Metode de sterilizare si dezinfectie

Sterilizarea reprezinta distrugerea sau indepartarea tuturor microorganismelor

patogene sau nepatogene. Forme vegetative(spori) de pe o suprafata sau dintr-un
mediu.(lichid sau solid)
Septic - reprezinta contaminat cu microbi patogeni
Aseptic - lipsit de microbi indiferent daca sunt patogeni sau nu
Asepsia - ansamblul de metode prin care evitam contaminarea mediului ambiant cu
germeni microbieni sau prin care putem mentine sterilitatea tesuturilor a mediilor de
cultura etc
Dezinfectia - distrugerea formelor vegetative, microbiene (uneori si a sporilor) din
anumite medii(solide sau lichide sau depe suprafete) se realizeaza cu ajutorul unor
agenti fizici sau cu aj unor substante dezinfectante.
Antisepsia - inlaturarea sau distrugerea formelor vegetative, microbiene de pe
tegumente, mucoase sau din plagi. Ea se realizeaza cu ajutorul substantelor
antiseptice.

Sterilizarea - 1 prin caldura

- uscata
- umeda

2 prin filtrare

3 prin radiatii

4 metode chimice de sterilizare

1 caldura uscata - ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene.

O prima metoda este sterilizarea prin incalzire la rosu - inseamna introducerea si
mentinerea in flacara becului Bunsen pana la inrosire pe toata lungimea a obiectului
care irmeaza a fi sterilizata - ansa bactereologica cu bucla si cu fir sau pentru spatula

Un alt tip o reprezinta flambarea - trecerea prin flacara de cateva ori a unui obiect
fara a atinge temperatura de incandescenta - se aplica ptru portansa, gatul unui
recipient de sticla, tub, eprubeta, flacon,

Prin aer umed - se realizeaza prin etuva ~pupinel - etuba este o cutie metalica cu
pereti dubli, cu aj unei rezistente electrice si unui termostat se obtine si mentine
temperatura ptru sterilizare.
Temperatura ptru maj obiectelor este de 180 grade iar ca timp 1 ora
In anumite situatii timpul poate depasi 1 ora ptru obiecte mari

Este indicata ptru obiecte de sticla, de portelan, instrumentar chirurgical

Nu se sterilizeaza in etuva obiectele de plastic, de cauciuc, vata, bumbac, materialele

contaminate(insamantarile)

Un alt procedeu este incinerarea -

Autoclavarea - se realizeaza in niste aparate numite autoclave
Vaporii de apa realizeaza la 0.5 atmosfere o temperatura de 115 grade celsius, la o
atmosfera avem vaporii de apa la 121 grade iar la 2 atmosfere trebuie sa fie 124
grade celsius. Se pot steriliza sticlarie cu exceptia pipetelor si lame, materiale
contaminate de laborator.

Alte metode de sterilizare sunt pasteurizare si fierberea dar care nu reprezinta

metode propriuzise de sterilizare

Pasteurizarea - caldura umeda, are aplicatii in conservarea ptru scurta durata a unor
alimente(lapte, bere)
Exista pasteurizare joasa - 30 min la 55-65 grade
medie 15 min 65-75 grade
Inalta - 2-5 min la 85-90 grade

Fierberea - poate fi utilizata atunci cand nu exista alta metoda de sterilizarea, timp de
30 min distruge bacteriile in forma vegetative dar nu si sporii bacterieni, timpul se
inregistreaza dupa ce apa a inceput sa fiarba, eficienta poate fi crescuta prin
adaugarea de carbonat de sodiu 1-2%

Sterilizarea prin filtrare - microorganismele pot fi retinute mecanic si electrostatic in

porii unui filtru.

Sterilizarea prin radiatii - radiatiile neionizante UV sau ionizante X au efecte

bactericide prin ruperea legaturilor de H sau oxidarea legaturilor duble. Radiatiile UV
sunt utile in sterilizarea suprafetelor de lucru pentru mediile de cultura, in cazul in
care nu exista hote microbiologice

Antisepsia si dezinfectia
Antisepticile si dezinfectantele - substante cu actiune antimicrobiene neselective
alterand functii comune microorganismelor si fiintelor superioare, Antisepticile pot fi
utilizate pe tegumente si mucoase iar dezinfectantele numai pe suprafete si structuri
care nu sunt vii.

Clasificare in fctie mecanism de actiune

1 substante care denatureaza proteinele si au efect bactericid sunt - acizii, bazele,
alcooluri
2 substante care oxideaza gruparile chimice libere ale enzimelor - hipermanganatul
de potasiu 1 la mie, peroxidul de oxigen solutie de 3% in apa,
3 substante care blocheaza gruparile chimice libere al;e enzimelor - metale grele -
Sarurile de mercur, saruri de argint, compusi care contin alchil al formaldehidei,
oxidul de etilena
4 substante care lezeaza membranele celulare - fenolii, crezolii, clorhexidina,
detergentii, substante cationice- saruri cuaternare de amoniu(bromocet),
5 substante care altereaza acizii nucleici - colorantii bazici(violet de gentian, albastru
de metilen), derivati de acridina(rivanol)

Controlul sterilizarii - se realizeaza prin indicatori fizici(temperatura), chimici (floarea

de sulf) sau biologici(spori de bacilus)

17.10.2012
Diagnosticul bactereologic

schema generala

diagnosticul de laborator bactereologic sau micologi are mai multe etape

1 recoltarea si transportul produsului patologic

trebuie sa se realizeze cat mai aproape de debutul bolii, inainte ca pacientului sa i se
fi administrat antibiotice sau chimioterapice cat mai rapid si corect dpdv al tehnicilor
utilizate respectand toate normele de asepsie si antisepsie prelevand sau recoltand
un anumit produs patologic in fctie de manifestarea clinica in cazul respectiv de ex in
caz infectie urinara - urina, dizinterie - fecale, sputa in tbc

2 examen microscopic - ptru el se realizeaza minim un frotiu din produsul patologic

recoltat si transportat care se va colora in coloratia Gram
este preferabil sa avem intotdeauna cel putin inca un frotiu de rezerva in special in
cazul anumitor produse patologice. Ex - LCR, produse recoltate prin punctie biopsie.
In cazul suspicionarii unei infectii micobacteriene (Koch) este necesara unui al doilea
frotiu care se va colora in coloratia ziehl-niellsen. Frotiurile se examineaza la MO
initial cu obiectiv de 40 ptru o analiza mai generala, ptru stabilirea campului
microscopic al zonei de interes apoi se examineaza cu obiectivul de imersie. Se
noteaza prezenta diverselor celule, eventual modificate de normal, prezenta celulelor
inflamatorii care reprezinta dovada reactivitatii organismului. Atunci cand produsul
recoltat e reprezentat de sange, urina sau materii fecale de regula nu se realizeaza
frotiuri fixate si colorate
Ex in cazul materiilor fecale se va face un preparat proaspat (nativ) intre lama si
lamela cautandu-se in special prezenta leucocitelor. In cazul suspicionarii unei infectii
urinare se realizeaza un sediment urinar dupa centrifugarea urinei care se va
examina intre lama si lamela in vederea aprecierii nr de leucocite ;pe camp
microscopic a prezentei unor cilindri leucocitari precum si a altor celule, normale sau
patologice.

