Metode moderne aplicate in

protectia mediului

Master – Biotehnologii în protectia mediului

PRINCIPII GENERALE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ
Principii generale de alcătuire a genomurilor organismelor și
virusurilor

Master – Biotehnologii în protectia mediului

 Grupe majore de microorganisme
Celulare Eubacterii • Archaea

• Procariote

• Eucariote
Protiste Fungi
Alge

Acelulare
Virusuri 3
Master – Biotehnologii în protectia mediului
 ORGANIZAREA ACELULARĂ

REVIEW - VIRUSURI
• Unit. Morfo-fiziologică – VIRIONUL - infecțios matur

Virus vegetativ– particula virală aflată în celulă, deficitară în unele aspecte ale
replicării, lipsit de capsidă.
Provirus – genom viral integrat în cromozomul celulei gazdă,
multiplicându-se sincron cu acesta.
• Particule de dimensiuni foarte mici (18-970 nm), vizibile doar cu
microscopul electronic
• Posedă un singur tip de acid nucleic: ADN sau ARN (monocatenar = m.c.
sau bicatenar = dublu catenar = d.c)
• Sunt paraziţi intracelulari obligatorii
• Lipsite de enzime proprii
• Înmulţirea virusurilor = replicare în celula gazda vie

Master – Biotehnologii în protectia mediului

 Structura virusurilor
I. genom viral (acidul nucleic)
II. capsida
III. inveliş viral (anvelopa)

Master – Biotehnologii în protectia mediului

 GENOMUL VIRAL
- este alcătuit dintr-o moleculă de acid nucleic viral
(linear sau circular)

ARN = RIBOVIRUSURI

ADN = DEZOXIRIBOVIRUSURI

ROL
poartă informaţia genetică necesară replicării
determină capacitatea infectivă a virusului
nr. de gene cuprins in genom este variat
nr. de proteine codificate dependent de mărimea
genomului
 Capsida
complex de structuri proteice care
îmbracă acidul nucleic viral

arhitectură şi compoziţie specifice fiecărui

tip viral
capsomera este unitatea morfologică a
capsidei virale

• Funcțiile capsidei:
– protejează genomul de acţiunea factorilor externi, de
nucleazele celulare;
– asigură forma virionului;
– fixează virionii nuzi de receptorii celulari specifici
– subunităţile structurale ale capsidei sunt antigene care
induc formarea şi reacţionează cu anticorpii neutralizanţi.
Master – Biotehnologii în protectia mediului
 Învelișul viral
• Peplos = anvelopă + înveliș extern
• derivă din membranele celulei gazdă:
– din membrana plasmatică
– din membrana nucleară

Rolul învelișului viral:

– protejează nucleocapsida;
– intervine în iniţierea ciclului infectant prin recunoaşterea şi
ataşarea v. de receptorii celulari;
– intervine în procesul de asamblare a noilor particule virale;

Master – Biotehnologii în protectia mediului

Fazele replicării

1. Adsorbţia - faza de adeziune şi fixare la celula- gazdă

2. Pătrunderea v. în celula-gazdă

3. Faza de eclipsă - v. pătruns în cel. se dezintegrează în

ac.nucleic şi proteine şi nu mai poate fi pus în evidenţă.

4. Faza de multiplicare activă – ac. nucleic separat şi capsida

separat se multiplică pt. ca în final să se asambleze - formând
particule virale complete.

