REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Corelații clinico-paraclinice în
accidentele vasculare cerebrale

Doctorand Delia Maria Stanca

Conducător de doctorat Prof. Dr. Ștefania Kory Calomfirescu

1
 CUPRINS

INTRODUCERE 3

STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII 3

1. Accidentul vascular cerebral – dimensiunea problemei 3
2. Utilizarea biomarkerilor neuronali în diagnosticul
3
accidentului vascular cerebral
3. Prognosticul pacienților cu accident vascular cerebral 4

CONTRIBUŢIA PERSONALĂ 4
1. Ipoteza de lucru/obiective 4
3. Studiul 1 – Prevalența AVC în activitatea Clinicii de Neurologie
5
Cluj-Napoca
4. Studiul 2 - Evaluarea unei noi metode diagnostice bazată pe
biomarkeri neuronali plasmatici pentru efectuarea diagnosticului
6
diferențial între accidentul vascular cerebral ischemic și cel
hemoragic, cu implicații majore în managementul terapeutic
5. Studiul 3 – Rolul biomarkerilor neuronali în evaluarea
9
prognosticului pacienților cu AVC
6. Concluzii generale 10

Cuvinte cheie
accident vascular cerebral, biomarkeri neuronali, proteina glială fibrilară acidă, receptorul pentru
acidul N-metil-D-aspartic, prognostic.

2
 Introducere
Accidentul vascular cerebral reprezintă a doua cauză de deces la nivel mondial după bolile
coronariene și a patra cauză de morbiditate, la nivel mondial, după bolile cardio-vasculare, HIV/SIDA și
tulburările depresive unipolare. Rata mortalității este semnificativ mai mare în țările cu sisteme publice
de sănătate nedezvoltate comparativ cu țările cu nivel de trai ridicat.
Biomarkerii pot juca mai multe roluri utile în neurologie. Diagnosticarea precoce și intervenția
terapeutică imediată sunt factori importanți pentru a reduce gradul de deteriorare a țesutului cerebral în
caz de accident vascular cerebral ischemic, precum și riscul de deces legat de AVC. Relevanța clinică a
tuturor markerilor trebuie să fie validată cu atenție în studii clinice controlate. Domeniul biomarkerilor
neuronali oferă în prezent o șansă de a îmbunătăți rezultatele managementului medical în accidentul
vascular cerebral ischemic acut. În ultimii ani au fost descriși o serie de biomarkeri neuronali, însă rolul
lor în patologia neurologică a fost puțin studiat. În prezent diagnosticul bazat pe markeri de leziune
neuronală nu este inclus în protocoalele standard pentru pacienții cu evenimente vasculare cerebrale
acute, fiind cunoscute relativ puține lucruri privind semnificația lor prognostică.
Acest studiu are ca obiectiv fundamentarea științifică a rolului proteinelor și antigenelor neuronale
în investigarea pacientului cu patologie vasculară cerebrală acută. Am dorit să determinăm dacă dozarea
simultană a proteinei gliale fibrilare acide și a anticorpilor anti subunitatea NR2 a receptorului NMDA ar
putea discrimina între hemoragia intracerebrală și AVC ischemic. Aceste informații ar putea fi folosite nu
numai pentru a diagnostica eficient pacienții și pentru a optimiza triajul și tratamentul pacienților, ci și la
identificarea diferitelor cai fiziologice care ar putea dezvălui obiective pentru terapia sub-acută de a
îmbunătăți rezultatele pe termen lung. În paralel am evaluat capacitatea biomarkerilor neuronali de a
estima prognosticul pacientului cu accident vascular cerebral prin evoluția a doi parametri prognostici
foarte importanți, volumul leziunii cerebrale și scala NIHSS.

Stadiul actual al cunoașterii

Accidentul vascular cerebral – dimensiunea problemei
Accidentul vascular cerebral este definit prin instalarea rapidă a semnelor de absență focală (sau
globală) a funcțiilor cerebrale cu durată mai mare de 24 de ore (în lipsa dezobstrucției arteriale
terapeutice sau a morții), fără altă cauză aparentă în afara originii vasculare. Aceste informații sunt
suplimentate prin investigații neuroimagistice care pot preciza substratul, dar cu toate acestea
diagnosticul se bazează pe date clinice.
Mortalitatea prin accident vascular cerebral se situează la 20% în prima lună după eveniment și
ulterior crește cu 5% pe an. Variațiile între țări și regiuni geografice sunt foarte mari și țin de factori
genetici, alimentari și de accesul la terapii avansate în fazele acute ale bolii. Originea accidentelor
vasculare este multifactorială și factorii de risc sunt aproape superpozabili (cu mici diferențe notabile) cu
cei pentru bolile cardiovasculare: hipertensiunea arterială, fumatul, dislipidemia, diabetul zaharat etc.
Existența unor factori de risc ce nu pot fi influențați (vârsta, rasa, greutatea mică la naștere, antecedentele
familiale de stroke) obligă la o evitare cu atât mai intensă a celor influențabili. Se estimează că până la
70% dintre evenimentele cerebrale vasculare ar putea fi evitate prin aderarea la un stil de viață sănătos,
cu activitate fizică, evitarea obezității, a fumatului și controlul optim al afecțiunilor predispozante.

Utilizarea biomarkerilor neuronali în diagnosticul accidentului vascular cerebral

Diagnosticul impune în primul rând diferențierea AVC de alte afecțiuni care cauzează deficit
neurologic focal: traumatisme cerebrale, tumori cerebrale, infecții cerebrale, epilepsie, afecțiuni psihice
etc. Neuro-imagistica este considerată singura metodă disponibilă de diferențiere între accidental vascular
ischemic și cel hemoragic, având în vedere că simptomatologia celor două entități este foarte
asemănătoare. Având în vedere că ischemia este vizibilă la CT cerebral în primele 3 ore de la instalare în
doar o treime din cazuri, există o necesitate evidentă pentru o metodă de diagnostic care să permită
diferențierea între ischemie și hemoragie. O astfel de metodă ar putea fi folosirea biomarkerilor neuronali.

