Bacili Gram-pozitivi sporulaţi. Genul Bacillus.

Bacillus anthracis

Definiţie. Încadrare
Genul Bacillus aparţine familiei Bacillaceae, cuprinde mai mult de 90 de specii:
- Implicate mai frecvent în patologii - B. anthracis, B. cereus şi B. subtilis.
- Cu utilitate practică - B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus, B. thuringiensis
- Bacillus infernus - izolată sub formă de spori și provine din structuri foarte vechi, de la o adâncime de peste 2,5 km

Caractere generale
1. Habitat
Bacillus anthracis se găseşte în ţesuturile şi umorile animalelor bolnave; poate fi eliminat în mediu prin dejecţiile acestora.
- Pe sol germenul sporulează - B. anthracis este un bacil telluric, solul este principalul focar de infecție.

2. Caractere morfotinctoriale
- bacili Gram-pozitivi cu capetele tăiate drept
- dimensiuni relativ mari - 3-10µm / 2µm,
- imobili
- încapsulaţi (în ţesuturile animalelor bolnave) – e antifagocitară, protejează de anticorpii litici şi are rol în patogenitate.
- dispuşi în lanţuri, dar şi 2 câte 2 sau izolaţi
- sporul are diametrul mai mic decât grosimea bacilului şi este dispus central = endospor central

3. Caractere de cultură
Germen aerob facultativ anaerob. Se dezvoltă pe medii simple, la 35-37ºC.
- Pe agar formează colonii mari, alb-cenuşii, de tip R, rugoase, „în cap de meduză” sau „coamă de leu”.
- În bulion lasă mediul limpede şi formează flocoane care se depun pe pereţii eprubetei.

4. Caractere biochimice
- Reduce nitraţii
- Este indol-negativ, urează-negativ
- Produce acetil-metil-carbinol, L
- Lichefiază gelatin
- Hidrolizează cazeina.

5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Rezistenţa formelor vegetative este similară cu a celorlalte bacterii: sunt distruse în 30 de minute la 60ºC.
Sporii sunt însă deosebit de rezistenţi - Sunt distruşi la temperatura de fierbere în circa 10 minute şi prin autoclavare.
o La -5ºC pot rezista până la 10 ani. Se păstrează la întuneric şi la temperatura camerei peste 30 de ani.
o În frotiuri fixate şi colorate nu îşi pierd vitalitatea.

6. Structură antigenică
Bacilul antraxului are două grupe majore de antigene:
- celulare (somatice) - polizaharidele peretelui celular, antigenul polipeptidic capsular şi antigenele din spori. Capsula are
determinism plasmidic
- Exotoxina - cu determinism plasmidic; constă dintr-un amestec de 3 proteine imunogene: 1. factorul edematos (EF); 2.
antigenul protectiv (PA), capabil să inducă producerea de anticorpi; 3. factorul letal (LF).

7. Răspuns imun
Infecţia cu bacilul antraxului este urmată de apariţia de anticorpi faţă de toxină şi faţă de polipeptidul capsular, anticorpi care pot fi
detectaţi prin metode de laborator.

