Temas Ingeniería Genética – Segundo parcial

Formas para maximizar la producción de un gen (p. 88)

Enzimas de restricción (p 36 – 43)
Vector pET28b (características del plásmido para producir proteína recombinante)
Purificación de proteínas utilizando tags de purificación (p. 87 – 92)
Bacteriófago lamda (p 66 – 71)
Cosmidos, fasmidos y otros vectores (p 75 – 81)
Librerías Genómicas (p 97 – 101)
Edición de genes (p 141 – 146) + CRISPR/Cas9, dedos de zinc y TALENs
Organismos transgénicos

Los temas en negrilla se evaluarán el 16 de enero como prueba de medio parcial.

La expresión de alto nivel de un gen clonado requiere más que un promotor fuerte. El ARNm
producido durante la transcripción necesita ser traducido efectivamente en proteína.
Aunque muchos factores pueden influir en la velocidad de traducción, el más importante es
la interacción del ribosoma con las bases inmediatamente aguas arriba del codón de
iniciación del gen. En las bacterias, una secuencia clave es el sitio de unión al ribosoma o la
secuencia Shine-Dalgarno (S-D). El grado de complementariedad de esta secuencia con el
16S rRNA puede afectar la velocidad de traducción (De Boer y Hui 1990). La
complementariedad máxima ocurre con la secuencia 5′-UAAGGAGG-3 '(Ringquist et al.
1992).

La separación entre la secuencia S-D y el codón de iniciación también es importante. Por lo

general, hay de cinco a 10 bases, siendo ocho óptimas. Disminuir la distancia por debajo de
4 pb o aumentarla más allá de 14 pb puede reducir la traducción en varios órdenes de
magnitud. La traducción se ve afectada por la secuencia de bases que siguen al sitio S-D (De
Boer et al. 1983b).

La presencia de cuatro residuos A o cuatro residuos T en esta posición dio la más alta
eficiencia de traducción. La eficiencia traslacional fue del 50% o 25% del máximo cuando la
región contenía, respectivamente, cuatro residuos C o cuatro residuos G.

La composición del triplete inmediatamente anterior al codón de inicio AUG también afecta
la eficiencia de la traducción. Para la traducción del ARNm de b-galactosidasa, las
combinaciones de bases más favorables en este triplete son UAU y CUU. Si UUC, UCA o AGG
reemplazan UAU o CUU, el nivel de expresión es 20 veces menor (Hui et al. 1984).

La composición del codón que sigue al codón de inicio AUG también puede afectar la
velocidad de traducción. Por ejemplo, un cambio en la tercera posición del cuarto codón de
un gen de interferón g humano resultó en un cambio de 30 veces en el nivel de expresión
(De Boer y Hui 1990). Además, hay un fuerte sesgo en el segundo codón de muchos ARNm
naturales, que es bastante diferente del sesgo general en el uso de codones.
Los genes altamente expresados tienen AAA (Lys) o GCU (Ala) como segundo codón. Devin
et al. (1988) cambiaron todos los nucleótidos G y C para los primeros cuatro codones de un
un gen de factor estimulante de colonias de granulocitos y la expresión aumentaron de
indetectable a 17% de la proteína celular total. Las secuencias aguas arriba del sitio S-D
pueden afectar la eficiencia de la traducción de ciertos genes. En el gen E. coli rnd hay una
serie de ocho residuos de uracilo.

Cambiar de dos a cinco de estos residuos no tiene efecto sobre los niveles de ARNm, pero
reduce la traducción hasta en un 95% (Zhang y Deutscher 1992). Etchegaray e Inouye (1999)
han identificado un elemento aguas abajo del codón de iniciación, la caja aguas abajo, que
facilita la formación del complejo de traducción-iniciación. La secuencia de la región no
traducida 3 'del ARNm también puede ser importante. Si esta región es complementaria de
las secuencias dentro del gen, pueden formarse bucles de horquilla y dificultar el
movimiento de los ribosomas a lo largo del mensajero.
El código genético es degenerado y, por lo tanto, para la mayoría de los aminoácidos hay
más de un codón. Sin embargo, en todos los genes, cualquiera sea su origen, la selección de
codones sinónimos es claramente no aleatoria (para revisiones, ver Kurland 1987, Ernst
1988 y McPherson 1988). El sesgo en el uso de codones tiene dos componentes: correlación
con la disponibilidad de ARNt en la célula, y elecciones no aleatorias entre codones que
terminan en pirimidina. Ikemura (1981a) midió la abundancia relativa de los 26 tRNA
conocidos de E. coli y encontró una fuerte correlación positiva entre la abundancia de tRNA
y la elección del codón.

Más tarde, Ikemura (1981b) observó que los genes más altamente expresados en E. coli
contienen principalmente aquellos codones correspondientes a los tRNA principales, pero
pocos codones de tRNA menores. En contraste, los genes que se expresan menos bien usan
más codones subóptimos. Forman y col. (1998) observaron una incorporación incorrecta
significativa de lisina, en lugar de arginina, cuando el codón AGA raro se incluyó en un gen
sobreexpresado en E. coli. Cabe señalar que el sesgo en el uso de codones incluso se
extiende a los codones de parada (Sharp y Bulmer 1988). UAA es favorecido en genes
expresados en niveles altos, mientras que UAG y UGA se usan con mayor frecuencia en
genes expresados en un nivel más bajo. Para una revisión de la traducción, el lector debe
consultar a Kozak (1999).