5. Faza de eliberare - v. formate părăsesc celula treptat pe

măsura formării sau se acumulează ⇒ explozia celulei gazdă,
eliberându-se ⇒ infecteaza alte celule.
Exemple de plante virozate

Cucumber Mosaic Virus (CMV)

Plum-pox Virus

Tomato necrotic streak virus

Master – Biotehnologii în protectia mediului
 ORGANIZAREA CELULARĂ

• procariotă

• eucariotă

Master – Biotehnologii în protectia mediului

 REVIEW - BACTERII
• Genomul procariot:
 gene esenţiale, localizate în structura cromosomului
 gene accesorii
• majoritatea au 1 cromozom = 1 moleculă de ADN d.c. circular
• lungime ce poate atinge 1nm
• se află condensat puternic în celula bacteriană
• este lipsit de membrană nucleară;
• menţinerea compactă, condensată a materialului nuclear în citoplasma
bacteriană este posibilă ca urmare a consistenţei citoplasmei care este un
gel permanent, fără curenţi citoplasmatici;
• partiția se bazează pe existența unui sistem membranar-mezosomi.
• la microscopul optic, aparatul nuclear se poate evidenţia folosind colorantul
Feulgen.
• folosind microscopia electronică, se observă numeroase detalii: o reţea
neregulată de cromatină formată din fibre de ADN.
• in cazul majorităţii bacteriilor, cu excepţia arhebacteriilor, genele au o
structură continuă
Master – Biotehnologii în protectia mediului
• Avantajele structurii circulare
• asigură protejarea moleculei de ADN faţă de degradarea
enzimatică prin exonucleaze
• creează o anumită constrângere topologică şi de aici
necesitatea apariţiei suprarăsucirilor care asigură
împachetarea într-un spaţiu strict delimitat în interiorul celulei
bacteriene.
Nucleoidul este un complex ADN-ARN-proteine în care:
• 80%- ADN şi constituie cromosomul propriu-zis.
• 10%- componenta proteică (ARN-polimerază)
• 10%- ARN (în principal din ARNr şi ARNm în curs de
formare)
Prin tratare cu ribonuclează cromosomul bacterian se
relaxează, ceea ce înseamnă că ARN are rol şi în
stabilizarea şi menţinerea formei condensate a nucleoidului.

Duplicarea genomului este inițiată la nivelul originii replicării

(ori C) și avansează unidirecțional, procesul fiind studiat în
amănunt la numeroase specii bacteriene.
Master – Biotehnologii în protectia mediului
 Elementele genetice accesorii (EGA)
 plasmide
 secvenţe de inserţie (SI)
 transpozoni (Tn)
 unii bacteriofagi

Comparativ cu informaţia genetică cromosomală, EGA prezintă

anumite proprietăţi:

– includ informaţie genetică accesorie, neesenţială pentru reproducerea

organismului purtător, iar unele dintre ele nu conferă nici o proprietate
detectabilă;

– sunt capabile de replicare şi chiar suprareplicare independentă faţă de

cromosomul bacteriei purtătoare.

Master – Biotehnologii în protectia mediului

Plasmidele
•multe bacterii conţin în plus faţă de nucleu, un
mic filament de ADN circular dublu catenar denumit plasmidă
• reprezintă o informaţie genetică accesorie, extracromozomială
•poartă gene implicate în propria replicare, stabilitate şi partiţie,
transmiţându-se la descendenţi.
• masa moleculară a plasmidelor variază în limite foarte largi: de la 1,5
x 106 Da până la 150 x 106 Da sau chiar mai mult la unele plasmide
mari (megaplasmide) de 400-450 Mda (la bacteriile din genul
Rhizobium).
Clasificare
1)plasmide circulare - alcătuite din ADN d.c. circular, iar forma in vivo pare
sa fie CCC (“circular covalently closed”); foarte rar şi temporar se întâlneşte
forma CO (“circular open”), în care una din cele două catene nu este continuă
având o legătură fosfodierica lipsă.
2) plasmide lineare. - alcătuite din ADN d.c. linear (L).

