 secunde. Cele trei puncte de hârtie au fost
reunite și a fost plasat imediat un tampon MoBio de 750 ml conținut în tuburi sterile de mărgele MoBio

4
(MoBio Laboratories, Inc, Carlsbad, CA). Saliva și probele de placa au fost plasate pe gheață și transportate
pentru depozitare la 80 C până la pregătirea pentru analiză.
Izolarea ADN și gena ARN ribozomal 16S
Pregătirea și secvențarea bibliotecii.
Specimenele au fost trimise la Microbiome Insights (Vancouver,BC , Canada), lideri în domeniul
de cercetare al microbiomului, pentru extracție și secvențiere. Secrețile de pe punctele de hârtie au fost
omogenizate, iar ADN-ul a fost izolat folosind ADN-ul de sol MoBio PowerMag Kit de izolare. Ribosomul
16S ,foarte conservat, Gena ARN (rRNA), care este foarte folosită sa caracterizeze diversitatea taxonomică
în comunitatea microbiana, a fost reacția în lanț a polimerazei amplificat cu două coduri primare cu bare
duble,a patra regiune hipervariabilă conform protocol conturat de Kozich, Westcott, Baxter,Highlander, și
Schloss (2013). Concentrații normale de 1 până la 2 ng / ml (conform specificațiilor normalizării Sequal
Prep kit) au fost utilizate. Ampliconii au fost secvențiați cu o Illumina MiSeq folosind 250 de baze paired-
end kit versiunea 2. Alinierea Mothur a fost utilizată pentru a alătura citirilor. Au fost perechi de baze
ambigue în citirile unite filtrate și o lungime maximă de 275 de baze perechi au fost specificate.
S-a abordat potențialul contaminării prin clasificarea ADN-ului amplificat din probe și dintre cele
patru șabloane si kituri de extracție au fost prelucrate la fel ca exemplarele. Două controale pozitive
constând din ADN SUP05 clonat au fost de asemenea incluse (numărul de copii ¼ 2 * 10 ^ 6). OTU-urile
au fost considerate contaminante și erau înlăturate dacă abundența lor medie în controale au atins sau au
depășit 25% din media lor abundentă în exemplare. O medie de 12.382 de citiri filtrate de calitate au fost
generate pe probă. Setul de date rezultat a avut 4.248 unice
Analize de imunitate salivară.
Probele de salivă au fost utilizate pentru analiza imuno-testului pentru a determina concentrațiile de
IL-1b, MMP-8 șiCRP. Analize imunosorbente legate de enzime pentru L-1b, CRP (Salimetrics, Carlsbad,
CA) și MMP-8 (Thermo Fisher Scientific, Hampton, NH) și programe software adecvate, compatibile au
fost utilizate pentru a genera rapoartele de date brute. Toate probele de studiu au fost analizate în
conformitate cu liniile directoare ale producătorilor.
Măsuri

MGI se bazează pe inspecția vizuală, elimină nevoia de sondare sau presiune și, prin urmare,nu
perturbă placa subgingivală (Lobene)și colab., 1985). Scara indicelui face devreme depistarea și modificările
subtile ale inflamației gingivale detectabile (Lobene și colab., 1985). Acest instrumentul a arătat fiabilitatea
timpurie a modificărilor vizuale ale gingivitei, cu o medie a coeficientului de corelație interrater de .81
(Lobene și colab., 1985). IMG are, de asemenea, o corelație pozitivă(r ¼ .88, p ¼ .0094) cu placă dentară
(Sosa-Jurado și colab., 2014) și satisface criterii pentru un indice gingival specificat în linii directoare ale
Consiliului pentru afaceri științifice(Council on Dental Therapeutics, 1986) și a fost în general acceptat
pentru utilizare în studiile clinice(Ata-Ali și colab., 2015; He, Qu, Chang și Wang,2018; Kinane și colab.,
2015).
Date clinice și demografice

Datele suplimentare au fost obținute de la părintii din date de studiu, inclusiv auto-raportare
clinica(starea fumatului, consumul ilicit de droguri, infecție orala și îngrijire orală prin auto-raportare),
variabile demografice (vârstă, venit,și educație) verificată prin revizuirea registrelor clinice, și vârsta
gestațională la naștere prin fișa clinică de revizuire. Vârsta gestațională la naștere a fost bazată pe ultima

5
menstruație și / sau ultrasonografie înainte de 14 săptămâni de gestație în conformitate cu criterii clinice
standard și naștere prematură definit ca o naștere care a avut loc înainte de 37 de săptămâni de gestație
(Colegiul American de Obstetricieni și ginecologi, 2014).
Analiză