tea 2

Corte de moléculas de ADN Antes de 1970 no existía ningún método para escindir el ADN en
puntos discretos. Todos los métodos disponibles para fragmentar el ADN no fueron
específicos. Las endonucleasas disponibles tenían poca especificidad del sitio y los métodos
químicos producían fragmentos muy pequeños de ADN. El único método donde se podía
ejercer cualquier grado de control era el uso de cizallamiento mecánico. Los hilos largos y
delgados que constituyen las moléculas de ADN dúplex son lo suficientemente rígidos como
para romperse fácilmente por las fuerzas de corte en solución. La sonicación intensa con
ultrasonido puede reducir la longitud a aproximadamente 300 pares de nucleótidos. Se
puede lograr un cizallamiento más controlado mediante agitación a alta velocidad en una
licuadora. Típicamente, el ADN de alto peso molecular se corta a una población de
moléculas con un tamaño medio de aproximadamente 8 kb agitando a 1500 rev / min
durante 30 min (Wensink et al. 1974). La rotura ocurre esencialmente al azar con respecto a
la secuencia de ADN. Los términos consisten en regiones cortas de una sola cadena que
deben tenerse en cuenta en los procedimientos de unión posteriores. Durante la década de
1960, los biólogos de fagos aclararon las bases bioquímicas del fenómeno de restricción y
modificación del huésped. La culminación de este trabajo fue la purificación de la
endonucleasa de restricción de Escherichia coli K12 por Meselson y Yuan (1968). Dado que
esta endonucleasa corta el ADN no modificado en grandes fragmentos discretos, se razonó
que debe reconocer una secuencia diana. Esto a su vez planteó la posibilidad de una
manipulación controlada del ADN. Desafortunadamente, la endonucleasa K12 resultó ser
perversa en sus propiedades. Si bien la enzima se une a una secuencia de reconocimiento
definida, la escisión ocurre en un sitio "aleatorio" a varias kilobases de distancia (Yuan et al.
1980). El avance tan buscado finalmente llegó en 1970 con el descubrimiento en
Hemophilus influenzae (Kelly & Smith 1970, Smith & Wilcox 1970) de una enzima que se
comporta de manera más simple. Es decir, la enzima reconoce una secuencia diana
particular en una molécula de ADN dúplex y rompe la cadena polinucleotídica dentro de esa
secuencia para dar lugar a fragmentos discretos de longitud y secuencia definidas. La
presencia de sistemas de restricción y modificación es un arma de doble filo. Por un lado,
proporcionan una rica fuente de enzimas útiles para la manipulación del ADN. Por otro lado,
estos sistemas pueden afectar significativamente la recuperación de ADN recombinante en
huéspedes de clonación. Por esta razón, algunos conocimientos de restricción y
modificación son esenciales.

La comprensión de la base biológica de la restricción controlada por el huésped y la

modificación del ADN bacteriófago condujo a la identificación de endonucleasas de
restricción.
Los sistemas de restricción permiten a las bacterias monitorear el origen del ADN entrante y
destruirlo si se reconoce como extraño. Las endonucleasas de restricción reconocen
secuencias específicas en el ADN entrante y escinden el ADN en fragmentos, ya sea en sitios
específicos o más al azar. Cuando el ADN entrante es un genoma bacteriófago, el efecto es
reducir la eficiencia del recubrimiento, es decir, reducir el número de placas formadas en las
pruebas de recubrimiento. Los fenómenos de restricción y modificación fueron bien
ilustrados y estudiados por el comportamiento del fago λ en dos cepas huésped de E. coli. Si
una preparación de stock de fago λ, por ejemplo, se realiza mediante crecimiento sobre la
cepa C de E. coli y luego se titula sobre E. coli C y E. coli K, los títulos observados en estas
dos cepas diferirán en varios órdenes de magnitud, siendo el título de E. coli K el más bajo.
Se dice que los fagos están restringidos por la segunda cepa huésped (E. coli K). Cuando los
fagos que resultan de la infección de E. coli K ahora se reemplazan en E. coli K, ya no están
restringidos; pero si primero se someten a un ciclo a través de E. coli C, una vez más se
restringen cuando se colocan sobre E. coli K (Fig. 3.1). Por lo tanto, la eficiencia con la que
las placas de fago λ sobre una cepa particular del huésped depende de la cepa en la que se
propagó por última vez.

Este cambio no heredable conferido al fago por la segunda cepa huésped (E. coli K) que le
permite ser reemplazado en esa cepa sin restricción adicional se llama modificación. Los
fagos restringidos se adsorben en huéspedes restrictivos e inyectan su ADN normalmente.
Cuando los fagos se marcan con 32P, es evidente que su ADN se degrada poco después de la
inyección (Dussoix y Arber 1962) y la endonucleasa que es la principal responsable de esta
degradación se llama endonucleasa de restricción o enzima de restricción (Lederberg &
Meselson 1964). El huésped restrictivo debe, por supuesto, proteger su propio ADN de los
efectos potencialmente letales de la endonucleasa de restricción y, por lo tanto, su ADN
debe modificarse adecuadamente. La modificación implica la metilación de ciertas bases en
un número muy limitado de secuencias dentro del ADN, que constituyen las secuencias de
reconocimiento para la endonucleasa de restricción.

Esto explica por qué los fagos que sobreviven a un ciclo de crecimiento sobre el huésped
restrictivo pueden posteriormente reinfectar ese huésped eficientemente; su ADN se ha
replicado en presencia de la metilasa modificadora, por lo que, al igual que el ADN del
huésped, se metila y protege del sistema de restricción. Aunque la infección por fagos ha
sido elegida como nuestro ejemplo para ilustrar la restricción y modificación, estos procesos
pueden ocurrir cada vez que el ADN se transfiere de una cepa bacteriana a otra. Se han
reconocido cuatro tipos diferentes de sistemas de restricción y modificación (R-M), pero
solo uno se usa ampliamente en la manipulación de genes. Se conocen al menos cuatro
tipos diferentes de sistemas R-M: tipo I, tipo II, tipo III y tipo II. Las diferencias esenciales
entre ellos se resumen en la Tabla 3.1. Los sistemas tipo I fueron los primeros en
caracterizarse y un ejemplo típico es el de E. coli K12. La enzima activa consta de dos
subunidades de restricción, dos subunidades de modificación (metilación) y una subunidad
de reconocimiento. Estas subunidades son los productos de los genes hsdR, hsdM y hsdS.
Las reacciones de metilación y corte requieren ATP y S-adenosilmetionina como cofactores.
Las secuencias de reconocimiento son bastante largas sin características reconocibles como
la simetría. La enzima corta el ADN no modificado a cierta distancia de la secuencia de
reconocimiento. Sin embargo, debido a que la reacción de metilación se realiza por la
misma enzima que media la escisión, el ADN objetivo puede modificarse antes de cortarse.
Estas características significan que los sistemas tipo I son de poco valor para la manipulación
genética (véase también el recuadro 3.1). Sin embargo, su presencia en E. coli Sin embargo,
su presencia en cepas de E. coli puede afectar la recuperación de recombinantes (ver pág.
24). Las enzimas tipo III tienen secuencias de reconocimiento simétricas, pero por lo demás
se parecen a los sistemas tipo I y tienen poco valor. La mayoría de los sistemas R-M útiles
son de tipo II. Tienen una serie de ventajas sobre los sistemas tipo I y III. Primero, la
restricción y la modificación están mediadas por enzimas separadas, por lo que es posible
escindir el ADN en ausencia de modificación. En segundo lugar, las actividades de restricción
no requieren cofactores como ATP o S-adenosilmetionina, por lo que son más fáciles de
usar. Lo más importante de todo es que las enzimas tipo II reconocen una secuencia
definida, generalmente simétrica, y se cortan dentro de ella. Muchos de ellos también
hacen una ruptura escalonada en el ADN y la utilidad de esto se hará evidente. Aunque los
sistemas de tipo II tienen cofactores y estructura macromolecular similares a los de los
sistemas de tipo II, el hecho de que la restricción se produzca a una distancia del sitio de
reconocimiento limita su utilidad. La clasificación de los sistemas R-M en los tipos I a III es
conveniente, pero puede requerir modificaciones a medida que se realizan nuevos
descubrimientos. Por ejemplo, el sistema Eco571 comprende un polipéptido único que tiene
actividades de restricción y modificación (Petrusyte et al., 1988). Se conocen otros sistemas
de restricción que quedan fuera de la clasificación anterior. Los ejemplos incluyen los
sistemas mcr y mrr (ver p. 43) y endonucleasas de referencia. Estas últimas son
desoxirribonucleasas de doble cadena (DNasas) derivadas de intrones o inteinas (Belfort y
Roberts 1997). Tienen secuencias de reconocimiento asimétricas grandes y, a diferencia de
las endonucleasas de restricción estándar, toleran cierta degeneración de secuencia dentro
de su secuencia de reconocimiento. La denominación de las endonucleasas de restricción
proporciona información sobre su origen. El descubrimiento de una gran cantidad de
sistemas de restricción y modificación exigía un sistema uniforme de nomenclatura. Un
sistema adecuado fue propuesto por Smith y Nathans (1973) y una versión simplificada de
esto está en uso hoy. Las características clave son: • El nombre de la especie del organismo
huésped se identifica por la primera letra del nombre del género y las dos primeras letras
del epíteto específico para generar una abreviatura de tres letras. Esta abreviatura siempre
se escribe en cursiva. • Cuando una fuente particular ha sido la fuente, entonces se
identifica. • Cuando una cepa huésped particular tiene varios sistemas R-M diferentes, estos
se identifican con números romanos. Algunos ejemplos se dan en la Tabla 3.2. Las
endonucleasas de referencia se nombran de manera similar, excepto que las endonucleasas
codificadas por intrones reciben el prefijo "I-" (por ejemplo, I-CeuI) y las endonucleasas de
inteína tienen el prefijo "PI-" (por ejemplo, Pl-PspI). Cuando es necesario distinguir entre las
actividades de restricción y metilación, se les da los prefijos "R" y "M", respectivamente, p.
R.SmaI y M.SmaI.