3 cultivarea pe medii de cultura a produsului patologic se va face in fctie de situatie

si anume - mediile si conditiile de incubare se vor alege in fctie de presupusul
microorganism pe care vrem sal izolam. Cultivarea se va realiza in asa fel incat sa se
poata obtina colonii izolate tehnica se numeste insamantarii in poligon , colonie care
urmeaza a se identifica

4 identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor

caractere

a caractere morfologice - se va realiza un frotiu care se va fixa si colora cu Gram sau

zihl-niellsen prin examinarea frotiului se vor evidentia microorganisme cu forma si
tintorealitatea specifice

b caractere de cultura - pe mediile de cultura se vor examina coloniile izolate aparute

pe mediile de cultura solide si care pot fi: colonii de tip s(smooth) ptru maj germenilor
studiati, tip R(rugos) ptru alte bacterii

c caractere biochimice - acestea pot fi foarte variate de la o specie la alta si sunt

foarte utile spre ex in cazul diferentierii enterobacteriilor, fiecare bacterie poate
creste si metaboliza anumite substante (glucoza, maltoza etc)

(teste biochimice care folosesc zaharurile; TSI, MIO, sau folosesc citratul zimmos)
d caractere antigenice - vor fi examinate bazandu-ne pe structura si antigenicitatea
microorganismelor si pe specificitatea reactiilor antigen-anticorp; vom utiliza
anticorpi cunoscuti ptru a identifica antigenele necunoscute spre ex : prin reactii de
aglutinare directa - pe lama se pot identifica antigenele si respectiv speciile si
tulpinile din genul shigella, salmonella, vibrio ;;; reactii de aglutinare indirecta - se
utilizeaza ptru id stretococilor de grup A sau B, unor enterotoxine sau ptru detectarea
unor fungi.

e caractere de patogenitate - putem examina capacitatea unui microorganism de a

elabora anumite substante cu rol in patogenitate de ex coagulaza produsa de
stafilococul auriu sau infectia experimentala a unui animal de laborator. Ex - izolarea
pneumococilor de la pacient cu pneumonie dupa inoculoarea sputei la un cobai, in
cazul in care in sputa avem pneumococi cobaiul moare in 24-48 ore iar din sangele
cobaiului se va izola o cultura pura de streptococus pneumonia.

f sensibilitatea la un anumit bactereofag specific (lizotipie)

g alte caractere id de ex prin metode ale biologiei moleculare sau alte metode
moderne

5 antibiograma - antifungigrama adica testarea sensibilitatii la antibiotice si

chimioterapice antibacteriene si antifungice in vederea stabilirii tratamentului, se
realizeaza de obicei prin metode difuzimetrice

In cazul unor infectii grave antibiograma difuzimetrica trebuie sa fie completata de

determinarea unei concentratii minim inhibitorii (CMI) si respectiv bactericide(CMB)

24.10.2012

Recoltarea si transportul produselor patologice in diagnosticul microbiologic corect -

reprezinta o etapa esentiala in diagnostic intrucat exista posibilitatea contaminarii
produsului patologic si implicit a esecului.

Reguli privind recoltarea

1 este rcomandabil ca recoltatrea si stabilirea modalitatii de transport a produsului

patologic (PP) sa fie facute de medic sau sub indrumarea unui medic de specialitate.
2 prelevarea produsului patologic trebuie sa aibe loc inainte ca pacientul sa fi primit
antibiotice sau chimioterapice, in cazul in care tratamentul cu antibiotice s-a instituit
inainte de prezentarea la laborator sunt mai multe optiuni
a oprirea daca e posibil al tratamentului ptru o perioada de 24-48 ore cu recoltarea
produsului patologic si inceperea diagnosticului microbiologic.
b recoltarea produsului patologic trebuie sa se faca imediat inainte de urmatoarea
doza de antibiotic
c incercarea de antagonizare a efectului antibioticului in mediul de cultura(cu sulfat
de magneziu ptru tetraciclina)
d pp din care estimam ca vom putea izola agentul etiologic al bolii suspicionate va fi
ales in fctie de simptomatologia clinica astfel
-recoltam o secretie de la nivelul presupusei porti de intrare(secretie nazala sau
faringiana in difterie)
- un produs de la nivelul cailor de raspandire in organism(sange)
- un produs de la nivelul cailor de eliminare din organism (urina)
- un produs de la nivelul focarului infectios(lichid cefalo rahidian- meningita, sputa in
pneumonie)
3 periodicitatea cu care se realizeaza recoltare, in anumite cazuri poate influenta
rezultatul

In suspicionarea unui sepsis se recomanda recoltarea a 2-3 probe de sange in 24 ore

pentru hemocultura

in suspicionarea o boala diareica acuta se recomanda recoltarea a cate unei probe de

materii fecale 3 zile consecutiv pentru coprocultura

in suspicionarea unei tuberculoze pulmonare se recomanda recoltarea a cate unei

proba de sputa 3 zile consecutiv

Din PP se vor recolta si utiliza in cursul diagnosticului microbiologic portiunile cele

mai reprezentative respectiv acele portiuni in care sunt cele mai mari sanse de a
identifica microorganismul vizat(in suspicionarea diareeca acuta - portiuni
mucopurolente sau mucosangvinolente)
Recoltarea si transportul produsului patologice se realizeaza in conditii de asepsie
pentru prevenirea contaminarii celui care recolteaza, ptru prevenirea suprainfectarii
pacientului si pentru prevenirea contaminarii produsului patologic.
Se vor utiliza instrumente sterile si recipiente, containere sau recoltoare sterile.
Recipientele ptru recoltare si transport trebuie curatate si sterilizate. preferabil prin
autoclavare, iar inchiderea recipientelor trebuie sa fie perfecta ptru a preveni orice
contaminare pe parcursul transportului
Datele de ID ale probei se trec obligatoriu in urmatoarele documente
- se trece in registrul unitatii sanitare care solicita analiza, in cazul in care recoltarea
se face inafara laboratorului
- formularul
- in registrul de lucru al laboratorului
- in formularul prin care se anunta rezultatul analizei.

