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1.

O grande sucesso experimental de Mendel está atrelado justamente a escolha do


organismo que seria observado, nesse caso a Pisum sativum. A escolha dessa
planta foi crucial pois ela é facilmente cultivada e reproduzida; possui ciclo de
vida curto, permitindo a obtenção de várias gerações em um curto espaço de
tempo; boa disponibilidade de formas e cores, tornando os resultados mais fáceis
de se observar; capacidade de autopolinização e polinização cruzada,
possibilitando a realização de cruzamentos entre plantas de genótipos diferentes
(polinização cruzada) e entre genótipos iguais (auto polinização). A partir desse
estudo, Mendel nos mostrou como ocorre o processo de hereditariedade nos
organismos vivos; também pudemos ver que os fatores genéticos não são
“misturados”, na verdade, são criadas novas combinações deles a cada nova
geração; e, por fim, podemos dizer que essa era a ideia que faltava para a Teoria
da Evolução e Seleção Natural, que unificou o pensamento biológico.
2. A) Uma molécula de DNA é feita de dois filamentos enrolados um no outro
formando uma dupla hélice. Cada um desses filamentos é composto por uma
sequência de cópias repetidas de um açúcar, chamado desoxirribose, e fosfato; de
cada grupo açúcar-fosfato é projetada uma base nucleotídica (existem 4 tipos,
sendo elas: adenina, timina, guanina e citosina).
B) Nós sabemos que todos os seres vivos possuem um DNA formado por quatro
bases nitrogenadas e o DNA, seja em qualquer tecido em que esteja, possui a
mesma sequência de bases. Os genes são regiões específicas do DNA que são
herdados de nossos progenitores. Esses genes são os responsáveis pela produção
da molécula de RNA, que orienta a síntese de proteínas com base nas informações
dadas pelo DNA. É por isso que dizemos que o DNA contém todas as informações
do organismo, pois é nele que achamos o código necessário para a produção de
cada proteína do corpo.
3. A replicação do DNA começa com a DNA helicase quebra as pontes de
hidrogénio entre as bases emparelhadas e desenrola a dupla-hélice, à frente da
DNA polimerase III. A tendência para se juntarem novamente é impedida pela
ligação de proteínas SSB (Single-stranded DNA binding proteins). A DNA
polimerase adiciona deoxiribonucleótidos no terminal 3’ da cadeia em
crescimento, usando a cadeia separada como molde. Os substratos para a DNA
polimerase são as formas trifosfatadas dos deoxinucleótidos: dATP, dGTP, dCTP
e dTTP. Porque a polimerização catalisada por esta enzima ocorre sempre no
terminal 3’ em crescimento, a síntese é contínua numa das cadeias molde. A esta
nova cadeia replicada chama-se cadeia líder. Na outra cadeia molde, a síntese
também ocorre no terminal 3’ mas em fragmentos e na direção contrária à do
movimento da forquilha de replicação. Para esta cadeia, a DNA polimerase tem
de esperar que a forquilha exponha mais DNA para continuar a sintetizar outro
fragmento. A estes fragmentos dá-se o nome de fragmentos de Okasaki, que mais
tarde serão unidos pela DNA ligase. À nova cadeia formada dá-se o nome de
cadeia atrasada. Como já foi dito, a DNA polimerase catalisa a adição de
nucleótidos no terminal 3’ de uma cadeia já existente. Assim, no início da
replicação, tanto na cadeia líder como na atrasada, são sintetizados pequenos
fragmentos de RNA para servirem de iniciadores da polimerização. São chamados
de RNA primers. Na cadeia líder é necessário um primer apenas uma vez, já que
pode usar como iniciador a cadeia molde. Na cadeia atrasada, cada fragmento de
Okasaki necessita do seu primer. Os primers são sintetizados por uma série de
proteínas chamadas de primossoma, cuja componente principal é a primase, um
tipo de RNA polimerase. A remoção de primers e o preenchimento dos espaços é
feita pela DNA polimerase I. Finalmente, a DNA ligase une esses fragmentos.