Las enzimas de restricción cortan el ADN en sitios de simetría rotacional y diferentes

enzimas reconocen diferentes secuencias.

La mayoría, pero no todas, las endonucleasas de restricción de tipo II reconocen y escinden

el ADN dentro de secuencias particulares de cuatro a ocho nucleótidos que tienen un eje
doble de simetría rotacional. Estas secuencias a menudo se denominan palíndromos debido
a su similitud con las palabras que leen lo mismo hacia atrás que hacia adelante. Por
ejemplo, las enzimas de restricción y modificación R.EcoRI y M.EcoRI reconocen la
secuencia:

La posición en la que se corta la enzima restrictiva generalmente se muestra con el símbolo

"/" y los nucleótidos metilados por la enzima de modificación se marcan generalmente con
un asterisco. Para EcoRI, estos se representarían así:

Por conveniencia, es una práctica habitual simplificar la descripción de las secuencias de

reconocimiento mostrando solo una hebra de ADN, la que corre en la dirección 5 'a 3'. Por lo
tanto, la secuencia de reconocimiento de EcoRI se mostraría como G / AATTC. A partir de la
información que se muestra arriba, podemos ver que EcoRI hace rupturas monocatenarias
con cuatro bases separadas en las hebras opuestas de su secuencia objetivo, generando así
fragmentos con extremos 5 'sobresalientes:

Estos fragmentos de ADN se pueden asociar mediante enlaces de hidrógeno entre los
extremos 5 'superpuestos, o los fragmentos se pueden circular por reacción intramolecular
(Fig. 3.2). Por esta razón, se dice que los fragmentos tienen extremos adhesivos o cohesivos.
En principio, los fragmentos de ADN de diversas fuentes pueden unirse por medio de los
extremos cohesivos y, como veremos más adelante, los cortes en las moléculas pueden
sellarse para formar una molécula de ADN recombinante artificialmente intacta. No todas
las enzimas tipo II escinden sus sitios objetivo como EcoRI. Algunos, como PstI (CTGCA / G),
producen fragmentos con voladizos de 3 ', mientras que otros, como SmaI (CCC / GGG),
producen extremos romos o al ras. Hasta la fecha, más de 10,000 microbios de todo el
mundo han sido seleccionados para detectar enzimas de restricción. De estos, se han
encontrado más de 3000 enzimas que representan aproximadamente 200 especificidades
de secuencia diferentes. Algunos ejemplos representativos se muestran en la Tabla 3.3. Para
obtener una base de datos completa de información sobre endonucleasas de restricción y
sus metilasas asociadas, incluidos sitios de escisión, disponibilidad comercial y referencias
bibliográficas, el lector debe consultar el sitio web mantenido por New England Biolabs
(www.rebase.neb.com). Ocasionalmente se encuentran enzimas con especificidades de
secuencia de ADN novedosas, pero la mayoría demuestra tener la misma especificidad que
las enzimas ya conocidas. Las enzimas de restricción con la misma especificidad de
secuencia y sitio de corte se conocen como isoschizomers. Las enzimas que reconocen la
misma secuencia pero se escinden en diferentes puntos, por ejemplo SmaI (CCC / GGG) y
XmaI (C / CCGGG), a veces se conocen como neoschizomers. En condiciones extremas, como
pH elevado o baja fuerza iónica, las endonucleasas de restricción son capaces de escindir
secuencias que son similares pero no idénticas a su secuencia de reconocimiento definida.
Esta especificidad alterada se conoce como actividad estelar. Los tipos más comunes de
actividad alterada son la aceptación de sustituciones de bases y el truncamiento del número
de bases en la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, EcoRI * (actividad estrella de
EcoRI) escinde la secuencia N / AATTN, donde N es cualquier base, mientras que EcoRI
escinde la secuencia GAATTC.

