1.

ANTIGENELE ARTIFICIALE SI SINTETICE

2. INTERACTIUNEA ANTIGEN-ANTICORP

3. FORMAREA ANTICORPILOR

4. ORIGINEA DIVERSITATII ANTICORPILOR

5. TESTE IMUNOLOGICE.
IMUNOGLOBULINELE
Structură şi funcţie
IMUNOGLOBULINELE = Molecule
glicoproteice din fracția γ-globulinelor,
sunt produse de plasmocite dirivate din
limfocite B activate ca răspuns la un
imunogen
= ANTICORPI

Se desting:
1. Ig membranare (BCR) – conține regiuni
hdrofobe care străbat MC + scurtă
regiune citoplasmatică, prin care este
ancorată în structura membranelor
2. Ig solubile (secretate, Ac ca atare)
În 1970, prin consens între specialisti, OMS a stabilit ca substantele cu
proprietati de anticorp, sa fie grupate în categoria imunoglobulinelor,
pornind de la faptul ca toate substantele din acest grup au functie
imunitara si sunt cuprinse în fractia globulinica a serului.
Anticorpii nu sunt numai gamaglobuline. Exista si alte globuline cu
functie de anticorp, dupa cum exista si gamaglobuline care nu au
activitate de anticorp

+ -
albumin
Amount of protein

globulins

a1 a b g Immune serum
2 Ag adsorbed serum

Mobility
 Funcţii generale
• Legare Ag extracelulare
- Bacterii
- Toxine microbiene
- Virusuri
• Funcţii efectoare
– Fixare complement (atît in vivo cît și in vitro)
– Legare de celule - Phagocytic cells, lymphocytes, platelets,
mast cells, and basophils have receptors that bind
immunoglobulins. This binding can activate the cells to
perform some function. Some immunoglobulins also bind to
receptors on placental trophoblasts, which results in transfer
of the immunoglobulin across the placenta. As a result, the
transferred maternal antibodies provide immunity to the
fetus and newborn
STRUCTURA
Unitatea de bază –
imunoglobulina
monomeră –
moleculă
tetrapeptidică
simetrică=
• 2 lanţuri grele
(Heavy)
• 2 lanţuri uşoare
(Light)
• Punţi disulfidice
– Între lanţuri
– În cadrul lanţului
 Lanțul ușor (L) Lanțul greu (H) Balama

g.m. 25-23 kDa 53-73 kDa

Nr. AA 216 AA 450 AA 15
Variabilitatea maxima a secventei de aminoacizi a catenei L se concentreaza în
pozitiile 24-34, 50-55, 89-97, iar a catenei H, la secventele 30-36, 50-56, 86-91 si
95-100. Aceste secvente formeaza regiunile hipervariabile sau regiunile
determinante de complementaritate (RDC), fata de configuratia spatiala a
epitopului. Aminoacizii acestor secvente intra în alcatuirea situsului de combinare
al moleculei de Ig.
Secventele relativ invariante se numesc regiuni cadru (RC) si formeaza 80-85%
din regiunea variabila a moleculei de Ig. Variatia secventei aminoacizilor la nivelul
regiunilor cadru este limitata la 5%.
Secventa regiunilor cadru si a celor determinante de complementaritate
alterneaza astfel: RC1, RDC1, RC2, RDC2, RC3, RDC3, RC4, RDC4.
Structura stabilă, bilaterală și simetrică este determinată de:
1. punțile dislfidice intercatenare, nr. lor variază în dependență de clasa și sub
clasa Ig
2. Legături necovalente
3. Componentul(ele) glucidic împiedică interacțiunea prea puternică proteină-
proteină.
 REGIUNILE IMUNOGLOBULINELOR
• Regiune Variabilă
– VL & VH Papain

• Regiune Constantă
– CH & CL
• Regiune balama
• Domeniile
Disulfide bond
• Oligozaharide