Master – Biotehnologii în protectia mediului

Plasmidele
majoritatea genelor codificate de plasmide conferă
caractere adaptative, avantajoase gazdelor bacteriene

Master – Biotehnologii în protectia mediului

Exemple de plante cu infecţii de natură bacteriena

Erwinia amylovora
Focul bacterian al
Rozaceelor
Xanthomomas campestris pv. phaseoli
Arsura bacteriană la fasole

Agrobacterium sp.
Clavibacter michiganensis Pectobacterium carotovorum
Cancerul bacterian
subsp. michiganensis (sin. Erwinia carotovora)
 REVIEW - EUCARIOTE

organismelor EK –gameții au ½ nr.crz

Număr par de cromozomi în nucleu (2n), fiecare crz
= 1 moleculă ADN d.c. linear
Organismele EK (majoritatea) se înmulțesc prin
reproducere sexuată

- materialul genetic este delimitat de o membrană

nucleară tipică, dublu stratificată
- repartizarea informaţiei genetice pe mai mulţi
genofori – CROMOSOMII
- transcrierea genetică se desfăşoară în nucleu, iar
traducerea se realizează în citoplasmă, unde se
găsesc şi ribozomii.
- complexarea permanentă a ADN cromosomal cu
anumite proteine bazice (histonele) face ca la
eucariote substanţa nucleară (cromatina) să
prezinte la nivel ultrastructural un aspect fibros,
unitatea structurală a cromosomilor fiind fibra de
cromatină.

Master – Biotehnologii în protectia mediului

 Condensarea cromatinei cu formarea cromosomilor

telomere

centromer

brat
cromosomal

cromosom condensat

2 cromatide unite la nivelul centromerului (constrictie primare) regiunile

terminale ale cromosomilor = telomere, precum si sateliti (doar in cazul
anumitor cromosomi)
Telomere - scurte secvente de ADN repetititv, secvente terminale ale cromosomilor confera stabilitatea
moleculelor lineare de ADN, - împiedică alipirea cromosomilor în timpul diviziunii - rol de protecţie enzimatică
împotriva nucleazelor
Centromer - regiune specifica a cromozomilor de la Ek; responsabil de deplasarea cromosomilor in cursul
diviziunii celulare deoarece, a nivelul sau, se gaseste kinetocorul (o structura proteica trilamelara) si fibrele
kinetocorului =prin intermediul carora cromosomii se fixeaza la fibrele fusului de diviziune.
Master – Biotehnologii în protectia mediului
Tipuri de cromatină

• Eucromatina – cromantina decondensată puternic și

condesată în timpul diviziunii celulare și se replică la
începutul fazei S a interfazei; ea apare sub formă
dispersată la nivelul nucleului interfazic.

• Heterocromatina - condensată permanent, apărând mai

intens colorată decât eucromatina; ea se localizează, de
obicei, la nivelul anumitor regiuni cromosomale.
Heterocromatina este adesea asociată cu membrana
internă a învelişului nuclear, implicat în schimburile
materiale, energetice şi informaţionale nucleu –
citoplasmă.

Regiunile eucromatice ale cromosomilor prezintă replicare

timpurie, pe când cele heterocromatice se replică, de
regulă, târziu, spre sfârşitul fazei de sinteză (S).

Master – Biotehnologii în industria farmaceutică

Compoziţia cromosomilor eucariotelor:

• Compoziția chimică: ADN (13–15%), ARN (12-13%), proteine

histonice şi nonhistonice (68-72%), mici cantităţi de lipide, ioni
de Ca2+ şi Mg2+, unele poliamine (spermina şi spermidina).

• Lungimea extrem de mare a moleculei de ADN este redusă

printr-o împachetare specifică realizată, de această dată, în
urma complexării ADN cu alte componente moleculare şi, în
primul rând, cu proteine bazice denumite histone.

• Fiecare cromosom interfazic conţine o singură moleculă

lineară de ADN dublu catenar (aceasta corespunde unei
cromatide). Cromosomul replicat este bicromatidic, fiind
alcătuit din două molecule identice de ADN şi se prezintă într-
o stare mult mai condensată (de 5-10 ori) comparativ cu cel
interfazic.