El contenido de G + C de una molécula de ADN afecta su susceptibilidad a diferentes

endonucleasas de restricción
El número y el tamaño de los fragmentos generados por una enzima de restricción
dependen de la frecuencia de aparición del sitio objetivo en el ADN a cortar. Suponiendo
una molécula de ADN con un contenido de G + C del 50% y una distribución aleatoria de las
cuatro bases, se produce un sitio de reconocimiento de cuatro bases cada 44 (256) pb. De
manera similar, se produce un sitio de reconocimiento de seis bases cada 46 (4096) pb y una
secuencia de reconocimiento de ocho bases cada 48 (65,536) pb. En la práctica, no hay una
distribución aleatoria de las cuatro bases y muchos organismos pueden ser ricos en AT o GC,
p. el genoma nuclear de los mamíferos es 40% G + C y el dinucleótido CG es cinco veces
menos común de lo estadísticamente esperado. Del mismo modo, CCG y CGG son los
trinucleótidos más raros en la mayoría de los genomas bacterianos ricos en A + T y CTAG es
el tetranucleótido más raro en los genomas bacterianos ricos en G + C. Por lo tanto, las
diferentes endonucleasas de restricción con sitios de reconocimiento de seis bases pueden
producir tamaños de fragmento promedio significativamente diferentes de los 4096 pb
esperados (Tabla 3.4). Ciertas endonucleasas de restricción muestran escisión preferencial
de algunos sitios en la misma molécula de ADN. Por ejemplo, el fago λDNA tiene cinco sitios
para EcoRI pero los diferentes sitios se dividen de forma no aleatoria (Thomas y Davis 1975).
El sitio más cercano al término derecho se divide 10 veces más rápido que los sitios en el
medio de la molécula. Hay cuatro sitios para SacII en el ADN λ pero los tres sitios en el
centro de la molécula se cortan 50 veces más rápido que el sitio restante. Hay un grupo de
tres enzimas de restricción que muestran una preferencia de sitio aún más dramática. Estos
son NarI, NaeI y SacII y requieren una interacción simultánea con dos copias de su secuencia
de reconocimiento antes de escindir el ADN (Kruger 1988, Conrad y Topal, 1989). Por lo
tanto, Nari se partirá rápidamente dos de los cuatro sitios de reconocimiento en el ADN del
plásmido pBR322, pero rara vez escinden los dos sitios restantes. Las manipulaciones
simples de ADN pueden convertir un sitio para una enzima de restricción en un sitio para
otra enzima. Para unir dos fragmentos de ADN, no es esencial que sean producidos por la
misma endonucleasa de restricción. Muchas endonucleasas de restricción diferentes
producen extremos cohesivos compatibles. Por ejemplo, AgeI (A / CCGGT) y AvaI (C /
CCGGG) producen moléculas con voladizos idénticos de 5 'y, por lo tanto, se pueden unir.
Hay muchos otros ejemplos de extremos cohesivos compatibles. Además, si los extremos
cohesivos fueron producidos por cortadores de seis bases, los productos de ligadura a
menudo son recuperables por los cortadores de cuatro bases. Por lo tanto, en el ejemplo
citado anteriormente, el sitio híbrido ACCGGG puede escindirse por HpaII (C / CGG), NciI (CC
/ GGG) o ScrFI (CC / NGG). Se pueden generar nuevos sitios de restricción rellenando los
voladizos generados por los endonucleares de restricción y uniendo los productos entre sí.
La figura 3.3 muestra que después de rellenar los extremos cohesivos producidos por EcoRI,
la ligadura produce sitios de restricción reconocidos por otras cuatro enzimas. Se conocen
muchos otros ejemplos de creación de nuevos sitios objetivo mediante relleno y ligadura.
También hay muchos ejemplos de combinaciones de endonucleasas de restricción de
extremo romo que producen productos de ligadura recuperables. Por ejemplo, cuando las
moléculas generadas por la escisión con AluI (AG / CT) se unen a las producidas por EcoRV
(GAT / ATC), algunos de los sitios de ligadura tendrán la secuencia GATCT y otros tendrán la
secuencia AGATC. Ambos pueden ser escindidos por MboI (GATC).

Una metiltransferasa, M.SssI, que metila el dinucleótido CpG (Nur et al. 1985) ha sido
aislada de Spiroplasma. Esta enzima se puede usar para modificar sitios objetivo de
endonucleasa de restricción in vitro que contienen la secuencia CG. Algunas de las
secuencias diana modificadas de esta manera serán resistentes a la escisión de la
endonucleasa, mientras que otras seguirán siendo sensibles. Por ejemplo, si la secuencia
CCGG se modifica con SssI, será resistente a HpaII pero sensible a MspI. Dado que el 90% de
los grupos metilo en el ADN genómico de muchos animales, incluidos los vertebrados y los
equinodermos, se presentan como 5-metilcitosina en la secuencia CG, M.Sss puede usarse
para imprimir ADN de otras fuentes con un patrón de vertebrado.

La metilación puede reducir la susceptibilidad del ADN a la escisión por endonucleasas de

restricción y la eficiencia de la transformación del ADN. La mayoría de las cepas de
laboratorio de E. coli contienen tres metilasas de ADN específicas del sitio. La metilasa
codificada por el gen dam transfiere un grupo metilo de S-adenosilmetionina a la posición
N6 del residuo de adenina en la secuencia GATC. La metilasa codificada por el gen dcm (la
metilasa Dcm, anteriormente llamada metilasa Mec) modifica los residuos de citosina
interna en las secuencias CCAGG y CCTGG en la posición C5 (Marinus et al. 1983). En el ADN
en el que el contenido de GC es del 50%, los sitios para estas dos metilasas ocurren, en
promedio, cada 256-512 pb.

La tercera metilasa es la enzima M.EcoKI, pero los sitios para esta enzima son mucho más
raros y ocurren aproximadamente una vez cada 8 kb. Estas enzimas son de interés por dos
razones.

Primero, algunos o todos los sitios para una endonuclasa de restricción pueden ser
resistentes a la escisión cuando se aíslan de cepas que expresan las metilasas Dcm o Dam.
Esto ocurre cuando se metila una base particular en el sitio de reconocimiento de una
endonucleasa de restricción. La base relevante puede ser metilada por una de las metilasas
de E. coli si el sitio de reconocimiento de metilasa se superpone al sitio de reconocimiento
de endonucleasa. Por ejemplo, el ADN aislado de Dam + E. coli es completamente resistente
a la escisión por MboI, pero no por Sau3AI, los cuales reconocen la secuencia GATC. De
manera similar, el ADN de una cepa Dcm + será escindido por BstNI pero no por EcoRII,
aunque ambos reconocen la secuencia CCATGG. Vale la pena señalar que la mayoría de las
cepas de clonación de E. coli son Dam + Dcm +, pero hay mutantes dobles disponibles
(Marinus et al. 1983).
La segunda razón por la que estas metilasas son de interés es que el estado de modificación
del ADN plasmídico puede afectar la frecuencia de transformación en situaciones especiales.
La eficiencia de la transformación se reducirá cuando el ADN plasmídico modificado con
Dam se introduzca en Dam-E. coli o el ADN modificado con Dam o Dcm se introduzca en
otras especies (Russell y Zinder 1987). Cuando se va a trasladar el ADN de E. coli a otra
especie, es mejor usar una cepa que carezca de las metilasas Dam y Dcm. Como se verá más
adelante, es difícil clonar ADN que contiene secuencias repetitivas cortas y directas de
manera estable. La eliminación de las unidades repetidas ocurre rápidamente, incluso
cuando la cepa huésped es deficiente en recombinación. Sin embargo, el mecanismo de
eliminación parece implicar la metilación de la presa, ya que no ocurre en los mutantes de la
presa (Troester et al. 2000).