3
 În țesutul neuronal există substanțe care sunt eliberate rapid în circulație în caz de injurie
neuronală. Dacă nivelurile plasmatice ale acestor substanțe s-ar corela cu tipul și extinderea distrucției
neuronale, am putea îmbunătăți diagnosticul folosind teste în condiții de pre-spital, putând astfel să
inițiem terapia trombolitică cât mai curând posibil.
Ischemia cerebrală induce insuficiență energetică celulară, excitotoxicitate, stres oxidativ, activare
enzimatică necontrolată, injurie microvasculară și moarte celulară, evenimente ce constituie cascada
ischemică. Permeabilitatea barierei hemato-encefalice în primele 48 de ore de la instalare este influențată
de activarea enzimatică extracelulară; distrucție suplimentară poate interveni în timpul reperfuziei.
În caz de hemorage intracerebrală injuria neuronală este suplimentată de efectul compresiv
exercitat de hematom, răspunsul inflamator sistemic, toxicitatea neuronală a hemoglobinei și a
trombolizei în interiorul trombului intracerebral. Faptul că distrucția țesutului cerebral este cauzată de
mecanisme diferite în cele două tipuri de accidente vasculare ne poate oferi șansa de a face diferențierea
între cele două patologii folosind biomarkerii neuronali.
Receptorul pentru acidul N-metil-D-aspartic (RNMDA) permite acțiunea neurotransmițătorului
glutamat; după moartea neuronală fragmente ale acestui receptor și ulterior anticorpi împotriva lor sunt
eliberați în fluxul sanguin. Sinteza anticorpilor necesită o anumită perioadă de timp, însă subunitățile NR1
și NR2 a receptorului sunt eliberate rapid în fluxul sanguin după debutul de accident vascular cerebral.
Fragmentarea subunității NR2 în peptide NR2A și NR2B este cauzata de ischemie sau neurotoxicitate,
oferind astfel posibilitatea de a discrimina între evenimente ischemice și hemoragice. Anticorpii anti NR 2
RNMDA sunt un indicator al excitotoxicității glutamatului asociate cu accident vascular cerebral acut și pot
fi utilizați în diagnosticul de accident vascular cerebral ischemic acut în primele 3 ore de la debutul
simptomelor.
GFAP este o proteină găsită în astrocite. Acesta a fost identificată recent ca un biomarker indicativ
de hemoragie intracerebrală în faza acută a AVC. Foerch a inclus într-un studiu prospectiv 93 de pacienți
cu accident vascular cerebral ischemic și 42 de pacienți cu hemoragie intracerebrală în termen de 6 ore de
la debutul simptomelor. GFAP a fost detectabil în ser la 81% dintre pacienții cu hemoragie și doar la 5%
din pacienții cu ischemie. O concentrație cut-off de 2,9 ng/L a oferit o sensibilitate de 79% și o specificitate
de 98% pentru diferențierea hemoragiei de ischemie.

Prognosticul pacienților cu accident vascular cerebral

Principalul interes al echipei medicale implicate în managementul pacienților cu accident vascular
cerebral ischemic în faza acută este existența sau nu a unei zone de țesut cerebral care să poată fi salvată
prin intervenție terapeutică promptă și agresivă de revascularizare. Conceptul de ”penumbră ischemică” a
fost introdus de Heiss și descrie existența la periferia zonei de ischemie cerebrală în care parenchimul este
compromis a unei zone de asemenea ischemiate, dar în care neuronii nu au fost distruși, zonă în care
aceștia supraviețuiesc pentru un interval de câteva ore de la debutul ischemiei pe baza unei perfuzări
sanguine reduse (”de mizerie”) prin creșterea fracției de extracție a oxigenului din sânge de la 40-50% la
peste 80%. În acest interval de timp intervenția terapeutică de revascularizare (tromboliza intravenoasă,
revascularizare chirurgicală etc.) permite salvarea acelei regiuni cerebrale; întârzierea intervenției
terapeutice sau lipsa zonei de penumbră ischemică de la bun început scade implicit eficacitatea
tratamentului din punct de vedere al recuperării funcționale.

Contribuția personală
Am fixat următoarele obiective de cercetare:
1. Evaluarea prevalenței accidentului vascular cerebral în activitatea Clinicii de Neurologie Cluj-
Napoca.

4
2. Evaluarea unei noi metode diagnostice bazată pe biomarkeri neuronali plasmatici pentru
efectuarea diagnosticului diferențial între accidentul vascular cerebral ischemic și cel hemoragic, cu
implicații majore în managementul terapeutic.
3. Studierea rolului prognostic al biomarkerilor neuronali în accidentul vascular cerebral.
Finanţarea cercetării a fost realizată prin grantul CNCSIS –UEFISCSU, proiectul cu numărul PNII –
IDEI 2621/2008: “Metodă modernă de investigație moleculară utilizând biomarkeri neuronali pentru
diagnosticul și prognosticul accidentului vascular cerebral în faza acută” – DIASTROKE.
Pentru realizarea obiectivelor am colaborat și cu cercetători din alte instituții de cercetare în cadrul
grantului sus-menționat: Institutul Oncologic Cluj-Napoca și Universitatea Babeș-Bolyai Cluj-Napoca.

Studiu 1. Prevalența AVC în activitatea Clinicii de Neurologie Cluj-Napoca.

În prima parte a programului de cercetare am avut ca obiectiv evaluarea caracteristicilor cu
relevanță terapeutică și prognostică pentru pacienții diagnosticați cu accident vascular cerebral și tratați
în Clinica Neurologică Cluj-Napoca. Aceste informații sunt utile pentru a avea o imagine de ansamblu a
magnitudinii problemei cu care ne confruntăm în îngrijirea pacienților atât în faza acută, cât și în cea de
sechelaritate post AVC.
Am evaluat în manieră retrospectivă documentele medicale ale pacienților internați pentru
accident vascular cerebral în Clinica Neurologie Cluj-Napoca în perioada iulie 2019 – aprilie 2011. Am
utilizat următoarele criterii de includere: pacienți cu tablou clinic sugestiv pentru un accident vascular
cerebral la prezentare și care pe perioada spitalizării au fost diagnosticați cu AVC printr-o metodă
imagistică de referință. Criteriile de excludere au fost diagnosticarea unui accident ischemic tranzitor sau
a altor patologii care mimează din punct de vedere clinic accidentul vascular cerebral, dar care au fost
confirmate prin examinările ulterioare (tumori cerebrale, traumatisme cerebrale, boli psihice etc.).
Am luat în studiu 385 de pacienți cu accident vascular cerebral tratați în serviciul nostru în
intervalul menționat. Caracteristicile lor demografice și clinice sunt prezentate în tabelul 1:
AVC ischemic AVC hemoragic
Nr. pacienți 260 125
Bărbați 145 (55,7%) 69 (55,2%)
Femei 115 (44,3%) 56 (44,8%)
Vârsta
<30 ani - 1 (0,8%)
31-40 ani - 9 (7,2%)
41-50 ani 46 (17,7%) 4 (3,2%)
51-60 ani 59 (22,7%) 26 (20,8%)
61-70 ani 80 (30,8%) 37 (29,6%)
71-80 ani 52 (20%) 34 (27,2%)
>80 ani 23 (8,8%) 14 (11,2%)
Scorul NIHSS la prezentare
0-4 77 (29,6%) 26 (20,8%)
5-15 103 (39,6%) 79 (63,2%)
16-20 56 (21,5%) 14 (11,2%)
>20 24 (9,2%) 6 (4,8%)
Mortalitatea în primele 14 zile 12 (4,6%) 12 (9,6%)
Tabelul 1: Caracteristicile demografice ale pacientilor incluși în studiu

Efortul de a identifica pacienții la risc de a dezvolta un AVC trebuie dublat de diagnosticarea cât mai
precoce a tipului fiziopatologic (odată instalată leziunea vasculară cerebrală) și instituirea rapidă a
terapiei de revascularizare cerebrală ori de câte ori există țesut cerebral ce poate fi salvat. Această
intervenție terapeutică este condiționată de diagnosticul rapid și precis al tipului de accident vascular

5
(ischemic sau hemoragic) și de existența unei infrastructuri (tehnică și umană) care să permită efectuarea
acestor manopere în fereastra terapeutică. Din acest punct de vedere demararea programului de
tromboliză pentru pacienții cu AVC ischemic începând cu luna ianuarie 2015 la nivelul Unității de Primire
Urgențe Cluj este un mare pas înainte în tratamentul acestei afecțiuni atât de invalidante.
Accidentul vascular cerebral este o afecțiune prevalentă în activitatea Clinicii de Neurologie Cluj-
Napoca. Profilul fiziopatologic și de gravitate al pacienților ce se adresează Clinicii nu diferă semnificativ
de cele raportate în literatura de specialitate. Existența unui număr mare de pacienți cu AVC ischemic
justifică investigarea unor căi pentru optimizarea diagnosticului în faza acută și a estimării prognosticului.