Master – Biotehnologii în protectia mediului

Clasele de secvenţă ADN la eucariot

– secvenţe unice sau nerepetate – o copie per genom haploid: ele

corespund genelor structurale ce codifică sinteza catenelor
polipeptidice şi a genelor reglatoare adiacente

– secvenţe moderat repetive - sunt secvenţe simple cu lungimea de

100-150 pb repetate de 102-105 ori în genom; ele reprezintă
aproximativ 30-60% din ADN total; ADN respectiv este parţial
transcris. Se consideră că unele secvenţe de ADN moderat repetate
reprezintă genele pentru ARNr, ARNt sau pentru histone

– secvenţe înalt repetate - sau ADN satelit localizate mai ales la

nivelul heterocromatinei din regiunea centromerului, a telomerelor şi
a constricţiilor secundare. Reprezintă unitatea de repetiţie este
formată dintr-un număr mic de nucleotide care sunt repetate de până
la un milion de ori per genom haploid

– microsateliţi - secvenţe alcătuite din câteva zeci de nucleotide

repetate sub formă tandemică

– minisateliţi – microsateliţi cu o lungime nucleotidică mai mare

Master – Biotehnologii în protectia mediului

 PROTEINELE HISTONICE

Interacţionează cu grupările fosfat ale ADN-ului nuclear. Complexul

nucleohistonic rezultat se numeşte cromatină. La eucariote, există o cerinţă
strictă ca ADN nou sintetizat să se asocieze cu histonele, astfel încât să
formeze complexul respectiv.
• 5 clase de histone (notate H1, H2A, H2B, H3 şi H4)

• Rolul histonelor
– în menţinerea şi controlul conformaţiei cromosomului
– asigură reglarea genică grosieră.
– acţionează ca represori ai activităţii genetice, deoarece prin condensarea
cromatinei şi superspiralizarea ADN determină inhibiţia sterică a
transcrierii, starea condensată a ADN nefiind propice pentru transcriere.

• Genele care determină sinteza diferitelor fracţiuni histonice sunt prezente, în

mai multe copii în genomul organismelor şi pot fi dispuse în tandem pe acelaşi
segment de ADN. (ex. la Drosophila melanogaster genele ce codifică sinteza
celor cinci tipuri de histone sunt grupate la nivelul unei secvenţe de 5.000 pb,
secvenţă ce se repetă în tandem de 100 ori).
Master – Biotehnologii în protectia mediului
 PROTEINE HISTONICE
2 x [ H2A, H2B, H3, H4 ] = MIEZUL NUCLEOSOMULUI
1. Dimerizarea histonelor
H3 + H4- heterodimer 2 x [H3‐H4]- tetramer 4[H3‐H4]
2[H2A] şi 2[H2B] dimeri

2. Inițierea nucleosomului
ataşarea la ADN a unui tetramer 4[H3‐H4]

3. Terminarea formării nucleosomului

dimeri 2[H2A] şi 2[H2B] se ataşează
la acest complex

NUCLEOSOM

H1 se leagă la ADNul linker, dintre 2 nucleosomi cu rol in

stabilizarea structurii nucleosomului
PROTEINELE NONHISTONICE
• sunt bogate în aminoacizi cu caracter acid (ex. triptofanul şi acidul
aspartic). In ansamblu, proteinele aparţinând acestui grup prezintă puncte
izoelectrice diferite cuprinse între 3,0 şi 10,0.

• Se cunosc peste 120 tipuri diferite, cu greutăţi moleculare cuprinse între

10.000 şi 150.000 Da. Ele au specificitate de specie dar mai ales de ţesut,
variind calitativ şi cantitativ în funcţie de intensitatea proceselor
metabolice ale ţesuturilor respective.