Es importante eliminar los sistemas de restricción en las cepas de E. coli utilizadas como
huéspedes para el ADN recombinante.
Si se introduce ADN extraño en un huésped de E. coli, puede ser atacado por sistemas de
restricción activos en la célula huésped. Una característica importante de estos sistemas es
que el destino del ADN entrante en el huésped restrictivo depende no solo de la secuencia
del ADN sino también de su historial: la secuencia de ADN puede o no estar restringida,
dependiendo de su fuente inmediatamente anterior a transformando la cepa huésped de E.
coli. Como hemos visto, las modificaciones posteriores a la replicación del ADN,
generalmente en forma de metilación de residuos particulares de adenina o citosina en la
secuencia diana, protegen contra los sistemas de restricción afines, pero no, en general,
contra los diferentes sistemas de restricción. Debido a que la restricción proporciona una
defensa natural contra la invasión de ADN extraño, es habitual emplear una cepa de E. coli
K12 deficiente en restricción K como huésped en transformación con moléculas
recombinantes recién creadas. Por lo tanto, donde, por ejemplo, el ADN de mamíferos se ha
ligado en un vector plasmídico, la transformación del huésped deficiente en restricción EcoK
elimina la posibilidad de que la secuencia entrante se restrinja, incluso si la secuencia de
mamífero contiene un sitio objetivo EcoK no modificado . Si el huésped es deficiente en
restricción EcoK pero competente en modificación EcoK, la propagación en el huésped
conferirá metilación de modificación y, por lo tanto, permitirá la propagación posterior del
recombinante en cepas competentes en restricción EcoK, si se desea. Mientras que el
sistema de restricción EcoKI, codificado por los genes hsdRMS, escinde el ADN que no está
protegido por metilación en el sitio objetivo, las endonucleasas McrA, McrBC y Mrr cortan el
ADN que está metilado en posiciones específicas. Las tres endonucleasas restringen el ADN
modificado por la metilasa CpC (M.SssI) y la endonucleasa Mrr atacará el ADN con
metiladenina en secuencias específicas. La importancia de estas enzimas de restricción es
que el ADN de muchas bacterias, y de todas las plantas y animales superiores, está
ampliamente metilado y su recuperación en los experimentos de clonación se reducirá en
gran medida si no se elimina la actividad de restricción. No hay problema con el ADN de
Saccharomyces cerevisiae o Drosophila melanogaster ya que hay poca metilación de su
ADN. Todos los sistemas de restricción en E. coli están agrupados en una "región de control
de inmigración" de aproximadamente 14 kb de longitud (Fig. 3.4). Algunas cepas llevan
mutaciones en uno de los genes. Por ejemplo, las cepas DH1 y DH5 tienen una mutación en
el gen hsdR y, por lo tanto, son defectuosas para la endonucleasa EcoKI, pero aún median
en la modificación EcoKI del ADN. La cepa DP50 tiene una mutación en el gen hsdS y, por lo
tanto, carece de las actividades de restricción y modificación de EcoKI. Otras cepas, como E.
coli C y la cepa de clonación HB101 ampliamente utilizada, tienen una deleción de toda la
región mcrC-mrr y, por lo tanto, carecen de todas las actividades de restricción.

Purificación de proteínas utilizando tags de purificación (p. 87 – 92)

La purificación de un producto genético clonado se puede facilitar mediante el uso de

etiquetas de purificación
Muchos vectores de clonación han sido diseñados para que la proteína que se expresa se
fusione con otra proteína, llamada etiqueta, que puede usarse para facilitar la purificación
de proteínas. Los ejemplos de etiquetas incluyen glutatión-S-transferasa, la proteína MalE
(unión a maltosa) y múltiples residuos de histidina, que pueden purificarse fácilmente
mediante cromatografía de afinidad.

Los vectores de etiqueta generalmente se construyen de modo que la secuencia de

codificación para una secuencia de aminoácidos escindida por una proteasa específica se
inserte entre la secuencia de codificación para la etiqueta y el gen que se expresa.

Después de la purificación, la proteína etiqueta se puede escindir con la proteasa específica

para dejar una proteína normal o casi normal.

También es posible incluir en la etiqueta una secuencia de proteínas que se puede analizar
fácilmente. Esto permite el análisis del producto del gen clonado cuando no se conoce su
actividad o cuando el análisis habitual es inconveniente. A continuación se dan tres
ejemplos diferentes de etiquetas. El lector que requiera una visión más detallada debe
consultar la revisión de La Vallie y McCoy (1995).

Para utilizar una fusión de polihistidina para la purificación, el gen de interés se manipula
primero en un vector en el que hay un polienlazador aguas abajo de seis residuos de
histidina y un sitio de escisión proteolítica. En el ejemplo que se muestra en la figura 5.14, el
sitio de escisión es el de la enteroquinasa. Después de la inducción de la síntesis de la
proteína de fusión, las células se lisan y la viscosidad del lisado se reduce mediante el
tratamiento con nucleasa. El lisado se aplica luego a una columna que contiene níquel
divalente inmovilizado, que se une selectivamente a la etiqueta de polihistidina.

Después de eliminar las proteínas contaminantes, la proteína de fusión se eluye de la

columna y se trata con enteroquinasa para liberar el producto génico clonado.
Para que el gen clonado se exprese correctamente, tiene que estar en el marco de lectura
traduccional correcto. Esto se logra al tener tres vectores diferentes, cada uno con un
polienlazador en un marco de lectura diferente (ver Fig. 5.14).

La enteroquinasa reconoce la secuencia (Asp) 4Lys y se corta inmediatamente después del

residuo de lisina. Por lo tanto, después de la escisión de enteroquinasa, la proteína génica
clonada tendrá algunos aminoácidos adicionales en el extremo N. Si se desea, el sitio de
escisión y las polihistidinas se pueden sintetizar en el término C.

Si el producto del gen clonado contiene un sitio de escisión de enteroquinasa, entonces se

puede usar una proteasa alternativa, como trombina o factor Xa, con un sitio de escisión
diferente.

Para facilitar el ensayo de las proteínas de fusión, se pueden incorporar secuencias cortas de
reconocimiento de anticuerpos en la etiqueta entre la etiqueta de afinidad y el sitio de
escisión proteasa. Algunos ejemplos de epítopos reconocibles se dan en la Tabla 5.4. Estos
anticuerpos se pueden usar para detectar, mediante transferencia Western, proteínas de
fusión que portan el epítopo apropiado. Tenga en cuenta que una etiqueta de polihistidina
en el terminal C puede funcionar tanto para el ensayo como para la purificación.

