1
Introducere
Există organisme şi microorganisme vii care au dimensiuni atât de mici încât nu pot f
observate decât la microscop (optic sau electronic). Între aceste microorganisme putem
discuta despre alge, fungi, bacterii, virusuri şi paraziţi. Relativ de curând au intrat în
discuţie şi alte structuri numite prioni. Diferitele microorganisme sunt studiate în cadrul
disciplinei de microbiologie. Ca un domeniu înrudit cu microbiologia poate f considerată şi
imunologia.
7
Din păcate, în ciuda monumentalității sale, ”nu a fost posibil” să fe găsit un spațiu în
care să-şi poată continua cercetările şi după pensionare, lucru din păcate mult prea des
întâlnit în istoria medicinei noastre.
Cu privire la poziţia acestui mare cercetător precum şi la situaţii care par a f foarte
asemănătoare peste ani, în ciuda trecerii timpului şi a speranţei că evoluţia societăţii
noastre este într-o direcţie pozitivă, vom prezenta în continuare un fragment din discursul
profesorului Victor Babeş, ţinut la Universitatea din Cluj în anul 1919. „Astăzi lumea
civilizată aşteaptă deci lucruri mari din partea noastră; nu îmbogăţirea oligarhiei
politice în afaceri, certuri politice, persecuţiuni şi denunţuri infame pentru
interese egoiste şi înguste, ci păstrarea şi sporirea celor mai valoroase
achiziţiuni ale omenirii: sănătatea, prosperitatea, forţa, justiţia, instrucţiunea şi ştiinţa,
spre a asigura pacea şi progresul şi prin ele forţa şi fericirea poporului român, servind de
exemplu popoarelor din Orient.
Dar politica noastră de până acum n-a făcut decât să ne ducă în cea mai mare
desorganizare, desbinare şi dezastru economic, permiţând prin egoism şi
nepăsare ca ţărănimea să fe azi degenerată, analfabetă, lipsită şi îndatorată
peste măsură; politicienii noştri au reuşit să oprime toate valorile, înlocuindu-le
prin clientela lor politică; au adus funcţionarismul, birocratismul, nepotismul la
culme; politicienii noştri în nepăsarea lor pentru interesele ţării au lăsat armata la
începutul războiului aproape nepregătită în clipele cele mai periculoase prin care a trecut
ţara şi din care nu ne-a scăpat decât vitejia fără pereche a soldatului român.
Trebue să ne întrebăm dacă nu acest politicianism este cauza tuturor relelor şi dacă nu
este o datorie patriotică să întrebuinţăm toate mijloacele necesare ca să-l nimicim şi să-l
înlocuim cu o altă putere care să ne garanteze regenerarea şi progresul.
În adevăr trebue să fm profund îngrijaţi şi să ne întrebăm înainte de toate cum vom
putea să eşim din acest dezastru şi cum vom putea face faţă creanţei mari pe care am
contractat-o faţă de lumea civilizată.
Publicul care, până deunăzi, a observat la guvernanţii noştri aceleaşi viţiuri politice,
aceeaşi nepăsare pentru interesele reale ale ţării, acelaşi nepotism, aceeaşi venalitate,
acelaşi egoism care ne-a condus la degenerare ca şi înainte războiului,aşteaptă cu
nerăbdare o schimbare radicală a moravurilor politice care să ne pună în
poziţiunea de a îndeplini măreaţa noastră misiune.
Faţă de aceste adevăruri ar f trebuit să ne aşteptăm ca România nouă să pună piciorul
în prag şi să rupă odată pentru totdeauna cu vechiul politicianism. Însă ce vedem spre
profunda noastră descurajare; că aceeaşi principii dezastruoase, egoiste, aceeaşi fraze
goale domină şi politica de astăzi şi că mergem orbi înainte spre un dezastru sigur. În loc ca
întinderea şi bogăţia acestei ţări binecuvântate să ne asigure un loc de frunte şi stare
economică briliantă, ne găsim astăzi în deplin faliment, expuşi ruinei şi foametei şi mai
mult decât oricând sub dependenţa şi exploatarea nemiloasă a naţiunilor mari.”
Ion Cantacuzino a avut o personalitate cu totul deosebită, imposibil de cuprins într-o
trecere atât de sumară prin istoricul microbiologiei. A studiat la Paris Filozofa şi
Literele, ştiinţele naturale şi Medicina. Pregătirea în microbiologie a desăvârşit-o pe
8
parcursul a 9 ani, în laboratorul lui Ilia Mecinikov, la Paris. A cunoscut mai multe limbi
străine, inclusiv latina şi greaca. A studiat la Paris şi a revenit în ţară pentru satisfacerea
stagiului militar (genişti, Jilava). A continuat studiile în Franţa (ştiinţe naturale 1886,
medicină 1887). Lucrează în Institutul Pasteur începând cu 1892, devine doctor în medicină
în 1894 şi este numit profesor suplinitor de Morfologie animală la Facultatea de Ştiinţe din
Iaşi (1894). A fost numit profesor la Facultatea de Medicină din Bucureşti în anul 1901 şi a
grupat în jurul său un mare număr de tineri medici, care au devenit la rândul lor
îndrumători şi creatori de şcoală (Al. Slătineanu, C. Ionescu-Mihăieşti, M. Ciucă, Al. Ciucă, D.
Danielopolu, D. Combiescu, N. Gh. Lupu, I. Bălteanu, I. Nicolau, Lidia şi I. Mesrobeanu şi
mulţi alţii).
În perioada 1908-1910, profesorul Cantacuzino este numit Director General al
Serviciului Sanitar, face Legea de organizare a acestui serviciu, înfinţează sanatoriile
Bisericani, Bârnova, Nifon, Cărbuneşti, Filaret precum şi primele laboratoare regionale de
bacteriologie şi igienă (Craiova, Galaţi, Constanţa, Iaşi, Sulina). Începe în 1912 prepararea
vaccinului contra febrei tifoide şi a holerei asiatice, ulterior începe prepararea serului
antidifteric. Este numit în 1917 Director al Directoratului Sănătăţii Publice civile şi militare,
calitate în care coordonează combaterea epidemiilor de holeră, tifos exantematic, febră
recurentă. În 1920 începe prepararea serurilor antimeningococic şi anti gangrenos (în
Laboratorul de Medicină experimentală) iar în data de 4 iunie semnează în calitate de prim
delegat, Tratatul de la Trianon. Un an mai târziu se înfinţează Institutul de Seruri şi
Vaccinuri, în 1926 începe vaccinarea BCG în România iar în 1928 înfinţează „Archives
Roumaines de Pathologie Expérimentale et de Microbiologie”. Din păcate, în momentul de
faţă „Romanian Archives of Microbiology and Immunology” (numele actual al revistei, care
a ajuns la volumul cu numărul 69) nu apare listată între publicaţiile recunoscute ofcial în
ţara noastră, cu toate că începând cu anul 2005 a existat un reviriment, comitetul editorial
străduindu-se să refacă prestigiul revistei, ca o datorie morală faţă de înaintaşi.
