O grande sucesso experimental de Mendel está atrelado justamente a escolha do
organismo que seria observado, nesse caso a Pisum sativum. A escolha dessa planta foi crucial pois ela é facilmente cultivada e reproduzida; possui ciclo de vida curto, permitindo a obtenção de várias gerações em um curto espaço de tempo; boa disponibilidade de formas e cores, tornando os resultados mais fáceis de se observar; capacidade de autopolinização e polinização cruzada, possibilitando a realização de cruzamentos entre plantas de genótipos diferentes (polinização cruzada) e entre genótipos iguais (auto polinização). A partir desse estudo, Mendel nos mostrou como ocorre o processo de hereditariedade nos organismos vivos; também pudemos ver que os fatores genéticos não são “misturados”, na verdade, são criadas novas combinações deles a cada nova geração; e, por fim, podemos dizer que essa era a ideia que faltava para a Teoria da Evolução e Seleção Natural, que unificou o pensamento biológico. 2. A) Uma molécula de DNA é feita de dois filamentos enrolados um no outro formando uma dupla hélice. Cada um desses filamentos é composto por uma sequência de cópias repetidas de um açúcar, chamado desoxirribose, e fosfato; de cada grupo açúcar-fosfato é projetada uma base nucleotídica (existem 4 tipos, sendo elas: adenina, timina, guanina e citosina). B) Nós sabemos que todos os seres vivos possuem um DNA formado por quatro bases nitrogenadas e o DNA, seja em qualquer tecido em que esteja, possui a mesma sequência de bases. Os genes são regiões específicas do DNA que são herdados de nossos progenitores. Esses genes são os responsáveis pela produção da molécula de RNA, que orienta a síntese de proteínas com base nas informações dadas pelo DNA. É por isso que dizemos que o DNA contém todas as informações do organismo, pois é nele que achamos o código necessário para a produção de cada proteína do corpo. 3. A replicação do DNA começa com a DNA helicase quebra as pontes de hidrogénio entre as bases emparelhadas e desenrola a dupla-hélice, à frente da DNA polimerase III. A tendência para se juntarem novamente é impedida pela ligação de proteínas SSB (Single-stranded DNA binding proteins). A DNA polimerase adiciona deoxiribonucleótidos no terminal 3’ da cadeia em crescimento, usando a cadeia separada como molde. Os substratos para a DNA polimerase são as formas trifosfatadas dos deoxinucleótidos: dATP, dGTP, dCTP e dTTP. Porque a polimerização catalisada por esta enzima ocorre sempre no terminal 3’ em crescimento, a síntese é contínua numa das cadeias molde. A esta nova cadeia replicada chama-se cadeia líder. Na outra cadeia molde, a síntese também ocorre no terminal 3’ mas em fragmentos e na direção contrária à do movimento da forquilha de replicação. Para esta cadeia, a DNA polimerase tem de esperar que a forquilha exponha mais DNA para continuar a sintetizar outro fragmento. A estes fragmentos dá-se o nome de fragmentos de Okasaki, que mais tarde serão unidos pela DNA ligase. À nova cadeia formada dá-se o nome de cadeia atrasada. Como já foi dito, a DNA polimerase catalisa a adição de nucleótidos no terminal 3’ de uma cadeia já existente. Assim, no início da replicação, tanto na cadeia líder como na atrasada, são sintetizados pequenos fragmentos de RNA para servirem de iniciadores da polimerização. São chamados de RNA primers. Na cadeia líder é necessário um primer apenas uma vez, já que pode usar como iniciador a cadeia molde. Na cadeia atrasada, cada fragmento de Okasaki necessita do seu primer. Os primers são sintetizados por uma série de proteínas chamadas de primossoma, cuja componente principal é a primase, um tipo de RNA polimerase. A remoção de primers e o preenchimento dos espaços é feita pela DNA polimerase I. Finalmente, a DNA ligase une esses fragmentos. 