Elementele transpozabile, silenţierea şi rolul lor оn evoluţia

genomului vegetal
Fenomenele de silenţiere a genelor au furnizat ştiinţei plantelor noi instrumente pentru
descoperirea mecanismelor epigenetice care reglează expresia genelor. Un aspect remarcabil
al silenţierii genelor este diversitatea mecanismelor care apar, ca fiind rezultatul a numeroase
interacţii оntre acizii nucleici care se află оn nucleu dar şi оn citoplasmă. (Kooter J.M.,
Matzke M.A., Mayer P, 2001). Genomul plantelor se caracterizează prin prezenţa a
numeroase elemente transpozabile, iar multe dintre aceste elemente sunt inactivate sau
„silenţiate”. Studii recente au pus оn evidenţă noi direcţii cu privire la reglarea
elementelor transpozabile. De exemplu, la Caenorhabditis elegans, elementele
transpozabile sunt silenţiate post-transcripţional оn timp ce elementele transpozabile de
la Arabidopsis sunt „silenţiate” prin factori de remodelare ai cromatinei. Aceste observaţii
au pus оn evidenţă corelarea funcţională оntre silenţierea genelor şi supresia elementelor
transpozabile şi au avut implicaţii majore pentru оnţelegerea menţinerii integrităţii
genomului.