Studiu 2. Evaluarea unei noi metode diagnostice bazată pe biomarkeri neuronali

plasmatici pentru efectuarea diagnosticului diferențial între accidentul vascular cerebral
ischemic și cel hemoragic, cu implicații majore în managementul terapeutic
Suntem în prezent capabili să oferim suport medical integral și reabilitare medicală unui pacient cu
accident vascular cerebral. În ciuda acestui fapt, sunt puține șanse pentru recuperare completă. Singurul
mod de a progresa este de a proiecta noi metode de diagnostic a ischemiei cerebrale, utile în interiorul
ferestrei terapeutice sau în faza sub-acută, pentru a permite inițierea rapidă a terapiei corecte. O astfel de
oportunitate pare să fie oferită de biomarkerii neuronali. Dacă nivelurile lor sanguine s-ar corela cu tipul
și întinderea leziunilor neuronale, ar putea fi posibilă suplimentarea capacităților de diagnosticare,
oferind astfel șansa administrării terapiei potrivite la pacienții care au nevoie.
Există studii în care se afirmă că anumite substanțe au specificitate pentru accidentele vasculare
cerebrale ischemice și respectiv hemoragice. Proteina glială fibrilară acidă (GFAP) este un biomarker care
pare a fi un indicator al hemoragiei cerebrale, în timp ce anticorpilor anti subunitatea NR 2 a receptorului
NMDA par a fi mai specifici pentru un eveniment ischemic.
În acest studiu am dorit să determinăm dacă dozarea simultană a proteinei gliale fibrilare acide și a
anticorpilor anti subunitatea NR2 a receptorului NMDA ar putea discrimina între hemoragia intracerebrală
și AVC ischemic. Aceste informații ar putea fi folosite nu numai pentru a diagnostica eficient pacienții și
pentru a optimiza triajul și tratamentul pacienților, ci și la identificarea diferitelor cai fiziologice care ar
putea dezvălui obiective pentru terapia sub-acută de a îmbunătăți rezultatele pe termen lung.
În perioada decembrie 2010 – noiembrie 2011 am evaluat în manieră prospectivă pacienți cu
accident vascular cerebral și subiecți-martor sănătoși. Am inclus în studiu pacienții cu simptome sugestive
pentru accident vascular cerebral și care au fost evaluați în cadrul Compartimentului de Urgență a
Spitalului nostru.
Am utilizat următoarele criterii de includere: intervalul de timp între debutul simptomelor și
prezentarea la spital <12 ore, hemipareză la prezentarea în spital și prezența semnelor clinice de afectare
emisferică. Am folosit următoarele criterii de excludere: pacienți cu accident vascular cerebral care s-au
prezentat la mai mult de 12 ore de la debutul deficitului neurologic; antecedente de leziuni tumorale sau
traumatice ale creierului și antecedente de accident vascular cerebral în ultimele 4 săptămâni. Tipul și
amploarea leziunii cerebrale (hemoragie sau ischemie) au fost stabilite cu ajutorul tomografiei
computerizate cerebrale, iar diagnosticul final a fost stabilit înainte de externare. Subiecții-martori au fost
selectați dintre rudele pacienților. Am inclus bărbați și femei fără boli neurologice cunoscute.
Probele de 5,5 ml de sânge venos au fost recoltate în tuburi vidate fără aditivi, la 12, 24, 48 și 72 h și
respectiv 1 și 2 săptămâni de la debutul simptomelor. În cazul martorilor sănătoși am evaluat nivelele
sanguine ale biomarkerilor neuronali o singură dată, la includere. Probele au fost centrifugate imediat la
3000 rpm timp de 5 minute la 4°C, iar serul separat a fost depozitat la -80°C pentru a putea fi prelucrat
ulterior.
Pentru determinarea nivelului seric al GFAP am utilizat un kit comercial BioVendor Human GFAP
ELISA, în care plăci preparate cu anticorpi policlonali anti-human GFAP sunt incubate 2 ore cu serul
pacienților, procedură ce determină legarea la proteina din ser a unui alt anticorp anti-human GFAP
marcat cu biotină. Acesta din urmă va fi apoi conjugat cu un sistem de dectare enzimatic (HRP-horse

6
radish peroxidase), care apoi va reacționa cu substratul (TMB) dând naștere unei reacții de culoare a cărei
intensitate va fi măsurată cu un cititor de plăci la 450nm.
Kitul Gold Dot NR2 Antibody Assay este un test cantitativ tip ELISA de detecție a anticorpilor dirijați
împotriva peptidului NR2, subunitate a receptorului NMDA.
Am folosit Exact Wilcoxon-Mann-Whitney U-test pentru a compara media valorile de GFAP și de
anticorpi împotriva NR2 RNMDA din serul pacienților care au avut AVC ischemic sau hemoragic. Pentru a
diferenția între leziune ischemică și accident vascular cerebral hemoragic am folosit regresia logit binar.
Am asociat regresia cu area under the receiver operating characteristic (AUROC).
Am înrolat 72 de pacienți cu accident vascular cerebral (49 pacienți cu AVC ischemic, 23 cu AVC
hemoragic) și 52 de subiecți-martor sănătoși. Nivelurile serice de anticorpi împotriva NR 2 RNMDA au fost
semnificativ mai mari în cazul AVC ischemice, comparativ cu cele întâlnite în AVC hemoragice. Nivelul lor
maxim este atins în timpul ischemiei la 12 ore și doar la 24 de ore în caz de hemoragie. După acest vârf de
concentrație nivelele serice scad lent. Comportamentul este similar în cazul ischemiei și hemoragiei, dar
valorile absolute au diferit semnificativ. GFAP variază în mod diferit în serul pacienților în cele două tipuri
de accidente vasculare cerebrale. În timpul AVC ischemic nivelurile sanguine au fost scăzute în primele ore
de la debut, apoi cresc până la un maxim la 48 de ore. În caz de hemoragie intracerebrală GFAP atinge
maximul în primele 12 ore, iar apoi concentrația serică a scăzut rapid la valori normale.
Utilizarea independentă a celor doi biomarkeri nu oferă în același timp sensibilitate și specificitate
suficiente pentru a putea lua o decizie terapeutică (vezi tabelul 2). Analiza ROC bazată pe valori derivate
din formula prezentată indică faptul că împreună, GFAP și NR 2 RNMDA poate discrimina între AVC
ischemic și hemoragic la 12 ore de la debutul clinic cu o sensibilitate și specificitate de 94% și 91%,
respectiv.
Biomarker CP Sensibiliate Specificitate PCP AUROC
(la 12 ore)
(95% interval) (95% interval)

NR2 RNMDA 0.98 0.17

0.44 (0.88 – 1.00) (0.06 – 0.39) 0.72 0.75
GFAP 0.94 0.69
0.68 (0.82 – 0.98) (0.47 – 0.86) 0.86 0.86
NR2 RNMDA
+ 0.94 0.91
0.92
GFAP 0.55 (0.82 – 0.98) (0.70 – 0.98) 0.93
Tabelul 2: Sensibilitatea și specificitatea GFAP și a anticorpilor anti NR2 RNMDA pentru a diferenția etiologia ischemică
sau hemoragică a AVC.