Motivele ptru care un produs patologic ar putea fi respins

Un produs patologic a fost receptionat fara ID, exista cazuri in care pp a fost ID dar e
necorespunzator(sputa recoltata pe parcursul de 24 ore, sputa care contina saliva si
secretii din tract respiratoe superior, urina recoltata cu mai mult de 60 min in urma,
exudatul nazal, urina, fecale ptru germeni anaerobi sau pp ptru care este evidenta
contaminarea- inchiderea necorespunzatoare a recipientului)

Transportul produselor patologice - trebuie sa urmeze regula pp trebuie sa ajunga la

laborator in cel mai scurt timp posibil
Contraindicatii

- mentinerea la temperatura scazuta - un container izoterm cu gheata la 0grade C

sau frigidere la 4 grade, cu toate acestea sunt anumiti germeni (meningococul,
gonococul, hemofilus influenzia)

Medii speciale de transport - carry blair

adaugarea de penicilina, streptomicina si cloramfenicol atunci cand se urmareste un

fung

transportul catre laborator se realizeaza de curier specializat.

in recipientele etanse se lipesc pictograme cu biohazard.

Exemple de recoltare si transport ptru cateva PP

Ptru exudate optice sau nazale -- pacientul pe un scaun, pe sursa de lumina, utilizam
2 taqmpoane cu vata obisnuita, usor umezite in ser
un tampon se va utiliza ptru examenul microscopic direct
al doilea se utilizeaza ptru insamantarea pe mediide cultura

in caz de difterie se utilizeaza 3 tampoane

tamponul trebuie incarcat cat mai bine cu pp adica il rotim relativ ferm pe suprafete
cu secretie

In caz de exudat faringian - se recolteaza dimineata inainte sa manance si fara ca

acesta sa se fi spalat pe dinti si fara sa recurga apa de gura.
in cazul ca s-a intamplat recoltarea se face dupa 4 ore
se sta pe scaun , gatul in usoara extensie
recomandabil stam in lateral ptru a evita contaminarea cu picaturi al unui abcess de
tuse
deprimam baza limbii cu apasator de limba steril si in conditii de iluminare adecvata
examinam faringele posterior, pilierii, amigdalele ptru a sesiza care sunt zonele
imflamate(rosii cu depozite, ulceratii si eventualele depozite purulente)
utilizam 2 tampoane, in caz de difterie se utilizeaza 3 tampoane
Solicitam pacientului sa spuna a si prin stergere recoltam secretia
evitam atingerea bazei limbii sau a palatului moale

In caz de sputa - inaintea prelevarii se recomanda periaj simplu al dintilor, clatirea

energica a gurii si gargara cu apa sau ser
daca proba pare constituita in principal din saliva solicitam recoltarea din nou,
stimularea expectoratiei prin ingalarea de aerosoli calzi cu solutie salina 3% ofera
probe citologice nesatisfacatoare utila in diagnosticul pneumocistis caryni
In cazul suspicionarii unei infectii fungice probele fluide se concentreaza prin
centrigugare 20 min la 3000 rot/min apoi se examineaza sedimentul
Fluidifierea (n-acetil cisteina) permite omoginizarea pp
pp recoltate se trimit la laborator cat mai curand preferabil in max 2 ore
Produsele recoltate itr-un recoltor steril 50-200 ml cu capac care permite o inchidere
etansa sunt etichetate si expediate imediat la laborator ptru a fi examinate.
Nu exista modalitati optime de conservare a sputei, mentinerea la 4grade previne
multiplicarea microorganismelor, conserva unii dintre germenii patogeni dar scade
pana la anulare de izolare a altora(meningococul si hemofilius influenza)

Deasemenea utilizarea unui mediu de transport perturba raportul dintre bacterii si

reperele citologice ale probei esentiale ptru aprecierea calitatii probei si interpretarii
rezultatelor sputoculturii,.
In cazul in care se urmareste spre exemplu izolarea micobacterium pneumonia
cultivarea trebuie facuta cat mai rapid
produsul patologic poate fi conservat maxim 4 ore

Puroiul - Este recomandat ca ptru recoltare utilizam tampoane sterile, el poate fi

recoltat cu ansa bactereologica, cu pipeta pasteur sau cand e vb de colectii profunde
prin punctie si aspirare. Atunci cand suspicionam infectia cu microorganisme
anaerobe sunt necesare niste conditii speciale deoarece exista germeni anaerobi care
sant inactivati in cateva secunde la contactul cu oxigenul.
31.10.2012

Transportul si recoltarea principalelor produse patologice

Lichid cefalo rahidian - se recolteaza in cazul suspicionarii unui sindrom meningeal

dupa examinarea fundului de ochi, verificam presiunea in artera principala a retinei si
observam daca exista sau nu semne de staza papilara.
recoltarea se face de catre medicul de specialitate
tehnicile de asepsie trebuie sa fie riguroase
existe meningite infectioase si neinfectioase iar cele infectioase pot fi bacteriene,
fungice, parazitare, virale, prionice
pentru elucidarea etiologiei unei astfel de meningite e necesara efectuarea unor
examinari biochimice suplimentare celor citologice si respectiv microbiologice.
astfel incat este necesara recoltarea la adult a unei cantitati cuprinsa intre 5-10 ml de
lcr.
se recomanda recoltarea lcr-ului in 2-3 tuburi sterile
2 tuburi vor fi centrifugate iar din al 3-lea tub se vor realiza testele biochimice cu o
exceptie, daca lcr este franc purulent examenul microscopic direct se face fara
centrifugare.
ca orice produs patologic lcr trebuie prelucrat imediat dupa recoltare cu alte cuvinte
recoltarea si examinarea produsului patologic trebuie sa inceapa la patul bolnavului.
noi ca si practicieni trebuie sa avem pe langa trusa de recoltare, o spirtiera, stativ
ptru eprubete, si eventula niste medii de cultura(agar-sange, sabouraut)
daca e necesar ca lcr sa fie transportat transportul trebuie sa fie cat mai rapid si la o
temperatura apropiata de temperatura corpului uman (mezofile)
In nici un caz lcr nu trebuie refrigerat deoarece hemofilus influenza si niseria
meningitis mor prin refrigerare

Hemocultura - arborele circulator e in mod normal steril, baterimie sau fungemia

reprezinta prezenta tranzitorie si de regula intermitenta a bacteriilor sau fungilor in
torentul circulator. bacterimia se poate insoti de semne clinice: cresterea temperaturii
si/sau frison, si alte semne clinice
situatii care produc bacterimie : in timp sau dupa extractii dentare sau periajul mai
energic al dintilor folosind periute de dinti dure, in curs de cateterisme,
bacterii care pot contamina : stafilococul epidermidis, coline bacterium (difteria),
streptococi non hemolitici
in realizarea unei hemoculturi tinem cont de 2 aspecte
1 momentul recoltarii sangelui
2 volumul de sange recoltat