4. A) Extração de DNA de tecidos coletados pode ser feita através de vários métodos
que estão disponíveis, escolhemos o método de acordo com o tipo de célula
células. As principais etapas desse processo são: lise de membranas, envolve o
rompimento das células e deve ser realizada em soluções tamponadas, geralmente
contendo um detergente e os reagentes tris-hidroximetil aminometano (Tris),
cloreto de sódio (NaCl) e ácido etileno diamino tetra-acético (EDTA);
precipitação de proteínas e em seguida do DNA, após a lise das membranas, os
ácidos nucleicos são liberados na solução aquosa juntamente com outros
constituintes celulares dos quais devem ser isolados. Para esse fim, são utilizados
solventes orgânicos, como o fenol ou clorofórmio, que desnaturam proteínas.
Nessa etapa, após a centrifugação, o DNA permanecerá solúvel na fase aquosa
(sobrenadante), a qual é transferida para um novo tubo, separando os ácidos
nucleicos de proteínas e demais constituintes celulares presentes na interfase e
fase orgânica; Solubilização do DNA, geralmente a lavagem do DNA é realizada
com etanol 70% para a remoção dos sais, detergentes e de outras impurezas. Após
a secagem por evaporação, o DNA é solubilizado preferencialmente em solução
tampão TE (Tris-HCl e EDTA). O DNA também pode ser ressuspendido em água
ultrapura.
B) Para a aplicação da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) são
necessários três segmentos de ácidos nucléicos: a dupla fita de DNA para servir
de molde e a construção de dois oligonucleotídeos (primers) específicos - de fita
simples e complementares as duas fitas molde de DNA -, desenhados de modo a
flanquear a seqüência a ser amplificada. Além disso, são necessários DNA
polimerase, dNTPs, tampão e sais (MgCl). A técnica consiste de ciclos repetitivos;
cada ciclo está dividido nos seguintes passos: 1º passo (94-96ºC) - Desnaturação
do DNA a alta temperatura, devido ao rompimento das pontes de hidrogênio que
unem as duas fitas; 2º passo (30-60ºC) - Anelamento dos primers em posições
específicas (essa temperatura é definida em função da seqüência nucleotídica dos
primers); 3º passo (72-75ºC) - Extensão da seqüência a ser amplificada pela ação
da DNA polimerase.
C) A técnica do Gel de eletroforese apresenta basicamente um sistema de suporte
(gel de agarose, por exemplo), uma cuba com eletrodos, um tampão no qual está
imerso o gel e os eletrodos nas extremidades da cuba. Você adiciona a amostra
em um dos poços do gel. A amostra deve estar corada ou o gel deve ter o corante
como por exemplo o brometo de etídio. Sob influência de um campo elétrico,
moléculas carregadas e partículas migram em direção ao polo oposto. A carga e a
massa das moléculas fazem com que elas migrem em velocidades diferentes e,
portanto, propiciam a separação destas. Como os ácidos nucléicos (DNA e RNA)
possuem carga elétrica negativa eles sempre migrarão em direção ao polo
positivo.
D) O método de seqüenciamento de DNA mais utilizado é o automático, baseado
no método de Sanger-Coulson. No seqüenciamento automático, os nucleotídeos
são marcados com quatro fluorocromos diferentes, um para cada nucleotídeo (A,
C, G, T). Esse método necessita de um DNA de fita simples e, normalmente, é
clonado em um vetor M13 ou outro vetor comercial. O método baseia-se na
síntese de uma segunda fita de DNA complementar ao DNA molde, na presença
de um primer complementar à seqüência adjacente ao sítio múltiplo de clonagem
do vetor. O fragmento de Klenow da DNA polimerase I inicia o elongamento da
cadeia complementar a partir da extremidade 3' do primer; os deoxinucleotídeos -
dNTP - (dATP - deoxiadenosina trifosfato -, dTTP - deoxitimidina trifosfato -,
dGTP - deoxiguanosina trifosfato -, dCTP - deoxicitosina trifosfato) são
selecionados de acordo com o pareamento ao molde e ligados a cadeia por
ligações fosfodiéster. Como, para cada dNTP, utiliza-se um fluorocromo
diferente, a eletroforese é realizada em um único canal do gel de seqüenciamento.
À medida que os fragmentos passam pelo feixe de laser, os fluorocromos são
excitados e a luz emitida, em diferentes comprimentos de onda, é detectada por
um fotomultiplicador. Esta informação é traduzida na forma de seqüência por
meio de um computador e apresentada no eletroferograma.