Figura 1: Analiza ROC cu model Binary logit pentru GFAP și anticorpi anti NR2 RNMDA la 12 ore de la debutul clinic.

7
 Probabilitatea de a avea AVC ischemic poate fi estimată folosind valorile GFAP și ale anticorpilor
anti NR2 RNMDA la 12 ore de la debut. Cu cât valoarea GFAP este mai mică și cea a anticorpilor anti NR2
RNMDA este mai mare, cu atât probabilitatea de leziune ischemică crește (ajungând la 99% în cazul unui
pacient cu GFAPseric de 0,2 ng/ml și anticorpi anti NR 2 RNMDA 4 ng/ml). Invers, un pacient cu AVC și care
are GFAP seric 10 ng/ml și anticorpi anti NR2 RNMDA 1,5 ng/ml are un risc de ischemie de doar 6%.
O abordare diagnostică bazată pe testarea biomarkerilor neuronali are potențiale avantaje, inclusiv
eficiența costurilor și disponibilitatea pe scară largă. În acest studiu am constatat ca biomarkerii neuronali
GFAP și anticorpii anti NR 2 RNMDA sunt capabili să distingă între AVC ischemice și hemoragice cu
sensibilitate și specificitate de 94% și respectiv 91% la 12 ore de la debutul simptomelor.

Figura 2: Nivelele anticorpilor anti NR2 RNMDA Figura 3: GFAP indică prezența hemoragiei
sugerează etiologia ischemică în toate momentele în care intracerebrale în primele 12 ore de la debut.
au fost dozați.

GFAP atinge nivelul maxim la 12 ore în leziunile hemoragice și doar la 48 ore (dar la nivele
semnificativ mai mari) în cele ischemice. GFAP a fost identificat recent ca un biomarker care indică
hemoragia intracerebrală în faza acută a AVC. Într-un studiu prospectiv care a inclus 93 de pacienți care
au avut un accident vascular cerebral ischemic și 42 pacienți care au avut o hemoragie intracerebrală, în
decurs de 6 ore de la debutul simptomelor GFAP a fost detectat în serul de 81% dintre pacienții cu
hemoragie și doar la 5% dintre pacienții cu ischemie. În studiul nostru, GFAP a fost un marker bun pentru
identificarea accident vascular cerebral hemoragic în termen de 12 de ore de la debutul simptomelor, un
nivel ridicat de sânge fiind un indicator al unui eveniment hemoragic. Nivelul maxim a fost observat la 12
ore după o hemoragie și la 48 de ore de la un eveniment ischemic. La 12 ore de la debutul simptomelor
sensibilitatea și specificitatea pentru evenimente ischemice și hemoragice discriminatorii au fost de 94%
și respectiv 69%.
Fragmentarea subunității NR2 în peptidele NR2A și NR2B este cauzată de ischemie sau
neurotoxicitate. Peptida receptorului NMDA este astfel un indicator al excitotoxicității glutamatului,
asociată cu fiziopatologia accidentului vascular cerebral acut și poate fi utilizată pentru diagnosticarea
AVC ischemic (în studiile clinice preliminare, acest biomarker a avut o sensibilitate de 97% și o
specificitate de 98%). În studiul nostru anticorpii împotriva NR 2 RNMDA au avut tipuri diferite de variație
în timpul AVC ischemic și respectiv hemoragic, așa cum a fost descris anterior. Acest biomarker a fost
foarte bun la discriminarea între pacienții cu AVC și martorii sănătoși, în orice moment (specificitate de
96% la 12 ore și 100% la 24 și 48 de ore de la debutul simptomelor). Atunci când este utilizat pentru a
diferenția ischemia de hemoragie, rezultatele nu au produs aceeași semnificație la 12 ore după accidentul
vascular cerebral.
Folosiți în mod independent, biomarkerii de mai sus nu sunt suficienți pentru a diferenția între
accidentul vascular cerebral ischemic și hemoragic cu o precizie suficientă. Cu toate acestea, am
demonstrat că sensibilitatea pentru GFAP este de 94%. Abilitatea predictivă suplimentară provine dintr-o
creștere a sensibilității prin adăugarea la protocol a anticorpilor anti NR 2, astfel încât prin utilizarea
nivelurilor de GFAP și ale anticorpilor anti NR 2 RNMDA, la 12 ore de la debut, putem identifica tipul de
accident vascular cerebral cu o sensibilitate și o specificitate foarte bune (94% și respectiv 91 %).

8
 Studiu 3. Rolul biomarkerilor neuronali în evaluarea prognosticului pacienților cu
AVC
Acest studiu are ca obiectiv fundamentarea științifică a rolului proteinelor și antigenelor neuronale
în investigarea pacientului cu patologie vasculară cerebrală acută. Am evaluat capacitatea biomarkerilor
neuronali de a estima prognosticul pacientului cu accident vascular cerebral prin evoluția a doi parametri
prognostici foarte importanți, volumul leziunii cerebrale și scala NIHSS.
În perioada decembrie 2010 – noiembrie 2011 am evaluat în manieră prospectivă pacienți cu
accident vascular cerebral și subiecți-martor sănătoși. Am inclus în studiu pacienții cu simptome sugestive
pentru accident vascular cerebral evaluați în cadrul Compartimentului de Primire Urgențe.
Criteriile de includere și excludere, protocolul de examinare și dozările biomarkerilor neuronali
sunt prezentate în detaliu în cadrul Studiului 2. Pe lângă acele examinări am administrat pacienților
incluși în studiu scala NIHSS pentru a evalua gravitatea afectării neurologice și am înregistrat volumul
leziunii cerebrale. Asupra acestor rezultate (scorul NIHSS la 12 ore de la debut, valorile GFAP și ale
anticorpilor anti NR2 RNMDA, volumul leziunii cerebrale) am aplicat teste statistice (regresia OLS) pentru
a evalua relevanța biomarkerilor pentru prognosticul pacienților cu AVC. Am evaluat rolul prognostic al
biomarkerilor doar la 12 ore de la debut întrucât pentru celelalte repere temporale (de la 24 de ore până
la 2 săptămâni de la debut) relevanța prognostică este depășită de criteriile clinice și imagistice, care
devin precumpănitoare.
Nivelul plasmatic al anticorpilor anti NR2 RNMDA la 12 ore de la debut permite estimarea
prognostică a evoluției clinice a pacientului la 2 săptămâni de la debut. Un nivel scăzut al anticorpilor la 12
ore se corelează cu un scor NIHSS mai mic la 2 săptămâni. Mai mult, o valoare scăzută a acestor anticorpi
se corelează cu o diferență mică (aflată în teritoriu negativ și semnificând ameliorare clinică) între scorul
NIHSS la 2 săptămâni și scorul inițial.
Nu am reușit să evidențiez o relație semnificativă statistic între nivelul plasmatic de GFAP la 12 ore
de la debut și evoluția clinică a pacienților la 2 săptămâni, acest biomarker neputând fi utilizat în acest
scop. GFAP dozat la 12 ore de la debut nu are nici capacitatea de a estima evoluția clinică a cazului
(diferența dintre scorurile NIHSS de la 2 săptămâni și de la 12 ore nu se asociază semnificativ statistic cu
acest biomarker).