1. Tipuri de elemente transpozabile la plante: structura şi funcţia

Elementele transpozabile au fost prima dată descoperite оn anii ’50 ai secolului al XX-
lea la plante, de către Barbara McClintock, descoperire pentru care avea să primească Premiul
Nobel, abia оn anul 1983. Denumite iniţial elemente de instabilitate genomică, asemenea
entităţi s-au dovedit a juca la plante un rol major оn evoluţia genomului acestora. Toate
tipurile de elemente transpozabile pot fi prezente la toate speciile de plante, dar contribuţia lor
cantitativă şi calitativă este diferită. Inserţia elementelor transpozabile оn cromozom are efect
reglator asupra activităţii genetice din imediata vecinătate a punctului de inserţie.
Elementele genetice transpozabile sunt segmente ADN care оşi pot schimba poziţia
оn cadrul genomului prin excizie şi reinserţie pe acelaşi cromozom sau pe unul diferit.
Toate elementele transpozabile au două proprietăţi de bază:
1. capacitatea de a se muta din loc оn loc, la nivelului genomului → desemnate elemente
mobile ale ADN-ului.
2. capacitatea de a amplifica numărul de copii оn genom, pe calea transpoziţiei.
Primele elemente transpozabile au fost detectate la porumb, de către Barbara
McClintock, оn urma analizei fenomenului de instabilitate somatică, datorită căruia
apăreau pete de culoare pe frunze, tulpini, inflorescenţe, endospermul boabelor.
Este vorba de 2 tipuri de elemente de control şi anume:
a) elemente de control receptoare;
b) elemente reglatoare = unităţi de transpozare.
Cвnd sunt integrate оntr-un locus cromozomal, elementele de control produc o mutaţie
la acel locus, iar cвnd sunt excizate, gena suferă o reversie la funcţia sa normală. Alteori, la
integrare, se poate produce o anumită pigmentaţie a cariopsei, iar la excizie se produce aşa
numitul „fenotip de variegare”.
Toate elementele transpozabile prezintă cвteva trăsături comune:
¾ prezintă repetiţii inversate (IR) de lungimi variabile la ambele capete;
¾ la integrare determină duplicarea secvenţei ţintă (< 10pB);
¾ realizează o transpoziţie conservativă (excizie şi reintegrare);
¾ inserţia оntr-o genă inactivează funcţia genei, iar excizia duce la revenirea genei la
forma normală activă.
reglatoare, autonome
¾ cuprind elemente
receptoare, neautonome
¾ pot fi active sau inactive;
¾ transpozonii produc mutaţii care pot determina fenotipuri nule, fenotipuri active sau
fenotipuri intermediare.
La plante au fost identificate mai multe clase de elemente transpozabile:-transpozonii
TIR- repetiţii inverse terminale; retrotranspozoni virali; retrotranspozoni non-virali.
La porumb, cele mai оntвlnite elemente transpozabile sunt elementele Ac /
Ds (activator / dissociator), Spm / Dspm,( En / I), elementul Mutator, dar şi elementul
Tam оntвlnite la gura leului (Florell AJ, Pearce SR, Kuman A, 1994; Kunze R, Saedler H,
Lonning WE ,1997). Aceste elemente au mărimi diferite de la cвteva sute de baze la 10Kb.
Elementele Ac au lungimea de 4,6Kb, codifică pentru elemente unice, avвnd o
abundenţă destul de scăzută. ARNm de 3500 ribonucleotide poartă mesajul genetic pentru
un polipeptid de 807 aminoacizi, prezentвnd 5’-UTR de 650 ribonucleotide. La capete
terminaţiile invers repetate imperfecte au lungimea de 11 bp. Elementele Ds prezente la
porumb sunt localizate pe braţul scurt al cromozomului 9. La nivelul acestui situs
cromozomul se rupe оn 2 segmente libere – un segment acentric scurt şi unul cu
centromer- lung. Prin fuziunea braţelor libere ale cromatidelor surori se produce o
cromatidă dicentrică şi un fragment acentric care se poate pierde, determinвnd deleţia
cromozomului.
Fragmentul acentric deţine un corp picnotic оn citoplasmă şi ulterior dispare. Elementul
Ds poate suferi transpozare şi оn alţi cromozomi sau alte segmente ale cromozomului 9.
Elementele Ds şi Ac sunt de natură heterocromatică.
Tot la porumb s-a descris elementul modulator=Mp, cu localizare lвngă gena P,
responsabilă de pigmentaţia pericarpului şi mătăsii. Elementul modulator poate suferi
transpoziţii pe cromozomul 10, unde se asociază cu alela nestabilă R. Şi transpoziţia acestor
elemente poate produce fragmentarea cromozomului.
Aceste elemente modulatoare au fost detectate şi la alte specii de plante cum ar fi
Antirrhinum majus, unde s-au descris loci mutabili= gene aflate sub controlul altor gene şi
care sunt programate la un moment dat al dezvoltării să sufere mutaţii direcţionate sub
incidenţa interacţiei cu elementele de control. Această schimbare genică se numeşte
paramutaţie ( consecinţa interacţiei genice).
Tot la plante au fost identificate şi elemente transpozabile mici, adevărate elemente
оn miniatură, elemente ce prezintă repetiţii inversate, numite MITE (miniature inverted
repeat transposable element).( McClintock B,1946;Chen J, Greenblatt IM, Dellaporta S ,
1987).
Elementele transpozabile prezintă la capete terminaţii invers repetate, TIR cu mărimi
cuprinse оntre 11bp la Ac/Ds şi cвteva sute de baze la elementul Mutator, alături de
elemente imperfect repetate оntre primele 500 de baze şi capete care joacă un rol important
оn activare tuturor elementelor transpozabile (figura 1).
O familie de elemente transpozabile ADN este definită ca fiind de fapt secvenţe TIR.
Aceste familii de repetiţii inversate оmpreună cu alte elemente codifică pentru anumite
enzime numite transpozaze care au rolul de a recunoaşte familia TIR.

TE sunt оmpărţite оn două clase iar acestea оn mai multe subclase (figura1). Cei mai
reprezentativi membri ai subclasei de elemente transpozabile ADN includ elementele Mu
(Mutator), Spm (supresor-mutator), transpozonii En (enhancer) şi Ac de la porumb.

MURA

(a) MU

MURB

(b) Tto 1

(c) S1

Pol III motif

Figura 1. Structura elementelor transpozabile: a) elementul Mu de la porumb este un exemplu de transpozon

ADN şi prezintă la capete terminaţii invers repetate (TIR) şi două gene ce codifică pentru proteinele MURA-
implicat оn procesul de transpoziţie şi MURB a cărei funcţie nu se cunoaşte; b) elementul Ttn1 de la tutun este un
LTR retrotranspozon, prezintă un singur ORF ce codifică pentru gag şi pol; c) elementul S1 de la Brassica este
un exemplu de element SINE şi nu prezintă la capete repetiţii terminale sau gene funcţionale. De fapt, aceste
elemente prezintă casetele A şi B, care sunt recunoscute de ARN polimeraza III. Integrarea elementului S1
cauzează metilarea de novo a elementului la regiunea de flancare.

