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Por ejemplo, Can & a mgosa lipasa (CRL) tratada con para-nitro-fenilcloroformiato y PEG activado
con cloruro de ácido cianúrico (Figura 2) mostró una mayor estabilidad en isooctano [14] y el
primero resultó ser más activo que el último. Sin embargo, en ambos casos, las mejoras de
estabilidad inducidas fueron acompañadas por la disminución de las actividades de lipasa y esterasa
de CRL en la Figura 5, aunque la actividad de transesterilización mejoró [141.
La modificación química covalente, el método original disponible para alterar las propiedades de las
proteínas, ahora ha resurgido como un poderoso enfoque complementario para la mutagénesis
dirigida al sitio y la evolución dirigida para adaptar proteínas y enzimas.
grupos funcionales, lo que resulta en un producto homogéneo [32,33]. SBL es una plantilla ideal
para este enfoque, ya que no contiene cisteínas naturales. Usando esta estrategia general, se adaptó
la especificidad de SBL. Los RJKM se hicieron más altos a medida que aumentaba el tamaño del
grupo -R introducido, lo que culminó en un aumento de actividad de más de tres veces en
comparación con el tipo salvaje cuando R = CH2- ~ -C, Hr1 [34]. El modelado molecular reveló
que la cadena lateral del grupo introducido -CH2-c-C, H ,, se colocó directamente sobre el residuo
de la tríada catalítica His64. Se especuló que esto indujo un entorno más hidrófobo que puede
reducir la pK del ácido conjugado de His64. El efecto de disminución de pK se confirmó con una
disminución sin precedentes (hasta 0,73 unidades) en pK, inducida por una única modificación
hidrofóbica [3,5 ”]. El alcance del enfoque de CMM se demostró recientemente por su aplicabilidad
al difícil problema de la generación controlada de neoglicoproteínas homogéneas [36 ”] y por su
adaptabilidad a un enfoque combinatorio para generar bibliotecas de CMM. Una pantalla de
sustrato identificó CMM con actividad de esterasa mejorada y con mayor selectividad de esterasa a
amidasa para estudios de ligadura de péptidos [37]. Los estudios preliminares hacia la
implementación práctica de estas CMM para aplicaciones de transesterificación [38] y ligadura de
péptidos también resultaron prometedoras y revelaron una selectividad mejorada de esterasa a
amidasa y rendimientos mejorados en reacciones de acoplamiento de péptidos. El enfoque CMM
también se ha aplicado a la glucosamilasa glucosil hidrolasa invertida [39 '']. El catalizador base
general de la glucoamilasa, Glu400, fue mutado en cisteína y luego oxidado en el ácido cisteína
sulfínico. Esto convirtió la cadena lateral CH2CH, C02H Glu400 del tipo salvaje en la cadena
lateral -CH, SO, H Cys400-S02H para el mutante modificado químicamente. La glucoamilasa
CMM exhibió un aumento de 1.8 veces en R ,,, / KM para la hidrólisis del sustrato de maltosa y un
pK, de -0.5 unidades más bajo que el tipo salvaje para la base catalítica Cys400-S02H en
comparación con Glu400 [39 ''].
Introducción cofactor
Se adoptó un enfoque similar de mutagénesis dirigida al sitio y modificación química para mejorar
la pobre actividad de las transaminasas de la piridoxalamina-ALBP semisintética descrita
anteriormente [40 ']. Comenzando con una proteína de ácido graso diferente, la proteína de unión a
ácido graso intestinal (IFABP), que carece de residuos de cisteína, se preparó el mutante Val6O +
Cys y se modificó el tiol introducido para incorporar el cofactor de piridoxal. Esta transaminasa
IFABP exhibió una mejora de velocidad de hasta ZOO veces con respecto a k ,,, / Khil en
comparación con el cofactor libre en solución, con la reacción altamente enantioselectiva para dar
productos de hasta 95% ee [40 '] . 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9..
Conclusiones y perspectivas.
En su mayor parte, los grupos de investigación individuales han adoptado un enfoque único de
modificación química específica. Sin embargo, para obtener información sobre los matices de la
actividad o la mejora de la estabilidad, existe la necesidad de estudios comparativos. A este
respecto, recientemente se informó una valiosa comparación de los biocatalizadores CLECII
cepacia lipasa y PEG-I1 capacia lipasa en solventes acuosos y orgánicos [41]. La modificación
química proporciona un método rápido y económico para estabilizar enzimas mediante reticulación
o mediante la introducción de restos monoméricos o poliméricos. Además, la modificación química
permite la introducción de grupos funcionales y grupos determinantes de especificidad que son
inaccesibles mediante técnicas de mutagénesis convencionales. Hasta la fecha, una desventaja
principal ha sido a menudo su falta de control con respecto al alcance y la regioquímica de la
reacción; sin embargo, esta desventaja se supera en el enfoque combinado de mutagénesis dirigida
al sitio más modificación química, que ha surgido como una estrategia rápida, controlada y versátil
que produce productos homogéneos bien caracterizados.