La biotina es un cofactor esencial para una serie de carboxilasas importantes en el

metabolismo celular. La biotina en estos complejos enzimáticos está unida covalentemente
a un residuo de lisina específico de la proteína transportadora de biotina carboxilasa. Las
fusiones hechas a un segmento de la proteína transportadora se reconocen en E. coli por la
biotina ligasa, el producto del gen birA, y la biotina se une covalentemente en una reacción
dependiente de ATP. La proteína de fusión expresada se puede purificar usando
cromatografía de afinidad con estrepttavidina (Fig. 5.15). E. coli expresa una única proteína
biotinilada endógena, pero no se une a la estreptavidina en su configuración nativa, lo que
hace que la purificación por afinidad sea altamente específica para la proteína de fusión
recombinante.

La presencia de biotina en la proteína de fusión tiene una ventaja adicional: su presencia se

puede detectar con enzimas acopladas a estreptavidina.

Los sistemas de purificación por afinidad descritos anteriormente tienen la desventaja de

que se requiere una proteasa para separar la proteína diana de la etiqueta de afinidad.
Además, la proteasa debe separarse de la proteína de interés.

Chong y col. (1997, 1998) han descrito un sistema de purificación único que no tiene
ninguna de estas desventajas. El sistema utiliza un elemento de empalme de proteínas, una
inteína, del gen VMA1 de Saccharomyces cerevisiae (véase el recuadro 5.2).

La inteína se modifica de manera tal que sufre una reacción de autoescisión en su extremo
N a bajas temperaturas en presencia de tioles, tales como cisteína, ditiotreitol o β-
mercaptoetanol.
El gen que codifica la proteína objetivo se inserta en un sitio de clonación múltiple (MCS)
de un vector para crear una fusión entre el extremo C del gen objetivo y el extremo N del
gen que codifica la inteína.

Se añadió ADN que codifica un pequeño dominio de unión a quitina (5 kDa) de Bacillus
circulans al término C de la inteína para la purificación por afinidad (Fig. 5.16).

La construcción anterior se coloca bajo el control de un promotor T7 inducible por IPTG.

Cuando los extractos brutos de las células inducidas se pasan a través de una columna de
quitina, la proteína de fusión se une y se lavan todas las proteínas contaminantes. Luego se
induce a la fusión a experimentar una autoescisión mediada por inteína en la columna
mediante incubación con un tiol. Esto libera la proteína objetivo, mientras que el dominio
de unión a quitina de la inteína permanece unido a la columna.

Se encuentran disponibles vectores que promueven la solubilización de proteínas

expresadas.
Uno de los problemas asociados con la sobreproducción de proteínas en E. coli es el
secuestro del producto en agregados insolubles o "cuerpos de inclusión" (Fig. 5.17).

Primero se informaron en cepas que sobreproducían las cadenas de insulina A y B (Williams

et al. 1982). Al principio, se pensó que su formación estaba restringida a la sobreexpresión
de proteínas heterólogas en E. coli, pero pueden formarse en presencia de altos niveles de
proteínas normales de E. coli, p. subunidades de ARN polimerasa (Gribskov y Burgess 1983).
Dos parámetros que pueden manipularse para reducir la formación de cuerpos de inclusión
son la temperatura y la tasa de crecimiento.

Existen varios informes que muestran que la disminución de la temperatura de crecimiento

aumenta el rendimiento de la proteína soluble plegada correctamente (Schein y Noteborn
1988, Takagi et al. 1988, Schein 1991).

Las composiciones de medios y los valores de pH que reducen la tasa de crecimiento

también reducen la formación de cuerpos de inclusión. La renaturalización de proteínas mal
plegadas a veces se puede lograr después de la solubilización en clorhidrato de guanidinio
(Lilie et al. 1998).

Se han descrito tres métodos "genéticos" para prevenir la formación de cuerpos de

inclusión. En el primero de estos, la célula huésped está diseñada para producir en exceso
un chaperón (por ejemplo, proteínas DnaK, GroEL o GroES) además de la proteína de interés
(Van Dyk y cols. 1989, Blum y cols. 1992, Thomas y cols. 1997). Castanie y col. (1997) han
desarrollado una serie de vectores que son compatibles con los plásmidos de tipo pBR322 y
que codifican la sobreproducción de chaperones (proteínas cuya función es ayudar al
plegamiento y replegamiento de otras proteínas). Estos vectores se pueden usar para
probar el efecto de los chaperones en la solubilización de productos génicos heterólogos.
Incluso con exceso de chaperón no hay garantía de plegado adecuado.

El segundo método consiste en realizar pequeños cambios en la secuencia de aminoácidos

de la proteína objetivo. Por ejemplo, los cambios de cisteína a serina
La organización genética del bacteriófago l favorece su subyugación como vector.
El bacteriófago λ es un virus de E. coli genéticamente complejo pero muy estudiado (cuadro
4.2). Debido a que ha sido objeto de tanta investigación en genética molecular, era natural
que, desde el comienzo de la manipulación genética, debiera haber sido investigado y
desarrollado como un vector. El ADN del fago λ, en la forma en que está aislado de la
partícula del fago, es una molécula dúplex lineal de aproximadamente 48,5 kbp. Se ha
determinado toda la secuencia de ADN (Sanger et al. 1982). En cada extremo hay
proyecciones cortas de 5 'monocatenarias de 12 nucleótidos, que son complementarias en
secuencia y por las cuales el ADN adopta una estructura circular cuando se inyecta en su
célula huésped, es decir, el ADN λ tiene terminales cohesivos que se asocian para formar El
cossite. Los genes funcionalmente relacionados del fago λ se agrupan en el mapa, excepto
los dos genes reguladores positivos N y Q. Los genes a la izquierda del mapa lineal
convencional (Fig. 4.10) codifican las proteínas de la cabeza y la cola de la partícula del fago .
Los genes de la región central están relacionados con la recombinación (por ejemplo, rojo) y
el proceso de lisogenización, en el que el cromosoma circularizado se inserta en su
cromosoma huésped y se replica de manera estable junto con él como un profágico. Gran
parte de esta región central, incluidos estos genes, no es esencial para el crecimiento del
fago y puede eliminarse o reemplazarse sin afectar gravemente el ciclo de crecimiento
infeccioso. Su capacidad de dispensación es de vital importancia, como se verá más
adelante, en la construcción de derivados de vectores del fago. A la derecha de la región
central se encuentran genes relacionados con la regulación y la inmunidad a la
superinfección (N, cro, cI), seguida de síntesis de ADN (O, P), regulación de la función tardía
(Q) y lisis de la célula huésped (S , R). La figura 4.11 ilustra el ciclo de vida λ.