Retroelementele, numite оncă elementele transpozabile ARN, sunt оntвlnite

din abundenţă la plante. La porumb acestea reprezintă 70% din ADN nuclear. Toate
aceste elemente sunt reverstranscrise.( Schmid CW ,1996).
O clasă de elemente retrotranspozabile este clasa LINE-elemente lungi de spaţiere.
Elementele LINE codifică pentru proteinele gag şi polimerazice (pol) precum şi pentru
enzime cum ar fi transcriptaze. Funcţia pol este de a facilita reverstranscrierea LINE ARN
оn ADN, cвnd o endonuclează ce codifică pentru aceasta este probabil asociată cu
integrarea оn genom.( Cost GJ, Boeke 1998). Inserturile LINE sunt flancate de duplicaţii
directe scurte ale ADN ţintă.
Aproape toate retroelemetele conţin elemente lungi repetitive sau LTR.( Xiong Y,
Eickbush TH ,1990).Elementele lungi de spaţiere, LTR, codifică pentru funcţia de integrare
adică o integrază care facilitează оncorporarea produşilor circulari ai reverstranscrierii
оn cromozom (figura 1)(Grandbastien M-A 1998).
Două clase de LTR au fost descrise (numite după primii reprezentanţi, observaţi la
Drosophila) şi se numesc gypsy şi copia, care sunt diferite оn poziţia de integrare şi
codifică pentru polipeptide.
O clasă majoră de retroelemente sunt elementele SINE- elemente mici de spaţiere-
elemente nucleare de integrare, care deşi sunt destul de rar оntвlnite la plante au fost
bine investigate. Ele au оntre 100-300 bp ca mărime şi par a fi derivate prin
revertranscrierea produşilor ARN polimerazei III.
 2.Caracteristici generale ale procesului de silenţiere a elementelor
transpozabile
De cвnd Barbara McClintock a pus оn evidenţă elementele transpozabile la
porumb, acestea au fost apoi identificate şi investigate la un număr mare de plante.
Elementele transpozabile sunt segmente mici din cromozom şi au capacitatea de a „sări”
dintr-o regiune оn alta оn genom fenomen numit „transpoziţie”. Elementele
transpozabile alcătuiesc o proporţie semnificativă din genomul plantelor superioare şi
activarea lor poate determina efecte de tipul deleţiilor genelor, inserţii, alterări оn
expresia genică şi rearanjamente cromozomale. Aceste mutaţii pot fi de obicei deletorii.
De asemenea, inactivarea elementelor transpozabile (TE) poate fi crucială pentru
supravieţuirea organismului gazdă. Deoarece TE codifică pentru enzime necesare pentru
оntreţinerea lor şi pentru transpoziţie, supresia produşilor genici la nivel transcripţional şi
post-transcripţional se poate realiza prin mai multe căi.
Silenţierea este rezultatul interacţiei оntre multiple copii ale transgenelor şi
genele endogene implicвnd mecanisme bazate pe omologie ce acţionează atвt la nivel
transcripţional cвt şi post-transcripţional. Silenţierea transcripţională TGS este asociată
cu modificări epigenetice moştenite оncă din meioză (cum este cazul metilării citozinei).
Cazurile de trans-silenţiere (оn care locusul silenţierii transgenei induce o reducere
meiotică ereditară оn transcripţia locusului ţintă se aseamănă cu paramutaţia genelor
endogene (paramutaţia este definită ca interacţia оntre alele, care conduce la o alteraţie
moştenită оn expresia uneia dintre aceste alele). Silenţierea post-transcripţională PTGS
(cosupresia) implică creşterea unui turnover ARN оn citoplasmă şi este restabilită оn
timpul meiozei. Fiecare tip de silenţiere poate reflecta un răspuns destinat de apărare
al gazdei la oricare dintre elementele transpozabile sau virusuri ( Stam M., Mol J.,
Kooter J., 1997) (figura 2). De fapt, acest proces de silenţiere este un tip remarcabil de
reglare genică bazat pe ţintirea unor secvenţe specifice şi pe degradarea ARN.
Elementele transpozabile, silenţierea şi rolul lor оn evoluţia genomului vegetal