8. Caractere de patogenitate
Principalii factori de virulenţă: polipeptidul capsular (antigenul K) şi toxina. Toxina se leagă de membrana celulelor ţintă, facilitând
legarea celorlalte două elemente (EF şi LF).
- Efectele biologice ale EF includ edem local şi inhibiţia funcţiilor PMN, fiind mediate de AMPc.
- Pătrunderea LF în celule, mediată de PA, determină moartea acestora, mecanismul fiind însă necunoscut.
Patogenie şi patologie specifică. Principalele afecţiuni produse
Manifestările clinice ale infecţiilor determinate de bacilul antraxului sunt reprezentate de:
a) Antraxul cutanat - forma cea mai frecventă la om, este cunoscută sub numele de „pustulă malignă”. Leziunea apare la nivelul
unui traumatism cutanat prin care pătrund spori. După 2-5 zile (incubația), la locul inoculării apare o papulă care se
transformă în veziculă. Aceasta se sparge lăsând o crustă neagră, înconjurată de edem.
Netratată, infecţia poate disemina pe cale limfatică sau sangvină, determinând septicemie;
b) Antraxul pulmonar - apărut prin inhalarea de praf cu spori. Apar întâi simptome uşoare şi nespecifice. În 2-3 zile (perioada
de incubaţie poate atinge chiar şi 6-8 săptămâni) apare insuficienţa respiratorie acută (febră, dispnee, hipoxie, hipotensiune),
decesul purând surveni în 24 de ore de la declanşarea bolii.
c) Antraxul gastrointestinal - apare prin ingerarea cărnii provenite de la animalul bolnav. Manifestările clinice includ febră,
greaţă, vărsături, dureri abdominale, diaree sangvinolentă şi ascită acută. Rata mortalităţii este foarte crescută.

Diagnostic de laborator
Constă, de regulă, în evidenţierea bacililor pe frotiuri colorate efectuate din exsudatele recoltate din leziunile cutanate, în demonstrarea
anticorpilor prin metoda fluorescentă directă sau prin efectuarea de culturi din produsul patologic de la nivelul leziunilor respective.
Diagnosticul cazului de antrax porneşte de la datele clinice şi epidemiologice. Examenul bacteriologic va putea confirma diagnosticul.
1. Recoltarea şi transportul - trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute, în special recoltarea cât mai rapid după
debutul bolii şi înainte de iniţierea antibioterapiei.
- Produsul pathologic: secreţii de la nivelul leziunilor cutanate, din edemul local şi / sau din ganglionii regionali, spută, materii
fecale, alimente incriminate, LCR, probe necroptice, sânge (pentru hemoculturi) etc.
- În cazul mediilor selective, agentul selectiv mai frecvent utilizat este polimixina B.
- În cazul în care estimăm că transportul către laborator va dura mai mult de 60 min, asigurăm o to de transport de 2-8ºC.
- Trebuie să menţionăm faptul că atunci când presupunem diagnosticul de antrax, trebuie luate măsuri de biosecuritate
speciale.
2. Examinarea microscopică - realizarea unor frotiuri care se colorează cu albastru de metilen şi Gram; se mai pot utiliza
albastru de metilen policrom (McFadyean) sau coloraţia imunofluorescentă, pentru evidenţierea capsulei bacteriene.
- În p.p. se pot remarca structuri tisulare, leucocite şi bacili Gram-pozitivi
- În coloraţia cu albastru de metilen policrom bacilii apar albaştri iar capsula apare ca un halo de culoare roz.
- Recent au fost realizaţi anticorpi care, marcaţi fluorescent, pot permite identificarea formelor vegetative.
3. Cultivarea - se utilizează geloză nutritivă sau geloză-sânge, în condiţii de aerobioză, la 37ºC (deşi se poate multiplica între
15 şi 42ºC). În cazul în care este de presupus că p.p. este contaminat se pot folosi metodele menţionate mai sus. Pentru
izolarea B. anthracis - mediul PLET (cu polimixină B, lizozim, EDTA şi acetat de thalium).
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:
- Caractere morfotinctoriale
- Caractere de cultură - pe mediile cu sânge, poate apărea o zonă discretă de β-hemoliză deşi în mod
caracteristic B. anthracis este non-hemolitic; pe medii speciale se poate stimula dezvoltarea capsulei; pe mediul
PLET produc colonii mici, de tip S;
- Caractere biochimice - Bacillus anthracis este catalază-pozitiv, produce lecitinază şi este sensibil la penicilină (faţă de
majoritatea speciilor din genul Bacillus, rezistente la penicilină); există şi alte teste biochimice care sunt efectuate la nivelul
centrului de referinţă;
- Caractere antigenice - Identificarea toxinelor (componentele PA, EF şi LF) prin tehnici de tip ELISA;
- Caractere de patogenitate - testarea producerii capsulei in vitro, caracteristică tulpinilor virulente de B. anthracis se poate
realiza prin cultivare (repicare) pe un mediu care conţine bicarbonat de sodiu (0,7%), la 37ºC şi în prezenţa unui procent
crescut de CO2; după 24 de ore, tulpinile capsulate vor produce colonii mucoide colorate McFadyean/ Giemsa);
- Testarea sensibilităţii la bacteriofagul g
- Alte caractere / teste utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă
o testarea sensibilităţii la penicilină ar putea permite şi demonstrarea apariţiei unor tulpini mutante
o testări biochimice suplimentare
 examen microscopic (frotiuri colorate cu negru Sudan pentru identificarea prezenţei globulelor lipidice
de β-hidroxibutirat);
 tehnici de biologie moleculară (depistarea prezenţei plasmidelor pX01 şi pX02).
 5. Antibiograma (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice) nu este necesară. Bacillus anthracis este sensibil la
penicilină, tetraciclină, cloramfenicol, gentamicină ciprofloxacină etc
!!! Este de o deosebită importanţă punerea diagnosticului de antrax la animale (în special ierbivore), principalul rezervor
pentru Bacillus anthracis.