Au fost comparate datele clinice și demografice între grupuri cu utilizarea de teste t independente și
teste chi-pătrate, după caz. Markerii inflamatori au fost în mod normal distribuiti după cum a stabilit Shapiro-
Wilk Test; astfel, funcția logaritmică era obișnuită sa transforme observațiile, după care testele t
independente au fost utilizate pentru a compara cele două grupuri.
OTU, care sunt grupuri de organisme grupate prin asemănarea ADN-ului, au fost agregate în fiecare
rang taxonomic (filon, clasă, ordine, familie, genul și speciile) și cele mai abundente au fost complotate în
funcție de abundența relativă. Generarea de scoruri de diversitate care ar putea fi folosit pentru a calcula
puterea pentru un viitor studiu mai amplu a fost un obiectiv principal al acestui studiu pilot.Diversitatea alfa,
o măsură a diversității speciilor în cadrul unui ecosistem particular, a fost estimat cu indici Chao1 și Shannon
folosind pachetul Vegan R (Oksanen, 2015) pe tabelele abundenței brute OTU după filtrarea
contaminanților. Indicele Chao1 este utilizat pentru a descrie bogăția sau numărul total al speciilor prezente
într-o comunitate (adică cu cât scorul Chao1 este mai mare, cu atât numărul este mai mare de specii prezente
[Lemos, Fulthorpe, Triplett, &Roesch, 2011]). Se folosește indicele Shannon pentru a descrie bogăția cu
egalitate (Magurran,2013). Comunități dominate numeric de una sau câteva specii prezintă un scor Shannon
scăzut, în timp ce comunitățile în care este abundența distribuita în mod egal între specii vor expune
uniformitate mare. Au fost efectuate calcule Chao1 cu 1.000 de permutații la o rarefacție adâncime de 3.000
de citiri. Semnificația diferențelor de diversitate au fost testate cu analiza de varianță (ANOVA). Pentru a
estima diversitatea beta pe eșantioane, OTU care au apărut în mai puțin mai mult de 10% din eșantioane
dintre care doar 3 au fost excluse, apoi au fost calculate indicii Bray-Curtis.
Am vizualizat diversitatea beta, care descrie diferențele dintre eșantioane, folosind ordonarea
multidimensională nonmetrica. Variația în comunitatea structurala a fost evaluată cu ANOVA multivariata
permutationala cu grupa gingivită ca principalul factor fix și folosind 4.999 permutări pentru testarea
semnificației. Am folosit modele generale liniare folosind pachetul DESeq2 (Love,Huber, & Anders, 2014)
pentru determinarea semnificației statistice ale diferențelor în abundența de OTU-uri individuale între
grupuri cu ajustari p folosind metoda lui Benjamin Hochberg(Love et al., 2014). Am investigat asociațiile
dintre scorurile de diversitate alfa, nivelurile tranformate ale indicatorilor biochimici ai bolii
parodontului(IL-1b, MMP și CRP) și varsta gestaționala la nastere (in saptamani) folosind produsul Pearson
-coeficienții de corelație de moment.

Tabelul 1: Sănătate sociodemografică și orală


Caracteristicile participanților (N=34)
Caracteristic frecventa,n (%)
Educaţie
<Finalizarea liceului 4 (11.8)
>Finalizarea liceului 27 (79,4)
Lipsesc 3 (8.8)

6
Sursa de venit
<100% nivel federal de sărăcie 17 (50)
>100% nivel federal de sărăcie 14 (41,2)
Lipsesc 3 (8.8)
Istoric de infecție a gurii / gingiilor
Da 5 (14.7)
Nu 26 (76,5)
Lipsesc 3 (8.8)
Dintii periați în ultimele 2 zile
Da 27 (79,4)
Nu 1 (2,9)
Lipsește 6 (17.6)
Folosit ata dentara în ultima lună
Da 11 (32,4)
Nu 20 (58,8)
Lipsesc 3 (8.8)
Am vizitat medicul stomatolog în ultima lună
Da 3 (8.8)
Nu. 28 (82.4)
Lipsesc 3 (8.8)
Tigarile afumate in ultima luna
Da 2 (5.8)
Nu 32 (24.1)
Lipsesc 1 (2.9)
Alt consum de droguri
Da 1 (2.9)
Nu 33 (97.1)

7
Figura 1. Compoziția taxonomică a celor mai abundente fila din grupele sănătoase și grupule cu gingivite.
Altele reprezintă taxoni neclasificati si mai putin numerosi.

8
Rezultate
Vârsta medie a participanților a fost de 26.03+ _ 5.12 ani. Alte caracteristici sociodemografice și
de sanatate orala ale participanților pot fi găsite în Tabelul 1. Din cei 34 de participanți înscriși, 22 au avut
gingia sănătoasă și 12 au avut semne vizuale de gingivită, după cum este indicat prin scorurile medii ale
IMG mai mare de 1. Nu am găsit nicio diferenta semnificativa între grupuri de vârstă, nivel de venit, nivel
de educație, fumat, alt consum de droguri,infecție orala / a gingiilor raportate sau obiceiuri de îngrijire orală.

Figura 2. Diferențe individuale taxonomice operaționale (OTU) între grupurile sănătoase

și grupurile cu gingivita.

Caracterizarea microbiomului oral în sănătatea parodontala și boala parodontala

Așa cum este ilustrat în figura 1, compararea celor două grupuri la nivelul filonului au aratat o
compoziție generală similară a microbiomului între grupuri. Cu toate acestea, au existat diferențe
semnificative în mai multe OTU care au fost clasificate la genul și nivelul familiei. OTU care aparțineau
genurilor Prevotella și Leptotrichia au fost prevalente la participanții sănătoși, în timp ce OTU-uri care
aparțineau familiei Mogibacteriaceae , genurilor Veionella și Prevotella au fost predominante la participanții
din grupul gingivitelor (p <.01; vezi Figura 2).
Dincolo de descrierea taxonomică a microbiomul subgingival, obiectivul nostru principal a fost
generarea unor scoruri de diversitate care ar fi utilizate pentru a calcula puterea pentru un studiu viitor, mai
mare. Nu am găsit diferențe semnificative în măsurile diversitatii alfa între grupurile din indexul Chao1 sau
Shannon, ceea ce înseamnă că cele două grupuri erau similare în ceea ce privește abundența și egalitatea
OTU în fiecare eșantion (p> .05; a se vedea figura 3).În mod similar, o vizualizare a diversității beta folosind
ordinarea multidimensionala nonmetrică și utilizarea ANOVA multivariabilă permutatională
folosindmatricile la distanță au confirmat că grupurile au fost similare (Pr [> F] ¼ 0,0977; a se vedea figura
4).

