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Modificación química con polímeros monofuncionales.

A diferencia de los enfoques mencionados anteriormente, la modificación química con reactivos


monofuncionales permite la unión de funcionalidades monoméricas o poliméricas específicas.

En particular, la modificación covalente con el polímero anfifílico polietilenglicol (PEG) se ha


empleado para solubilizar proteínas para aplicaciones en disolventes orgánicos, y es útil para la
preparación de proteínas terapéuticamente activas con antigenicidad reducida y mayor estabilidad
viva [13].

Por ejemplo, Can & a mgosa lipasa (CRL) tratada con para-nitro-fenilcloroformiato y PEG activado
con cloruro de ácido cianúrico (Figura 2) mostró una mayor estabilidad en isooctano [14] y el
primero resultó ser más activo que el último. Sin embargo, en ambos casos, las mejoras de
estabilidad inducidas fueron acompañadas por la disminución de las actividades de lipasa y esterasa
de CRL en la Figura 5, aunque la actividad de transesterilización mejoró [141.

Modificación covalente de peroxidasa de rábano picante (HRP) con para-nitro-fenilcloroformato-


metoximetilPEG (mPEG) ofreció protección contra la desnaturalización por extremos de pH y
también contra la inactivación térmica [15]. Se especuló que la modificación de mPEG mejoró la
estabilidad de HRP al disminuir la repulsión electrostática entre las cargas superficiales [15]. Una
alternativa a la PEGilación es el uso del modificador covalente aniónico anfifílico de polioxietilen
lauril éter (Brij35) no iónico (Figura 3), que se ha aplicado a la catalasa [16]. La Brij35-catalasa
exhibió una solubilidad mejorada en tolueno seco y en 1, 1, 1-tricloroetano, mostrando una
actividad ZOO-veces mayor que la enzima nativa en 1, 1, l-tricloroetano y una actividad 15-ZO
mayor que la enzima nativa en agua solución. Además, este estudio mostró que la modificación
Brij35 de la catalasa dio una mayor actividad general que la modificación PEG en solución acuosa
[16]. El citocromo C fue PEGilado y posteriormente sometido a esterificación de sus grupos
carboxilato para producir un biocatalizador mejorado [17]. Aunque la proteína nativa podría, en
presencia de peróxido de hidrógeno, oxidar ocho de los 20 hidrocarburos aromáticos policíclicos
evaluados, el citocromo C modificado oxidó 17 de los 20, en las mismas condiciones, un aumento
doble en el rango de sustrato [17].

Introducción química de restos pequeños y reemplazo de átomos


La introducción química de pequeñas funcionalidades moleculares también ha demostrado ser
beneficiosa. Por ejemplo, la nucleasa RNasa A no glicosilada era. químicamente acoplado a D- y
Icosamina produciendo enzima mono y di-glicosilada (Figura 4) [18]. Asp53 y Glu49 se
identificaron como los sitios probables de glicosilación. La RNasa A químicamente monoglicosilada
exhibió una disminución del 80% en la actividad específica en comparación con la enzima nativa,
pero tuvo una estabilidad térmica mejorada en comparación tanto con la RNasa A no glucosilada
como con el material natural en vko glicosilado, RNasa B, que está glicosilada en Asn34 y contiene
cinco glicoformas. [181, La modificación química de la CRL con diethplpara-nitrofenil fosfato
(DPNP) se empleó para alterar la especificidad de esta hidrolasa [19]. Como se muestra en la Figura
5, mientras que la CRL nativa hidrolizó selectivamente enantio y regio el oxo-éster o el a-tio-éster
del butirato de Z-tio-4-ditioacetilo, el DPNP-CRL pudo hidrolizar solo el a-tioacetato [191. Como la
enzima oxido-reductasa glutatión peroxidasa es inestable y no está fácilmente disponible, se ha
despertado un interés significativo en su imitación. Usando un procedimiento previamente
establecido [ZO], la tripsina se convirtió químicamente en seleno-tripsina mediante el reemplazo
del Ser195 0 nucleófilo, con un átomo de Se oxidativamente lábil (Figura 6) [Zl]. La seleno-tripsina
carecía de actividad hidrolítica, pero la Figura 7 exhibió una buena actividad de glutatión
peroxidasa. Catalizó la reducción de glutatión (GSH) asistida por peróxido: 2 GSH + ROOH + GS-
SG + H, O + ROH usando el mismo mecanismo que la enzima natural y se encontró que tenía una
tasa de segundo orden constante solo lox veces menor que la glutatión peroxidasa nativa [Zl].
La misma estrategia se aplicó a la subtilisina para generar una seleno-subtilisina que, en presencia
de tiofenoles, catalizó la reducción enantioselctiva de los hidroperóxidos racémicos produciendo
hidroperóxidos y alcoholes ópticamente activos [Z ”]. Esta hidroperoxidasa semisintética exhibió
una eficiencia catalítica comparable a la HRP nativa, pero produjo de manera importante los
enantiómeros opuestos (es decir, el hidroperóxido R y el alcohol S) al proceso catalizado por HRP
natural [ZZ ”]. Además, mientras que los sustratos de hidroperóxido de la peroxidasa natural están
limitados a estructuras no estéricamente comprometidas, incluso los hidroperóxidos terciarios
fueron aceptados por seleno-subtilisina. La practicidad de este enfoque fue demostrada por la
preparación a gran escala (10 g) de seleno-subtilisina [23] y su reutilización en forma CLEC para
aplicaciones de lotes múltiples [24 '']. El CLEC de seleno-subtilisina exhibió alta actividad y
selectividad incluso después de 10 ciclos de reacción.

La explosión en aplicaciones comerciales y sintéticas de enzimas ha estimulado gran parte del


interés en mejorar la funcionalidad y la estabilidad de las enzimas.