În perioada 1931-1932 face parte din Guvernul prezidat de Nicolae Iorga, în calitate de
ministru al sănătăţii publice. Lucrează la elaborarea unei noi legi sanitare. Cu numai nouă
zile înainte de a înceta din viaţă prezidează Congresul de Tuberculoză şi propune înfinţarea
Ligii contra Tuberculozei.
Pe lângă şcoala pe care a format-o, una dintre cele mai mari realizări ale Profesorului
Cantacuzino a fost înfinţarea în anul1921 a Institutului de Seruri şi Vaccinuri, numit
astăzi INCDMI „Cantacuzino” (Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare pentru
Microbiologie şi Imunologie), centru de cercetare ştiinţifcă fundamentală şi aplicativă,
centru de învăţământ de specialitate, instituţie care a preparat şi prepară seruri, vaccinuri
şi alte produse biologice utile în diagnosticul bolilor transmisibile.
Alexandru Slătineanu (1873-1939) a organizat învăţământul universitar de
microbiologie la Iaşi (cercetări în domeniul febrei tifoide, tuberculozei, tifosului
exantematic, etc.).
Constantin Ionescu-Mihăieşti (1883-1962) a abordat teme importante în domeniul
virusologiei, bacteriologiei, parazitologiei, imunologiei, hematologiei, anatomiei patologice
şi epidemiologiei. A avut contribuţii deosebite în studierea mycobacteriilor şi
9
enterovirusurilor. A muncit intens pentru dezvoltarea Institutului „Cantacuzino” a cărui
director a fost începând cu anul 1934. A continuat activitatea ştinţifcă şi administrativă
promovată de Ion Cantacuzino.
Mihai Ciucă (1883-1969) a dezvoltat o bogată activitate ştiinţifcă în domeniul
bacteriologiei şi epidemiologiei, experimental, terapeutic şi clinic. A studiat împreună cu
Jules Bordet fenomenul lizogeniei (1921); a avut contribuţii deosebite în domeniul malariei
find numit secretar al Comisiei de Malarie de pe lângă Liga Naţiunilor. A fost profesor de
microbiologie întâi la Iaşi şi din 1934 în Bucureşti find al treilea profesor de bacteriologie
din Bucureşti după Victor Babeş şi Ion Cantacuzino.
Alexandru Ciucă (1880-1872) a absolvit facultatea de medicină veterinară din
Bucureşti. Activitatea lui s-a îndreptat mai ales spre organizarea producţiei de seruri
hiperimune pentru tratamentul tetanosului, difteriei etc. A fost al treilea director al
Institutului Cantacuzino.
Dumitru Combiescu (1887-1961) a cercetat capitole majore ale patologiei infecţioase
(febra tifoidă, febra recurentă, dizenteria, tetanosul, antraxul, gangrena gazoasă etc). A
avut contribuţii deosebite în domeniul rickettsiozelor şi leptospirozelor. În timpul primului
război mondial a organizat măsuri de prevenire a tifosului exantematic.
Matei Balş (1905-1989) a fost cea mai proeminentă personalitate a secolului XX, în
România, în domeniul bolilor infecţioase. A făcut un stagiu de microbiologie la Institutul
Pasteur din Paris şi ulterior a intrat între personalităţile cu formaţie „cantacuzinistă”,
lucrând alături de Ion Cantacuzino, Mihai Ciucă, I. Bălteanu. Deşi era un foarte bun clinician
a devenit şi întemeietorul şcolii moderne de bacteriologie clinică. Tehnicile şi metodele de
diagnostic imaginate i-au adus numeroase brevete şi inovaţii care îi poartă numele atât în
ţară cât şi în străinătate.
Şcoala astfel întemeiată a avut o activitate cu rezultate excepţionale pentru ştiinţa
românească, pentru microbiologie şi pentru sănătatea publică.
După 1989, Institutul Cantacuzino a reintrat în Reţeaua Internaţională a Institutelor
Pasteur şi a Institutelor Asociate ceea ce a permis obţinerea unor rezultate, importante.
INCDMI „Cantacuzino” trebuie să continue tradiţia înaintaşilor şi să îşi menţină poziţia
importantă în cadrul instituţiilor care se ocupă de sănătatea publică la nivel naţional şi
internaţional. Eforturile de la nivel central din perioada 1997-2000 şi respectiv eforturile
depuse în perioada 2005-2007 au reprezentat un sprijin important în acest sens.
George Emil Palade (1912-2008)
Absolvent al facultăţii de medicină din Bucureşti, a desfășurat o prodigioasă activitate
ştinţifcă, în Statele Unite. A fost unul dintre pionierii microscopiei electronice şi a
fracționării celulelor (separarea organitelor celulare). A fost iniţial cercetător şi ulterior
profesor de biologie celulară al Institutului Rockefeller din New York iar din 1973 al
universităţii Yale din New Haven. Ultimul loc în care George Emil Palade a fost profesor a
fost facultatea din San Diego, California. A pus bazele unor noi departamente pentru studiul
celular.
Cercetările lui au cuprins descrierea rolului şi structurii mai multor organite
(mitocondria în detaliu cu structura membranei și a cristelor, a defnit rolul reticulului
10
endoplasmic, sistem tubular ce este prezent in orice celula animală sau vegetală). Într-un
articol publicat în 1955, Palade a prezentat o fotografe de microscopie electronică ce
reprezenta reticulul endoplasmic rugos şi a explicat legătura între cele 2 structuri şi rolul lor
în eliberarea produşilor de secreţie).
Cea mai importantă a fost descoperirea rolului corpusculilor citoplasmatici, denumiţi
iniţial ”corpusculii lui Palade”. A precizat compoziția lor esențială (acizi ribonucleici)
rezultând altfel denumirea de „ribozomi”.
În 1974 realizările sale sunt încununate cu premiul Nobel pentru Medicină şi Fiziologie.
Datorită eforturilor depuse, incidenţa şi prevalenţa anumitor boli infecţioase a scăzut.
Trebuie avută însă în vedere emergenţa şi re-emergenţa diferitelor maladii.