9
Figura 3. Nicio diferență semnificativă în diversitatea Chao1 și Shannon alfa între grupuri indică faptul
că cele două grupuri au fost similare în ceea ce privește abundența și egalitatea unităților taxonomice
operaționale din fiecare eșantion.

10
Figura 4. Această diagramă de ordinație multidimensională nonmetrică reflectă

diversitatea beta între grupurile sănătoase și grupurile cu gingivita. Fiecare punct

reprezintă un eșantion de microbiom. Punctele portocalii reflectă probe sănătoase de

grup, iar punctele albastre reprezintă probe de grup cu gingivită. Punctele care se

reunesc împreună reflectă similaritatea. Lipsa grupării indică faptul că sănătos și

comunitățile de gingivite nu sunt foarte diferite unele de altele. Am confirmat acest lucru

statistic cu valoarea R2, care a arătat că procentul de variație între grupuri nu a fost

semnificativ.

11
Asociații dintre microbiomul oral, indicatori biochimici ai bolii parodontale și nașterea prematură

Rezultatele noastre au indicat faptul că participanții la grupul de gingivită au avut niveluri


semnificativ mai mari de IL-1b salivar și MMP-8; nivelurile salivare de CRP nu diferă semnificativ (a se
vedea figura 5). Noi am gasit corelații pozitive moderate până la puternice între toți cei trei markeri
inflamatori salivari (IL-1b, MMP-8 și CRP; vezi Tabelul 2). O asociere slab pozitiva a fost găsită între
diversitatea alfa (Chao1) și CRP (r ¼ .374, p ¼ .029; vezi Figura 6). Nu am găsit nicio relație între vârsta
gestațională la naștere și oricare dintre markerii inflamatori sau diversitate alfa.
Discuţie
În ciuda prevalenței gingivitei în sarcină și asociațiile sale cu nașterea prematură și alte afecțiuni
adverse, se știe puțin despre mediul bacterian subgingival la gravide. Pentru a dezvolta asistența medicala și
intervențiile care pot atenua acest risc, este critic sa înțelegem microbiomul gingivitei sarcinii ,relația sa cu
inflamatia locala și rezultate adverse la naștere. Prin urmare, scopul acestui studiu a fost caracterizarea
microbiomul subgingival al unui mic grup de femei afro-americane gravide la si a genera date preliminare
care ne-ar ajuta in calcularea puterii pentru un studiu mai mare. În plus, ne-am propus să explorăm asocieri
între microbiomul subgingival matern, indicatori inflamatori ai bolii parodontale și naștere prematura.

Figura 5. Nivelurile salivare de interleukină-1b și nivelurile de matrice metaloproteinaza

au fost semnificativ mai mari la grupul de gingivită, în timp ce nivelurile de proteine C

reactive salivare nu au fost diferite semnificativ între grupuri.

Tabelul 2: corelațiile dintre trei markeri inflamatori (N =34)