4. A) Extração de DNA de tecidos coletados pode ser feita através de vários métodos que estão disponíveis, escolhemos o método de acordo com o tipo de célula células. As principais etapas desse processo são: lise de membranas, envolve o rompimento das células e deve ser realizada em soluções tamponadas, geralmente contendo um detergente e os reagentes tris-hidroximetil aminometano (Tris), cloreto de sódio (NaCl) e ácido etileno diamino tetra-acético (EDTA); precipitação de proteínas e em seguida do DNA, após a lise das membranas, os ácidos nucleicos são liberados na solução aquosa juntamente com outros constituintes celulares dos quais devem ser isolados. Para esse fim, são utilizados solventes orgânicos, como o fenol ou clorofórmio, que desnaturam proteínas. Nessa etapa, após a centrifugação, o DNA permanecerá solúvel na fase aquosa (sobrenadante), a qual é transferida para um novo tubo, separando os ácidos nucleicos de proteínas e demais constituintes celulares presentes na interfase e fase orgânica; Solubilização do DNA, geralmente a lavagem do DNA é realizada com etanol 70% para a remoção dos sais, detergentes e de outras impurezas. Após a secagem por evaporação, o DNA é solubilizado preferencialmente em solução tampão TE (Tris-HCl e EDTA). O DNA também pode ser ressuspendido em água ultrapura. B) Para a aplicação da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) são necessários três segmentos de ácidos nucléicos: a dupla fita de DNA para servir de molde e a construção de dois oligonucleotídeos (primers) específicos - de fita simples e complementares as duas fitas molde de DNA -, desenhados de modo a flanquear a seqüência a ser amplificada. Além disso, são necessários DNA polimerase, dNTPs, tampão e sais (MgCl). A técnica consiste de ciclos repetitivos; cada ciclo está dividido nos seguintes passos: 1º passo (94-96ºC) - Desnaturação do DNA a alta temperatura, devido ao rompimento das pontes de hidrogênio que unem as duas fitas; 2º passo (30-60ºC) - Anelamento dos primers em posições específicas (essa temperatura é definida em função da seqüência nucleotídica dos primers); 3º passo (72-75ºC) - Extensão da seqüência a ser amplificada pela ação da DNA polimerase. C) A técnica do Gel de eletroforese apresenta basicamente um sistema de suporte (gel de agarose, por exemplo), uma cuba com eletrodos, um tampão no qual está imerso o gel e os eletrodos nas extremidades da cuba. Você adiciona a amostra em um dos poços do gel. A amostra deve estar corada ou o gel deve ter o corante como por exemplo o brometo de etídio. Sob influência de um campo elétrico, moléculas carregadas e partículas migram em direção ao polo oposto. A carga e a massa das moléculas fazem com que elas migrem em velocidades diferentes e, portanto, propiciam a separação destas. Como os ácidos nucléicos (DNA e RNA) possuem carga elétrica negativa eles sempre migrarão em direção ao polo positivo. D) O método de seqüenciamento de DNA mais utilizado é o automático, baseado no método de Sanger-Coulson. No seqüenciamento automático, os nucleotídeos são marcados com quatro fluorocromos diferentes, um para cada nucleotídeo (A, C, G, T). Esse método necessita de um DNA de fita simples e, normalmente, é clonado em um vetor M13 ou outro vetor comercial. O método baseia-se na síntese de uma segunda fita de DNA complementar ao DNA molde, na presença de um primer complementar à seqüência adjacente ao sítio múltiplo de clonagem do vetor. O fragmento de Klenow da DNA polimerase I inicia o elongamento da cadeia complementar a partir da extremidade 3' do primer; os deoxinucleotídeos - dNTP - (dATP - deoxiadenosina trifosfato -, dTTP - deoxitimidina trifosfato -, dGTP - deoxiguanosina trifosfato -, dCTP - deoxicitosina trifosfato) são selecionados de acordo com o pareamento ao molde e ligados a cadeia por ligações fosfodiéster. Como, para cada dNTP, utiliza-se um fluorocromo diferente, a eletroforese é realizada em um único canal do gel de seqüenciamento. À medida que os fragmentos passam pelo feixe de laser, os fluorocromos são excitados e a luz emitida, em diferentes comprimentos de onda, é detectada por um fotomultiplicador. Esta informação é traduzida na forma de seqüência por meio de um computador e apresentada no eletroferograma. 