El bacteriófago I tiene circuitos de control sofisticados. Como veremos, es posible insertar

ADN extraño en el cromosoma del derivado del fago-λ y, en algunos casos, los genes
extraños pueden expresarse eficientemente a través de promotores λ. Por lo tanto,
debemos considerar brevemente los promotores y los circuitos de control que afectan la
expresión del gen λ (ver Ptashne (1992) para una monografía excelente sobre los circuitos
de control del fago-λ). En el ciclo lítico, la transcripción λ ocurre en tres etapas temporales:
temprana, media y tardía. Básicamente, la transcripción genética temprana establece el
ciclo lítico (en competencia con la lisogenia), los productos génicos medios replican y
recombinan el ADN, y los productos genéticos tardíos empaquetan este ADN en partículas
de fago maduras. Después de la infección de un huésped sensible, la transcripción temprana
procede de los principales promotores ubicados inmediatamente a la izquierda (PL) y a la
derecha (PR) del gen represor (cI) (Fig. 4.12). Esta transcripción está sujeta a represión por el
producto del gen cI y en un lisógeno esta represión es la base de la inmunidad a la
superinfección de λ. Al principio de la infección, las transcripciones de PL y PR se detienen
en los sitios de terminación tL y tR1. El sitio tR2 detiene las transcripciones que escapan más
allá de tR1. Lambda cambia de transcripción de etapa temprana a etapa intermedia por anti-
terminación. El producto del gen N, expresado desde PL, dirige este cambio. Interactúa con
la ARN polimerasa y, antagonizando la acción de la proteína de terminación del huésped ρ,
le permite ignorar las señales de parada para que las transcripciones de PL y PR se extiendan
a genes como el rojo, el O y el P necesarios para la etapa intermedia. Las transcripciones
tempranas y medias y los patrones de expresión, por lo tanto, se superponen. El producto
cro, cuando se ha acumulado suficiente, evita la transcripción de PL y PR. El gen Q se
expresa desde la porción distal de la transcripción PR extendida y es responsable del cambio
de medio a tardío. Esto también funciona por anti-terminación. El producto Q
específicamente termina la transcripción de PR corta, extendiéndola a los genes tardíos, a
través de la región cos coherida, de modo que finalmente se producen muchas partículas de
fago maduras. Tanto N como Q desempeñan papeles regulatorios positivos esenciales para
el crecimiento de fagos y la formación de placas; pero un fago N puede producir una
pequeña placa si el sitio de terminación tR2 se elimina mediante una pequeña deleción
denominada nin (independiente de N) como en λN− nin.

Hay dos tipos básicos de vectores fagos l: vectores de inserción y vectores de reemplazo.
El ADN λ de tipo salvaje contiene varios sitios objetivo para la mayoría de las endonucleasas
de restricción comúnmente utilizadas y, por lo tanto, no es adecuado en sí mismo como
vector.
Por lo tanto, se han producido derivados del fago de tipo salvaje que tienen un solo sitio
objetivo en el que se puede insertar ADN extraño (vectores de inserción) o tienen un par de
sitios que definen un fragmento que se puede eliminar (relleno) y reemplazar por ADN
extraño (vectores de reemplazo). Como el fago λ puede acomodar solo alrededor del 5%
más que su complemento normal de ADN, los derivados del vector se construyen con
deleciones para aumentar el espacio dentro del genoma. Las moléculas de ADN λ más cortas
que producen placas de tamaño casi normal tienen un 25% de eliminación. Aparentemente,
si se elimina demasiado ADN no esencial del genoma, no se puede empaquetar en partículas
de fago de manera eficiente. Esto puede convertirse en una ventaja, si el fragmento
reemplazable de un vector de tipo de reemplazo se elimina por separación física o se
destruye eficazmente por tratamiento con una segunda endonucleasa de restricción que lo
corta solo, entonces el genoma del vector eliminado solo puede dar lugar a placas si se
inserta un nuevo segmento de ADN en él. Esto equivale a una selección positiva para fagos
recombinantes que llevan ADN extraño. Varios grupos de investigadores produjeron muchos
derivados de vectores tanto del tipo de inserción como de reemplazo al principio del
desarrollo de la tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, Thomas et al. 1974, Murray
& Murray 1975, Blattner et al. 1977, Leder et al. 1977) . La mayoría de estos vectores se
construyeron para su uso con EcoRI, BamHI o HindIII, pero su aplicación podría extenderse a
otras endonutruras mediante el uso de moléculas enlazadoras. Estos primeros vectores han
sido reemplazados en gran medida por vectores mejorados para la construcción rápida y
eficiente de bibliotecas de ADN genómico o complementario (ADNc) (véase el Capítulo 6).

Se han descrito varios vectores de fagos l con propiedades mejoradas.

Al igual que con los vectores plasmídicos, se han desarrollado derivados de vector de fago
mejorados. Ha habido varios objetivos, entre los cuales se encuentran los siguientes. •
Aumentar la capacidad de fragmentos de ADN extraños, preferiblemente para fragmentos
generados por cualquiera de varias enzimas de restricción (revisado por Murray 1983). •
Diseñar métodos para seleccionar positivamente la formación recombinante. • Para
permitir que las sondas de ARN se preparen convenientemente mediante la transcripción
del inserto de ADN extraño; Esto facilita la detección de bibliotecas en los procedimientos
de cromosoma para caminar. Un ejemplo de un vector con esta propiedad es λZAP (ver pág.
104). • Desarrollar vectores para la inserción de ADNc eucariota (pág. 104) de manera que la
expresión del ADNc, en forma de un polipéptido de fusión con β-galactosidasa, se impulse
en E. coli; Esta forma de vector de expresión es útil en la detección de anticuerpos. Un
ejemplo de tal vector es λgt11. Los primeros dos puntos serán discutidos aquí. La discusión
de los vectores mejorados en la construcción y selección de la biblioteca se difiere hasta el
Capítulo 6. La capacidad máxima de los derivados del fago-λ solo se puede lograr con
vectores del tipo de reemplazo, de modo que también ha habido un incentivo
complementario para diseñar métodos para seleccionando positivamente la formación
recombinante sin la necesidad de una eliminación previa del fragmento de relleno. Incluso
cuando se toman medidas para eliminar el fragmento de relleno mediante la purificación
física de los brazos del vector, pueden permanecer pequeñas cantidades contaminantes, de
modo que la selección genética para la formación recombinante sigue siendo deseable. El
método habitual para lograr esto es explotar el fenotipo Spi-. El tipo salvaje λ no puede
crecer en cepas de E. coli lisogénicas para el fago P2; en otras palabras, el fago λ es Spi +
(sensible a la inhibición de P2). Se ha demostrado que los productos de los genes λ rojos y
gam, que se encuentran en la región 64-69% en el mapa físico, son responsables de la
inhibición del crecimiento en un lisógeno P2 (Herskowitz 1974, Sprague et al. 1978 Murray
1983). Por lo tanto, se han derivado vectores en los que el fragmento de relleno incluye la
región 64-69%, de modo que los recombinantes en los que este ha sido reemplazado por
ADN extraño son fenotípicamente Spi- y pueden seleccionarse positivamente mediante el
enchapado en un lisógeno P2 (Karn et al. 1984, Loenen y Brammar 1980).