Tratament
Se efectuează cu Penicilina G, administrată în doze de 2 milioane de unităţi la 6 ore, timp de 7-10 zile (la adulţi). În caz de alergie la
penicilină se pot folosi de ex. eritromicină sau tetraciclină, la fiecare 6 ore. Cloramfenicolul poate fi de asemenea util în terapia acestei
afecţiuni.

Epidemiologie
Antraxul uman este de obicei o boală cu caracter profesional, apărând de exemplu la îngrijitorii de animale, la ciobani, lucrătorii din
abatoare, măcelari, tăbăcari, blănari etc.
Antraxul provoacă încă pierderi importante de animale (în special cornute mari) în Orientul mijlociu, Africa, Asia, dar boala la
animale este înregistrată şi în ţările dezvoltate.

Profilaxie
- La animale, boala (cărbunele) poate fi controlată prin imunizarea cu vaccinuri atenuate. Resturile animalelor moarte de antrax trebuie
arse sau îngropate la mare adâncime.
- Lucrătorii din sectorul veterinar şi din alte sectoare cu risc crescut pentru antrax ar trebui imunizaţi cu un vaccin preparat din
antigenul capsular protectiv. Este de asemenea importantă aplicarea măsurilor de igienă în aceste locuri de muncă.
Genul Clostridium – Clostridium Tetani

Definiţie. Încadrare
Include peste 170 de specii, dintre care o parte sporulează. Cele mai multe dintre specii sunt anaerobe.
Fenomenul de anaerobioză a fost descoperit în anul 1861, de către Louis Pasteur, care a identificat şi fermentaţia butirică produsă
de Vibrion butyrique(numele actual fiind Clostridium butyricum). Până în anul 1880, aceste specii erau incluse în genul Bacillus.
Reprezintă un grup foarte heterogen, în cazul căruia secvenţierea ARN r 16S nu a condus la o clasificare suficient de clară. Se discută
despre existenţa a 19 sub-grupuri. 3 dintre aceste sub-grupuri includ peste 70% din flora normală intestinală.

Caractere generale
1. Habitat - În stare vegetativă sunt prezenţi în intestinul omului şi al animalelor. Eliminaţi în mediul extern (pe sol), sporulează.
Sporii sunt foarte rezistenţi.

2. Caractere morfotinctoriale
Sunt bacili mari, Gram-pozitivi, cu capetele rotunjite, mobili, cu cili peritrichi (ex. cu excepţia C. perfringens sau a C. butyricum). În
prezenţa oxigenului sporulează, formând un spor terminal, mai mare decât diametrul celulei bacteriene, care conferă germenului
aspectul de băţ de chibrit.