Carbohydrate

Fc

CL Fab
VL

CH2 CH3
CH1
Hinge Region
VH
 Fragmentele Ig: relaţii structură/funcţie
A) Regiune Variabilă = fragmentul Fab (Antigen biding
fragment)
– VL & VH - determină specificitatea
- situate la extrimitatea NH2 terminală
- situsuri de combinare ale Ac prin formarea unei
cavități tridimensionale – centru activ (paratopul, 5-7
AA sau 3-4 reziduri glucidice) - care reacționează
specific cu epitopul Ag
– Valenţa = determinată de nr. de paratopi (1 - paratop -
Ac incomplet, 2- ... – Ac complet)
 Fragmentele Ig: relaţii structură/funcţie
B) Regiune Constantă = Fragmentul Fc (crystalizable, cytotropic,
compliment binding Fragment)
– CH & CL
– purtător de receptori,
– responsabil de activitatea biologică a Ig
– formează extremitățile carboxil-terminale
– asigură uniformitatea structurală și funcțională a unei clase de Ig
– transportul transplacentar al Ig
– fixează complementul
– fixarea proteinei A a stafilococilor
– definește clasele și subclasele de Ig (specificitatea antigenică a
catenei H)
 Fragmentele Ig: relaţii structură/funcţie
C) Regiune balama (lipsește la IgM și IgE)
– La mijlocul lanțurilor H
– 15 AA, Punți intercatenare S-S (Cys)
– Asigură flexibilitatea moleculei

Domeniile moleculei de Ig se formeaza prin plierea fiecareia din

cele 4 catene polipeptidice si prin rasucirea lor în spirala.
Domeniile sunt regiuni globulare ale moleculei, legate între ele
prin secvente lineare scurte. Domeniile se pliaza într-o
conformatie stabila, conferita de secventa proprie de aminoacizi.
Comparativ cu secventele lineare, domeniile pliate sunt mai
rezistente la proteoliza.
Catena L are doua domenii: unul corespunzator regiunii
variabile (VL) si altul corespunzator regiunii constante (CL).
Catena H are 4 domenii: unul corespunzator regiunii variabile
(VH) si trei domenii ale regiunii constante: CH1, CH2, CH3.
Componenta glucidica a imunoglobulinei
îndeplineste urmatoarele functii;
- realizeaza si mentine o conformatie a moleculei
de imunoglobulina, esentiala pentru secretie;
- mareste solubilitatea moleculelor de
imunoglobulina;
- are rol de spatiator între domeniile unui lant si
între catenele moleculei;
- participa la functiile citotrope ale moleculei de
imunoglobulina;
- are rol în legarea C1q, componenta a sistemului
complement .
Fragmentele Ig: relaţii structură/funcţie