5. A mutação é uma mudança na sequência de DNA de um gene. Existem mutações
benéficas, mas a grande maioria gera doenças e características diferentes. Por
exemplo, a anemia falciforme é a substituição do ácido glutâmico pelo ácido
valina e causa uma alteração na forma da proteína. Assim, acontecem alterações
no formato dos glóbulos vermelhos do sangue deixando-os incapazes de
transportar oxigênio. A síndrome do cromossomo X frágil (SXF) caracteriza-se
por deficiência mental e padrão de herança dominante ligado ao cromossomo X.
É causada por mutação no gene FMR1, que apresenta, em sua região reguladora
(porção 5’ não traduzida), uma repetição de trinucleotídeos (CGG)n, cujo número
varia de 6 a 55 nas pessoas normais da população. Nos afetados pela SXF, o
número dessas repetições (CGG)n é superior a 200, constituindo a mutação
completa. Quando o número de trinucleotídeos da repetição (CGG)n está entre 55
e 200, tem-se a pré-mutação. Existem diversas vias de reparação do DNA que
sofreu mutação, são elas: fotorreativação, reparo pela cyclobutane pyrimidine
dimer (CPD) photolyase ou apenas fotoliase; remoção de grupamentos químicos,
as aquiltransferases removem grupamentos de hidrocarbonetos (alquil) que foram
inseridos nas bases transferindo, em seguida, para um resíduo de cisteína na
enzima; reparo por excisão de bases, reposição de bases danificadas ou alteradas;
reparo por excisão de nucleotídeos, elimina lesões pela remoção de trechos de
nucleotídeos e depois há o preenchimento da lacuna resultante através da DNA
pol I e a ligase une as pontas; reparo de mau pareamento, reconhece pareamentos
incorretos, detecta qual base foi inserida incorretamente, remove a base incorreta
e recruta o reparo por excisão de nucleotídeos, essa funciona durante a replicação
e precisa de sinais de metilação no DNA; reparo transleção, algumas mutações
obstruem a DNA pol III replicativa, o que pode levar a morte celular, reparo
translesão permitirá que a maquinaria de replicação atravesse o local da lesão,
prosseguindo a replicação; reparo de quebra de dupla-fita, União de extremidades
não homólogas onde complexos reconhecem pontas quebradas, ocorre, então,
excisão de nucleotídeos nas pontas.
6. Os elementos transponíveis de eucariotos enquadram-se em duas classes: classe 1
de retrotransposons e DNA classe 2 de transposons. Os retrotransposons, também
conhecidos como elementos classe 1, codificam uma transcriptase reversa que
produz uma cópia de DNA bifilamentar (a partir de um RNA intermediário) que
é capaz de se integrar em uma nova posição no genoma. Os transposons de DNA
codificam a transposase que corta o transposon do cromossomo e catalisa sua
reinserção em outros locais cromossômicos.
7. Para iniciar a transcrição de um gene, a RNA polimerase liga-se ao DNA do gene
numa região denominada promotor. Cada gene (ou, em bactérias, cada grupo de
genes transcritos juntos) tem seu próprio promotor. Um promotor contém
sequências de DNA que deixam a RNA polimerase ou as suas proteínas auxiliares
se ligarem ao DNA. Uma vez formada a bolha de transcrição, a polimerase pode
iniciar a transcrição. Uma vez que a RNA polimerase está na posição do promotor,
o próximo passo da transcrição — o alongamento — pode começar. Basicamente,
o a longamento é a fase que a sequência de RNA fica mais longa, graças à adição
de novos nucleotídeos. Durante o alongamento, a RNA polimerase "caminha" ao
longo de uma fita de DNA, conhecida como fita molde, da 3' para 5'. Para cada
nucleotídeo no molde, a RNA polimerase adiciona um nucleotídeo de RNA
correspondente (complementar) à extremidade 3' da fita do RNA. O transcrito de
RNA é quase idêntico à fita de DNA não-molde ou codificante. Contudo, as fitas
de RNA têm a base uracila (U) em vez de timina (T), assim como um açúcar
ligeiramente diferente no nucleótido. Assim, como podemos ver no diagrama
acima, cada T da fita codificante é substituído por um U no transcrito de RNA. A
RNA polimerase vai continuar transcrevendo até encontrar sinais para parar. O
processo de término da transcrição é chamado terminação e isso acontece uma vez
que a polimerase transcreve uma sequência de DNA conhecida como terminador.