Figura 4: Legatura dintre volumul ischemiei și anticorpii Figura 5: Legatura dintre volumul hemoragiei și GFAP
anti NR2 RNMDA la 12 ore. la 12 ore. Regresia OLS este semnificativă statistic
(R2=0.736, p-value<0.001).

9
Figura 6: Regresia OLS a valorii NIHSS la 2 săptămâni Figura 7: Regresia OLS a valorii NIHSS la 2 săptămâni
asupra valorii anticorpilor anti NR2 RNMDA la 12 ore asupra valorii GFAP la 12 ore nu este semnificativă
este semnificativă statistic (R² = 0.700, p-value<0.001). statistic (R² = 0.164, p-value<0.055).
Nivelul plasmatic al anticorpilor anti NR2 RNMDA la 12 ore după debutul accidentului vascular
cerebral oferă informații prognostice semnificative statistic atât cu privire la volumul ischemiei cerebrale
(un nivel plasmatic mare semnalând o leziune ischemică voluminoasă) cât și la recuperarea funcțională.
Corelația lor este semnificativă statistic atât cu statusul clinic la 2 săptămâni (estimat prin scorul NIHSS)
cât și cu recuperarea funcțională în acest interval (estimată prin diferența dintre scorul NIHSS de la 2
săptămâni și cel de la debut).
Concentrația serică a GFAP la 12 ore de la debutul AVC are valoare prognostică pentru volumul
hematomului intracerebral (un nivel plasmatic mare semnalând o leziune hemoragică voluminoasă); nu
am reușit însă să stabilim o corelație semnificativă statistic între GFAP și scorul NIHSS sau gradul de
recuperate funcțională în primele 2 săptămâni de la stroke.

Concluzii generale
1. Accidentul vascular cerebral este o afecțiune prevalentă în activitatea Clinicii de Neurologie Cluj-
Napoca. Profilul fiziopatologic și de gravitate al subiecților cu stroke ce se adresează Clinicii nu diferă
semnificativ de cele raportate în literatura de specialitate.
2. Existența unui număr mare de pacienți cu AVC ischemic justifică investigarea unor căi pentru
optimizarea diagnosticului în faza acută și a estimării prognosticului.
3. Nivelurile de proteina acidă fibrilară glială (GFAP) și de anticorpi împotriva subunității NR2 a
receptorului N-metil-D-aspartat pot discrimina între hemoragia intracerebrală și leziunea cerebrală
ischemiă la pacienții cu accident vascular cerebral acut. Atunci când sunt utilizați împreună, acești
biomarkeri oferă o sensibilitate și specificitate foarte bune în diferențierea între cele două tipuri de
accident vascular cerebral la 12 de ore de la debutul clinic (94% și respectiv 91%).
4. Dacă modalitatea de lucru descrisă în acest studiu ar fi adoptată în protocolul diagnostic, aceasta
ar putea îmbunătăți potențial rezultatele tratamentului pacientului după un accident vascular cerebral
prin optimizarea triajului și atribuirea rapidă a protocolului de tratament. Cu toate acestea, consider că
acest model ar trebui să fie validat prospectiv într-o cohortă independentă.
5. Nivelul plasmatic al anticorpilor anti NR 2 RNMDA la 12 ore după debutul accidentului vascular
cerebral oferă informații prognostice semnificative statistic atât cu privire la volumul ischemiei cerebrale
(un nivel plasmatic mare semnalând o leziune ischemică voluminoasă) cât și la recuperarea funcțională.
Corelația lor este semnificativă statistic atât cu statusul clinic la 2 săptămâni (estimat prin scorul NIHSS)
cât și cu recuperarea funcțională în acest interval (estimată prin diferența dintre scorul NIHSS de la 2
săptămâni și cel de la debut).
6. Concentrația serică a GFAP la 12 ore de la debutul AVC are valoare prognostică pentru volumul
hematomului intracerebral (un nivel plasmatic mare semnalând o leziune hemoragică voluminoasă); nu
am reușit însă să stabilim o corelație semnificativă statistic între GFAP și scorul NIHSS sau gradul de
recuperate funcțională în primele 2 săptămâni de la stroke.

10
11
PhD THESIS ABSTRACT

Clinical and biologic correlations in

stroke

PhD student Delia Maria Stanca

PhD coordinator Prof. Dr. Ștefania Kory Calomfirescu

12
 CUPRINS

INTRODUCTION

CURRENT STATE OF KNOWLEDGE

1. Stroke – the size of the problem
2. Neuronal biomarkers for stroke diagnosis
3. The prognosis of the stroke patient

PERSONAL CONTRIBUTION
1. Purpose
3. Study no. 1 – Stroke in the Neurologic Clinic Cluj-Napoca
4. Study no.2 – New diagnostic protocol based on neuronal
biomarkers for discriminating between ischemic and hemorrhagic
stroke
5. Study no.3 – Prognostic value of the neuronal biomarkers in stroke
6. General conclusions

Keywords
stroke, neuronal biomarkers, glial fibrillary acidic protein, receptor for N-methyl D-aspartic acid,
prognostic.

13
 Introduction
A neurologic deficit of sudden onset conforming to a vascular territory is a clear clinical indication
that a patient is suffering from an acute stroke. For such a patient it is in theory a rather simple procedure
to have a confirmation of the diagnostic in a hospital setting, using cerebral imaging. An intracerebral
hemorrhage is readily discernable with cerebral imaging; however it is a different thing with cerebral
ischemia. The therapeutic window leaves precious little time when the diagnosis of acute cerebral
ischemia is established with certainty.
Neuro-imaging is considered to date the only tool available for differentiating between ischemic
stroke and intracerebral hemorrhage, as the symptoms of the two conditions show substantial overlap.
We have two options when a patient in whom we suspect an acute ischemic stroke is brought in the
Emergency Department: either we give thrombolytic therapy (provided we are within 4 and a half hours
after the onset of symptoms and we have strong indicators that the patient is having an ischemic event) or
we offer supportive treatment. Since ischemia is visible with cerebral CT in the first 3 hours after the onset
in only a third of the cases , there is a clear need for other diagnostic tools and strategies to make the
differential diagnosis between ischemia and hemorrhage. Such an opportunity seems to be offered by the
neuronal biomarkers.
They are substances found in the neural tissue and are rapidly released into the blood stream after
neuronal injury. If their blood levels should correlate with the type and extent of the neural damage we
would be in the position to supplement our diagnostic capabilities with tests that could be performed in
the pre-hospital setting or the outpatient unit, thus putting us in the position of offering the thrombolytic
therapy as early as possible.
In this study, we wanted to determine whether GFAP and antibodies against NR2 RNMDA could
together discriminate between intracerebral hemorrhage (ICH) and ischemic stroke (IS). This information
could be used not only to efficiently diagnose individuals to optimize the triage and management of
patients, but also to identify different physiological pathways that could reveal promising targets for sub-
acute therapy to improve long-term outcomes. We also have assessed the ability of the biomarkers to
correctly estimate the prognosis of the stroke patients.