Microbiologul, medicul clinician şi asistenta medicală trebuie să aplice cunoştinţele de
microbiologie în practica de zi cu zi. Deşi anumite tehnici pot f învăţate din rutină,
persoana cu adevărat profesionistă înţelege faptele ştiinţifce precum şi principiile afate la
baza acestor tehnici. Profesionistul ştie de asemenea în ce mod ar trebui adaptate aceste
tehnici în cazul anumitor tipuri de pacienţi (ex. pentru cei supuşi chirurgiei cardiace,
pacienţilor care au suferit arsuri pe suprafeţe întinse), ce tehnici trebuie utilizate în sălile de
operaţie, de aşteptare şi în instituţiile unde sunt îngrijiţi copii mici sau foarte mici, cum pot
f modifcate acestea în condiţii de urgenţă (de exemplu în caz de război sau alte calamităţi
produse de om sau calamităţi naturale) şi cum trebuie făcută informarea pacienţilor,
populaţiei, de exemplu referitor la imunizări. Un membru antrenat alechipei medicale
poate să diferenţieze adevărul de interpretarea greşită şi / sau dezinformarea din aşa-zisa
„literatură medicală” scrisă pentru publicul larg şi poate recunoaşte erorile apărute în mass
media, dacă are noţiunile necesare de microbiologie.
Persoanele care lucrează în domeniul sanitar dar şi orice altă persoană realmente
interesată, constată sau pot constata că în aproape orice activitate cotidiană există o
aplicabilitate a cunoştinţelor microbiologice.
Povestiri Adevarate
1.1.1. Girolamo Fracastoro (1478-1553)
S-a născut într-o veche familie de medici. A fost coleg la Facultatea de Medicină cu
Nicolaus Copernicus (astronom şi medic). S-a ocupat atât de medicină cât şi de astronomie,
matematică, poezie, geografe, muzică etc.
Poate f considerat un bun diagnostician; este primul medic care a făcut diferenţa între
ciumă şi tifosul exantematic (au existat 2 izbucniri epidemice de tifos, analizate de această
minte luminată, în 1505 şi în 1528). Se poate spune că a descris corect din punct de vedere
epidemiologic, în lumina datelor cunoscute la acea vreme, ciuma, variola, febra tifoidă şi
tifosul exantematic.
A scris mai multe lucrări în domeniul medical, care cuprind informaţii incredibil de
corecte, dintre care unele au fost confrmate ulterior aproape în totalitate.
11
Prima dintre aceste lucrări a fost scrisă în versuri şi se pare că a fost publicată la
Veneţia [Syphilis sive morbus Gallicus(Siflisul sau boala galică), 1530, trei volume; numele
se datorează faptului că se presupune că siflisul ar f fost răspândit în Italia de trupe
franceze asediatoare]. În primele două volume, Fracastoro descrie cu bune amănunte
siflisul; a descris şi luesul ca entitate în cadrul acestei patologii, a discutat modalităţile de
debut şi chiar diferenţele între cele trei stadii ale bolii. Apar menţionate şi informaţii despre
modalităţi de diagnostic şi „tratament” (vapori de mercur, mixturi din sulf, mercur şi
extracte vegetale etc). În această scriere sunt discutate chiar şi metode de prevenţie. În al
treilea volum, Girolamo Fracastoro prezintă date privind călătoriile lui Columb în Indiile de
Vest (se pare că boala era foarte răspândită printre băştinaşi) dar şi o poveste din
mitologie, povestea păstorului Syphil (numele siflisului are, se pare, o vechime foarte
mare) care a fost pedepsit de zeul Apollo, tocmai prin această boală.
Lucrarea De contagione, contagionis morbis et eorum curratione („Despre contagiune,
boli contagioase şi tratamentul lor”), publicată tot la Veneţia, la vârsta de 68 de ani, include
toate cunoştinţele şi teoriile lui Fracastoro referitor la bolile contagioase ale acelor vremuri.
În mod uimitor, cu sute de ani înainte ca aceste aspecte să fe studiate şi parţial
demonstrate ştiinţifc de către Louis Pasteur, într-o vreme când bolile erau considerate
drept „pedeapsa zeilor”, teoria „miasmelor morbigene” a lui Hipocrate este combătută iar
Fracastoro emite ipoteza conform căreia bolile contagioase sunt transmise prin intermediul
unor „finţe invizibile” [Seminaria morborum (seminţele bolilor)]. După mai mult de 130 de
ani, Antony van Leeuwenhoeck utilizează microscopul pentru a studia câteva dintre
microorganisme. În plus, Girolamo Fracastoro discută căile de intrare a „seminţelor bolii” în
organism: a. pe gură, b. prin respiraţie, c. prin răni, d. direct prin piele. Mai mult decât atât,
clasifcă „contagiul” drept find de trei feluri: a. prin contact direct (ex. în tuberculoză, lepră,
siflis); b. prin contact indirect, prin fomites (haine, aşternuturi, farfurii) şi c. la distanţă
(„seminţele morbigene” find purtate la distanţă de către vânt, ploaie, apa râurilor etc., ca
în cazul ciumei). Cu toate că a oferit incredibil de multe explicaţii, cu toate că teoriile sale
au fost în bună parte confrmate ulterior, la acea vreme nu au fost acceptate iar teoria
„miasmelor morbigene” a fost pentru încă mult timp considerată ca find valabilă.
Cu toate acestea, se poate spune că Girolamo Fracastoro poate f recunoscut în istoria
medicinei ca „părintele patologiei infecţioase”.
revenire sus
15
2.STRUCTURA CELULEI
BACTERIENE
2. 1. Caracteristici
Bacteriile se pot clasifca după mai multe criterii, însă o variantă utilă de clasifcare este
clasifcarea în funcţie de structură şi aspectul peretelui bacterian, bacteriile putând f:
- rigide, cu perete dens, imobile sau mobile; unele dintre aceste bacterii pot forma
micelii (ex. bacterii din genurileMycobacterium, Actinomyces, Streptomyces, Nocardia);
dacă majoritatea bacteriilor studiate sunt cultivabile pe medii artifciale există şi bacterii
care pot f denumite ca paraziţi strict intracelulari (ex. genurile Rickettsia, Chlamydia);
- fexibile, cu perete celular subţire (ex. spirochetele, Treponema spp, Leptospira spp.);
- lipsite de perete celular (ex. bacteriile din genul Mycoplasma).
Celula bacteriană este o celulă procariotă şi are caracteristici structurale diferite în
comparaţie cu celula eucariotă
Forma
2. 2. 1. În funcţie de formă, bacteriile se pot grupa în mai multe categorii şi pot avea:
16
a). formă cocoidală, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat.
Majoritarea steptococilor şi staflococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii
sunt lanceolaţi, gonococii şi meningococii pot f reniformi.