Marker inflamator 1 2 3

1. Interleukin-1 b - .743 ** .603 **

2. Metaloproteinază matriciala-8 .743 ** - .409 *

3. Proteină C-reactivă .603 ** .409 * -

12
Primele șase fila reprezentate în spațiul subgingival al ambelor grupuri de participanți a fost
Firmicutes,Actinobacterii, Bacteroidete, Fusobactera,Proteobacterii și Spirochaetes. Într-un studiu anterior
asupra populațiilor care nu sunt gravide, cercetătorii au utilizat secvențierea ARNr 16S și au raportat că până
la 96% din bacteriile din gurile noastre aparțin uneia dintre aceste șase fila (Dewhirst) et al., 2010). În linii
mari, sarcină sau gingivita în timpul sarcinii nu pare sa deplaseze compoziția taxonomică a spaţiului
subgingival.
În ciuda acestei asemănări generale, diferențe inviduale ale OTU-uri existau între grupuri
(veziFigura 2). Cele cinci OTU-uri care au diferențiat participanții cu gingia sănătoasă de cei cu semnele de
gingivită au fost toate caracterizate drept taxoni care se găsesc frecvent în cavitatea bucală și conțin specii
care sunt cunoscuti agenți patogeni parodontali sau agenți patogeni oportuniști.De exemplu, genul Prevotella
este cel mai mare genul din Bacteroidetes (phylum Bacteroidetes) et al., 2010) și conține specii precum
Prevotella intermedia care sunt cunoscuti agenți patogeni parodontali(Cobb și colab.2017). Leptotrichia și
Veionella conține specii care se găsesc de obicei în cavitatea bucală și se știe că acționează ca agenți patogeni
oportunisti (Eribe & Olsen, 2017) sau pentru stimularea creșterii altor organisme patogene(Eribe & Olsen,
2017; Knapp și colab.,2017). Deși capacitatea noastră de a trage la nivel de specie concluziile ,acestea au
fost limitate de alegerea noastră de a secventia a patra regiune hipervariabilă a genei 16S ARNr, rezultatele
noastre au confirmat concluziile din studiile contemporane ale microbiomului care au indicat că gingia
bolnavă la femeia gravidă părea să rezulte din tulburări în cadrul ecologiei florei orale existente în mod
normal mai degrabă decât patogeni singulari (Costalonga &Herzberg, 2014).
Aceste tulburări pot duce la schimbări în diversitatea comunităților microbiene care afectează
echilibrul organismelor comensale cu cel al organismelor patogene și sunt asociate cu boala parodontala la
populațiile care nu sunt însărcinate (Cobb și colab.,2017). Diversitatea comunității microbiene poate fi
descrisa în două moduri. Diversitatea Alpha descrie câte OTU-uri sunt prezente într-o comunitate și cât de
uniform sunt distribuite; diversitate beta descrie diversitatea dintre două medii diferite. Chao1 și Shannon
sunt doi indici obișnuiți utilizați pentru a descrie diversitatea în interiorul unei comunitati bacteriene, așa
cum s-a descris anterior. Pe baza descoperirilor din populațiile care nu sunt gravide, diversitatea alfa ar trebui
să fie mai mare la indivizi cu boală parodontală (Abusleme și colab., 2013; Griffen et al., 2012) deoarece
sângerarea gingivală creează o sursă de nutrienți și se adâncesc buzunarele parodontale creeand nișe
anaerobe. Ambii asigură condiții ideale pentru proliferarea mai multor organisme și o diversă comunitate
bacteriană. În ciuda diferențelor din OTU-uri specifice, nu am găsit nicio diferență semnificativă între
diversitate alfa sau beta, între cele două grupuri de participanți, ceea ce sugerează că aceste diferențe
individuale OTU nu au fost suficient de mari să afecteze diversitatea generală a comunității. Acest lucru este
probabil atribuit razei limitate de boală în acest sens deoarece statutul gingival al majorității participanților
a indicat doar o inflamație ușoară.Un alt aspect potențial este cursa participanților. Recent, cercetătorii au
început a elucida divergențe substanțiale în microbiom printre indivizi din diferițirase și etnii (Gupta, Paul
și & Dutta,2017). De exemplu, Mason și colegii (2013) au constatat că 33 din 77 de genuri la nivelul cavitatii
orale difera semnificativ în abundență între persoane negre ne-hispanice, non-hispanice albe, chineze și
hispanice din Statele Unite și că a fost posibil să se identifice etnia unui individ din semnătura microbiomului
subgingival

13
Deși profilul microbiomului femeilor afro-americane din eșantionul nostru nu se distinge clar ca
unic, variații subtile ale abundenței taxonomice probabil au afectat scorurile de diversitate și au contribuit
spre lipsa de diferență între grupuri.
IL-1b și MMP-8 sunt cunoscuți biomarkeri salivari ai bolii parodontale (AlMoharib et al., 2014).
Deoarece boala parodontală reprezintă un proces inflamator însoțit de distrugerea țesutului conjunctiv,
molecule circulante cum ar fi IL-1b și MMP-8 sunt integrale in aceste procese și pot fi detectate în saliva
(Sexton și colab., 2011). S-a arătat că IL-1b funcționează în concert cu alte citokine pentru a regla răspunsul
inflamator localizat în parodontiu (AlRowis și colab., 2014). MMP-8 este o enzimă conducătoare în
distrugerea țesutului la indivizi cu boală parodontală (AlRowis și colab.,2014). Așa cum era de așteptat,
participanții la grupul gingivită au avut niveluri salivare semnificativ mai mari de IL-1b și MMP-8 decât
participanții cu gingia sanatoasa.
În studiul nostru, CRP nu a fost diferit intre grupuri. CRP este produs de ficat și este un marker
sistemic eliberat în faza acută a unui răspuns inflamator (AlMoharib și colab., 2014). CRP ajunge la salivă
prin lichiduk crevicular gingival sau glandele salivare (AlMoharib et al., 2014) și este crescut în saliva
indivizilor cu boală parodontală cronică sau progresivă (Miller și colab., 2010; Shojaee și colab., 2013). De
asemenea, sa arătat că CRP din plasma este crescut gravide cu boală parodontală (Sharma și colab., 2009).
Cu toate acestea, în studiul nostru, poate fi concepută acea gingivită, o formă mai ușoară de boala parodontala
expusa de majoritatea participantilor în grupul gingivitelor, este posibil să nu aibă a declanșat suficient un
răspuns în faza acută la crește nivelul sistemic al PCR (Jain, Gautam și Naseem, 2011).

Figura 6. O corelație slabă și pozitivă între Chao1 (o măsură a diversității alfa) și CRP sugerează că a
crescut bogăția sau abundența microorganismelor din spațiul subgingival ce declanșează un răspuns în
fază acută și crește nivelul CRP.