Current state of knowledge

Stroke – the size of the problem
Stroke is the third most common cause of death in the United States and the main cause of
disability. Early diagnosis and immediate therapeutic interventions are important factors to reduce the
extent of brain tissue damage and the risk of stroke-related death. The survivors of such an event are
confronted with physical and mental handicaps (5 years from the acute event up to 25% of the patients
develop vascular dementia), with a decisive impact on life expectancy, quality of life and the cost
supported by the society. The health-care expenditures resulting from a stroke is estimated at $140,000
per patient.
Brain imaging is still the gold standard for differentiating the type of brain lesions in a stroke
patient (ischemia or hemorrhage). Both the computerized tomography and the MRI scan of the brain
require hospital admittance and lead to time-to-treatment delay. Those investigations are mandatory
before specific, highly specialized therapeutic measures are taken (surgery, thrombolysis etc.). There are
however therapeutic steps that can be performed earlier, on site, in the ambulance or in the emergency
unit, such as lowering the blood pressure or the reversal of the anticoagulant therapy in case of ICH and
the pre-notification of the stroke unit for IS. There is clearly a need for a diagnostic test to be performed in
the near-patient environment that could provide early warning as of what type of brain lesion is a stroke
patient experiencing.

14
 Stroke mortality is 20% in the first month and it increases thereafter with 5% per year. There are
huge differences among countries and geographic regions, caused by genetic and environmental factors
and by the access to advanced therapies during the acute phase. The origin of the disease is multifactorial
and the risk factors are almost identical with those of the cardiovascular diseases: arterial hypertension,
smoking, diabetes mellitus, dyslipidemia etc. It is estimated that up to 70% of the stroke cases could be
avoided by the adherence to a healthy lifestile, physical exercises, avoidance of obesity and smoking and
the optimal control of the arterial hypertension.

Neuronal Biomarker in stroke management

By cerebral imaging, an intracerebral hemorrhage is readily discernible; however, it is a different
story with cerebral ischemia. The therapeutic window is already closing when a diagnosis of acute
ischemic stroke is made with certainty. The question of what to do in the pre-hospital setting during the
acute phase of the stroke is still unanswered: should the thrombolytic therapy be instituted immediately
(without having diagnostic certainty, as ischemia is visible with cerebral CT in the first 3 hours after onset
in only a third of the cases) or should the diagnostic confirmation be obtained first? Acting quickly and
without diagnostic certainty could reverse the ischemic process but runs the risk of treating a patient who
has no stroke (the neurological deficit may be caused by stroke mimics such as epileptic seizures or
cerebral tumors) or who is at risk for a hemorrhagic transformation. Conversely, the certainty of an
ischemic process within the cerebral tissue leaves us with no alternative other than to take account of the
damage and offer supportive treatment.
We are now able to offer comprehensive medical support for a patient after an acute stroke and to
perform rehabilitation after the damage is done. Despite this, there can still be little chance for complete
recovery. The sequels that exist after stroke can impose a huge financial burden on society and lead to
hard-to-assess personal suffering. The only way of moving forward is to design new methods to diagnose
ischemic stroke within the therapeutic window or in the sub-acute phase. They allow the rapid
identification of the correct therapeutic path. Such an opportunity seems to be offered by neuronal
biomarkers.
Neuronal biomarkers are substances found in the neural tissue and are released into the blood
stream after a neuronal injury, or more precisely after the disruption of the blood-brain barrier. If their
blood levels correlate with the type and extent of the neural damage, it may be possible to supplement
diagnostic capabilities, offering the best therapy as early as possible for patients in need.
Several neuronal proteins have been studied as would-be neuronal biomarkers and a limited
number of substances are constantly cited as having significance for the diagnosis of stroke, but no
consensus has been reached regarding their use in the clinic. Earlier reports state that some substances
have certain specificity for ischemic and hemorrhagic stroke. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) is a
biomarker candidate that appears to be indicative of intracerebral hemorrhage, while antibodies against
N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR2 (NR2 RNMDA) appear to be more specific for an ischemic
event. Nevertheless, neither marker alone appears to be sensitive and specific enough for clinical decision
making. The GFAP has been recently investigated as biomarker for ICH. It has been shown that it is
released rapidly in acute ICH (the serum level being correlated with the size of the hematoma), whereas a
more delayed kinetic is expected in case of an ischemic lesion. A GFAP cutoff of 0.29 micrograms/L
provided diagnostic sensitivity of 84.2% and specificity of 96.3% for differentiating ICH from IS. However,
normal serum levels of GFAP cannot rule out ICH. There is agreement among neurologists that a single
biomarker cannot provide enough information and that a panel of substances should be used instead.
Many molecular biomarkers that have been implicated in the neurovascular injury cascade after
stroke have been studied in recent years with regard to their ability to predict the type of stroke (ischemic
or hemorrhagic), including inflammatory mediators such as monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1),
matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 (TIMP-1),
interleukin-6 (IL-6), C-reactive protein (CRP), ficolin-3 and the brain damage markers S100B and
proenkephalin neuropeptide. Other studied markers include B-type neurotrophic growth factor, von

15
Willebrand factor (vWF), GFAP and NMDA-R fragments. The diagnostic significance and potential clinical
utility of these biomarkers remains to be validated.

The prognosis of the stroke patient

The concept of ”ischemic penumbra” was introduced by Heiss and it defines the presence during
ischemic stroke of a region of viable neuronal tissue at the periphery of the necrotic zone that has a
”misery” perfusion and that is still functioning by increasing its oxygen extraction fraction from 40-50% to
more than 80%. By early and effective therapeutic intervention (thrombolysis, surgery etc) this tissue can
be salvaged.

Personal contribution
The main purposes of this study were:
4. Assessment of the therapeutic burden caused by the stroke patients in the Neurologic Clinic Cluj-
Napoca.
5. I wanted to determine whether GFAP and antibodies against NR2 RNMDA could together
discriminate between intracerebral hemorrhage (ICH) and ischemic stroke (IS). This information could be
used not only to efficiently diagnose individuals to optimize the triage and management of patients, but
also to identify different physiological pathways that could reveal promising targets for sub-acute therapy
to improve long-term outcomes.
6. Assessment of the prognostic value of the neuronal biomarkers in stroke.
This work was supported by CNCSIS –UEFISCSU research grant of the Romanian Government,
project number PNII – IDEI 2621/2008.

Study no. 1. Stroke in the Neurologic Clinic Cluj-Napoca.

The puropse of the study was the assessment of the therapeutic burden caused by the stroke
patients in the Neurologic Clinic Cluj-Napoca.
I have retrospectively evaluated the medical records of the patients that presented in our service
with stroke between July 2009 and April 2011. The inclusion criteria were: clinical presentation
suggestive for stroke; the stroke diagnosis and the physiopatologic type was confirmed by brain imaging
during the hospital stay. The exclusion criteria were transient ischemic attack, stroke mimics (brain
tumors, brain trauma, psychiatric conditions).
There were 385 patients treated in our service during that period (see table 1).
Ischemic stroke Hemorrhagic stroke
N 260 125
Men 145 (55,7%) 69 (55,2%)
Women 115 (44,3%) 56 (44,8%)
Age
<30 years - 1 (0,8%)
31-40 years - 9 (7,2%)
41-50 years 46 (17,7%) 4 (3,2%)
51-60 years 59 (22,7%) 26 (20,8%)
61-70 years 80 (30,8%) 37 (29,6%)
71-80 years 52 (20%) 34 (27,2%)
>80 years 23 (8,8%) 14 (11,2%)
NIHSS score at admittance
0-4 77 (29,6%) 26 (20,8%)
5-15 103 (39,6%) 79 (63,2%)

16
 16-20 56 (21,5%) 14 (11,2%)
>20 24 (9,2%) 6 (4,8%)
Mortality in the first 14 days 12 (4,6%) 12 (9,6%)
Table 1: Demographic characteristics of our patients.