Legare Ag

Legare complement
Legare receptori Fc

Transfer placentar
PROTEOLIZA IMUNOGLOBULINELOR
Papaina scindeaza molecula de imunoglobulina la nivelul
regiunii balama (aminoacidul 224) si elibereaza doua
fragmente Fab (Fragment antigen binding) si fragmentul Fc
(cristalizabil). Fiecare fragment Fab (50 kD) contine un lant
L întreg si jumatatea N-terminala a lantului H, notata cu Fd
(difficult), care cuprinde domeniile VH si CH1. Fragmentul
Fab poate fi scindat transversal si rezulta fragmentul Fv
(variabil) format din domeniile VL si VH, separat de
domeniile CL si CH 1.
Fragmentul Fc (50 kD) este format din jumatatile
C-terminale ale celor doua catene H, unite printr-o legatura
S-S si prin legaturi necovalente.
Pepsina cliveaza lan-turile H sub regiunea balama si
elibereaza fragmentul Fc’, mai mic decât fragmentul Fc
papainic si doua fragmente Fab’ legate între ele (Fab’)2,
prin punti S-S intercatenare.
 Fragmentele Ig: relaţii structură/funcţie
• Fab conține:
– regiunile V (variabile ale catenelor L și H)
– regiunea constantă a lanțului L (CL)
– regiunea constantă a lanțului H (CH1)
• Fc conține:
– Porțiunea mai mare a lanțului H
 Fragmentele Ig: relaţii structură/funcţie
• Glucidele Ig:
– Component oligozaharidic heterogen
– Localizare – regiunea C
– Forma – catene laterale (simple, complexe, Nr, tipul
situsul de legare dieferă și este caracteristic pt fiecare
clasă.)
– Comp. ch. – glucoză, galactozamină, manoză, fucoză,
ac. sialic.
– Conținutul 3%(IgG)-13%(IgE)
– Fixarea – în urma trecerii Ig prin RER a complexului
Golgi sub acțiunea transglicozidazelor
Organizarea conformaţională a
moleculelor Ig
 Heterogenitatea anticorpilor
Moleculele de imunoglobuline din plasma oricarui organism sunt foarte heterogene,
atât datorita diversitatii epitopilor fata de care s-au sintetizat – ceea ce induce variatii
ale secventelor hipervariabile ale moleculei, cât si datorita variatiilor secventei de
aminoacizi în regiunile constante ale moleculei.
Heterogenitatea anticorpilor este ordonata în clase, subclase, tipuri, alotipuri si
idiotipuri, pe baza variatiei secventei de aminoacizi.

Moleculele de imunoglobuline au calitati duble: ele se comporta nu numai ca

molecule de recunoastere, care recunosc specific antigenul, dar la rândul lor sunt
recunoscute ca antigene.

Variatiile de structura chimica a imunoglobulinelor se comporta ca determinanti

antigenici si induc sinteza anticorpilor anti-imunoglobulina. Variatiile de ordin
chimic ale imunoglobulinelor se evidentiaza prin metode imunochimice de
precipitare între moleculele de imunoglobulina cu rol de antigen si anticorpii anti-
imunoglobulina din serul imun.
Din punctul de vedere al manifestarii imunopotentei determinantilor antigenici ai
imunoglobulinelor, s-au definit trei nivele de heterogenitate: izotipica, alotipica si
idiotipica.
 HETEROGENITATEA Ig

1. Specificitatea izotipică – întîlnită la toți indivizii unei specii date.

Este reprezentată de prezența unor determinanți genetici care
diferențiază regiunile constante ale diferitor clase și subclase de
catene H, precum și tipurile de catene L. Este independetă de funcția
de anticorp, dar influențează funcțiile efectoare ale Ig. Exista 5
variante antigenice distincte ale catenelor H în regiunea constanta,
notate cu g, m, a, d, e, corespunzatoare celor 5 clase de
imunoglobuline: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE.
 HETEROGENITATEA Ig
2. Specificitatea alotipică (alos = altul)– este caracteristică pentru Ig unui număr
redus de indivizi ai unei specii date. Este reprezentată de determinații antigenici ce
caracterizează catele L și H, reprezentați de modificări în secvența AA din regiunile
constante ale lanțurilor polipeptidice. Nu influeanțează specificitatea și nici funcțiile
efectoare ale Ig.
Semnificatia variantelor antigenice alotipice ale moleculelor de imunoglobuline este
analoga celei a antigenelor de grup sanguin.
Fenomenul este general, adica si alte molecule provenite de la un organism pot fi
imunogene pentru alte organisme ale aceleiasi specii, la care se comporta ca
aloantigene.
Variantele moleculare alotipice sunt consecinta existentei genelor alele perechi (aa),
o caracteristica generala a organismelor diploide. Prin mutatii succesive, în acelasi
locus, apar mai multe alele care formeaza o serie polialelica - a1, a2, a3 …… an.
Genele alele ocupa acelasi locus pe cromosomii omologi, ca si gena de tip salbatic
a.
Fiecare individ va avea o combinatie de gene alele: aa1, aa2 ….. Aan.
Alotipurile imunoglobulinelor sunt rezultatul variatiilor secventei aminoacizilor în
regiunile constante ale catenelor H si L, ceea ce le confera un grad superior de
heterogenitate, consecinta a alelelor codominante la acelasi locus.
 HETEROGENITATEA Ig

Variantele idiotipice (idios = individual) este reprezentat de o populatie

omogena de molecule de anticorpi, sintetizate de descendentii unei
clone celulare, care recunosc si se combina cu un singur determinant
antigenic (epitop).
Condiționează antegenitatea Ac.
Determinantii antigenici ai catenelor L determina tipurile de
imunoglobuline.