3. Caractere de cultură - Cresc pe medii simple, în anaerobioză, formând colonii S rotunde, înconjurate de o zonă pufoasă.
4. Caractere biochimice - Elaborează o hemolizină, o exotoxină neurotropă, proteaze, gelatinaze etc.
5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Formele vegetative sunt distruse de expunerea timp de 15-20 de minute la temperaturi de 55-60oC şi de substanţe dezinfectante.
Sporii rezistă la temperatura de 100oC, dar sunt distruşi prin autoclavare la 120oC şi 1 atm, timp de 30 de minute şi la pupinel timp de
1 oră la 180oC.

6. Structură antigenică
Prezintă antigene flagelare de tip H, de perete (antigenul somatic O) şi o exotoxină cu structură proteică. Toţi bacilii tetanici
elaborează un singur tip de toxină, sub control plasmidic.

7. Răspuns imun
Apare un răspuns imun umoral, cu producere de anticorpi antitoxină, dar care nu sunt utili din punct de vedere al protecţiei şi nici în
scop diagnostic.

8. Caractere de patogenitate
Cl. tetani este patogen prin multiplicare la poarta de intrare (nu are capacitate de invazivitate) şi toxinogeneză.

Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni produse

Filtratul de cultură are două componente:
- Tetanolizina - produce liza hematiilor
- Tetanospasmina - inhibă eliberarea acetilcolinei, interferând astfel cu activitatea sinapsei neuromusculare şi inhibă neuronii
spinali postsinaptici, blocând eliberarea unor mediatori inhibitori, determinând astfel spasme musculare generalizate,
hiperreflexie şi convulsii.
Neuronii motori spinali sunt de obicei inhibaţi de către glicină şi acidul gaminobutiric. Toxina blochează eliberarea acestor mediatori,
ceea ce determină excitarea neuronilor motori spinali, cu apariţia de spasme severe şi dureroase ale musculaturii striate (paralizie
spastică). Conştienţa este păstrată. Toxina poate ajunge la nivelul SNC şi retrograd prin propagare pe cale axonală de la poarta de
intrare sau pe cale sangvină. Orice stimul extern precipită un atac de tetanos. Moartea apare prin asfixie; mortalitatea e de 50%.

Diagnostic de laborator
Diagnosticul este clinic, epidemiologic şi bacteriologic. Se recoltează produsul patologic de la nivelul plăgii (puroi) şi se realizează
frotiuri care se colorează cu albastru de metil sau prin coloraţia Gram. Antibiograma nu este necesară; C. tetani este sensibil la
penicilină.
Tratament
Tratamentul trebuie realizat de urgenţă, prin administrarea de ser antitetanic (cu măsurile de precauţie necesare în cazul seroterapiei) şi
eliminarea focarului tetanigen, pentru a se împiedica formarea unor noi cantităţi de toxină. La tratamentul specific se asociază
administrarea anatoxinei tetanice.

Epidemiologie
Sursa de infecţie este reprezentată de om şi animale (prin dejectele acestora care ajung pe sol).
Transmiterea se face prin intermediul pământului contaminat cu spori. Poarta de intrare este de obicei o plagă contaminată cu pământ
ce conţine spori de bacili tetanici (plagă cu risc tetanigen).