1 - este recomandat ca recoltarea sa fie urmata de insamantarea direct pe mediul de

cultura la patul bolnavului ptru a preveni contaminarea (sistem inchis de recoltare si
insamantare fara a mai exista etapa de trasport)
mediile de cultura sunt medii lichide imbogatite (bulion infuzie de cord-creier- ptru
anaerobi, ptru bacterie cu multiplicare lenta este recomandata utilizarea mediului
bifazic care cultiva in 2 trepte mediul geloza - chocolat, suplimentat cu mediul lichid
bulion tripticaza din soia)
in cazul in care recoltarea a fost realizata simultan in 2 flacoane ptru hemocultura
unul dintre flacoane va fi incubat in aerobioza, celalalt in anaerobioza
ptru unele microorganisme (brucella) incubarea se face in atmosfera de 5-10 % co2
iar temperatura de incubare e cel mai frecvent cuprinsa intre 35-37 grade celsius

examinarea flacoanelor de hemocultura se face de 2 ori pe zi timp de 3 zile dupa

care ele se examineaza zilnic timp de miinim 7 zile, examinarea se face macroscopic,
urmarind o serie de aspecte care ar putea traduce o crestere microbiana si anume.
tulburarea mediului mai mult sau mai putin uniform, aparitia unei pelicule la
suprafata mediului lichid sau aparitia unor bule de gaz
dpdv microscopic putem realiza frotiuri din ceea ce a crescut in acele flacoane, le
coloram Gram
dupa obtinerea culturii pure trecem la identificarea definitiva a agentului etiologic si
determinarea sensibilitatii la antibiotice si chimioterapice
in momentul de fata exista sisteme automate utilizate ptru hemocultura(bacter - ex)
in cazul in care rezultatul este pozitiv flaconul e analizat prin metode ale
microbiologiei clasice;

recoltam minim 2 probe de sange pe parcursul a 24 ore in anumite

cazuri(endocardita bacteriana subacuta - bacterimia e continua) in acest caz e
suficient 2 hemoculturi in 24 ore, in sepsis recoltam 3 hemoculturi din sedii diferite
pe parcursul a 10 minute.
in febra de origine necunoscuta recoltam 2-3 hemoculturi din sedii diferite la un
interval de timp cuprins 45-60 minute

2 - de regula in cursul unei bacteremii nr de unitati formatoare de colonii(ufc) pe ml

de sange e redus astfel incat trebuie recolta un volum de sange adecvat
pentru fiecare hemocultura recoltam cam 20 ml de sange la adulti si intre 1 si 5 ml la
nou nascuti, sugari si copii mici

reguli generale in recoltarea sangelui si hemoculturii

sangele fiind un produs biologic in mod normal steril vom izola cel mai adesea un
singur agent etiologic, izolat putem gasi si mai multi
dintre acesti agenti etiologici cu semnificatie clinica izolati cel mai frecvent din
hemoculturi sunt : stafilococul auriu, diferite enterobacterii, niseria meningitidis,

tinem cont ca in sange exista o serie de factori antimicrobiene a caror actiune trebuie
pe cat posibil diminuata, fie prin diluarea sangelui 1/10 pe mediul de cultura sau prin
utilizarea unor substante chimice care pot neutraliza (polianetol sulfonat de sodiu)
antib

mediile de cultura si conditiile de incubare trebuie alese in asa fel incat sa permita
cresterea agentilor etiologici presupusi

asigurarea calitatii mediilor de cultura va include atat controlul sterilitatii fiecarui lot
sau cat si controlul eficientei acestora
prin inocularea mediilor respective cu tulpini de referinta

ca la orice recoltare trebuie respectare regulile de asepsie si inaintea oricarui

tratament antimicrobian

la interpretarea rezultatului hemoculturii avand in vedere pe de o parte posibilitatea

contaminarii unei hemoculturi iar pe de alta parte cresterea incidentei hemoculturilor
pozitive cu semnificatie clinica in care sunt implicate microorganisme conditionat
patogene trebuie o colaborare buna intre mediul internist si cel de laborator.

7.11.2012

Utilizarea microscopului optic

examen microscopic al bacteriilor
preparateproaspete, frotiuri coloranti si coloratii

fctionarea microscopului optic

pe camp luminos -
mo este un instrument care permite observarea obiectelor mai mmici decat cele care
pot fi vazute cu ochiul liber.
microscopul formeaza imagini virtuale, marite si rasturnate ale obiectului cu ajutorul
unui sistem de lentile cu obiectiv si lentile oculare
in mo pe campluminos lumina este transmisa dealungul axului optic al
instrumentului prin preparate. In aceste conditii obtinandu-se un camp vizual
puternic luminat in care obiectele pentru a putea fi vazute se disting pe fondul
luminos fie prin opacitate fie prin culoarea lor

partile componente ale mo

mo are urmatoarele parti componente
1 piciorul microscopului, alcatuit dintro masa metalica cu rol de sustinere pe care se
sprijina platina microscopului, pe platina se aseaza preparatul
platina prezinta un orificiu central, care permite trecerea luminii si orificii laterale in
care sunt prinsi cavalerii. cu ajutorul carora preparatele sunt fixate pe platina cu aj la
2 suruburi ce se gas sub platforma ce se deplaseaza pe 2 directii perpendiculare
2 tubul sustine ocularul si obiectivul, poate fi deplasat mai rapid si grosier cu aj
macrovizei si mai lent si fin cu aj microvizei, la capatul superior al tubului ocular se
pot pune oculare cu div puteri de marire care se pot schimba f usor. utilizam frecvent
ocularul de 10x, exista obiective uscate (10-20-40) si cu imersie (90-100) OU primesc
fasciculul de lumina ce trece prin preparat direct prin aer astfel ca o parte din raze
trimise de obiect catre lentila concava se pierd prin reflexie totala. Pierderea razelor
delumina datorita acestui fenomen de reflexie se poate inlatura prin interpunerea
intre lamela si obiectiv a unei picaturi de ulei de cedru cu indice de refractie apropiat
de cel al sticlei
3 dispozitivul de iluminare - e format din oglinda si condensator
oglinda are rolul de a dirija razele de la sursa de lumina spre axul optic al
microscopului iar condensatorul este format din 2-3 lentile cu ajutorul carora lumina
reflectata de oglinda este concentrata asupra obiectului ptru a obtine o imagine clara
condensatorul se poate deplasa pe verticala pana cand obiectul se gaseste in focarul
fasciculului convergent care iese din condensator.

examinarea folosind mo in camp luminos

examinarea unui preparat proaspat intre lama si lamela

pe lama se depune o picatura din suspensia care urmeaza a fi examinata. se acopera

cu o lamela se aseaza pe platina microscopului si se fixeaza cu aj cavalerilor.
condensatorul este coborat circa 1,5 cm sub platina diafragmul este semideschis iar
obiectivul de 40 este coborat pana deasupra lamelei. Privind prin oculare rotim f incet
macroviza ridicand usor tubul mo pana apare campul microscopic. Punem la punct
imaginea ridicand usor tubul mo si regland lumina prin modificareaa fantei
condensatorului