Stroke is a prevalent feature of the Neurologic Clinic Cluj-Napoca. The stroke type or other featurea
do not signifficantly differ from the ones in the literature. The high prevalence of the disease motivates us
to search new ways to improve our diagnostic and prognostic abilities.

Study no. 2. New diagnostic protocol based on neuronal biomarkers for

discriminating between ischemic and hemorrhagic stroke
A diagnostic approach based on biomarker testing has potential advantages, including cost-
effectiveness and widespread availability. Performing those tests in the primary care units would facilitate
rapid patient transport to a hospital with an integrated stroke team. In this study, we found that the
neuronal biomarkers GFAP and NR2 RNMDA are able to distinguish IS from ICH with 94% sensitivity and
91% specificity at 12 hours after onset of symptoms.
The role that neuronal biomarkers should play in the diagnostic workup of a stroke patient is still
not well established. The occurrence of neuronal proteins in the blood stream implies two necessary
conditions: a source and an avenue, i.e. neuronal death, disorganization of the extracellular matrix and
increased permeability of the blood-brain barrier. Both ischemic and the hemorrhagic stroke lead to brain
cell death and barrier dysfunction. However, there are subtle differences between them, both in the way
they cause cell death and in the way they increase barrier permeability, and those differences could
provide the opportunity for a differential diagnosis.
During ischemic episodes, sudden cerebral tissue hypoperfusion initiates a series of events known
as the ischemic cascade. These events include cellular energetic failure, excitotoxicity, oxidative stress,
erratic enzymatic activation, microvascular injury and cell death. Disruption of the blood-brain barrier in
ischemic stroke is a biphasic event and is influenced by the reperfusion that occurs after injury. Within the
first 24 hours, there is increased permeability of the blood-brain barrier due to extracellular enzymatic
activation, and further damage occurs 48–72 h after the infarction. In the case of an intracerebral
hemorrhage, the neural damage is caused initially by the compressive effect (thus the damage depends
greatly on the volume and expansion rate of the hematoma), and the blood-brain barrier remains intact.
Knowing that the brain tissue damage is caused through different mechanisms in the two types of stroke
offers the potential to discriminate between types of stroke through the use of circulating neuronal
biomarkers.
Between December 2010 and November 2011 we enrolled consecutive stroke patients and healthy
controls in a prospective manner. We included in the study patients with symptoms suspicious for acute
stroke that were evaluated in the Emergency Department of our Hospital. The inclusion criteria were:
time window between symptom onset and hospital admission <12 h, presence of hemiparesis at hospital
admission and presence of clinical signs of hemispheric involvement. We used the following exclusion
criteria: stroke patients presenting later than 12 hours after the onset of the neurologic deficit, history of
tumoral or traumatic lesions of the brain and a history of stroke within the 4 weeks prior to enrollment.
The type and extent of the brain lesion (ICH or IS) were established using brain CT scan and the final
diagnosis was established before discharge. The healthy controls were selected among the relatives of the
patients; we included men and women with no known neurological diseases.
Samples of 5.5 ml of venous blood were taken into vacuum tubes with no additives from each
patient at 12, 24, 48 and 72 hours and 1 and 2 weeks after the onset of symptoms. For the healthy controls
we assessed the blood levels of the neuronal biomarkers only once, at inclusion. Samples were centrifuged
immediately at 3000 rpm for 5 min at 4°C, and the separated serum was stored at -80°C for further
processing.

17
 Serum GFAP levels were assessed using a commercial human GFAP ELISA kit (BioVendor
Heidelberg, Germany) following the manufacturer’s instructions. Samples in duplicate were diluted at 1:3
before analysis, and 100 μl was added to microplate wells. Quality controls and increasing concentrations
of standards were done for obtaining calibration curve. After 2 hours of incubation at room temperature,
100 μl biotin-labeled anti-GFAP-antibody solution was added to each well, followed by a one hour
incubation. The detection step consisted of incubation with HRP (horse radish peroxidase)-conjugate for 1
hour followed by pipetting in 100 μl TMB (3,3',5,5'-tetramethyl benzidine) substrate for colorimetric
detection. After stopping the color reaction, the plate was immediately read at 450 nm with a Sunrise
Tecan microplate reader equipped with acquisition software Magellan 3. The entire experiment was
performed at room temperature and between each step a washing procedure was applied (4 cycles of 400
μl washing solution/well). Serum values (ng/ml) were extracted from the standard curve.
The Gold Dot NR2 Antibody Assay kit (CIS Biotech, Inc., Atlanta, GA) is an ELISA method designed to
quantify serum levels of antibodies directed against NR2 peptide, an NMDA receptor subunit. We analyzed
serum samples according to the manufacturer’s manual. 100 μl of diluted patient and control serum
samples (1:50), calibrators, positive control and negative controls were added to a microtiter plate and
incubated for 30 minutes at 37°C on a shaker to allow the antibody to react with the NR2 peptide coated
on a solid phase of the microplate. After washing for three times with 200 μl of working solution (5
minutes during each wash at 37°C, on a shaker), 100 μl of protein A-HRP was added to each well and
incubated for 30 minutes at 37°C on a plate shaker. Another washing step was performed as described
above followed by a onetime washing step with 200 μl of deionized water for 1 minute on shaker. After
pipetting 100 μl of the TMB substrate, the microplate was gently shaken in darkness for 10 minutes at
room temperature to achieve color development. The enzymatic reaction was stopped with acid solution
and read after 10 minutes using a Bioteck Synergy 2 microplate reader at 450 nm/630 nm. A standard
calibration curve was generated and corresponding values in ng/ml were determined. Assays were done
in duplicate.
We used Exact Wilcoxon-Mann-Whitney U-test to compare the average values of GFAP and of
antibodies against NR2 RNMDA from patients who had IS or ICH. To discriminate between ischemic and
hemorrhagic stroke we used binary logit regression. We associated the Area under the Receiver Operating
Characteristic (AUROC) curve to the regression.
Seventy-two stroke patients were enrolled (49 patients having IS, 23 having ICH). Table 1 displays
the baseline variables of the study population. The two neuronal biomarkers were assessed in serum
samples taken at the above-mentioned time points. The serum levels of antibodies against NR2 RNMDA
were significantly higher in cases of IS compared to ICH. They peaked at 12 hours (IS) and 24 hours (ICH)
after the onset of the neurologic deficit and then slowly declined; the behavior is similar in cases of IS and
ICH, but the absolute values significantly differed.
GFAP levels have markedly different patterns of variation in IS and ICH. During ischemic stroke the
blood levels were low in the first hours after onset and then rose and peaked at 48 hours. In cases of
intracerebral hemorrhage, they peaked within the first 12 hours, and then the serum concentration fell
rapidly to normal levels.
Used independently, the two biomarkers cannot discriminate with an acceptable sensitivity and
specificity between IS and ICH. Used together, they offer a sensitivity and specificity of 94% and 91%,
respectively.
Biomarker CP Sensitivity Specificity PCP AUROC
(la 12 ore)
(95% interval) (95% interval)

NR2 RNMDA 0.98 0.17

0.44 (0.88 – 1.00) (0.06 – 0.39) 0.72 0.75
GFAP 0.68 0.94 0.69 0.86

18
 (0.82 – 0.98) (0.47 – 0.86) 0.86
NR2 RNMDA
+ 0.94 0.91
0.92
GFAP 0.55 (0.82 – 0.98) (0.70 – 0.98) 0.93

Figure 1: The ROC analysis after Binary Logit Model for GFAP and antibodies against NR2 RNMDA at 12 hours after the
onset.