Catena L are doua variante antigenice, notate cu k si l, care se

gasesc la toate cele 5 clase de imunoglobuline.

Cele doua tipuri structurale de lanturi L (k si l) prezinta deosebiri

de secventa a aminoacizilor în regiunea constanta si nu au
determinanti antigenici comuni.

Catenele L de tip k si l determina tipurile moleculare de

imunoglobuline.

La om, raportul Ig k/ l este 7/3, iar la soarece este 19/1, valori care
probabil reflecta raportul numeric al genelor codificatoare pentru
cele doua tipuri de catene.
 Tipuri lanţuri uşoare
• Kappa (k)
• Lambda (l)
 Subtipuri lanţuri uşoare

• Lanţurile lambda
– Lambda 1 (l1)
– Lambda 2 (l2)
– Lambda 3 (l3)
– Lambda 4 (l4)
 CLASELE DE IMUNOGLOBULINE
DUPĂ TIPUL LANŢURILOR GRELE:

• IgG - g
• IgM - m
• IgA - a
• IgD - d
• IgE - e
 Funcțiile biologice dominante ale claselor de Ig:

1. IgG prezintă cele mai multe particularități funcționale

caracteristice anticorpilor și determină imunitatea
pasivă la făt
2. IgA asigura rezistența imunitară în secreții, la nivelul
mucoaselor și manifestă o asctivitate antivirală netă
3. IgM anticorpul caracteristic primei faze a rezistenței
imunitare (răspunsul primar) participă în liza
bacteriilor;
4. IgD – receptor pe limfocitele B
5. IgE – rol de reagină, mediator principal în reacțiile
alergice.
 Subclase imunoglobuline
OMS în 1966 a propus denumirea celor 4 subclase în
baza concentrației în ser:
• Subclase IgG
– IgG1 - g1 – 70-80%
– IgG2 - g2 – 13-18%
– IgG3 - g3 – 6-8%
– IgG4 - g4 – 3%

• Subclase IgA
– IgA1 - a1
– IgA2 - a2
 Subclase imunoglobuline
Subclasa Lanțul Localizarea Nr. punților Semi-viața, Transfer Activarea
greu determinanților S-S zile placentar compleme
specifici de intercatenare ntului
subclasă
IgG1 1 Fc 2 21 + ++

IgG2 2 Fc 4 21 + +

IgG3 3 Fd 5 7,1 + +++

IgG4 4 Fc și Fd 2 21+ + -
 IgG
• Structură
– Monomer (7S)
– g.m. 150 kDa

IgG1, IgG2 şi IgG4 IgG3

 IgG
• Proprietăţi
– Concentraţie plasmatică: cea mai mare (75% din Ig
serice)
– Principala Ig în spaţiul extravascular
– Transfer placentar – nu necesită legare Ag (IgG2)
– Fixează complement ( cu excepția IgG4)
– Se leagă de receptori Fc ai celulelor imune (IgG2,
IgG4)
– Semi-viața 21 zile
– Manifestă activitate opsonizantă, antibacteriană,
antitoxică, antivirală
 IgM
Lanţ J
• Structură
– Pentamer (19S)
– Extra domeniu (CH4)
– Lanţ J
CH4
– G.m. 900kDa
 IgM
• Structură
• Proprietăţi
– Concentraţie plasmatică: imediat după IgG (5-6%
din totalul Ig)
– Prima Ig produsă de fetus şi de către celulele B
– Fixează complement
– Semi-viața 5 zile
– Apar primele după un stimul Ag, indică un proces
infecțios acut.
Fixarea C1 de către IgG şi IgM
 IgA
• Structură
– În plasmă - monomer
– În secreţii (sIgA)
• Dimer
• Lanţ J
• Componentă secretorie