Se pot examina astfel : sedimentul urinar, materii fecale(provenind de la pacient cu

bda), suspensii de bacterii care se presupun ca sunt mobile

La sedimentul urinar putem vizualiza celule epiteliale, celule sanguine (leucocite sau
hematii), cilindri urinari(hialini, leucocitari, eritrocitari, epiteliali etc), cristale urinare,
fungi

Preparatr fixat si colorat

frotiul se aseaza pe platina mo si se examineaza cu aj cavalerilor, centram zona pe

care dorim sa o examinam. Procedam ca la examinarea unui preparat proaspat,
utilizand deasemenea obiectivul de 40. Alegem campul pe care il vom examina
ulterior cu obiectivul cu imersie. Ridicam tubul mo punem o picatura de ulei de cedru
pe lama in zona pe care urmeaza sa o examinam. Condensatorul este ridicat pana
sub platina mo si are diafragmul deschis. folosind macroviza coboram obiectivul cu
imersie pana atingem suprafata lamei de sticla realizand astfel si contactul cu uleiul
de cedru. manevra trebuie realizata cu grija ptru a nu sparge lama. privind prin
oculare si rotind f incet macroviza ridicand f incet tubul microscopic pana prindem
imaginea campului. cu aj microvizei punem la punct imaginea.
Se pot examina :morfologia celulelor din produsul patologic, prezentaleucocitelor si
daca acestea sunt modificate, prezenta bacteriilor si dispunerea acestora intra sau
extra leucocitar, morfologia bacteriilor, morfologia unor paraziti; in cazul unui frotiu
colorat cu albastru de metilen putem vizualiza bacterii colorate in albastru inchis iar
in cazul bacteriilor capsulate capsula va aparea ca un halou necolorat in jurul
bacteriei. In cazul examinarii unui frotiu gimsa se vad hematiile care apar roz-rosii.
PMN - in roz cu granulatii brune si nucleu violacel, euzinofile roz, nucleu violaceu,
limfocite si macrofage. Bacteriile colorate in violet.
in cazul coloratiei gram in cazul
frotiul se realizeaza din cultura pura se vizualizeaza microorganismele au aceasi
forma si dimensiuni, dispozitie cu sau fara capsula prezinta un halou necolorat, gram
pozitive in violet sau gram negative in rosu, fungii in violet.
din produs patologic cu coloratie gram - putem vizualiza celule inflamatorii, bacterii
gram pozitive sau negative, fibrina, si fungi

Intrtinerea microscopului - dupa terminarea examenului microscopic trebuie

efectuate urmatoarel;e proceduri
inchidem sursa delumina
ridicam cu aj macrovizei tubul mo
coboram condensatorul
scoatem lama de pe platina mo
preparatele proaspete le punem in borcan cu dezinfectant sulfocromic
preparatele fixate si colorate pe care dorim sa le pastram se introduc intrun container
cu xilom 1-2 min dupa care scoatem lama din xilor asteptam sa se evapore si o
punem intro cutie
stergem lentila obiectilului cu imersie cu o harie moale ptru a o curata de uleiul de
cedru

periodic trebuie sterse lentila oi cu tifon imbibat in xilor

curatam platina mo si lentila condensatorului cu un tifon imbibat in xilor

acoperim mo cu o husa ptru al feri de praf.

14.11.2012

Tehnica executiei frotiurilor patologice si culturi

Coloratia Gram, si ziehl nielsen, coloratie cu albastru de metilen

schema generala de diagnostic microbiologic vom examina microscopic produsul
patologic in etapa a 2-a sau colonia aparuta pe mediul de cultura

uneori este decisiv ptru diagnostic

preparatele microscopice proaspete intre lame si lamele sau umede

este de preferat sa folosim lame si lamele noi care inainte de a fi utilizate sufera
urmatoarele proceduri -
1 imersare in amestec sulfo cromic cateva zile
2 spalare, clatire, pastrare in alcool la 50 grade
3 lamele se usuca folosind o carpa curata apoi se degreseaza suplimentar prin
flambare
4 depunem pe lama o picatura din produsul care urmeaza a fi studiat
5 daca produsul patologic are consistenta lichidiana atunci va fi utilizat ca atare
6 daca vrem sa studiem mobilitatea microorganismelor care au format colonii pe un
mediu solid vom descarca cu ajutorul unei anse cateva colonii, intr-o picatura de
solutie salina fiziologica, apa distilata sau bulion
7 acoperim lama cu o lamela, cel mai frecvent presam usor lamela ptru a elimina
eventualele bule de aer
8 observam preparatul proaspat cu MO pe camp luminos asezand preparatul pe
platina microscopului si examinam initial cu O 10 apoi cu 20 sau 40
NU EXAMINAM CU IMERSIE

Executarea frotiurilor din produs patologic cu consistenta solida sau din culturi
microbiene realizate in mediul de cultura solid

1 dupa ce am flambat lama o asezam cu partea flambata in sus

2 cu ajutorul ansei bactereologice sterilizate si racita depunem in centrul lamei o
picatura de ser sau apa distilata
3 sterilizam ansa si asteptam sa se raceasca dupa care prelevam din produsul
patologic sau 2-3 colonii si depunem ceea ce am recoltat in picatura de ser sau apa
de pe lama
4 omogenizam f bine combinatia si incercam sa coloram
a albastru de metilen - acoperim frotiul cu solutie de albastru de metilen pentru 3-4
minute, spalam cu apa distilata sau apa de la robinet, asezam frotiul in stativ ptru
uscare sau grabim uscarea prin tamponarea cu hartie de filtru. Examinam la
microscop notam ceea ce am observat pe camp si facem interpretare.

b coloratia Gram - diluam intr-un recipient fuxina(9 parti apa distilata la o parte de
fuxina); acoperim frotiul cu violet de metil sau cristale violet(violet de gentiana) ptru
1-3 minute. Indepartam colorantul, acoperim frotiul cu solutie Lugor ptre 1-3 minute;
indepartam lugorul; acoperim frotiul cu un amestec de alcool-acetona(o parte
acetona la 3 parti alcool de 96%) ptru un timp f scurt(7-8 secunde); spalam insistent
cu apa distilata sau de la robinet; acoperim frotiul cu fuxina diluata 1/10 ptru 1 minut
dupa care spalam cu apa; asezam frotiul in stativ ptru uscare sau grabim uscarea cu
hartie de filtru. Examinam la MO, notam observatiile si interpretam

c coloratie ziehl-nielssen - o coloratie utila in identificarea prezentei de bacili acid

alcool rezistenti(BAAR) care solubilizeaza peretele bacterian prin cresterea
temperaturii facilitand astfel patrunderea colorantului. Punem frotiul uscat si fixat pe
un suport situat deasupra tavitei de colorare dupa care acoperim complet lama cu
fuxina bazica nediluata. Trecem becul de gaz aprins pe sub lama acoperita de fuxina
pana incepe emiterea de vapori. In cazul in care lama nu mai este acoperita complet
cu fuxina adaugam fuxina. Timpul de lucru ~10 minute, perioada in care repetam de
3 ori operatia de incalzire a lamei pana la emiterea de vapori. Spalam insistent cu
apa distilata sau apa de la robinet. Adaugam amestec de colorant acid-alcool(3 ml de
acid clorhidric concentrat si 97 ml de alcool etilic 90%) timp de 2-3 minute. Spalam
cu apa, recoloram cu albastru de metilen ptru un minut dupa care spalam din nou cu
apa asezam frotiul in stativ ptru uscare sau grabim cu hartie, examinam la MO,
notam si interpretam.