Profilaxie
Se adresează plăgilor cu risc tetanigen, plăgilor contaminate cu alte bacterii aerobe piogene care consumă oxigen şi cele contaminate
cu pământ; acestea asigură condiţii de anaerobioză, în care sporii trec în formă vegetativă, se multiplică şi elaborează exotoxina ce
ajunge la nivelul centrilor motori bulbari.
Se face profilaxia tetanică a următoarelor tipuri de plăgi:
- plăgi înţepate profunde, în care nu există o suprafaţă de contact cu oxigenul;
- plăgi traumatice mari, profunde, cu margini neregulate, cu resturi de ţesuturi devitalizate care consumă oxigenul din plagă şi care
creează condiţii de anaerobioză;
- plăgi postoperatorii (septice) sau posttraumatice.
În orice situaţie este obligatorie toaleta chirurgicală a plăgii, ce constă în:
- deschiderea largă a plăgii;
- desfacerea marginilor plăgii şi tăierea „franjurilor”;
- îndepărtarea resturilor tisulare;
- spălarea cu apă şi săpun;
- administrarea de substanţe oxidoreducătoare (H2O2) (nu spirt medicinal).
În plus, dacă persoana a fost corect imunizată, se face rapel cu ATPA (anatoxină tetanică purificată şi adsorbită). Anticorpii antitoxină
tetanică vor apărea în aproximativ 2 zile.
Dacă persoana nu a fost vaccinată, atitudinea este următoarea:
- se face vaccinare cu ATPA;
- se administrează şi ser antitetanic (în altă zonă decât cea în care s-a efectuat vaccinarea);
- se administreaza penicilină timp de 10 zile (sau eritromicină în cazul în care există hipersensibilitate faţă de penicilină).

Profilaxia specifică se realizează prin vaccinare DTP.

- vaccinarea începe la 2 luni (3 administrări succesive), cu 2 rapeluri;
- la 6-7 ani se face un nou rapel cu DT;
- ulterior se fac eventualele rapeluri cu ATPA sau dT (e indicată admin. de anatoxină tetanică la fiecare 10 ani)
Clostridium botulinum

Definiţie. Încadrare
Sunt germeni strict anaerobi sporulaţi, necapsulaţi, Gram-pozitivi, mobili, cu cili peritrichi. Sporii sunt foarte
rezistenţi. Clostridium botulinum reprezintă o specie patogenă prin producerea de toxine (exotoxine) neurotrope.
Despre botulism se discută în mod clar începând cu anul 1817, în Germania, după ce 71 de persoane (din 174) au decedat datorită
asfixiei, după ce au consumat cârnaţi incomplet preparaţi termic - botulinum (botulus = cârnat).

Caractere generale
1. Habitat.
În stare vegetativă se poate evidenţia în intestinul omului şi al animalelor. Dacă sunt eliminaţi în mediul extern (pe sol), sporulează.
Sporii sunt rezistenţi (germeni telurici).

2. Caractere morfotinctoriale - Sunt bacili mari, Gram-pozitivi, necapsulaţi, mobili, cu cili peritrichi. În prezenţa O2
sporulează.

3. Caractere de cultură - Cresc pe medii simple, în condiţii de anaerobioză şi formează colonii rotunde, netede, de tip S,
înconjurate de o zonă pufoasă.

4. Caractere biochimice
Elaborează exotoxine cu neurotropism faţă de sistemul nervos periferic.
- Toxinele A, B, E sunt mai comune la om, în zona noastră geografică.
Produc şi enzime proteolitice, cu formare de gaz - se poate observa în cazul unor conserve alimentare.

5. Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici

Formele vegetative sunt distruse la expunerea timp de 15-20 de minute la 55 de grede precum şi de acţiunea dezinfectantelor.
Sporii sunt distruşi prin autoclavare timp de 30 de minute .

6. Structura antigenică
Cl. botulinum prezintă antigene flagelare de tip H, antigene la nivelul peretelui precum şi antigene solubile (exotoxine). Există 8 tipuri
de bacili botulinici, în funcţie de exotoxinele elaborate (A, B, C cu 2 variante, D, E, F, G, H). Tipul G nu a fost asociat cu afecţiuni
umane. În România au fost identificate mai frecvent cazuri de toxiinfecţie alimentară cu Cl. botulinum tipurile A şi B.

7. Răspuns imun
Apare un răspuns imun umoral, cu producere de anticorpi antitoxină, dar care nu sunt utili din punct de vedere al protecţiei şi nici în
scop diagnostic.

8. Caractere de patogenitate
Cl. botulinum nu se multiplică în organism. Se multiplică în alimente şi produce o exotoxină (dacă este lizogenizat), care este distrusă
prin fierbere la 100ºC, timp de 20 minute. Se discută implicarea acestui microorganism în botulismul neo-natal, în care se pare că este
vorba de o multiplicare în intestinul sugarilorcare consumă de exemplu miere, contaminată cu spori de Cl. botulinum.