Dispunerea bacteriilor depinde de mediul de cultură în care se dezvoltă, de vârsta
culturii bacteriene, de alte aspecte fziologice precum şi de modul în care are loc diviziunea
în cursul procesului de creştere şi multiplicare (planul de diviziune).
Modul de dispunere poate f considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele
genuri de bacterii, de ex.:
- staflococii sunt coci sferici dispuşi în grămezi („ciorchine”);
- pneumococii sunt coci lanceolaţi dispuşi doi câte doi, eventual înconjuraţi de o capsulă
comună (în diplo);
- streptococii sunt coci dispuşi în lanţuri etc.;
b). formă de bastonaş (bacili, „rods”), drepţi cu capetele uşor rotunjite (enterobacterii),
drepţi cu capetele tăiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuţite
(Fusobacterium nucleatum), dispuşi uneori într-un mod caracteristic (de exemplu „în
palisade”, ca şi scândurile dintr-un gard - bacilii pseudodifterici);
c). aspect cocobacilar (exemplu H. infuenzae, B. pertussis, B. abortus);
d). actinomicete, care în culturi tinere formează flamente lungi, ramifcate (asemănător
mucegaiurilor); aceste flamente se fragmentează şi rezultă aspecte bacilare
(ex. Actinomyces israelli);
e). forma spiralată (bacili curbi - V. cholerae, spirili şi spirochete - T. pallidum).
Unele bacterii, chiar şi atunci când rezultă prin multiplicarea unei singure celule
„mamă” prezintă un pleomorfsm deosebit de accentuat (de exemplu Proteus spp.).
În culturi vechi sau sub infuenţa unor factori fzici, chimici, biologici, sub tratament cu
antibiotice etc., pot apărea forme modifcate: flamentoase, umfate, ramifcate etc., care
pot crea confuzii de diagnostic pentru examinatorul fără experienţă sau care nu face o
examinare ţinând cont de context. Dacă are loc repicarea acestora pe mediu de cultură
proaspăt iar examinarea ulterioară se face la timpul potrivit (având în vedere durata optimă
de multiplicare) vor rezulta forme „tipice” pentru specia respectivă.
Dimensiunile
2. 2. 2. Dimensiunile variază în funcţie de gen, specie, condiţiile de mediu, vârsta şi
stadiul de dezvoltare al culturii. În general bacteriile au dimensiuni de ordinul micrometrilor,
de exemplu, pentru coci 0,5-2 µm, iar pentru bacili 0,3-2/0,5-10 µm. Dintre bacteriile
vizibile la microscopul optic, Francisella tularensis (discutată astăzi în legătură cu posibile
atacuri teroriste) poate avea dimensiuni mici, de circa 0,3-0,6 µm / 0,2 µm. Rickettsiile,
chlamydiile şi mycoplasmele nu sunt vizibile la microscopul optic datorită dimensiunilor
17
foarte mici. Flagelii pot atinge dimensiuni de până la 10µm. Formele flamentoase rezultate
după tratamentul cu antibiotice pot depăşi această dimensiune. Bacteriile din
genul Proteus pot prezenta „în mod natural” forme flamentoase, de dimensiuni mari.
Dacă în 1993 a fost pusă în evidenţă Epulopiscium fshelsoni (60-800 µm / 200-500 µm),
cea mai mare bacterie cunoscută astăzi este Thiomargarita namibiensis, o proteobacterie
Gram negativă, potenţial vizibilă cu ochiul liber (dimensiuni între 100–300 µm şi până la
750 µm). (1999)
Datorită dimensiunilor mici, bacteriile pot f vizualizate numai cu ajutorul microscopului,
fe clasic, cu lumina transmisă direct, atunci când utilizând un ocular cu o mărire de 10r şi
un obiectiv (de imersie) cu o mărire de 90-100 X, se realizează o amplifcare a
dimensiunilor bacteriene de circa 900-1.000 X, fe utilizând alte tipuri de microscoape. Spre
exemplu, utilizarea preparatelor colorate prin metode în care marcajul se face cu subtanţe
fuorescente va creşte puterea de rezoluţie iar numărul de câmpuri investigate poate f mai
redus în comparaţie cu investigarea unui preparat colorat clasic (a se vedea capitolul
referitor la genul Mycobacterium).
Iluminarea în câmp obscur permite examinarea preparatelor proaspete şi evidenţierea
agentului etiologic al siflisului (T. pallidum), agentul etiologic al leptospirozei (Leptospira
spp.), inclusiv mobilitatea acestora.
Informaţii privind preparatele microscopice, executarea şi colorarea frotiurilor, tehnica
examenului microscopic în diagnosticul microbiologic sunt prezentate în anexa nr. 1.
2. 3. Componentele structurale
ale celulei bacteriene
Atât din punct de vedere structural cât şi funcţional, există o serie de asemănări între
celula procariotă şi celula eucariotă. Bacteriile prezintă atât elemente structurale interne
cât şi structuri externe care pot şi merită a f studiate având implicaţii în relaţiile dintre
celula bacteriană şi organismul gazdă. Există două tipuri de elemente structurale, unele
dintre acestea find întâlnite la toate speciile de bacterii (constante), altele find întâlnite
numai în anumite condiţii şi doar la anumite specii sau tulpini bacteriene (facultative).
2. 3. 1. 3. Mezozomii
Mezozomii sunt structuri care se formează prin invaginarea membranei citoplasmatice
de care rămân legaţi. Sunt prezenţi în special la bacteriile Gram-pozitive. Au structura
chimică a membranei citoplasmatice şi aceleaşi funcţii în permeabilitate şi respiraţie. Cu un
capăt se pot fxa de materialul nuclear, favorizând distribuirea în mod egal a genomului
între cele două celule fice. Au rol şi în formarea septului transversal.
2. 3. 1. 4. Citoplasma
La microscopul optic, pe preparatele colorate uzual, observăm numai citoplasma
bacteriană, intens bazoflă. Detaliile structurale (nucleoplasmă, ribozomi, incluzii) se pot
observa numai cu ajutorul microscopului electronic. Are o structură mai simplă faţă de
citoplasma eucariotelor. Este constituită dintr-un sistem coloidal format din proteine,
enzime, lipide, pigmenţi, hidraţi de carbon, săruri minerale şi apă. Conţine în mod
caracteristic 80% apă, menţine într-un sistem coloidal proteine, carbohidraţi, lipide, săruri
etc, conţine o mare cantitate de ARN (ex. ARNm, ARNt).
Particulele citoplasmatice studiate sunt: ribozomii, incluziile, vacuolele; în citoplasmă
pot exista şi elemente facultative, plasmidele (formate din ADN extracromozomial).