28.11.2012

Medii de cultura, clasificare

pentru a identifica agentul etiologic al unei infectii trebuie ca dintrun produs

patologic recoltat de la pacient sa obtinem mai intai respectivul microorganism ptru
ca ulterior sa i se poata studia caracterele fenotipice sau genotipice. Cultivarea pe
medii de cultura este esentiala si pentru determinarea sensibilitatii la antibiotice si
chimioterapice.
Metodele de cultivare a bacteriilor sau fungilor urmaresc 3 obiective
1 obtinerea unei populatii microbiene suficiente cantitativ pentru investigatiile
propuse.
2 prevenirea contaminarii produsului cercetat cu un microorganism strain
3 izolarea fiecarei tulpini microbiene in cazul unui produs plurimicrobian(trebuiesc
culturi monomicrobiene denumite culturi pure)

clasificare i fctie de mai multe criterii

in functie de continutul in celule vii avem urmatoarea clasificare

medii necelulare sau artificiale sau medii de cultura
medii celulare care includ celule vii si anume
animale de laborator
oua de gaina embrionate
culturi de celule

mediile de cultura artificiale

sunt cele mai ieftine, se pot prepara usor folosind retete impuse de
producator(asemanatoare celor de bucatarie), sunt cele mai utilizate in
practicamicrobiologica

conditii generale impuse mediilor de cultura artificiale

sterile, nutritive(factorii de crestere necesari), un anumit ph 7,2-7,6, o anumita
presune osmotica, sa aiba o umiditate favorabila multiplicarii germenilor

Medii de cultura dupa starea de agregare

solide - agar (geloza), agar-sange, AABTL, ADCL, Muller-Hinton
lichide - bulion simplu, bulion Muller-hinton, bulion nutritiv, apa peptonata alkalina,
samisolide - Curry-Blair, Miu,

Dupa complexitatea ingredientelor

simple - agar, bulion-sange

complexe - agarul-sange, geloza-chocolat
Dupa scopul urmarit

de transport - stuart, curry-blair, apa peptonata alkalina

de izolare - agar-sange, lofller,
de identificare - miu, tesei
de conservare - agar nutritiv in coloana

Dupa continutul in apa

cu umiditate obisnuita sau mediile deshidratate

Medii speciale

medii elective - lofller

medii selective - agar-sange cu azid de sodiu, chackmann
de imbogatire - apa peptonata alkalina, bulion selenit
diferentiale - AABTL, ADCL, agar sange, miu, TSI

Mediu electiv - contine ingredientele sau nutrientii care convin cel mai bine
dezvoltarii unei anumite bacterii, (lofller) care contine ser coagulat de bou, mediu
electiv bacilul difteric

Mediu selectiv - prin continutul sau in substante antimicrobiene, inhiba dezvoltarea

altor bacterii decat cea a carei izolare se urmareste. Ex - mediu cu telurit de potasiu
ptru izolarea bcilului difteric

Mediu de imbogatire - favorizeaza inmultirea anumitor bacterii PATOGENE inhiband

dezvoltarea florei de asociatie dintr-un produs patologic(apa peptonata alkalina)

Mediu diferential - contine un indicator de ph si un anumit nutrient(un zahar) care

poate fi sau nu metabolizat ,odificand ph-ul mediului si implicit culoare acestuia sau
poate modifica aspectul coloniilor(de obicei culoarea ) AABTL - agar cu albastru de
brom timol lactoza care permite diferentierea bacteriilor lactozo pozitive in speta E-
coli, de cele lactolzo negative salmonella, shisigela
ADCL - agar dezoxicolat citrat lactoza, TSI - contine 3 zaharuri si fier, Miu - mobilitat
de indol uree

Etapele generale ptru prepararea unui mediu

1 cantarirea ingredientelor
2 dizolvarea lor in apa distilata sau apa deionizata
3 verificarea ph-ului si ajustarea lui la ph-ul corect
4 filtrarea
5 sterilizarea (autoclavare)
6 repartizarea mediului in placi Petri sau tuburi, eprubete etc

mediile deshidratate
se face ca la cafea - 2-3 lingurite peste care se toarna apa fierbinte

Mediile gata preparate

indiferent de forma de prezentare a mediului de cultura la laborator se supune unui

control de calitate
Ex - ptru a testa sterilitatea mediului agar-sange incubam 2 placi la 37 grade C timp
de 48 ore, daca rezultatul e negativ(nu apar colonii) se pot utiliza

Descrierea succinta ptru mediul agar-sange

agarul nutritiv baza care se dizolva la temperatura ridicata si prin agitare in apa
distilata
autoclavam timp de 15 min la 121 grade C dupa care se raceste la 50 grade
la aceasta temperatura adaugam sange de berbec defibrinat 5%, se poate utiliza
sange de cal, iepure sau om grupa 0.
se toarna sangele dupa care se toarna in placi si putem sa il tinem la 4grade C pana
la 4 saptamani

Lp 9 Bacteriologie 5.12.2012

Tehnici de cultivare si caractere de

cutura ale bacteriilor
Obtinerea coloniilor izolate prin epuizarea inoculului cu ansa bacteriologica, in general tehnicile
de cultivare se folosesc pentru obtinerea de colonii izolate, prin insamantarea produsului
patologic pe medii solide.

Insamantarea in pentagon deschis a mediului solid intr-o placa Petri folosind ansa bacteriologica
pentru obtinerea de colonii bacteriene izolate, pornind de la un produs patologic recoltat si
transportat catre laborator intr-o epubreta sau un tub inchis cu dop de vata.

Include urmatoarele etape:

- Se sterilizeaza ansa bacteriologica la flacara becului de gaz, prin aducerea la

incandescenta a buclei si firului ansei, urmat de flambarea port ansei, trecea prin flacara
de 2-3 ori.