5. A mutação é uma mudança na sequência de DNA de um gene. Existem mutações benéficas, mas a grande maioria gera doenças e características diferentes. Por exemplo, a anemia falciforme é a substituição do ácido glutâmico pelo ácido valina e causa uma alteração na forma da proteína. Assim, acontecem alterações no formato dos glóbulos vermelhos do sangue deixando-os incapazes de transportar oxigênio. A síndrome do cromossomo X frágil (SXF) caracteriza-se por deficiência mental e padrão de herança dominante ligado ao cromossomo X. É causada por mutação no gene FMR1, que apresenta, em sua região reguladora (porção 5’ não traduzida), uma repetição de trinucleotídeos (CGG)n, cujo número varia de 6 a 55 nas pessoas normais da população. Nos afetados pela SXF, o número dessas repetições (CGG)n é superior a 200, constituindo a mutação completa. Quando o número de trinucleotídeos da repetição (CGG)n está entre 55 e 200, tem-se a pré-mutação. Existem diversas vias de reparação do DNA que sofreu mutação, são elas: fotorreativação, reparo pela cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) photolyase ou apenas fotoliase; remoção de grupamentos químicos, as aquiltransferases removem grupamentos de hidrocarbonetos (alquil) que foram inseridos nas bases transferindo, em seguida, para um resíduo de cisteína na enzima; reparo por excisão de bases, reposição de bases danificadas ou alteradas; reparo por excisão de nucleotídeos, elimina lesões pela remoção de trechos de nucleotídeos e depois há o preenchimento da lacuna resultante através da DNA pol I e a ligase une as pontas; reparo de mau pareamento, reconhece pareamentos incorretos, detecta qual base foi inserida incorretamente, remove a base incorreta e recruta o reparo por excisão de nucleotídeos, essa funciona durante a replicação e precisa de sinais de metilação no DNA; reparo transleção, algumas mutações obstruem a DNA pol III replicativa, o que pode levar a morte celular, reparo translesão permitirá que a maquinaria de replicação atravesse o local da lesão, prosseguindo a replicação; reparo de quebra de dupla-fita, União de extremidades não homólogas onde complexos reconhecem pontas quebradas, ocorre, então, excisão de nucleotídeos nas pontas. 6. Os elementos transponíveis de eucariotos enquadram-se em duas classes: classe 1 de retrotransposons e DNA classe 2 de transposons. Os retrotransposons, também conhecidos como elementos classe 1, codificam uma transcriptase reversa que produz uma cópia de DNA bifilamentar (a partir de um RNA intermediário) que é capaz de se integrar em uma nova posição no genoma. Os transposons de DNA codificam a transposase que corta o transposon do cromossomo e catalisa sua reinserção em outros locais cromossômicos. 7. Para iniciar a transcrição de um gene, a RNA polimerase liga-se ao DNA do gene numa região denominada promotor. Cada gene (ou, em bactérias, cada grupo de genes transcritos juntos) tem seu próprio promotor. Um promotor contém sequências de DNA que deixam a RNA polimerase ou as suas proteínas auxiliares se ligarem ao DNA. Uma vez formada a bolha de transcrição, a polimerase pode iniciar a transcrição. Uma vez que a RNA polimerase está na posição do promotor, o próximo passo da transcrição — o alongamento — pode começar. Basicamente, o a longamento é a fase que a sequência de RNA fica mais longa, graças à adição de novos nucleotídeos. Durante o alongamento, a RNA polimerase "caminha" ao longo de uma fita de DNA, conhecida como fita molde, da 3' para 5'. Para cada nucleotídeo no molde, a RNA polimerase adiciona um nucleotídeo de RNA correspondente (complementar) à extremidade 3' da fita do RNA. O transcrito de RNA é quase idêntico à fita de DNA não-molde ou codificante. Contudo, as fitas de RNA têm a base uracila (U) em vez de timina (T), assim como um açúcar ligeiramente diferente no nucleótido. Assim, como podemos ver no diagrama acima, cada T da fita codificante é substituído por um U no transcrito de RNA. A RNA polimerase vai continuar transcrevendo até encontrar sinais para parar. O processo de término da transcrição é chamado terminação e isso acontece uma vez que a polimerase transcreve uma sequência de DNA conhecida como terminador. Agora, elucidando as diferenças