La celula tânără citoplasma este intens colorată, omogenă, conţine ARN în cantitate
mare, este clară în timp ce la celula „bătrână” citoplasma are aspect granular.
2. 3. 1. 5. Ribozomii: structură, rol
Ribozomii au formă aproximativ sferică, pot f văzuţi la microscopul electronic. Mărimea
lor (circa 10-20 nm) depinde de concentraţia ionilor Mg 2+ şi K+. Unii ribozomi sunt liberi în
citoplasmă, în timp ce alţii apar legaţi de faţa internă a membranei citoplasmatice. Din
punct de vedere chimic conţin circa 65% ARNr (ribozomal). Au constanta de sedimentare de
70 unităţi Swedberg dar sunt constituiţi din două subunităţi de câte 30S şi respectiv 50S. În
subunitatea mică intră o singură moleculă de ARNr, 16S şi 21 de tipuri de proteine
ribozomale. În subunitatea mare intră mai multe tipuri de molecule de ARNr (ex. ARNr 23S).
Între cele două subunităţi se formează canalul prin care trec moleculele de ARNm
21
(mesager) în cursul sintezei proteice. Se apreciază că într-o bacterie cu dimensiuni medii,
afată în faza de creştere activă, se sintetizează circa 500 ribozomi / minut, metabolismul
bacterian find foarte intens.
Ribozomii au rol esenţial în procesul de biosinteză proteică. Au tendinţa de a se grupa în
polisomi (poliribozomi) cu efcienţă sporită în biosinteza proteică. În aceste condiţii, la un
moment dat pe aceeaşi moleculă de ARNm se afă în scopul traducerii mesajului genetic
mai mulţi ribozomi, care constituie un ansamblu care poartă numele de polisom.
Biosinteza proteică
Biosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor.
Cu toate că secvenţa de aminoacizi din structurile proteice este „dictată” de secvenţa
de baze azotate din ADN, pentru că nu există afnitate şi posibilitate de cuplare între ADN şi
aminoacizi este necesar ca o altă structură să permită poziţionarea aminoacizilor în lanţul
viitoarei proteine.
Iniţial are loc transcrierea informaţiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta
această informaţie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare.
Gena este segmentul de ADN care deţine informaţia genetică pentru sinteza unei proteine.
Segmentul de ADN care controlează sinteza unui polipeptid poartă numele de cistron.
ARNm care deţine informaţia genetică pentu sinteza unei singure catene de polipeptid
poartă numele de ARNm monocistronic.
La bacterii, de obicei, o moleculă de ARNm trebuie să poarte informaţia necesară
pentru sinteza mai multor catene diferite şi în acest caz ARNm poartă numele de ARNm
policistronic. Această situaţia particulară este datorată dimensiunii mici a acestor
procariote precum şi metabolismului intens care are loc în cursul procesului de creştere şi
multiplicare. Spre exemplu, la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt necesare potenţial
3 enzime diferite, iar mesajul genetic pentru sinteza acestora se afă deţinut de o singură
moleculă de ARNm policistronic.
De regulă, numai o catenă de ADN este folosită drept matriţă pentru ARNm.
Transcrierea mesajului genetic este selectivă (se desfăşoară între promotor şi semnalul de
terminare) şi este controlată de ARN polimeraza ADN-dependentă.
Pentru traducerea mesajului genetic este necesară intervenţia la nivel ribozomal a
moleculelor de ARNt (de transfer). Acestea au o dublă specifcitate (pentru fecare dintre cei
20 de aminoacizi există una sau mai multe molecule de ARNt; în acelaşi timp există enzime
specifce fecărui tip de aminoacid care controlează legarea corectă a aminoacizilor activaţi
pe ARNt corespunzător). La nivelul fecărui ARNt există trei nucleotide (anticodon)
complementar codonului care corespunde aminoacidului.
ARNt nu are niciodată la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU şi în aceste condiţii
ne putem explica motivul pentru care codonii UAA, UAG şi UGA sunt codoni stop.
Succesiunea specifcă a nucleotidelor este transpusă într-o secvenţă specifcă de
aminoacizi care intră în constituţia lanţului polipeptidic din proteina în curs de formare.
2. 3. 1. 6. Incluziile
Incluziile sunt formaţiuni care apar în citoplasmă la sfârşitul perioadei de creştere
activă. Dimensiunea şi forma incluziilor citoplasmatice pot varia în funcţie de condiţiile
22
externe. Pot conţine polimeri anorganici (de exemplu, corpusculii metacromatici ai
genului Corynebacterium, la a căror descoperire a avut un rol important Profesorul Victor
Babeş), substanţe anorganice simple, polimeri organici (rezervor energetic mai ales la
germenii sporulaţi aerobi), lipide, cristale, granulaţii de sulf etc.
2. 3. 1. 7. Vacuolele
Vacuolele sunt formaţiuni sferice care conţin diferite substanţe în soluţie apoasă. Au o
membrană lipoproteică numită tonoplast. Au fost descrise în mai ales la bacteriile acvatice
şi ar putea avea un rol în plutirea acestora.
2. 3. 1. 8. Nucleul
Masa nucleară vine în contact direct cu citoplasma. Este localizată în partea centrală a
celulei. Conţine ADN, nu are nucleoli. Are afnitate pentru coloranţii bazici, dar pe
preparatele colorate uzual este mascat de bazoflia intensă a citoplasmei bogată în ARN.
Unicul cromozom bacterian este alcătuit dintr-o singură moleculă de ADN dublu
catenar, cu aspectul unui fr lung (1.000-2.000 µm), închis într-un inel şi replicat pe el
însuşi, superspiralat. Mărimea cromozomului poate să difere în funcţie de specia bacteriană
(şi respectiv numărul de perechi de baze); cea mai mică celulă bacteriană ar f cea
de Mycoplasma spp., la care dimensiunea este de 4.700 kpb, în timp ce cromozomul de E.
coli poate avea o dimensiune de circa 3 ori mai mare. Având în vedere că dimensiunea
bacteriilor este de circa 1-2 mm în cazul cocilor şi de câteva ori mai mare în cazul bacililor,
pentru ca materialul genetic să poată f conţinut în acest spaţiu redus, acesta trebuie să fe
compactat într-un mod remarcabil şi astfel, rezultă nucleoidul bacterian care poate f
diferenţiat microscopic. Nucleoidul este format din molecula de ADN asociată cu proteine şi
o cantitate variabilă de ARN.
Relativ recent (1989) s-a descoperit că există şi bacterii care deţin cromozomi lineari
(ex. Borrelia burgdorferi). Toate speciile din genul Borrelia deţin şi plasmide lineare.