La modificación química covalente, el método original disponible para alterar las propiedades de las
proteínas, ahora ha resurgido como un poderoso enfoque complementario para la mutagénesis
dirigida al sitio y la evolución dirigida para adaptar proteínas y enzimas.

La reticulación del glutaraldehído de los cristales enzimáticos y la modificación del polietilenglicol


(PEG) de los grupos amino de la superficie enzimática son métodos prácticos para mejorar la
estabilidad del biocatalizador.

Mientras que la reticulación de cristales enzimáticos genera biocatalizadores insolubles fácilmente


recuperables, la PEGilación aumenta la solubilidad en disolventes orgánicos.

Se ha aprovechado la modificación química para la incorporación de cofactores en plantillas de


proteínas y para el reemplazo de átomos con el fin de generar una nueva funcionalidad, como la
conversión de una hidrolasa en una peroxidasa.

A pesar de la amplitud de la aplicabilidad de las enzimas modificadas químicamente, una dificultad


que anteriormente ha impedido su implementación es la falta de especificidad química o regional de
las modificaciones químicas, que pueden producir mezclas de productos heterogéneas e
irreproducibles. Este desafío se ha abordado recientemente mediante la introducción de una
posición única para la modificación por una mutación dirigida por un sitio que posteriormente
puede modificarse químicamente para introducir una cadena lateral de aminoácidos no natural de
una manera altamente específica de quimio y regio.

grupos funcionales, lo que resulta en un producto homogéneo [32,33]. SBL es una plantilla ideal
para este enfoque, ya que no contiene cisteínas naturales. Usando esta estrategia general, se adaptó
la especificidad de SBL. Los RJKM se hicieron más altos a medida que aumentaba el tamaño del
grupo -R introducido, lo que culminó en un aumento de actividad de más de tres veces en
comparación con el tipo salvaje cuando R = CH2- ~ -C, Hr1 [34]. El modelado molecular reveló
que la cadena lateral del grupo introducido -CH2-c-C, H ,, se colocó directamente sobre el residuo
de la tríada catalítica His64. Se especuló que esto indujo un entorno más hidrófobo que puede
reducir la pK del ácido conjugado de His64. El efecto de disminución de pK se confirmó con una
disminución sin precedentes (hasta 0,73 unidades) en pK, inducida por una única modificación
hidrofóbica [3,5 ”]. El alcance del enfoque de CMM se demostró recientemente por su aplicabilidad
al difícil problema de la generación controlada de neoglicoproteínas homogéneas [36 ”] y por su
adaptabilidad a un enfoque combinatorio para generar bibliotecas de CMM. Una pantalla de
sustrato identificó CMM con actividad de esterasa mejorada y con mayor selectividad de esterasa a
amidasa para estudios de ligadura de péptidos [37]. Los estudios preliminares hacia la
implementación práctica de estas CMM para aplicaciones de transesterificación [38] y ligadura de
péptidos también resultaron prometedoras y revelaron una selectividad mejorada de esterasa a
amidasa y rendimientos mejorados en reacciones de acoplamiento de péptidos. El enfoque CMM
también se ha aplicado a la glucosamilasa glucosil hidrolasa invertida [39 '']. El catalizador base
general de la glucoamilasa, Glu400, fue mutado en cisteína y luego oxidado en el ácido cisteína
sulfínico. Esto convirtió la cadena lateral CH2CH, C02H Glu400 del tipo salvaje en la cadena
lateral -CH, SO, H Cys400-S02H para el mutante modificado químicamente. La glucoamilasa
CMM exhibió un aumento de 1.8 veces en R ,,, / KM para la hidrólisis del sustrato de maltosa y un
pK, de -0.5 unidades más bajo que el tipo salvaje para la base catalítica Cys400-S02H en
comparación con Glu400 [39 ''].

Introducción cofactor
Se adoptó un enfoque similar de mutagénesis dirigida al sitio y modificación química para mejorar
la pobre actividad de las transaminasas de la piridoxalamina-ALBP semisintética descrita
anteriormente [40 ']. Comenzando con una proteína de ácido graso diferente, la proteína de unión a
ácido graso intestinal (IFABP), que carece de residuos de cisteína, se preparó el mutante Val6O +
Cys y se modificó el tiol introducido para incorporar el cofactor de piridoxal. Esta transaminasa
IFABP exhibió una mejora de velocidad de hasta ZOO veces con respecto a k ,,, / Khil en
comparación con el cofactor libre en solución, con la reacción altamente enantioselectiva para dar
productos de hasta 95% ee [40 '] . 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9..

Conclusiones y perspectivas.
En su mayor parte, los grupos de investigación individuales han adoptado un enfoque único de
modificación química específica. Sin embargo, para obtener información sobre los matices de la
actividad o la mejora de la estabilidad, existe la necesidad de estudios comparativos. A este
respecto, recientemente se informó una valiosa comparación de los biocatalizadores CLECII
cepacia lipasa y PEG-I1 capacia lipasa en solventes acuosos y orgánicos [41]. La modificación
química proporciona un método rápido y económico para estabilizar enzimas mediante reticulación
o mediante la introducción de restos monoméricos o poliméricos. Además, la modificación química
permite la introducción de grupos funcionales y grupos determinantes de especificidad que son
inaccesibles mediante técnicas de mutagénesis convencionales. Hasta la fecha, una desventaja
principal ha sido a menudo su falta de control con respecto al alcance y la regioquímica de la
reacción; sin embargo, esta desventaja se supera en el enfoque combinado de mutagénesis dirigida
al sitio más modificación química, que ha surgido como una estrategia rápida, controlada y versátil
que produce productos homogéneos bien caracterizados.

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