La eliminación del gen gam tiene otras consecuencias. El producto gam es necesario para el
cambio normal en la replicación de ADN λ del modo bidireccional al modo de círculo
rodante (ver Fig. 4.11). El fago gam no puede generar el ADN lineal concatemérico, que
normalmente es el sustrato para empacar en las cabezas de los fagos. Sin embargo, los
fagos de gam forman placas porque los sistemas de recombinación roja y rec actúan sobre
moléculas de ADN circulares para formar multímeros, que pueden empaquetarse. el rojo-
gam-fago depende totalmente del intercambio mediado por rec para la formación de placa
en bacterias rec +. El ADN λ es un sustrato pobre para este intercambio recrédito. Por lo
tanto, dicho fago crea placas extremadamente pequeñas a menos que contengan una o más
secuencias cortas de ADN llamadas sitios chi (instigador cruzado de puntos calientes), que
estimulan el intercambio repetido. Muchos de los vectores de reemplazo actuales generan
clones rojos-gam y, por lo tanto, se han construido con un sitio de chi dentro de la parte no
reemplazable del fago. La generación más reciente de vectores λ, que se basan en EMBL3 y
EMBL4 (Frischauf et al. 1983; Fig. 4.13), tienen una capacidad de ADN de tamaño 9–23 kb.
Además de ser chi +, tienen polienlazadores que flanquean el fragmento de relleno para
facilitar la construcción de la biblioteca. Los fagos con insertos pueden seleccionarse en
función de su fenotipo Spi-, pero hay una alternativa. El vector se puede digerir con BamHI y
EcoRI antes de la unión con fragmentos de ADN extraños producidos con BamHI. Si se
eliminan los pequeños fragmentos BamHI – EcoRI de los polilinkers, el fragmento de relleno
no se reincorporará.

Al empaquetar el ADN en el fago I in vitro, es posible eliminar la necesidad de células

competentes de E. coli
Hasta ahora, hemos considerado solo una forma de introducir ADN de fago manipulado en
la bacteria huésped, es decir, mediante la transfección de bacterias competentes (ver
Capítulo 2). La transfección es la introducción de ADN de fago desnudo en una célula
bacteriana. Usando ADN λ recién preparado que no ha sido sometido a ningún
procedimiento de manipulación génica, la transfección producirá típicamente alrededor de
105 placas / μg de ADN. En un experimento de manipulación de genes en el que el ADN del
vector se restringe y luego se liga con ADN extraño, esta cifra se reduce a aproximadamente
104-103 placas / μg de ADN del vector. Incluso con una bioquímica de ácido nucleico
perfectamente eficiente, parte de esta reducción es inevitable. Es una consecuencia de la
asociación aleatoria de fragmentos en la reacción de ligadura, que produce moléculas con
una variedad de combinaciones de fragmentos, muchas de las cuales son inviables. Sin
embargo, en algunos contextos, se requieren 106 o más recombinantes. La escala de tales
experimentos se puede mantener dentro de un límite razonable empacando el ADN
recombinante en partículas de fago maduras in vitro. Colocar el ADN recombinante en una
capa de fago permite que se introduzca en la bacteria huésped mediante los procesos
normales de infección de fagos, es decir, adsorción de fagos seguida de inyección de ADN.
Esto se conoce como transducción. Dependiendo de los detalles del diseño experimental, el
envasado in vitro produce aproximadamente 106 placas / μg de vector de ADN después de
la reacción de ligadura. La figura 4.14 muestra algunos de los eventos que ocurren durante
el proceso de empaquetado que tienen lugar dentro del huésped durante el crecimiento
normal de los fagos y que ahora debemos realizar in vitro. El fago de ADN en forma de
cateterismo, producido por un mecanismo de replicación de círculo rodante (ver Fig. 4.11),
es el sustrato para la reacción de empaquetamiento. En presencia del precursor de la cabeza
del fago (el producto del gen E es la proteína principal de la cápside) y el producto del gen A,
el ADN concatemérico se escinde en monómeros y se encapsida. Se introducen mellas en
cadenas opuestas del ADN, con 12 pares de nucleótidos separados en cada sitio cos, para
producir el monómero lineal con sus terminales cohesivos. El producto del gen D se
incorpora a lo que ahora se convierte en una cabeza de fago completa. Los productos de los
genes Wand FII, entre otros, luego unen la cabeza con una estructura de cola ensamblada
por separado para formar la partícula madura. El principio del envasado in vitro es
suministrar el ADN recombinante ligado con altas concentraciones.

de precursor de cabeza de fago, proteínas de empaquetamiento y colas de fago.

Prácticamente, esto se realiza de manera más eficiente en un lisado mixto muy concentrado
de dos lisógenos inducidos, uno de los cuales está bloqueado en la etapa previa a la cabeza
por una mutación ámbar en el gen D y, por lo tanto, acumula este precursor, mientras que
el otro no puede formando cualquier estructura de la cabeza por una mutación ámbar en el
gen E (Hohn y Murray 1977). En el lisado mixto, se produce la complementación genética y
se empaqueta el ADN exógeno (Fig. 4.15). Aunque el ADN concatemérico es el sustrato para
el empaquetamiento (los concatemeros unidos covalentemente, por supuesto, se producen
en la reacción de ligadura por asociación de los extremos cohesivos naturales de λ), el
sistema in vitro empaquetará ADN monomérico agregado, que presumiblemente primero
concatemeriza no -covalentemente. Hay dos problemas potenciales asociados con el
envasado in vitro. Primero, el ADN endógeno derivado de los profágicos inducidos de los
lisógenos utilizados para preparar el lisado de empaquetamiento puede empaquetarse. Esto
puede superarse eligiendo el genotipo apropiado para estos profágicos, es decir, la escisión
tras la inducción se inhibe por la deleción b2 (Gottesmann y Yarmolinsky 1968) y la
inmunidad imm 434 evitará la formación de placa si se usa una bacteria lisogénica imm 434
para enchapar la reacción compleja. mezcla. Además, si el vector no contiene ninguna
mutación ambarina, se puede usar un bacter huésped no supresor para que el ADN
endógeno no genere placas. El segundo problema potencial surge de la recombinación en el
lisado entre el ADN exógeno y los marcadores de fago inducidos. Si es problemático, esto se
puede superar mediante el uso de lisógenos deficientes en recombinación (es decir, rojo -
rec) y mediante la irradiación UV de las células utilizadas para preparar el lisado, eliminando
así la actividad biológica del ADN endógeno (Hohn y Murray 1977) .

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d.harvard.edu%2FPLASMID%2FGetVectorDetail.do%3Fvectorid%3D285

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