14
În ciuda acestui fapt, analiza noastră oferă un indiciu care sugerează o asociere între microbiomul
subgingival și inflamația sistemică. Corelația dintre diversitatea CRP și Chao1 sugerează că bogăția crescută
sau abundența de microorganisme din spațiul subgingival declanșează un răspuns în fază acută și crește
nivelurile de CRP . Această constatare importantă sugerează un asociere între microbiomul subgingival în
sarcină și inflamație sistemică, care în cele din urmă poate afecta sănătatea sarcinii. Cu toate ca aceste
rezultate sunt preliminare, indică cu tărie necesitatea investigării ulterioare a microbiomului ca mecanism
explicativ care leagă boala parodontală în sarcină cu rezultate adverse la naștere, cum ar fi nașterea
prematură.
Rezultatele studiului nostru nu au o aplicație directă la practica de asistență medicală sau la
îmbunătățirea rezultatelor sănătății materne a nou-născutului; Însă rezultatele studiului nostru au pus bazele
viitorului, cercetări mai aprofundate care investighează microbiomul oral maternal și relația acestuia cu
sănătatea maternă a nou-născutului. Studiile viitoare de cercetare ale microbiomului sunt importante pentru
cercetători care caută să înțeleagă comportamentul, bazele sănătății materne a nou-născutului și pentru
clinicienii care evaluează direct, educă și îngrijiesc gravide. O înțelegere mai profundă a funcției și
diversității microbilor în gură va informa atât preconcepția cât și educația prenatală cu privire la importanța
comportamentelor de igienă orală și îngrijiri de sănătate orală.Cercetările viitoare pot fi de asemenea
esențiale în domeniul pentru dezvoltarea de noi instrumente și diagnostice care modeleaza evaluarea sănătății
orale prenatale, educație, și orientări de intervenție pentru promovarea unei guri sănătoase și rezultate bune
la naștere.
Limitări

Limitările acestui studiu includ proiectarea pe secțiunea sa transversală și raza limitată a


severitatatii bolii parodontale; este nevoie de investigarea longitudinală a microbiomului oral în sarcină cu
o gama mai larga de boli. Mai mult, poate fi introdusă prejudecata pentru că anchetatorul a efectuat evaluarea
vizuala, atribuirea grupului și colectarea de exemplare. În ciuda acestor limitări, rezultatele acestui studiu
pilot oferă noi informații despre microbiomul subgingival al gravidelor cu gingia sănătoasa și bolnava
Concluzie

Din cauza efectelor modificărilor hormonale ale femeile însărcinate, probabilitatea unui răspuns hiperreactiv
inflamator în sarcină este sporit (Steinberg și colab., 2013). Gingivita în sarcina este o formă precoce a bolii
parodontului care a fost asociată cu nașterea prematura. Descoperirile noastre oferă o descriere inițială a
mediului microbian al spațiului subgingival al femeilor afro-americane în timpul sarcinii și relațiile dintre
microbiomul subgingival, markeri inflamatori ai bolii parodontale și a vârstei gestaționale la naștere.
Informațiile obținute în urma acestui studiu oferă sprijin preliminar pentru cercetările viitoare pentru
investigarea progresiei bolii parodontale la gravide și ajută la explicarea modului în care această boală ar
putea fi legată de rezultatele adverse ale sarcinii.

15
Referinte

Abusleme, L., Dupuy, A. K., Dutzan, N., Silva, N., Burleson, J. A.,
Strausbaugh, L. D., … Diaz, P. I. (2013). The subgingival
microbiome in health and periodontitis and its relationship with
community biomass and inflammation. ISME Journal, 7(5),
1016–1025.
Adriaens, L. M., Alessandri, R., Spo¨ rri, S., Lang, N. P., & Persson, G. R.
(2009). Does pregnancy have an impact on the subgingival
microbiota? Journal of Periodontology, 80(1), 72–81.
Agueda, A., Echeverrı´a, A., & Manau, C. (2008). Association between
periodontitis in pregnancy and preterm or low birth weight:
Review of the literature. Medicina Oral Patologı´a Oral Y Cirugı´a
Bucal, 13(9), E609–E615.
AlMoharib, H. S., AlMubarak, A., AlRowis, R., Geevarghese, A., Preethanath,
R., & Anil, S. (2014). Oral fluid based biomarkers in
periodontal disease: Part 1. Saliva. Journal of International Oral
Health, 6(4), 95–103.
AlRowis, R., AlMoharib, H. S., AlMubarak, A., Bhaskardoss, J., Preethanath,
R., & Anil, S. (2014). Oral fluid based biomarkers in
periodontal disease–Part 2. Gingival crevicular fluid. Journal of
International Oral Health: JIOH, 6(5), 126–135.
American College of Obstetricians and Gynecologists. (2014). Method
for estimating due date. Committee opinion No. 611. Obstetrics
and Gynecology, 124, 863–866.
Andrukhov, O., Ulm, C., Reischl, H., Nguyen, P. Q., Matejka, M., &
Rausch-Fan, X. (2011). Serum cytokine levels in periodontitis
patients in relation to the bacterial load. Journal of Periodontology,
82, 885–892.
Anil, S., Alrowis, R. M., Chalisserry, E. P., Chalissery, V. P., AlMoharib,
H. S., & Al-Sulaimani, A. F. (2015). Oral Health and Adverse
Pregnancy Outcomes. In M. Virdi (Ed.), Emerging trends in oral
health sciences and dentistry. Retrieved from https://www.
intechopen.com/books/emerging-trends-in-oral-health-sciencesand-
dentistry/oral-health-and-adverse-pregnancy-outcomes
Ata-Ali, J., Flichy-Ferna´ndez, A. J., Alegre-Domingo, T., Ata-Ali, F.,
Palacio, J., & Pen˜arrocha-Diago, M. (2015). Clinical, microbiological,
and immunological aspects of healthy versus
peri-implantitis tissue in full arch reconstruction patients: A
prospective cross-sectional study. BMC Oral Health, 15, 43.
https://bmcoralhealth.biomedcentral.com/track/pdf/10.1186/
s12903-015-0031-9
Boggess, K. A., Urlaub, D. M., Massey, K. E., Moos, M.-K., Matheson,
M. B., & Lorenz, C. (2010). Oral hygiene practices and dental
service utilization among pregnant women. The Journal of the
American Dental Association, 141(5), 553–561.
Carrillo-de-Albornoz, A., Figuero, E., Herrera, D., & Bascones-Martı´-
nez, A. (2010). Gingival changes during pregnancy: II. Influence
of hormonal variations on the subgingival biofilm. Journal
of Clinical Periodontology, 37(3), 230–240.
Challis, J. R., Lockwood, C. J., Myatt, L., Norman, J. E., Strauss, J. F., &