Figure 2: antibodies against NR2 RNMDA levels may be Figure 3: GFAP may be indicative of ICH at 12 hours
indicative of IS at all timepoints. after onset.

Glial fibrillary acidic protein peaks early during hemorrhagic brain lesions and late (at significantly
higher levels) in ischemic events. GFAP was recently identified as a biomarker that is indicative of
intracerebral hemorrhage in the acute phase of stroke. In a prospective study that included 93 patients
who had an ischemic stroke and 42 patients who had an intracerebral hemorrhage, within 6 hours after
the onset of symptoms, GFAP was detectable in the serum of 81% of ICH patients, but only in the serum of
5% of IS patients. In our study, GFAP was a good marker for identifying hemorrhagic stroke within 12
hours after the onset of symptoms, a high blood level being indicative of a hemorrhagic event. The
maximum level was seen at 12 hours after an ICH and at 48 hours after an IS. At 12 hours after the onset of
symptoms the sensitivity and specificity for discriminating ischemic and hemorrhagic events were 94%
and 69%, respectively.

The fragmentation of the NR2 subunit into the peptides NR2A and NR2B is caused by ischemia or
neurotoxicity. The NMDA receptor peptide is thus an indicator of glutamate excitotoxicity associated with
acute stroke pathophysiology and can be used for the diagnosis of acute ischemic stroke (in preliminary
clinical studies, the biomarker had a sensitivity of 97% and a specificity of 98%). In our study, the
antibodies against NR2 RNMDA had different patterns of variation during IS and ICH, as has been
previously described. This biomarker was very good at discriminating between stroke patients and
healthy controls at any time point (specificity 96% at 12 hours and 100% at 24 and 48 hours after the
onset of symptoms). When used to differentiate IS from ICH, the results did not produce the same
significance at 12 hours after stroke.

19
 Study no. 3. Prognostic value of the neuronal biomarkers in stroke
This study aims to scientificly establish the role of neuronal proteins and antigens in investigating
the patient with acute cerebral vascular disease. We evaluated the ability of the neuronal biomarkers to
predict patient prognosis after stroke through the evolution of two important prognostic parameters,
cerebral lesion volume and NIHSS scale.
During the period December 2010 - November 2011 we prospectively evaluated patients with
stroke and healthy subjects. We included in the study patients with symptoms suggestive of stroke
evaluated in the Emergency Department.
Inclusion and exclusion criteria, examination protocol and dosing neuronal biomarkers are
presented in detail in Study 2. In addition to those examinations I administered to patients included in the
study NIHSS scale to assess the severity of neurological impairment and recorded brain lesion volume. On
these results (NIHSS score at 12 hours after onset, and GFAP values of anti NR2 RNMDA, brain lesion
volume) we applied statistical tests (OLS regression) to assess the relevance of biomarkers for the
prognosis of patients with stroke. We evaluated the prognostic role of biomarkers only 12 hours from the
onset as for other time points (from 24 hours to 2 weeks after onset) is exceeded prognostic relevance of
clinical and imaging criteria, which are prevailing.
The plasma level of anti NR2 RNMDA 12 hours of onset allows the estimation prognostic clinical
outcome of patients 2 weeks after onset. A low level of antibody 12 hours correlates with NIHSS scores
less than 2 weeks. Furthermore, a low value of these antibodies correlates with a small difference
(currently in negative territory and signifying clinical improvement) between NIHSS score and baseline
score to 2 weeks.
I was unable to show a statistically significant relationship between plasma levels of GFAP to 12
hours of onset and clinical course of patients 2 weeks, this biomarker may not be used for this purpose.
GFAP dosed at 12 hours from the onset has no ability to predict clinical outcome of the case (the
difference between NIHSS scores from two weeks to 12 hours and not statistically significantly associated
with this biomarker).

Figure 8: Size of the ischemic lesion and the antibodies Figure 9: Size of the hemorrhagic lesion and GFAP at 12
against NR2 RNMDA at 12 hours. hours. OLS regression is signifficant (R2=0.736, p-
value<0.001).

20
Figure 10: OLS regression of the NIHSS score at 2 weeks Figura 11: OLS regression of the NIHSS score at 2 weeks
and antibodies against NR2 RNMDA at 12 hours is and GFAP at 12 hours is not signifficant (R² = 0.164, p-
signifficant (R² = 0.700, p-value<0.001). value<0.055).
The plasma level of anti NR2 RNMDA at 12 hours after stroke onset provides statistically significant
prognostic information both on the volume of cerebral ischemia (high plasma levels indicating an
ischemic lesion bulky) and functional recovery. Statistically significant correlation with their clinical
status 2 weeks (estimated by NIHSS score) and functional recovery in this range (estimated by the
difference between the NIHSS score at 2 weeks after onset).
Serum GFAP within 12 hours of stroke onset has prognostic value intracerebral hematoma volume
(high plasma levels signaling a voluminous hemorrhagic lesion); But we failed to establish a statistically
significant correlation between GFAP and NIHSS score or the degree of functional recovery during the first
2 weeks after stroke.

General conclusions
1. Stroke is a prevalent disease in the activity of the Neurology Clinic of Cluj-Napoca. The
pathophysiological profile and severity of stroke of the patients do not differ significantly from those
reported in the literature.
2. The large numbers of the patients with ischemic stroke warrants investigation of ways to
optimize acute diagnosis and prognosis estimation.
3. The levels of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and NR2 subunit receptor antibodies against N-
methyl-D-aspartate can discriminate between intracerebral hemorrhage and ischemic brain lesions in
patients with acute stroke. When used together, these biomarkers provides a very good sensitivity and
specificity in differentiating between the two types of stroke to 12 hours of clinical onset (94% and 91%
respectively).
4. If the method described in the study protocol should be adopted in diagnosis, this could
potentially improve patient treatment outcomes after a stroke by optimizing the allocation triage and
rapid treatment protocol. However, I believe that this model should be validated prospectively in a cohort
independent.
5. The plasma level of anti NR2 RNMDA 12 hours after stroke onset provides statistically significant
prognostic information both on the volume of cerebral ischemia (high plasma levels indicating an
ischemic lesion bulky) and functional recovery. Statistically significant correlation with their clinical
status 2 weeks (estimated by NIHSS score) and functional recovery in this range (estimated by the
difference between the NIHSS score at 2 weeks after onset).
6. Serum GFAP within 12 hours of stroke onset has prognostic value intracerebral hematoma
volume (high plasma levels signaling a voluminous hemorrhagic lesion); But we failed to establish a
statistically significant correlation between GFAP and NIHSS score or the degree of functional recovery
during the first 2 weeks after stroke.

21