Replicarea cromozomului bacterian se face printr-un mecanism semiconservativ. Aşa
cum am menţionat, cromozomul este unic, însă în celula care se dezvoltă rapid există
posibilitatea ca înainte ca prima replicare să se f încheiat să se iniţieze încă o replicare şi în
acest caz celula bacteriană va putea f meroploidă (doar anumite regiuni cromozomiale
sunt copiate de mai multe ori) sau chiar poliploidă (tot cromozomul a fost copiat de mai
multe ori). Dacă replicarea cromozomială nu este succedată de diviunea celulei (aşa cum
se întâmplă în mod obişnuit), putem remarca în celula bacteriană existenţa mai multor
cromozomi. Cromozomii suplimentari (în total 2 sau 4) nu aduc o informaţie genetică
diferită pentru că ei sunt copii ale cromozomului iniţial (identici cu acesta).
Nucleul deţine informaţia genetică necesară proceselor vitale de creştere şi
multiplicare.
Codonul
Din punct de vedere funcţional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de
ADN formează un codon. Codonii deţin informaţia genetică pentru a plasa într-o anumită
secvenţă un anumit aminoacid, în lanţul polipeptidic care va f sintetizat la nivelul
ribozomilor.
Cistronul
23
Cistronul reprezintă o subunitate funcţională a genei, capabilă să determine
independent sinteza unui lanţ polipeptidic.
Gena
Gena structurală reprezintă o porţiune a genomului, respectiv o anumită secvenţă de
nucleotide dispuse liniar. Genele structurale reprezintă circa 90% din ansamblul informaţiei
genetice. Poartă înscrisă în structura sa informaţia genetică necesară pentru sinteza unei
proteine specifce, structurale sau funcţionale (enzime).
2. 3. 2. Structuri facultative
Structurile facultative ale celulei bacteriene sunt reprezentate de capsulă, cili (fagelii),
fmbrii (pili) şi spori (forme de rezistenţă).
2. 3. 2. 1. Capsula: structură, rol, evidenţiere
Numeroase bacterii sintetizează polimeri organici (de obicei polizaharide) care
formează în jurul celulei o matrice fbroasă, numită glicocalix.
La unele bacterii glicocalixul aderă strâns de celula bacteriană şi reprezintă capsula.
Există bacterii care deţin o capsulă bine defnită, cu structură polizaharidică (S.
pneumoniae, K. pneumoniae, unele tulpini de E. coli etc) sau cu structură polipeptidică
(Bacillus anthracis etc).
La alte bacterii, glicocalixul formează o reţea laxă de fbrile care se pierde parţial în
mediu şi poate f separată de corpul bacterian prin centrifugare, capsula fexibilă, care nu
este vizibilă la microscopul optic.
Roluri:
- factor de virulenţă, împiedicând fagocitarea bacteriei şi favorizând invazivitatea;
- rezistenţă faţă de surfactanţi, anticorpi;
- permite aderarea unor bacterii (rol de adezină);
- barieră protectoare faţă de bacteriofagi, protozoare;
- conţine substanţe cu specifcitate antigenică (de specie sau de tip) - antigenul K. Spre
exemplu, în cazul S. pneumoniaeexistă peste 90 tipuri antigenice capsulare în timp ce la E.
coli sau la Klebsiella pneumoniae există peste 80 tipuri antigenice capsulare.
Referitor la modalităţile de evidenţiere ale structurilor capsulare, este de menţionat că
prin coloraţia cu albastru de metilen sau tuş de China / India, în jurul bacteriei apare un
halou necolorat. Există şi coloraţii speciale pentru capsulă, de exemplu coloraţia Hiss.
Structura antigenică a capsulei permite identifcarea bacteriilor, spre exemplu prin reacţia
de umfare a capsulei (Neufeld) atunci când se folosesc seruri polivalente sau monovalente
anti-capsulare pentru identifcarea pneumococilor.
2. 3. 2. 2. Flagelii: structură, rol, localizare
Cilii sau fagelii conferă mobilitate bacteriilor. Mobilitatea poate f evidenţiată în
preparatul proaspăt (între lamă şi lamelă) sau pe anumite medii speciale (ex. MIU).
Mobilitatea germenilor din genul Proteus este observată pe orice mediu de cultură solid pe
care acest microorganism foarte mobil se dezvoltă (fenomenul de „invazie”).
24
Flagelii sunt formaţiuni fne, alungite, fexibile, cu origine la nivelul corpusculului bazal.
Acesta este alcătuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri
aranjate ca două perechi pe o structură care trece prin mijlocul lor. Corpusculul bazal este
plasat în perete şi membrana citoplasmatică. Din punct de vedere chimic fagelul este de
natură proteică (fagelina).
Roluri:
- în mobilitate (cu o viteză de circa 50 µm / secundă); cilul are o mişcare de rotaţie,
asemănătoare unei înşurubări în mediu şi ca atare corpul bacterian este împins în direcţia
opusă; „motorul” rotaţiei e reprezentat de corpusculul bazal iar energia este obţinută din
ATP;
- antigenic (datorită structurii proteice - antigenul H, specifc de tip);
- în clasifcarea bacteriilor (prin număr şi distribuţie), bacteriile putând f
- monotriche (cu un fagel dispus la o extremitate), de exemplu Vibrio
cholerae, Pseudomonas aeruginosa;
- lofotriche (cu un mănunchi de fageli dispus la o extremitate);
- peritriche (cu mai mulţi fageli dispuşi de-a lungul suprafeţei bacteriene), de
exemplu E. coli, Proteus mirabilis, Salmonella typhi.
2. 3. 2. 3. Fimbriile (pilii)
Sunt formaţiuni scurte, fne, nu au rol în mobilitate. De obicei pilii sunt mai subţiri decât
cilii. Pot f foarte numeroase pe suprafaţa majorităţii bacteriilor; pot f observate numai la
microscopul electronic.
Există pili comuni, cu următoarele roluri:
- în aderenţa bacteriană (adezine);
- conţin receptori specifci pentru bacteriofagi;
- antigenic (la unele bacterii), ex. N. meningitidis şi N. gonorrhoeae.
Există pili „F” (sexuali), determinaţi genetic de factorul de fertilitate F (episom). Aceştia
îndeplinesc rolul canalului de conjugare.
2. 3. 2. 4. Sporii: structură, compoziţie chimică, rol, localizare
Fenomenul de sporogeneză este mai des întâlnit
la Bacillaceae (genurile Clostridium şi Bacillus). Pe sol, în condiţii de uscăciune, la adăpost
de lumina solară directă, endosporii persistă zeci şi poate sute de ani.