16
Petraglia, F. (2009). Inflammation and pregnancy. Reproductive
Sciences, 16(2), 206–215.
Cobb, C. M., Kelly, P. J., Williams, K. B., Babbar, S., Angolkar, M., &
Derman, R. J. (2017). The oral microbiome and adverse pregnancy
outcomes. International Journal of Women’s Health, 9,
551–559.
Corwin, E. J., Hogue, C. J., Pearce, B., Hill, C. C., Read, T. D., Mulle, J.,
& Dunlop, A. L. (2017). Protocol for the Emory University African
American Vaginal, Oral, and Gut Microbiome in Pregnancy
Cohort Study. BMC pregnancy and childbirth, 17(1), 161.
https://bmcpregnancychildbirth.biomedcentral.com/track/pdf/1
0.1186/s12884-017-1357-x
Costalonga, M., & Herzberg, M. C. (2014). The oral microbiome and
the immunobiology of periodontal disease and caries. Immunology
Letters, 162(2), 22–38.
Council on Dental Therapeutics. (1986). Guidelines for acceptance of
chemotherapeutic products for the control of supra gingival
dental plaque and gingivitis. Journal of the American Dental
Association, 112, 529–532.
Detman, L. A., Cottrell, B. H., & Denis-Luque, M. F. (2010). Exploring
dental care misconceptions and barriers in pregnancy. Birth,
37(4), 318–324.
Dewhirst, F. E., Chen, T., Izard, J., Paster, B. J., Tanner, A. C., Yu, W.-H.,
… Wade, W. G. (2010). The human oral microbiome. Journal of
Bacteriology, 192(19), 5002–5017.
Duran-Pinedo, A. E., Chen, T., Teles, R., Starr, J. R., Wang, X.,
Krishnan, K., & Frias-Lopez, J. (2014). Community-wide transcriptome
of the oral microbiome in subjects with and without
periodontitis. The ISME Journal, 1659–1672.
Eke, P. I., Dye, B. A., Wei, L., Slade, G. D., Thornton-Evans, G. O.,
Borgnakke, W. S., … Genco, R. J. (2015). Update on prevalence
of periodontitis in adults in the United States: NHANES
2009 to 2012. Journal of Periodontology, 86(5), 611–622.
Eke, P., Dye, B., Wei, L., Thornton-Evans, G., & Genco, R. (2012).
Prevalence of periodontitis in adults in the United States: 2009
and 2010. Journal of Dental Research, 91(10), 914–920.
Eribe, E. R., & Olsen, I. (2017). Leptotrichia species in human infections
II. Journal of Oral Microbiology, 9(1), 1368848. https://
www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/20002297.2017.1368848
Faul, F., Erdfelder, E., Buchner, A.,& Lang, A.-G. (2009). Statisticalpower
analyses using G* Power 3.1: Tests for correlation and regression
analyses. Behavior Research Methods, 41(4), 1149–1160.
George, A., Shamim, S., Johnson, M., Dahlen, H., Ajwani, S., Bhole, S.,
& Yeo, A. E. (2012). How do dental and prenatal care practitioners
perceive dental care during pregnancy? Current evidence
and implications. Birth, 39, 238–247.
Giglio, J. A., Lanni, S. M., Laskin, D. M., & Giglio, N. W. (2009). Oral
health care for the pregnant patient. Journal of the Canadian
Dental Association, 75, 43–48.
Griffen, A. L., Beall, C. J., Campbell, J. H., Firestone, N. D., Kumar, P.