- Se ia epubreta cu produs patologic in mana stanga, iar ansa bacteriologica este tinuta in
mana opusa ca un creion.

- Se scoate dopul eprubetei.

- Se flambeaza gura epubretei prin trecerea acesteia, se introduce ansa in epubreta fara sa
se atinga gura sau peretii acesteia in partea superioara se recolteaza pe aceas ansa
fragmente care ar putea include, cu o mai mare probabilitate bacteriile implicate in
procesul infectios.

- Retragem ansa fara sa atingem peretii sau gura eprubetei.

- Se flambeaza din nou gura epubretei se monteaza dopul la epubreta iar produsul
 patologic recoltat pe ansa bacteriologica il inoculam pe mediu de cultura existent pe
placa Petri.

- Cu ansa incarcata cu produs patologic se vor trasa pe respectivul mediu de cultura

linii/striuri, linii parelel intre ele fara a ridica ansa de pe mediul de cultura. Aceste linii
reprezentand o prima latura a unui pentagon deschis.

- Sterilizam ansa la flacara, racim ansa prin atingerea acesteia pe suprafata mediului solid,
steril, neinsamantat, langa peretele posterior al placii Perit.

- Fara sa se mai incarce ansa cu produs patologic se traseaza o a doua latura a

pentagonului care va intersecta prima latura dupa care ansa se va steriliza din nou.

- La fel se procedeaza si pt urmatoarele laturi, avand grija ca ultima latura sa nu se

uneasca cu prima.

- Procedand in acest fel, ansa este reincarcata cu microrganisme dar in cantitate din ce in
ce mai mica pana ce se va ajunge la acele colonii microbiene izolate.

- Se introduce placa Petri pe care a fost realizeata cultivarea in termostat la temeratura

optima multiplicarii microrganismului suspectat 37 grade celsius.

- Dupa o perioada de incubare de la 18-24h pt cele mai multe dintre microorganisme

studiate pe prima latura a acelui pentagon se va obtine cea mai importanta cantitate de
cultura. Pe urmatoarele laturi se va remarca scaderea cantitativa a culturii, iar pe ultima
latura a pentagonului deschis se vor obtine colonii izolate.

Caractere de cultura include:

- Necesitatile specifice in vederea cultivarii

- Bacterii neprententioase, acele bacterii ce cultiva pe medii simple ( E Coli)

- Bacterii pretentioase, care necesita medii coplexe imbogatite prin adauarea unor factori
de crestere ( Hemofilus influente)

- Bacterii strict aerobe ( bordetella pertusis)

- Bacterii aerobe facultativ anaerobe ( stafilococus aureus)

- Bacteriile carboxifile cum este streptococus pneumonie

- Bacterii micro-aerofile ( campylobacter)

Intervalul de timp pt apartia coloniilor izolatre este in functie de timpul de generatie, 18-24h pt
majoritatea bacteriilor, sau poate fi cuprins intre 24-48h pt fungi ( cresc pe mediul saburo), timp
de generatie de saptamani ( tuberculosis)
Aspectul culturilor pe medii solide: examinarea culturilor este in proces foarte important, pt a
obtine cele mai bune rezultate este preferabila lumina naturala

Examinarea se face cu ochiul liber dar trebuie completata acasts examinare cu ajutorul unei lupe
pt a sesiza aparitia unor colonii de diminsiuni mici si foate mici.

Aspectul coloniilor variaza in functie de micro-organismul implicat fara a perminte diferentieri de

specie. Trebuie sa examinam urmatoarele elemente:

- Colonii mari de peste 2 mm cum este cauzul ( stafilococus aureus, klepsiella)

- Colonii medii pt majoritatea coloniilor studiate

- Colonii mici ( streptococus viridas – colonii mici verzui)

Marginile coloniei:

- Regulate

- Neregulate

- Intregi circulare erodat

Forma:

- Puncti forme

Relief:

- Bombat etc.

Suprafata:

- Neteda

- Umeda

- Lucioasa

- Mata

Culoarea:

- Pigmentate

Opacitatea:

- Transparente, semi si opace

Tipuri de colonii:

- Colonia de tip S ( suprafata bombata si neteda), margini circularea si adesea aspect

stralucitor, germenii pastreaza structura antigerminica si nu aglutineaza spontat in
solutia salina fiziologica. Germenii isi pastreaza virulenta.

- Colonia de tip R este plata , mata , marginile sunt crenelate, structura antigenica nu este
catacyeristica in acest caz, iar virulenta nu este conservata, colonii de tip R
( microbacterium tuberculosis, bacilus atracis)

Caractere particulare:

- Fenomenul de invazie care reprezinta un caracter de indentificare preliminara pentru “

proteus” are o mobilitate exagerata. Daca insamantam o tulpina care apartine acestui
gen, la periferia unei placi cu mediu simplu, de la locul insamantarii cultura se dezvolta in
valuri concentrice, pe toata suprafata mediului.

- Fenomenul de catarare “ proteus” in tuburi cu geloza inclinata.

Aspectul coloniiilor pe mediul lichide:

- Bacteriile se dezvolta in toata masa de lichis, tulburandu-l.

- Se accepta faptul ca tulpinile pe mediile solide formeaza colonie de tip S, tulbura

omogen mediul, in timp ce tulpinile ce formeaza colonii de tip R realizeaza o tulpurare
mai putin omogena, chiar pot lasa mediul limpede, cu formarea unui val la suprafata
mediului, cum este exemplul a bacilului ifteric sau tuberculos

12.12.2012

subiectul 1 - coloratia gram , timpi, interpretare exemple

subiectul 2 - coloratiea ziehl-nielssen, timpi, interpretare exemple
subiectul 3 - definiti notiunea de mediu selectiv, exemple
subiectul 4 - definiti notiunea demediu electiv, exemple
s 5 - definiti notiunea de mediu de imbogatire, ex
s6 - definiti notiunea de mediu diferentiat, ex
s7 ce este o colonie bacteriana, cum se pot obtine colonii bacteriene izolate
s8 - aspectele culturilor bacteriene pe medii solide (S,R), corelatii intre acestea si
patogenitatea,
s9 - aspectele culturilor bacteriene pe medii lichide, corelatii intre acestea si
patogenitate, exemple
s 10 - antibiograma difuzimetrica, principiu si interpretare