Patogenie şi patologie. Principalele afecţiuni produse

Botulismul apare, mai frecvent, prin ingestia de alimente care conţin toxina, putând fi considerat o toxiinfecţie alimentară (toxina este
preformată în aliment).
Se recunosc următoarele forme de botulism:
a. toxiinfecţia alimentară - după ingerare, toxina se resoarbe la nivel intestinal, ajunge în circulaţie, iar pe această cale la nivelul
plăcilor neuromotorii. Aici împiedică eliberarea de acetilcolină, determinând o paralizie flască.
o Paralizia începe la extremitatea cefalică (de exemplu, paralizia muşchilor globilor oculari, care apare la 18-24 ore de
la ingestie şi se manifestă prin diplopie-vedere dublă sau paralizie bulbară) şi este descendentă, ajungând până la
paralizia musculaturii respiratorii.
o Moartea poate surveni prin asfixie (datorită paraliziei muşchilor respiratori).
o Bolnavul rămâne conştient până aproape de exitus.
o Rata mortalităţii în această formă de botulism este mare.
 b. botulismul plăgilor - apar manifestări neurologice anormale şi nu pot fi implicate alimentele drept sursă pentru toxina
botulinică. Boala afectează persoanele care folosesc droguri injectate intravenos, cele cu leziuni traumatice contaminate cu
pământ sau gravidele la care s-a efectuat o cezariană.
c. botulismul intestinal (mai ales la sugari) - este urmarea formării toxinei botulinice prin germinarea la nivel intestinal a
sporilor ingeraţi. Manifestările clinice sunt similare cu cele ale toxiinfecţiei alimentare cu toxina preformată (paralizie
respiratorie). Mortalitatea este foarte mare.
d. botulismul prin inhalare de spori;
e. botulismul în care sursa este necunoscută

Toxina botulinică este cea mai puternică otravă cunoscută; doza letală pentru om este de 1-2 mg.

Diagnostic de laborator
Fiind o toxiinfecţie alimentară de tip toxic, nu se face diagnostic bacteriologic.
1. Se poate încerca determinarea a tipului (toxic) de Cl. botulinum implicat, prin toxinotipie:
- Din aliment se extrage structura antigenică în formă solubilă.
- Produsul în care presupunem prezenţa toxinei, atât fiert (şi răcit) cât şi nefiert, se inoculează la şoareci.
- În cazul în care în produs există toxină botulinică, semnele clinice apar la circa 24 h iar şoarecii mor după circa 48 h.
2. Se poate încerca identificarea toxinei botulinice şi printr-o reacţie de tip ELISA.
3. Tehnicile de biologie moleculară (PCR) pentru determinarea genei care codifică pentru toxina botulinică se pot efectua numai
în cazul obţinerii culturii de Cl. botulinum, nu şi pornind de la produsul patologic (ex. un aliment).

Tratament
Se administrează ser antibotulinic monovalent (dacă se cunoaşte tipul de toxină implicată); dacă nu, ser polivalent. Se poate administra
ser trivalent (A, B, E), prompt, pe cale i.v., cu precauţiile seroterapiei, în condiţii de ventilaţie asistată.

Epidemiologie
Botulismul apare în întreaga lume, fiind asociat în principal cu consumul de conserve preparate în casă.
Sursa este reprezentată de alimentele care conţin toxina botulinică preformată (în majoritatea cazurilor) sau de către solul contaminat
(ex. în botulismul plăgilor).
Transmiterea se poate face şi prin ingestia de alimente contaminate cu spori (în botulismul infantil şi cel al adultului) sau prin
inhalarea acestora.

Profilaxie
Este nespecifică şi constă în prelucrarea termică adecvată a alimentelor conservate, prevenirea contaminării rănilor, prevenirea
consumului de droguri pe cale i.v. etc.