Rolul proteinelor nonhistonice

• în reglajul fin al activităţii genelor, asigurând prin interacţiunea lor cu
histonele activarea specifică a genelor care trebuie să funcţioneze la un
moment dat. Activarea genelor se realizează în special prin fosforilare.
• cuprind o serie de enzime ale metabolismului nuclear, cum ar fi: ADN-
polimeraze, ARN-polimeraze, NAD-sintetaze, nucleozid-trifosfataza,
metilaze, fosfokinaze, proteine cu caracter contractil de tipul miozinei,
actinei, tubulinei (proteine implicate în “mişcările” cromosomilor).
• ca şi proteinele histonice, proteinele nonhistonice sunt sintetizate în
citoplasmă şi apoi transferate în nucleu. Ele sunt variabile şi heterogene
atât ca structură cât şi ca funcţie prezentând şi o mare viteză de sinteză şi
degradare. Activitatea lor presupune interacţiuni complexe atât cu
histonele cât şi cu ADN şi ARN.
Master – Biotehnologii în protectia mediului
În cazul organismelor simple cea mai mare parte a ADN este formată
din secvențe unice de nucleotide, purtătoare de informație genetică
(gene)
La organismele superioare ADN conține o mare cantitate de secvențe
repetitive: repetiții în tandem și repetiții dispersate.

Tipuri de secvențe repetitive din ADN eucariot: repetiții dispersate (sus)

și repetiții în tandem (jos)
- stau la baza unor metode de identificare a apartenenței taxonomice
a unor noi organisme
- evidențierea diversității moleculare.
Genele organismele superioare sunt mai complexe, prezentând în structura lor atât
secvenţe informaţionale - exoni (a căror succesiune de codoni se regăseşte în
ordinea aminoacizilor prin polipeptidul codificat) cât şi secvenţe noninformaţionale -
introni (secvente genice necodificatoare). In acest fel, genele de la eucariote au o
structură discontinuă sau în mozaic.
Master – Biotehnologii în protectia mediului
Exemple de plante cu infecţii de natură fungică
- Pustule liniare, ex.: Rugina neagră a grâului
- Pustule punctiforme, ex.: rugina brună

Puccinia graminis Puccinia triticina

Alterarea legumelor si fructelor constă în `reducerea
cantitatii recoltei si modificarea caracteristicilor organoleptice
(miros, gust, consistenţă)

Formarea unor substanţe toxice ca urmare a acţiunii

enzimelor proprii (autoliză)
Producerea de micotoxine – avand posibile efecte
negative asupra sanatatii umane
Micotoxine Mucegaiuri Produse agricole
/horticole
Zearalenone Fusarium graminearum, Cereale
Fusarium culmorum
Tricotecene Fusarium Cereale
(deoxinivalenol)
Aflatoxine Aspergillus flavus Arahide, alune,
Aspergillus parasiticus bumbac, fistic, smochine
Ochratoxine si citrinine Penicillium viridicatum Cereale, fructe, cafea
Aspergillus ochraceus
Aspergillus carbonarius

PIERDERI ALE
RECOLTEI
Bibliografie : Metaboliţi secundari şi mucegaiuri

# Specii fungice Acelaşi metabolit secundar

O singură specie fungică Mai mulţi metaboliţi secundari

29
Ribéreau-Gayon et al, 2004b, Simpson et al, 2004, Doaré-Lebrun, 2005, La Guerche et al, 2004, 2005, 2006, 2007,
Vacher et al, 2008, Bau et al, 2005a et 2006, Serra et al, 2005 et 2006a, Bejaoui et al, 2006, Belli et al, 2006, Gómez
et al, 2006, Perrone et al, 2006, El Khoury et al, 2008, Bragulat et al, 2008, Melki Ben Fredj et al, 2007 et 2009
 Ofiliri micotice

Ofilire cauzată de Verticillium

Ofilire cauzată de Fusarium
 • Se manifestă pe toate organele
Făinarea aeriene ale plantei, sub forma unor
pete pâsloase sau prăfoase, de
culoare albă

Uncinula necator
Făinarea viţei de vie

Erysiphae graminis
Făinarea cerealelor

Leveillula taurica
Oidium lycopersici
Făinarea tomatelor
Făinarea tomatelor
Exemple de plante infectate de Oomicete

Pythium sp.

Phytophthora infestans = Mana tomatelor