Identificarea bacteriilor, pe baza caracterilor de cultura, biochimice si metabolice

evidentierea caracterilor biochimice pe mediile diferentiale multitest

se iau colonii care sunt prezumate a fi enterobacterii, se fac teste preliminare

testul TSI - tripple sugar + iron

coloana e de culoare rosie ca si panta din eprubeta,

materiale si metode - tuburi sau eprubete de dimensiuni mici, cu mediu tsi
coloniile izolate
o ansa fir

tehnica de lucru - utilizam ptru insamantare o ansa fir, prelevam 1-3 colonii izolate pe
mediul respectiv dupa care prin intepare in mediu tsi insamantam coloana iar prin
retragere pana ajunge pe panta iar pe panta le descarcam in zig zag(epuizarea
coloniei), dupa care incubam 18-24 ore la 35-37 grade.
Dupa 24 ore citim, toate entero bacteriile fermenteaza glucoza(o consuma) este una
din cele 3 zaharuri din tsi, din rosu vireaza in galben, sunt bacterii glucolopozitive,
daca nu a fermentat ramane rosu si sunt glucozo negative

daca panta nu a fermentat inseamna ca lactoza si zaharoza nu au fermentat, bacteria

e lactozo negativa, daca panta a trecut in galben inseamna ca a fermentat lactoza
sau zaharoza si e lactozo-pozitiva

in cazul in care observam ca in coloana pe langa faptul ca mediul a virat in galben,

putem avem inegrirea mediului, acest lucru semnifica ca acea bacterie formeaza
hidrogen sulfurat h2s,
tot in coloana mai putem observa bacterii care produc gaz, vom avea niste bule,

se mai utilizeaza MIU - mobilitate indol uree,

materiale necesare - tuburi si eprubete mici cu mediu miu

hartie indicator cu reactiv ehrlich
coloniile izolate
ansa fir

tehnica de lucru - utilizam ptru insamantare o ansa fir, prelevam 1-3 colonii izolate pe
mediu respectiv, si insamantam mediul prin intepare astfel incat sa realizam o
insamantare in linie dreapta

fixam de dop hartiuta indicator in asa fel incat sa aj deasupra coloanei de mediu fara
sa il atingem, incubam la 35-37 grade timp de 24 ore, iar in unele cazuri pana la 48
ore.
in cazul in care bacteria este imobila dupa 24 ore de incubare, vom avea un traiect
de dezvoltare = cu traiectul de insamantare
daca e mobila, vom avea o opacitate in mediu mai mare sau mai mica in fctie de
mobilitatea bacteriei.

ptru a vedea daca b e indol pozitiva sau negativa ne uitam la hartie, si daca ramane
alba nu a dezvoltat indoli, daca b produce indoli atunci hartia isi schimba culoarea si
devine rosie

daca nu produce uree atunci mediul ramane de aceeasi culoare in general galben sau
rar maronie,
daca produce uree mediul devine rosu (in general la suprafata cu inel rosu)
MILF

Mediu cu citrat(simmosns)

materiale necesare
o suspensie relativ densa, obtinuta din 1-3 colonii pure,
mediu care contine acid citric 2%, si care in prezenta indicatorului de ph si la ph
neutru, are o culoare verde

cu ajutorul unei anse fir, prelevam suspensia bacteriana care si insamanteaza pe o

singura linie, pe mediu,

daca nu a consumat citratul ramane culoare verde

daca l-a consumat devine mediu albastru, a utilizat citratul ca unica sursa de carbon

19.12.2012

testarea sensibilitatii la antibiotice si chimioterapice

metode de testare a sensibilitatii bacteriilor la agentii antimicrobieni

antibiograma reprezinta metoda de laborator prin care se apreciaza sensibilitatea la

antibiotice a germenilor recoltati de la bolnavii cu infectii bacteriene dupa cultivare
pe medii specifice care sa permita dezvoltarea optima a microorganismului ptru care
se efectueaza testarea. ptru antibiograme trebuie sa folosim culturi izolate
reprezentand o sg tulpina bacteriana chiar si in cazul infectiilor multibacteriene. cele
mai frecvente tehnici sunt
tehnicile calitative
antibiograma difuzimetrica comuna sau cu discuri
antibiograma difuzimetrica comparativa
~ difuzimetrica standardizata
~ ~rapide

tehnicile cantitative

-metoda dilutiilor in mediu lichid

-~~ in agar
- ~ microdilutiilor in agar
- ~ pctelor de ruptura
- testul E

Metodele calitative

antibiograma difuzimetrica comuna

ca tehnicade lucru insamantam germenele de testat pe mediu solid (agar muller

hinton)
insamantarea se poate realiza de ex prin inundarea placii urmata de aspirarea
aseptica a excesului de inocul cu ajutorul unei pipete sau cu aj unui tampon cu vata
dupa circa 20 min timp in care placa petri se lasa cu capacul intre deschis in
vecinatatea becului de gaz aprins, se aplica microcomprimatele in care sunt
incorporate antibiotice in concentratia standardizata. Aplicarea microcomprimatelor
se poate face cu aj unei pense in conditii aseptice sau cu aj unui aplicator
automat(dispenser)

Microcomprimatele trebuie sa vina in contact perfect cu mediul motiv ptru care cu

ajutorul aceleeasi pense le presam usor. dupa care incubam peste noapte la
termostat la 35-37 grade dupa 18-24 ore facem citirea si observam ca antibioticul
eliberat de microorganismdifuzeaza in mediu realizand zone de inhibitie in care
coloniile microbiene nu se dezvolta. cu cat zona de inhibitie e mai larga cu atat
germenul va fi considerat mai sensibil. cu toate acestea daca in interiorul zonei de
inhibitie chiar daca diametrul masurat este f mare se dezvolta colonii germenul va fi
considerat rezistent.

antibiograma difuzimetrica standardizata (kirby bauer)

ca si tehnica este asemanatoare cu prima metoda prezentata dar este standardizata

fiind singura metoda difuzimetrica recunoscuta pe plan international.
ea permite obinerea unor rezultate reproductibile si corelabile intre laboratoare
diferite. elementele necesare standardizarii

mediul muller hinton

substante nutritive minerale care trebuie adaugate in cazul testarii anumitor
microorganisme([ ex mg si ca ptru tulpini de pseudomonas aeroginosa... bacilul
piocianic)... atunci cand este testata la amino glicozide}
se va verifica ph-ul mediului
grosimea mediului trebuie sa fie de 4 mm{se obtine prin turmarea de 25 ml pe o
placa petri care are diametrul de 90 mm}
inoculul se obtine din 5 colonii izolate si trebuie sa aiba o turbiditate corespunzatoare
standardului de 0.5 adica trebuie sa aiba 10 la a 8-a unitati formatoare de colonii/ ml
timpul de incubare 16-18 ore la 35-37 grade celsius
concentratia substantelor antimicrobiene din microcomprimate este standardizata ca
si dimensiunea acestor discuri (6mm)
pastrarea placilor cu mediul muller hinton pana in momentul utilizarii se va face ptru
maxim 7 zile in pungi de plastic la + 4 grade celsius
utilizarea tulpinilor de referinta ptru controlul de calitate
interpretarea rezultatelor prin masurarea diametrului zonei de inhibitie si compararea
acestor diametre cu cele din tabelele elaborate de catre producatori sau centre de
referinte