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Departamento de
Morfologia
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PCR em Tempo Real
* Pobre precisão
* Baixa sensitividade
* Baixa resolução
* Não automatizado
* Contaminação (brometo)
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PCR em Tempo Real
PCR tradicional x PCR tempo real:
Fluorescence
Starting
Template
PCR
Round 1
2X
Template Cycle
PCR tradicional
Análise Real-time
Deteção do produto
Constante detecção e
PCR no gel de agarose
Round 2 monitoramento dos
produtos de amplificação
durante toda corrida
4X (emissão de fluorescência)
Template
30-40 ciclos
PCR em tempo real
Sistemas de detecção
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PCR em Tempo Real
5x
Gel de agarose
(3 picogramas = 1 genoma)
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PCR em Tempo Real
FASES DA PCR:
→ Platô: Detecção por gel para os métodos tradicionais. Produtos não são mais
produzidos e começam ser degradados
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PCR em Tempo Real
→ Sistema óptico
→ Termociclador
→ Hardware
→ Software
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PCR em Tempo Real
2. Laser excita a
sonda fluorescente
1. Polimerase encontra o primer. do primer.
… ...
F
T
… ... 3. Florescência
é absorvida
pela molécula
inibidora Q.
… ...
F
T
….
7
PCR em Tempo Real
… ...
F
T
. . .… .
…. . . …
7. polimerase quebra o primer
marcado. A sonda fluorescente e a
molécula inibidora são liberadas.
… . . . …
… .. . … ...
… . . .
F Q
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PCR em Tempo Real
Análise
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PCR em Tempo Real
Montagem da reação:
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PCR em Tempo Real
Terminologia:
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PCR em Tempo Real
Terminologia:
→ Rn: sinal do alvo normalizado pelo sinal da referência passiva (ex. ROX)
ROX: fluorescência presente no meio (correção do volume)
Normalização: fluorescência total- fluorescência ROX
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PCR em Tempo Real
Terminologia:
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PCR em Tempo Real
Terminologia:
Diluição de uma
threshold
mesma amostra
CT
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PCR em Tempo Real
Terminologia:
CT: cycle threshold: ciclo onde a reação cruza o limiar de detecção (threshold)
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