marcantes nas transcrições em procariotos e eucariotos temos que nos primeiros há apenas uma RNA polimerase, já nos eucariotos temos três (RNA pol I, RNA pol II, RNA pol III). Além disso nos procariontes a holoenzima RNA polimerase liga-se ao DNA a partir da subunidade sigma que reconhece o sítio de iniciação, já os eucariontes requerem a montagem de muitas proteínas em um promotor antes que a RNA polimerase II possa começar a sintetizar RNA. Algumas dessas proteínas são chamadas de fatores gerais de transcrição. Outro ponto importante é que nos eucariotos a transcrição ocorre no núcleo, enquanto a tradução ocorre no citoplasma. Já nos procariotos tal separação celular não existe. 8. A tradução possui, assim como a transcrição, três etapas, sendo elas: iniciação, alongamento e terminação. Dentro das células eucarióticas, a iniciação da tradução acontece assim: primeiro o RNAt transportando a metionina se liga a subunidade ribossômica pequena. Juntos, se ligam à extremidade 5' do RNAm através do reconhecimento do cap 5' GTP (adicionado durante o processamento no núcleo). Em seguida, eles "caminham" ao longo do RNAm na direção 3' e param quando alcançam o códon de iniciação (com frequência, mas nem sempre, o primeiro AUG). Nas bactérias, a situação é um pouco diferente. Aqui, a subunidade ribossômica pequena não começa pela extremidade 5' e caminha em direção a 3'. Em vez disso, ela se associa diretamente a determinadas sequências no RNAm. Essas sequências Shine-Dalgarno antecedem os códons e "os apontam" para o ribossomo. Na segunda etapa, o alongamento, o primeiro RNAt transportador de metionina começa no compartimento do meio no ribossomo, chamado de sítio P. Ao lado, um novo códon é exposto em outro compartimento, chamado de sítio A. O sítio A será o "desembarque" para o próximo RNAt, aquele cujo anticódon é o correspondente perfeito (complementar) do códon em exposição. Uma vez que o RNAt correspondente desembarca no sítio A é hora da ação: isto é, a formação de uma ligação peptídica que conecta um aminoácido a outro. Esta etapa transfere a metionina do primeiro RNAt para o aminoácido do segundo RNAt no sítio A. Agora temos dois aminoácidos. A metionina forma o N-terminal do polipeptídeo, e o outro amioácido é o C-terminal. Depois que a ligação peptídica é formada, o RNAm é puxado para frente no ribossomo por exatamente um códon. Esse deslocamento permite que o primeiro RNAt, agora vazio, saia através do sítio E (do inglês "exit"). Isso também faz com que um novo códon fique exposto no sítio A, para que todo ciclo se repita. A tradução acaba em um processo chamado terminação. A terminação acontece quando um códon de parada no RNAm (UAA, UAG ou UGA) entra no sítio A. Códons de parada são reconhecidos por proteínas chamadas de fatores de liberação, os quais se adaptam perfeitamente no sítio P (embora não sejam RNAt). Fatores de liberação confundem a enzima que normalmente forma as ligações peptídicas: fazem-na adicionar uma molécula de água ao último aminoácido da cadeia. Essa reação separa a cadeia do RNAt, assim a proteína recém-produzida é liberada. 9. Sabemos que uma molécula de RNAm é lida de uma ponta para outra, ou seja, apenas uma das quatro bases diferentes, A, U, G ou C, pode ser encontrada em cada posição. Assim, se as palavras que codificam aminoácidos tivessem uma letra de tamanho, apenas quatro palavras seriam possíveis. Esse vocabulário não pode ser o código genético, pois precisamos ter uma palavra para cada um dos 20 aminoácidos comumente encontrados nas proteínas celulares. Se as palavras tivessem duas letras de tamanho, então 4 x 4 = 16 palavras seriam possíveis. Esse vocabulário ainda não é grande o suficiente. Se as palavras tivessem três letras de tamanho, seriam possíveis 4 x 4 x 4 = 64 palavras. Esse vocabulário fornece palavras mais do que o suficiente para descrever aminoácidos. Podemos concluir que a palavra código deve consistir em, pelo menos, três nucleotídeos. A prova convincente de que um códon tem três letras de tamanho (e não mais que três) veio dos estudos de Crick e Brenner, em 1961. Eles