17
S., Yang, Z. K., … Leys, E. J. (2012). Distinct and complex
bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by
16S pyrosequencing. ISME Journal, 6(6), 1176–1185.
Guimara˜es, A. N., Silva-Mato, A., Miranda Cota, L. O., Siqueira, F. M.,
& Costa, F. O. (2010). Maternal periodontal disease and preterm
or extreme preterm birth: An ordinal logistic regression
analysis. Journal of Periodontology, 81(3), 350–358.
Gupta, V. K., Paul, S., & Dutta, C. (2017). Geography, ethnicity or
subsistence-specific variations in human microbiome composition
and diversity. Frontiers in Microbiology, 8, 1162. https://
www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2017.01162/full
Han, Y. (2011). Oral health and adverse pregnancy outcomes–what’s
next? Journal of Dental Research, 90(3), 289–293.
He, T., Qu, L., Chang, J., & Wang, J. (2018). Gingivitis models-relevant
approaches to assess oral hygiene products. Journal of Clinical
Dentistry, 29, 45–51.
Holt, S. C., & Ebersole, J. L. (2005). Porphyromonas gingivalis, Treponema
denticola, and Tannerella forsythia: The ‘red complex’, a
prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis.
Periodontology 2000, 38(1), 72–122. Q9
Hunter, L. P., & Yount, S. M. (2011). Oral health and oral health care
practices among low-income pregnant women. Journal of
Midwifery & Women’s Health, 56(2), 103–109.
Ide, M., & Papapanou, P. N. (2013). Epidemiology of association between
maternal periodontal disease and adverse pregnancy
outcomes–systematic review. Journal of Periodontology, 84,
S181–S194.
Jain, S., Gautam, V., & Naseem, S. (2011). Acute-phase proteins: As
diagnostic tool. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences,
3(1), 118.
Jeffcoat, M., Parry, S., Sammel, M., Clothier, B., Catlin, A., & Macones,
G. (2011). Periodontal infection and preterm birth: Successful
periodontal therapy reduces the risk of preterm birth. BJOG: An
International Journal of Obstetrics & Gynaecology, 118(2), 250–
256.
Khader, Y., Al-shishani, L., Obeidat, B., Khassawneh, M., Burgan, S.,
Amarin, Z. O., … Alkafajei, A. (2009). Maternal periodontal
status and preterm low birth weight delivery: A case–control
study. Archives of Gynecology and Obstetrics, 279(2), 165–
169.
Kinane, D. F., Zhang, P., Benakanakere, M., Singleton, J., Biesbrock,
A., Nonnenmacher, C., & He, T. (2015). Experimental gingivitis,
bacteremia and systemic biomarkers: A randomized clinical
trial. Journal of Periodontal Eesearch, 50, 864–869.
Knapp, S., Brodal, C., Peterson, J., Qi, F., Kreth, J., & Merritt, J. (2017).
Natural competence is common among clinical isolates of
Veillonella parvula and is useful for genetic manipulation of this
key member of the oral microbiome. Frontiers in Cellular and
Infection Microbiology, 7, 139. https://www.frontiersin.org/
articles/10.3389/fcimb.2017.00139/full

18
Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., &
Schloss, P. D. (2013). Development of a dual-index sequencing
strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence
data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied and
Environmental Microbiology, 79(17), 5112–5120.
Lamont, R. J., Koo, H., & Hajishengallis, G. (2018). The oral microbiota:
Dynamic communities and host interactions. Nature Reviews:
Microbiology, 16, 745–759.
Lang, N. P., Scha¨ tzle, M. A., & Lo¨e, H. (2009). Gingivitis as a risk factor
in periodontal disease. Journal of Clinical Periodontology, 36, 3–
8.
Lee, R. S.-Y., Milgrom, P., Huebner, C. E., & Conrad, D. A. (2010).
Dentists’ perceptions of barriers to providing dental care to
pregnant women. Women’s Health Issues, 20(5), 359–365.
Lemos, L. N., Fulthorpe, R. R., Triplett, E. W., & Roesch, L. F. (2011).
Rethinking microbial diversity analysis in the high throughput
sequencing era. Journal of Microbiological Methods, 86, 42–51.
Lima, D. P., Moimaz, S., Garbin, C., Sumida, D. H., Jardim, E. G., Jr., &
Okamoto, A. C. (2015). Occurrence of Socransky red complex
in pregnant women with and without periodontal disease. Oral
Health & Preventive Dentistry, 13(2), 169–176.
Lobene, R., Weatherford, T., Ross, N., Lamm, R., & Menaker, L. (1985).
A modified gingival index for use in clinical trials. Clinical Preventive
Dentistry, 8(1), 3–6.
Love, M. I., Huber, W., & Anders, S. (2014). Moderated estimation
of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.
Genome Biology, 15(12), 550. https://genomebiology.
biomedcentral.com/track/pdf/10.1186/s13059-014-0550-8
Macedo, J., Ribeiro, R., Machado, F., Assis, N., Alves, R., Oliveira, A.,
& Ribeiro, L. (2014). Periodontal disease and oral health-related
behavior as factors associated with preterm birth: A case–
control study in south-eastern Brazil. Journal of Periodontal
Research, 49(4), 458–464.
Macones, G. A., Parry, S., Nelson, D. B., Strauss, J. F., Ludmir, J.,
Cohen, A. W., … Sammel, M. D. (2010). Treatment of localized
periodontal disease in pregnancy does not reduce the occurrence
of preterm birth: Results from the Periodontal Infections
and Prematurity Study (PIPS). American Journal of Obstetrics
and Gynecology, 202(2), 147.e1–147.e8.
Madianos, P. N., Bobetsis, Y. A., & Offenbacher, S. (2013). Adverse
pregnancy outcomes (APOs) and periodontal disease: Pathogenic
mechanisms. Journal of Clinical Periodontology, 40(s14),
S170–S180.
Magurran, A. E. (2013). Measuring biological diversity. Hoboken, NJ:
Wiley-Blackwell.
Marchi, K. S., Fisher-Owens, S. A., Weintraub, J. A., Yu, Z., & Braveman,
P. A. (2010). Most pregnant women in California do not
receive dental care: Findings from a population-based study.
Public Health Reports, 125, 831–842.