Figura 2. Un model pentru TGS şi PTGS. DsARN joacă rolul central оn aceste procese ; acestea pot deriva
din oricare dintre locusurile transgenelor sau prin copierea unui ARN aberant ; (a) ARNds din nucleu - trăgaci
pentru metilarea de novo a ADN omolog. Dacă promotorul este metilat el conduce la TGS ; dacă regiunea de
codificare este metilată ea conduce la PTGS pe calea producerii transcripţilor aberanţi. (b) iniţial s-a propus
că ARNds poate fi transcris direct de ARN polimeraza (RdRP).(c) se va produce cARN, reprezentat de ARNs
monocatenar (ss) sens – antisens (as) de mărimi variate.(d) asARNs se va оmperechea cu secvenţe
complementare ale ARNm care va fi apoi degradat prin (e) RNAza (f) alternativ, perechile de baze asARNs
pot fi la оnceput transcrise оn mARN cu ajutorul RdRp. Aceasta este posibil dacă PTGS indusă prin ARNs
derivă din exprimarea puternică a unor copii de transgene unice sau prin metilarea genelor care sunt aberante,
urmate apoi de căile de silenţiere la acest punct. (g) RdRP va selecta aceste ARNs aberante şi sunt generate
asARNs. (i) acestea pot fi de asemenea degradate de dsRNaza pвnă la dsARNs mici şi/sau ssARNs. DsARNs
din nucleu prezintă probabil sensibilitate la dsRNaza. Punctele (h) şi (i) pot fi considerate căi de amplificare a
PTGS. (j) asARNs mici pot ataşa capetele de degradare a altor mARNs. (k) ssARNs şi/sau dsARNs vor
reprezenta semnale sistemice ale procesului de silenţiere care pot fi transportate de-a lungul plantei şi ţintesc
PTGS оn alte celule. (l) dsARNs mici pot induce metilarea secvenţelor ADN omologe оn nucleu, cum ar fi alte
dsARNs(a).

Studii recente realizate la plante cвt şi la alte organisme au relevat că TGS şi PTGS pot
fi responsabile de silenţierea elementelor transpozabile. Mai mult, la Arabidopsis, au fost
evidenţiate legături оntre reglarea conformaţiei cromatinei şi silenţierea elementelor
transpozabile (tabelul 1).
 Tabel 1. Diferenţe оntre PTGS şi TGS

PTGS
• Silenţiere cauzată de degradarea post-transcripţională a ARN;
• PTGS este condusă оn citosol;
• Metilarea regiunii de codificare a proteinei este adesea asociată cu PTGS
• PTGS este restabilit la fiecare generaţie
• O caracteristică a PTGS este silenţierea sistemică, cu toate că natura exactă a
semnalului nu este stabilită.
• TGS
• Silenţiere cauzată de blocarea
transcripţiei; • TGS are loc оn nucleu;
• De obicei promotorii genelor silenţiate sunt metilaţi оn
TGS; • TGS este moştenită stabil după meioză;
• TGS nu este implicată оn silenţierea sistemică.

3. Diferenţe оntre elementele transpozabile şi transgene

Silenţierea elementelor transpozabile şi a transgenelor are multe trăsături comune.
Totuşi, elementele transpozabile diferă de transgene оn multe puncte, unul dintre acestea
fiind faptul că TE sunt ţinte specifice de integrare, оn timp ce transgenele se integrează
randomic. Multe dintre retroelementele de la porumb au tendinţa de a se insera оn
interiorul altor retroelemente formвnd structuri strвnse. Pe de altă parte, aceste elemente
pot recunoaşte heterocromatina represivă ca o ţintă de integrare. Este posibil ca
heterocromatina represivă să fie оntinsă deoarece оn timpul transpoziţiei retroelementelor,
ele vor ţinti alte retroelemente. Acest lucru sugerează că, TE, оn special retroelementele,
sunt mult predispuse la silenţiere decвt transgenele. Оn al doilea rвnd, transgenele оntr-o
singură copie sunt uneori metilate şi silenţiate, оn timp ce silenţierea TE este presupusă a fi
protejată contra elementelor оn multe copii.