Componentă Lanţ J
secretorie
 IgA
• Structură
• Proprietăţi
– Concentraţie plasmatică: după IgG
– Principala Ig în secreţii (imunitatea mucoaselor)
• lacrimi, saliva, suc gastric, surfactant pulmonar
– Nu fixează complement
– Se leagă de receptorul Fc al unor celule imune
 IgD

• Structură
– Monomer (6,5S)
– G.m. 170kDa
– Piesă “coadă”
(tail piece)
Tail Piece
 IgD
• Structură
• Proprietăţi
– Concentraţie plasmatică: pe locul trei (0,2%)
– Ig prezentă pe suprafaţa celulelor B
– Nu fixează complement
– Semi viața 3 zile
– Posibil participă la eliminarea limfocitelor B care
produc autoAc
 IgE

• Structură
– Monomer (7,9S)
– G.m. 185kDa
– Extra domeniu (CH4)

CH4
 IgE

• Structură
• Proprietăţi
– Concentraţie plasmatică: cea mai redusă (0,002-0,01%)
• Se leagă de bazofile şi mastocite (nu necesită legare Ag) , șoc
anafilactic, recții alergice
– Parazitoze (opsonizarea (cresc sensibilitatea pentru procesul de
fagocitare) helminţilor și artropodelor )
• Se leagă de receptorul Fc al eozinofilelor
– Nu fixează complementul
– Semi-viața 2-3 zile, termolabile – inactivate la 560C în 30
min
 Proprietățile fizico-chimice, imunochimice și biologice ale Ig umane

IgG IgA IgM IgD IgE

Clasa lanțului H γ α μ δ ε
Tipul lanțului L K sau λ K sau λ K sau λ K sau λ K sau λ
G.M., kDa 150 160 900 180 200
Viteza de sedimentare, S 7 7, 10, 13- 18-20 7 8
15, 17
Glucide, % 2-6 5-15 5-15 18 18
Variante izotipice și subclase IgG1-IgG4 IgA1-IgA2 IgM1-
de lanț H IgM2
Apariția în cursul răspunsului ultima Interme- prima
imun diar
Activarea complementului + - ++++ - -
Liza bacteriilor + + +++ - -
Inhibarea replicării virale + +++ +
Functiile moleculei de imunoglobulina
În ansamblul efectorilor sistemului imunitar, moleculele
de imunoglobulina îndeplinesc doua categorii de functii:

- functii de specificitate
- functii grupate sub denumirea de activitati biologice
efectoare
Specificitatea imunoglobulinei fata de un antigen este exprimata prin capacitatea de
recunoastere fina a epitopului complementar al antigenului si de combinare cu acesta.
Specificitatea moleculei de imunogobulina este conferita de situsul sau de combinare.
Marea diversitate a moleculelor de anticorpi, asigura o diversitate uriasa a situsurilor de
combinare.
Specificitatea de legare este data de structura spatiala a situsului de combinare cu
antigenul, conferita de resturile de aminoacizi ale regiunilor hipervariabile ale catenelor H
si L.
Aminoacizii care formeaza situsul de combinare al moleculei de imunoglobulina, prin
plierea regiunilor hipervariabile, delimiteaza o cavitate moleculara ce difera ca forma si
marime.
Cavitatea prezinta substructuri (proeminente si depresiuni), pe care le formeaza secventele
hipervariabile, în timp ce restul regiunilor variabile ale celor doua catene confera structura
tridimensionala a cavitatii moleculare. Potrivirea spatiala dintre situsul de combinare al
moleculei de anticorp si epitopul specific, din punctul de vedere al configuratiei spatiale,
este perfecta. Eventualele imperfectiuni geometrice pot fi ocupate de moleculele de apa.
Potrivirea perfecta a celor doua unitati combinante este sugerata de metafora “cheie-
broasca”.
Dupa combinarea cu antigenul, modificarile spatiale ale situsului de combinare a
anticorpului sunt minime, nedectabile. Epitopul antigenic are un rol important în
potrivirea conformationala perfecta cu situsul de combinare a anticorpului, deoarece
corespunde unei regiuni moleculare cu factor de temperatura mai ridicata, ceea ce
sugereaza o flexibilitate mai accentuata a secventei moleculare respective.
Functiile biologice efectoare sunt amorsate de reactia antigen-anticorp și sunt dependente de
regiunile constante ale moleculei de imunoglobulina.
Fiecare domeniu al regiunii constante a moleculei de imunoglobulina îndeplineste anumite
functii:
- legarea antigenului pe imunoglobulinele de suprafata care functioneaza ca receptori pe
limfocitele B, declanseaza proliferarea si diferentierea lor, iar legarea antigenului cu
imunoglobulinele citotrope pentru mastocite, declanseaza degranularea acestor celule;
- dupa cuplarea cu antigenul, moleculele de imunoglobulina expun fragmentul Fc, recunoscut
ulterior de receptorii specifici pentru Fc de pe suprafata monocitelor, macrofagelor, PMNN.
Astfel se stimuleaza procesul de fagocitoza a celulelor nonself tapetate cu imunoglobuline,
denumit imunofagocitoza;
- celulele K, prin intermediul receptorilor pentru Fc, interactioneaza cu celulele nonself tapetate
cu IgG si realizeaza liza de contact prin fenomenul de citotoxicitate;
- interactiunea antigen-anticorp genereaza un semnal care se transmite regiunii Fc. Aceasta îsi
modifica configuratia spatiala si expune un situs de recunoastere de care se leaga C1q;
- regiunea balama este transductoare de semnale si are un rol important în flexibilitatea moleculei
de imunoglobulina, permitând variatia unghiului dintre fragmentele Fab: ele trec reversibil de la
forma T la Y. Geometria variabila a moleculei de imunoglobulina mareste eficienta de legare a
antigenului, deoarece ajusteaza pozitia celor doua situsuri de combinare ale anticorpului, în
functie de distanta la care se gasesc determinantii antigenici pe suprafata unui antigen particulat
(virus sau celula);
- regiunea balama a moleculelor de IgG si IgD este sensibila la actiunea enzimelor proteolitice,
iar a moleculei de IgA este rezistenta.
IMUNOGLOBULINELE

genetică, diversitatea Ig
 Genele imunoglobulinelor
Localizarea cromozomială a genelor pentru
imunoglobuline:
• lanţuri grele: cromozom 14q32
• lanţ uşor k: cromozom 2p11-12
• lanţ uşor λ: cromozom 22q11-12
 Genele imunoglobulinelor
• Fiecare limfocit exprimă pe suprafaţă un receptor de Ag specific.
• Genele sun rearanjate din repertoriul de segmente genice:
 Segmente genice

• Regiunile variabile ale lanţurilor grele şi uşoare au trei

regiuni hipervariabile fiecare (complementarity-
determining regions, CDRs)
• Regiunea variabilă a lanţului greu este codificată de
către trei segmente genice:
– V (“variabil”): codifică reg variabila a lant greu
– D (“diversitate”): segment de diversitate.
– J (“joining”): segment de legătura al lantului greu
 Mecanism de rearanjare
• Rearanjarea = un segm de gena dintr-o
regiune se disloca → in alta regiune
– un nr de secvente se pierd intr-o regiune dar se
reutilizeara in alta
– → structura unei noi gene functionale
– → lant nou ARN → o noua Ig
Rearanjamentul genelor Ig:
(în timpul dezvoltării limfocitelor B)