Materialul genetic este concentrat şi, împreună cu apa legată, lipide, Ca ++, Mg++, este
înconjurat de un strat protector (membrana sporală, cortexul sporal, învelişurile sporale).
„Sâmburele” sporal împreună cu membrana citoplasmatică formează protoplastul sporal.
Roluri:
- formă de rezistenţă şi conservare a speciei (în condiţii favorabile un spor se poate
transforma într-o bacterie / forma vegetativă; procesul de formare a sporului ar putea f
considerată una dintre cele mai primitive forme de diferenţiere, dar nu este un proces de
reproducere celulară aşa cum se întâmplă la fungi sau paraziţi);
- rezistă la căldură, uscăciune, la anumite substanţe chimice şi antibiotice, raze UV etc.
Sporul poate f localizat:
- central sau subterminal, mai mic decât celula (ex. la Bacillus anthracis);
25
- central sau subterminal, mai mare decât celula (ex. la Clostridium hystoliticum etc);
- terminal (ex. la Clostridium tetani, cu aspectul de „băţ de chibrit”).
Poate f evidenţiat prin coloraţii speciale (de exemplu verde malachit) sau prin coloraţia
Gram (locul sporului rămâne necolorat).
Este sensibil la formol, propiolactonă etc. Este distrus prin autoclavare.
2. 4. Povestiri adevărate
2. 4. 1. Sporii bacterieni; Izbucnire epidemică de infecţii cu Clostridium novyi tipA în
rândul utilizatorilor de droguri administrate injectabil, în Scoţia
În Scoţia, în perioada aprilie-august a anului 2000, s-a raportat un număr fără precedent
de îmbolnăviri în rândul utilizatorilor de droguri pe cale injectabilă. Au fost identifcate 60
de cazuri (23 confrmate şi 37 probabile), la subiecţi cu vârsta medie de 30 de ani, dintre
care 31 erau de sex feminin (51,66%). Toţi pacienţii erau consumatori de droguri
administrate prin injecţie intramuscular şi subcutanat (în acest caz a fost vorba despre un
preparat compus din heroină şi acid citric). 20 (87%) dintre cazurile confrmate au evoluat
către deces. Din totalul pacienţilor, 15 au prezentat fasciită necrozantă, 22 au
dezvoltatedem la locul de injectare, iar 13 au prezentat pleurezie.
În 20 (54%) dintre cazurile probabile şi 14 (61%) dintre cele confrmate au existat
legături familiale sau sociale între subiecţi. Semnele clinice cel mai des înregistrate au fost:
durere şi edem marcat la nivelul locului de injectare; în câteva dintre cazuri, în afară de
aceste semne, pacienţii au prezentat insufcienţă multi-organică. O caracteristică a
sindromului de afectare multi-organică a fost reprezentată de reacţia leucemoidă, cu
leucocitoză la valori foarte ridicate, cu deviere la stânga a formulei leucocitare (numeroase
leucocite tinere, nesegmentate).
Probe din heroina confscată (pură şi în combinaţie cu acid citric), probe de sânge şi
fragmente tisulare (recoltate antemortem şi postmortem) au fost trimise către
laboratoarele de referinţă din Glasgow şi Londra, dar şi către laboratorul Centrului pentru
prevenirea şi controlul bolilor (CDC, Atlanta, SUA). Supoziţia iniţială (infrmată prin testele
de laborator) a fost cea de contaminare a drogurilor cu spori de Bacillus anthracis.
Testele efectuate pe probele recoltate au evidenţiat contaminarea masivă
cu spori de Clostridium novyi, tip A, a drogurilor injectabile recuperate (probabil datorită
condiţiilor precare de obţinere, stocare şi transport ale acestora). Autorităţile au emis
ipoteza că o cantitate mult mai mare de droguri se poate afa în circulaţie şi această
situaţie ar putea f considerată ca o adevărată „bombă biologică” pentru populaţia
consumatoare de droguri. Microorganismul cel mai frecvent izolat din probele recoltate de
la pacienţi (în condiţii de anaerobioză şi transportate corespunzător, la adăpost de oxigen)
a fost Clostridium novyi.Din probele recoltate s-au izolat, de asemenea, Clostridium
perfringens şi Clostridium saccharolyticum. În cazul în care autorităţile de sănătate publică
nu s-ar f gândit, în cazul diagnosticului diferenţial, şi la o ipoteză în care germenii
anaerobi să fe implicaţi, izbucnirea epidemică ar f putut să rămână fără diagnostic
etiologic.
26
Pe lângă prezenţa sporilor, demonstrată prin tehnici de laborator, a fost utilizată
testarea efectului citopatic asupra culturilor monostrat de linii celulare Vero şi astfel s-a
demonstrat prezenţa alfa-toxinei produsă de C. novyi,tip A, în probele recoltate.
Alfa-toxina este eliberată la nivelul procesului infecţios (locul injectării drogului, unde
prin realizarea condiţiilor de anaerobioză, sporii trec în formă vegetativă se multiplică şi
bacteriile sintetizează exotoxina), în ţesutul subcutanat, conduce la instalarea unui răspuns
infamator local intens, cu edem marcat. Alfa-toxina are o contribuţie patogenică şi în
situaţiile cu evoluţie spre insufcienţă multi-organică, asociat cu hipotensiune arterială,
reacţie leucemoidă şi fasciită necrozantă. Condiţiile de anaerobioză sunt atinse deoarece
soluţia de heroină tamponată cu acid citric produce necroză tisulară la locul injectării (în
cazul în care soluţia ar f fost injectată intravenos, sporii ar f fost distruşi de către
mecanismele de apărare ale gazdei, la nivel sanguin).
În cazul în care ipoteza unei afectări datorită sporilor proveniţi de la bacterii anaerobe
ar f fost emisă de la început şi dacă nu s-ar f instituit (la o parte dintre cazuri)
antibioterapia empirică cu antibiotice / chimioterapice cu spectru larg anterior recoltării
probelor, procentul de infecţii cu etiologie confrmată ar f putut să fe mai mare.
S-au emis mai multe comunicate de presă pentru a pune în temă populaţia şi pentru a
alerta comunitatea medicală şi pe eventualii consumatori de droguri.
2. 4. 2. Capsula bacteriană
Multe s-au scris despre Neisseria meningitidis, meningococul, răspunzător pentru
izbucniri epidemice de meningită, cu urmări îngrijorătoare (decese, sechele). Infecţiile
meningococice rămân încă o problemă de sănătate la nivel mondial iar înţelegerea
mecanismelor prin care Neisseria meningitidis eludează mecanismele de apărare ale gazdei
este foarte importantă. Meningococul determină boala prin invazivitate şi multiplicare,
aderând la celulele umane şi invadându-le însă după această etapă procesul rămâne, în
mare parte, un mister.