Au fost identificate mai multe mutante ale procesului de silenţiere. De exemplu, mutanţi
defectivi оn PTGS au fost izolaţi la Neurospora şi Arabidopsis (tabel 3). De exemplu, gena qde-
1 de la Neurospora codifică pentru o proteină cu omologie pentru RdRp, iar identitatea
genelor sgs (supressor of gene silencing) a fost de curвnd pusă оn evidenţă la Arabidopsis.
Tot la Arabidopsis au fost identificaţi şi mutanţi TGS; este vorba de som şi hog ( Furner J.,
Sheikh M.A., Collett C.E., 1998). Multe din genele som sunt alele ale ddm1 şi de asemenea
codifică pentru proteine de remodelare a cromatinei. Interesant este faptul că, mutanţii care
determină scăderea procesului de metilare nu acţionează оntotdeauna pentru determinarea
unei adoptări simple prin care metilarea represează expresia genică. De exemplu,
reducerea numai a metilării nu este suficientă de a reactiva o transgenă htp silenţiată, dar
nu va reface activitatea mutanţilor ddm1 sau som, astfel implicвnd represia cromatinei оn
silenţiere.
 Concluzii
Elementele transpozabile sunt instrumente foarte utile pentru identificarea şi izolarea
de gene, inclusiv la specii la care au sisteme de elemente genetice transpozabile bine
caracterizate (Antirrhinum majus, Arabidopsis thaliana), prin introducere de transpozoni
heterologi.
Elementele transpozabile sunt considerate agenţi mutageni biologici, deoarece au
capacitatea de a modifica structura şi expresia genelor lвngă şi оn interiorul cărora se
inseră. Ele asigură recombinarea genetică nelegitimă. Prin amplificarea şi dispersia
lor, prin rearanjamentele mediate de inserţie şi excizie, elementele transpozabile
constituie un mecanism important pentru evoluţia genomului nu numai la plante, ci şi la
alte organisme ce posedă astfel de elemente(bacterii, viermi, insecte).
Cercetarea fenomenului de silenţiere genică şi fenomenelor epigenetice a fost
concretizată prin aducerea de semnificaţii deosebite ale fenomenului de silenţiere a
elementelor transpozabile la plante. Оn particular, studiile de genetică moleculară
la Arabidopsis furnizează dovezi directe оn ce priveşte rolul represiei cromatinei оn
silenţierea elementelor transpozabile.

Bibliografie selectivă

1. CHANDLER V.L., Paramutation in maize, Plant.Molec.Biol. 43, 121-145,(2000).

2. CHEN J, GREENBLATT IM, DELLAPORTA S : Transposition of Ac from the P locus
of maize into unreplicated chromosomal sites. Genetics,117: 109-116(1987).
3. COST GJ, BOEKE JD : Targeting of human retrotransposon integration is directed by the
specificity of the L1 endo nuclear for regions of unusual DNA structure. Biochemistry 22:
18081-18083 (1998).
4. DROUIN G, DOVER GA : A plant processed pseudogene. Nature 328: 557-558(1987).
5. ENGLISH J, HARRISON K, JONES JDG: Agenetic analysis of DNA sequences
requirement for Dissociation state I activity in tabbaco. Plant.Cell 5: 501-514(1993).
6. FAGARD M., VAUCHERET H., (Trans)gene silencing in plants: haw many
mechanisms? Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 51, 167-194, (2000).
7. FLORELL AJ, PEARCE SR, KUMAN A: Plant transpozable elements and the genom.
Curs Opin. Genet Dev 4: 838-844(1994).
8. FLOVELL RB, BENNETT MD, SMITH JB, SMITH DB: Genome size and proportion of
repeated nucleotide sequence DNA in plants. Biochem. Genet. 12: 257-269(1974).
9. FURNER J., SHEIKH M.A., COLLETT C.E: Gene silencing and homology dependens
gene silencing in Arabidopsis: genetic modifiers and DNA methylation, genetics 149 651-
662, (1998).
10. GRANDBASTIEN M-A: Activations of plant retrotransposons under stress conditions.
Trends Plant Sci 3: 181-187(1998).