Agora, elucidando as diferenças marcantes nas transcrições em procariotos e
eucariotos temos que nos primeiros há apenas uma RNA polimerase, já nos
eucariotos temos três (RNA pol I, RNA pol II, RNA pol III). Além disso nos
procariontes a holoenzima RNA polimerase liga-se ao DNA a partir da
subunidade sigma que reconhece o sítio de iniciação, já os eucariontes requerem
a montagem de muitas proteínas em um promotor antes que a RNA polimerase II
possa começar a sintetizar RNA. Algumas dessas proteínas são chamadas de
fatores gerais de transcrição. Outro ponto importante é que nos eucariotos a
transcrição ocorre no núcleo, enquanto a tradução ocorre no citoplasma. Já nos
procariotos tal separação celular não existe.
8. A tradução possui, assim como a transcrição, três etapas, sendo elas: iniciação,
alongamento e terminação. Dentro das células eucarióticas, a iniciação da
tradução acontece assim: primeiro o RNAt transportando a metionina se liga a
subunidade ribossômica pequena. Juntos, se ligam à extremidade 5' do RNAm
através do reconhecimento do cap 5' GTP (adicionado durante o processamento
no núcleo). Em seguida, eles "caminham" ao longo do RNAm na direção 3' e
param quando alcançam o códon de iniciação (com frequência, mas nem sempre,
o primeiro AUG). Nas bactérias, a situação é um pouco diferente. Aqui, a
subunidade ribossômica pequena não começa pela extremidade 5' e caminha em
direção a 3'. Em vez disso, ela se associa diretamente a determinadas sequências
no RNAm. Essas sequências Shine-Dalgarno antecedem os códons e "os
apontam" para o ribossomo. Na segunda etapa, o alongamento, o primeiro RNAt
transportador de metionina começa no compartimento do meio no ribossomo,
chamado de sítio P. Ao lado, um novo códon é exposto em outro compartimento,
chamado de sítio A. O sítio A será o "desembarque" para o próximo RNAt, aquele
cujo anticódon é o correspondente perfeito (complementar) do códon em
exposição. Uma vez que o RNAt correspondente desembarca no sítio A é hora da
ação: isto é, a formação de uma ligação peptídica que conecta um aminoácido a
outro. Esta etapa transfere a metionina do primeiro RNAt para o aminoácido do
segundo RNAt no sítio A. Agora temos dois aminoácidos. A metionina forma o
N-terminal do polipeptídeo, e o outro amioácido é o C-terminal. Depois que a
ligação peptídica é formada, o RNAm é puxado para frente no ribossomo por
exatamente um códon. Esse deslocamento permite que o primeiro RNAt, agora
vazio, saia através do sítio E (do inglês "exit"). Isso também faz com que um novo
códon fique exposto no sítio A, para que todo ciclo se repita. A tradução acaba
em um processo chamado terminação. A terminação acontece quando um códon
de parada no RNAm (UAA, UAG ou UGA) entra no sítio A. Códons de parada
são reconhecidos por proteínas chamadas de fatores de liberação, os quais se
adaptam perfeitamente no sítio P (embora não sejam RNAt). Fatores de liberação
confundem a enzima que normalmente forma as ligações peptídicas: fazem-na
adicionar uma molécula de água ao último aminoácido da cadeia. Essa reação
separa a cadeia do RNAt, assim a proteína recém-produzida é liberada.