aproveitaram as mutações supressoras do trabalho de Benzer sobre mapeamento genético em fagos para provar que o código genético era realmente composto por trincas, oito anos após a ideia ter sido proposta. Eles foram capazes também de demonstrar que a sequência de bases do DNA era lida a partir de um determinado ponto, trinca por trinca, de maneira não sobreposta. Isto significava que cada mensagem genética tinha uma estrutura de leitura fixa que poderia ser alterada pela adição ou remoção de uma única base. O polipeptídio especificado pela mensagem conteria aminoácidos incorretos a partir do ponto em que a base foi adicionada ou removida. Um aspecto que deve ser ressaltado é o fato destas mutações terem sido induzidas por corantes do tipo acridina, que causam inserção ou deficiência de bases na sequência de nucleotídeos do DNA. Crick e Brenner assumiram que se uma mutação fosse uma inserção de apenas uma base no DNA da região rII (representada por um sinal +), a sua supressora deveria ser uma deleção (representada por sinal -). Assim, se a sequência de bases do DNA estivesse sendo lida trinca por trinca (da esquerda para a direita), começando de um ponto determinado, a inserção de uma base determina que todas as trincas à direita da mutação fossem lidas de maneira diferente do original; esta seria, portanto, uma mutação do tipo mudança do quadro de leitura. Assim, a leitura correta das trincas seria interrompida após uma mutação (+), sendo, entretanto, restabelecida após uma mutação (−). Se a região alterada entre as duas mutações não for crítica, o polipeptídeo pode ser funcional. Mutações supressoras devem estar sempre próximas das mutações que elas suprimem, uma vez que é pouco provável que um polipeptídeo contendo grande número de aminoácidos alterados permaneça funcional. Caso tivéssemos uma segunda mutação de sinal (+), ela não teria suprimido a mutação (−) e não haveria reversão para o tipo selvagem. A natureza tríplice do código somente foi demonstrada quando foram obtidos mutantes contendo três mutações do tipo inserções ou três deficiências, pois esses mutantes triplos tinham o fenótipo selvagem. Este resultado só seria possível se o código fosse lido em trincas, pois somente neste caso a ordem correta da leitura seria restabelecida após três alterações de mesmo sinal. Os experimentos revelaram também a impossibilidade de apenas 20 dos 64 códons possíveis serem usados para especificar aminoácidos. Neste caso, 44 códons não teriam sentido, isto é, não corresponderiam a aminoácidos. Se isso fosse verdadeiro, um destes códons sem sentido deveria muito provavelmente aparecer entre uma inserção e sua deficiência supressora, determinando a terminação da cadeia polipeptídica antes que a leitura correta fosse restabelecida. Em outras palavras, estes estudos já sugeriam que o código genético era degenerado ou redundante. Dizer que o código genético é degenerado significa que mais de um tipo de trinca de bases pode determinar o mesmo aminoácido na cadeia polipeptídica. 10. O proteoma é enriquecido por dois processos celulares: a recomposição alternativa do pré-mRNA e a modificação pós-traducional das proteínas. A recomposição alternativa do pré-mRNA permite que um gene codifique mais de uma proteína. As proteínas são feitas de domínios funcionais que são, em geral, codificados por éxons diferentes. Assim, a recomposição alternativa de um pré- mRNA pode levar à síntese de múltiplas proteínas (chamadas de isoformas) com combinações diferentes de domínios funcionais. Modificações pós-traducionais são eventos de processamento covalente que mudam as propriedades das proteínas por clivagem proteolítica ou por adição de um grupo químico a um ou mais aminoácidos. Estas modificações podem determinar a atividade, a localização, e interações com outras proteínas. Na sinalização, por exemplo, cascatas de quinases são ativadas e/ou desativadas pela adição e/ou remoção reversíveis de grupos fosfatos. Outro exemplo é a ubiquitinação de ciclinas no ciclo celular que corresponde à marcação de proteínas para a destruição em tempos definidos.