19
Martin, J. A., Hamilton, B. E., Osterman, M. J. K., Driscoll, A. K., &
Drake, P. (2018). Births: Final Data for 2017. National Vital
Statistics Reports, 67(8). https://www.cdc.gov/nchs/data/nvsr/
nvsr67/nvsr67_08-508.pdf
Mason, M. R., Nagaraja, H. N., Camerlengo, T., Joshi, V., & Kumar, P.
S. (2013). Deep sequencing identifies ethnicity-specific
bacterial signatures in the oral microbiome. PLOS ONE,
8(10), e77287. https://journals.plos.org/plosone/article/file?
id¼10.1371/journal.pone.0077287&type¼printable
Miller, C. S., Foley, J. D., Bailey, A. L., Campell, C. L., Humphries, R. L.,
Christodoulides, N., … Jacobson, J. W. (2010). Current developments
in salivary diagnostics. Biomarkers in Medicine,
4(1), 171–189.
Mor, G., Aldo, P., & Alvero, A. B. (2017). The unique immunological and
microbial aspects of pregnancy. Nature Reviews Immunology,
17(8), 469–482.
Novak, M. J., Novak, K. F., Hodges, J. S., Kirakodu, S., Govindaswami,
M., DiAngelis, A., … Michalowicz, B. S. (2008). Periodontal
bacterial profiles in pregnant women: response to
treatment and associations with birth outcomes in the obstetrics
and periodontal therapy (OPT) study. Journal of Periodontology,
79(10), 1870–1879.
Offenbacher, S., Katz, V., Fertik, G., Collins, J., Boyd, D., Maynor, G.,
…Beck, J. (1996). Periodontal infection as a possible risk factor
for preterm low birth weight. Journal of Periodontology, 67(10),
1103–1113.
Oksanen, J. (2015). Vegan: An introduction to ordination. Retrieved
from https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/vignettes/
intro-vegan.pdf
Petersen, P. E. (2009). Global policy for improvement of oral health in
the 21st century—Implications to oral health research of World
Health Assembly 2007, World Health Organization. Community
Dentistry and Oral Epidemiology, 37(1), 1–8.
Polyzos, N. P., Polyzos, I. P., Zavos, A., Valachis, A., Mauri, D., Papanikolaou,
E. G.,…Messinis, I. E. (2010). Obstetric outcomes after
treatment of periodontal disease during pregnancy: Systematic
review and meta-analysis. British Medical Journal, 341, c7017.
https://www.bmj.com/content/bmj/341/bmj.c7017.full.pdf
Romero, R., Dey, S. K., & Fisher, S. J. (2014). Preterm labor: One
syndrome, many causes. Science, 345(6198), 760–765.
Sexton, W. M., Lin, Y., Kryscio, R. J., Dawson, D. R., Ebersole, J. L., &
Miller, C. S. (2011). Salivary biomarkers of periodontal disease
in response to treatment. Journal of Clinical Periodontology,
38(5), 434–441.
Sharma, A., Ramesh, A., & Thomas, B. (2009). Evaluation of plasma
C-reactive protein levels in pregnant women with and without
periodontal disease: A comparative study. Journal of Indian
Society of Periodontology, 13, 145–149.
Shojaee, M., Golpasha, M. F., Maliji, G., Bijani, A., Mir, S. M. A., & Kani,
S. N. M. (2013). C-reactive protein levels in patients with periodontal

20
disease and normal subjects. International Journal of
Molecular and Cellular Medicine, 2(3), 151–155.
Sosa-Jurado, F., Herna´ndez-Galindo, V. L., Mele´ndez-Mena, D.,
Mendoza-Torres, M. A., Martı´nez-Arroniz, F. J., Vallejo-Ruiz, V.,
… Santos-Lo´pez, G. (2014). Detection of hepatitis C virus RNA
in saliva of patients with active infection not associated with
periodontal or liver disease severity. BMC Infectious Diseases,
14(1), 72. https://bmcinfectdis.biomedcentral.com/track/pdf/1
0.1186/1471-2334-14-72
Stadelmann, P. F., Eick, S., Salvi, G. E., Surbek, D., Mohr, S., Bu¨ rgin,
W., … Sculean, A. (2014). Increased periodontal inflammation
in women with preterm premature rupture of membranes.
Clinical Oral Investigations, 19, 1537–1546.
Steinberg, B. J., Hilton, I. V., Iida, H., & Samelson, R. (2013). Oral health
and dental care during pregnancy. Dental Clinics, 57, 195–210.
Vettore, M., Leao, A., Leal, M. d. C., Feres, M., & Sheiham, A. (2008).
The relationship between periodontal disease and preterm low
birthweight: Clinical and microbiological results. Journal of
Periodontal Research, 43(6), 615–626.
Zhou, X., & Li, Y. (2015). Atlas of oral microbiology. Amsterdam, the
Netherlands: Elsevier.

21