9. Sabemos que uma molécula de RNAm é lida de uma ponta para outra, ou seja,
apenas uma das quatro bases diferentes, A, U, G ou C, pode ser encontrada em
cada posição. Assim, se as palavras que codificam aminoácidos tivessem uma
letra de tamanho, apenas quatro palavras seriam possíveis. Esse vocabulário não
pode ser o código genético, pois precisamos ter uma palavra para cada um dos 20
aminoácidos comumente encontrados nas proteínas celulares. Se as palavras
tivessem duas letras de tamanho, então 4 x 4 = 16 palavras seriam possíveis. Esse
vocabulário ainda não é grande o suficiente. Se as palavras tivessem três letras de
tamanho, seriam possíveis 4 x 4 x 4 = 64 palavras. Esse vocabulário fornece
palavras mais do que o suficiente para descrever aminoácidos. Podemos concluir
que a palavra código deve consistir em, pelo menos, três nucleotídeos. A prova
convincente de que um códon tem três letras de tamanho (e não mais que três)
veio dos estudos de Crick e Brenner, em 1961. Eles aproveitaram as mutações
supressoras do trabalho de Benzer sobre mapeamento genético em fagos para provar
que o código genético era realmente composto por trincas, oito anos após a ideia ter
sido proposta. Eles foram capazes também de demonstrar que a sequência de bases
do DNA era lida a partir de um determinado ponto, trinca por trinca, de maneira não
sobreposta. Isto significava que cada mensagem genética tinha uma estrutura de
leitura fixa que poderia ser alterada pela adição ou remoção de uma única base. O
polipeptídio especificado pela mensagem conteria aminoácidos incorretos a partir do
ponto em que a base foi adicionada ou removida. Um aspecto que deve ser ressaltado
é o fato destas mutações terem sido induzidas por corantes do tipo acridina, que
causam inserção ou deficiência de bases na sequência de nucleotídeos do DNA. Crick
e Brenner assumiram que se uma mutação fosse uma inserção de apenas uma base no
DNA da região rII (representada por um sinal +), a sua supressora deveria ser uma
deleção (representada por sinal -). Assim, se a sequência de bases do DNA estivesse
sendo lida trinca por trinca (da esquerda para a direita), começando de um ponto
determinado, a inserção de uma base determina que todas as trincas à direita da
mutação fossem lidas de maneira diferente do original; esta seria, portanto, uma
mutação do tipo mudança do quadro de leitura. Assim, a leitura correta das trincas
seria interrompida após uma mutação (+), sendo, entretanto, restabelecida após uma
mutação (−). Se a região alterada entre as duas mutações não for crítica, o
polipeptídeo pode ser funcional. Mutações supressoras devem estar sempre próximas
das mutações que elas suprimem, uma vez que é pouco provável que um polipeptídeo
contendo grande número de aminoácidos alterados permaneça funcional. Caso
tivéssemos uma segunda mutação de sinal (+), ela não teria suprimido a mutação (−)
e não haveria reversão para o tipo selvagem. A natureza tríplice do código somente
foi demonstrada quando foram obtidos mutantes contendo três mutações do tipo
inserções ou três deficiências, pois esses mutantes triplos tinham o fenótipo selvagem.
Este resultado só seria possível se o código fosse lido em trincas, pois somente neste
caso a ordem correta da leitura seria restabelecida após três alterações de mesmo sinal.
Os experimentos revelaram também a impossibilidade de apenas 20 dos 64 códons
possíveis serem usados para especificar aminoácidos. Neste caso, 44 códons não
teriam sentido, isto é, não corresponderiam a aminoácidos. Se isso fosse verdadeiro,
um destes códons sem sentido deveria muito provavelmente aparecer entre uma
inserção e sua deficiência supressora, determinando a terminação da cadeia
polipeptídica antes que a leitura correta fosse restabelecida. Em outras palavras, estes
estudos já sugeriam que o código genético era degenerado ou redundante. Dizer que
o código genético é degenerado significa que mais de um tipo de trinca de bases pode
determinar o mesmo aminoácido na cadeia polipeptídica.
10. O proteoma é enriquecido por dois processos celulares: a recomposição
alternativa do pré-mRNA e a modificação pós-traducional das proteínas. A
recomposição alternativa do pré-mRNA permite que um gene codifique mais de
uma proteína. As proteínas são feitas de domínios funcionais que são, em geral,
codificados por éxons diferentes. Assim, a recomposição alternativa de um pré-
mRNA pode levar à síntese de múltiplas proteínas (chamadas de isoformas) com
combinações diferentes de domínios funcionais. Modificações pós-traducionais
são eventos de processamento covalente que mudam as propriedades das proteínas
por clivagem proteolítica ou por adição de um grupo químico a um ou mais
aminoácidos. Estas modificações podem determinar a atividade, a localização, e
interações com outras proteínas. Na sinalização, por exemplo, cascatas de
quinases são ativadas e/ou desativadas pela adição e/ou remoção reversíveis de
grupos fosfatos. Outro exemplo é a ubiquitinação de ciclinas no ciclo celular que
corresponde à marcação de proteínas para a destruição em tempos definidos.

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