Unul din atributele de patogenitate ale meningococului este reprezentat
de capsula polizaharidică, cu un rol clar demonstrat în supravieţuirea bacteriană în fuidele
extracelulare. Studii recente au arătat că aceeaşi structură contribuie şi la supravieţuirea
intracelulară.
Sistemul complement este unul dintre factorii de apărare foarte importanţi în protecţia
subiecţilor faţă de infecţia cu N. meningitidis; totuşi acest microorganism s-a adaptat şi a
dezvoltat mecanisme proprii de protecţie anti-complement.
Structurile bacteriene de genul capsulei polizaharidice precum şi cele care „imită”
structurile proprii (self) ale gazdei sau leagă molecule proprii organismului salvează
germenul de la liză celulară şi fagocitoză. Se pare că Neisseria meningitidis îşi foloseşte
efcient proprietăţile, atât extra- cât şi intracelular.
Prin inocularea de tulpini capsulate şi necapsulate marcate izotopic în culturi celulare
de celule fagocitare şi nefagocitare umane s-a încercat monitorizarea invazivităţii şi
multiplicării intracelulare. Rezultatele au fost surprinzătoare deoarece capsula, care
diminuează capacitatea de aderare la membrana celulară şi de intrare a germenului în
celulă, este esenţială pentru supravieţuirea intracelulară a microorganismului. Un posibil
27
mecanism prin care se produce această supravieţuire ar f cel al rezistenţei capsulare la
peptidele cationice antimicrobiene (CAMPs – cationic antimicrobial peptides), componente
ale sistemului imun înnăscut.
Degradarea intracelulară a bacteriilor internalizate poate f legată de o multitudine de
mecanisme, printre care acţiunea pH-ului, stresul oxidativ sau acţiunea enzimelor litice şi a
peptidelor antimicrobiene. Teoretic prezenţa capsulei ar putea interfera, direct sau indirect,
cu oricare din aceste mecanisme. În particular s-a evidenţiat deja medierea rezistenţei
pentru Klebsiella pneumoniae la CAMPs de către capsula sa, polizaharidică.
În ceea ce priveşte capsula N. meningitidis, studii preliminare au arătat deja că tulpinile
necapsulate sunt mai susceptibile acţiunii defensinelor, protegrinelor şi polimixinei B,
asemănătoare CAMPs. Polimixina B, un peptid ciclic de origine microbiană, a fost folosită ca
model al CAMPs datorită proprietăţilor ei de permeabilizare a membranei externe a
germenilor Gram-negativi. Experimental s-a măsurat rata de supravieţuire a meningococilor
timp de 45 de minute în diferite concentraţii de polimixină B. Rezultatele au confrmat că
absenţa capsulei scade viabilitatea microbiană în prezenţa polimixinei B. Acest model pe
culturi celulare susţine ipoteza conform căreia capsula N. meningitidis reprezintă un
mecanism major pentru supravieţuirea intracelulară a bacteriei din cursul infecţiei.
2. 4. 3. Importanţa examenului microscopic
Examenul bacteriologic direct are o mare importanţă pentru diagnosticul de etapă, dar
şi pentru cel defnitiv; poate schimba radical indicaţia de tratament precum şi prognosticul
pentru respectivul pacient. În cadrul examenului bacteriologic direct, examenul
preparatului proaspăt între lamă şi lamelă a rămas „ruda săracă”, find mai rar folosit (prea
rar); informaţiile obţinute pot f însă foarte utile. La un pacient seropozitiv stadiul C3, cu
diaree trenantă şi severă, examenul citobacteriologic a arătat prezenţa unor formaţiuni
rotund ovalare interpretate ca levuri, probabil candidozice. În ciuda tratamentului antifungic
pentru levuri diareea a rămas la fel de severă şi starea gravă. La o nouă examinare a
materiilor fecale, de data aceasta şi a preparatului proaspăt între lamă şi lamelă, colorat cu
albastru de metil, s-au văzut (datorită colorantului) aceleaşi formaţiuni rotunde dar cu
capsulă, ridicându-se suspiciunea unei infecţii cu criptococ, care ulterior s-au identifcat
după culturi şi repicări repetate pe medii specifce. Dar ce este de subliniat este că
schimbarea imediată a tratamentului a condus la remiterea simptomatologiei şi
îmbunătăţirea stării pacientului.
2. 5. Evaluarea cunoştinţelor
1. Alegeţi afrmaţia falsă:
a. Bacilii au formă rotundă şi se adună în grămezi
b. Haemophilus infuenzae este un cocobacil
c. Dimensiunile bacteriene sunt de ordinul micrometrilor şi din acest motiv bacteriile se pot
examina la microscopul optic
d. Aspectul in diplo” este caracteristic pneumococilor
28
e. Există bacterii cu dimensiuni foarte mici (ex.: Chlamydia spp. şi Mycoplasma spp.) care
nu pot f vizualizate la microscopul optic
3. Peretele bacterian:
a. Este o componentă constantă a bacteriilor din toate genurile
b. Este degradat cu uşurinţă sub acţiunea lizozimului (muramidazei)
c. Are aceeaşi grosime atât la bacteriile Gram-negative, cât şi la cele Gram-pozitive
d. Nu este sediu de acţiune pentru nici un tip de antibiotic
e. Conţine antigene capsulare
4. Care dintre enunţuri este corect în ceea ce priveşte structurile facultative bacteriene:
a. Sporii bacterieni au rol în replicarea ADN-ului
b. Mobilitatea bacteriilor este dată de fmbrii
c. Sporul este o formă de rezistenţă bacteriană
d. Capsula este ubicuitară la toate genurile bacteriene
e. O bacterie nu poate avea mai mult de un singur fagel
5. Sporii bacterieni:
a. Nu se distrug prin autoclavare
b. Sunt forme de rezistenţă ale bacteriilor şi se pot transforma în forme vegetative
c. Nu se vizualizează microscopic
d. Pentru orice tip bacterian, sunt localizaţi în acelaşi loc şi anume central
e. Sunt caracteristici tuturor speciilor bacteriene
3. Fiziologia bacteriană
3. 1. Constituţia chimică a
bacteriilor
3. 1. 1. Apa: procent, rol
Apa reprezintă peste 75-85% din greutatea umedă a bacteriei. Există apă liberă (mediu
de dispersie) şi apă legată fzico-chimic cu diferite structuri. Sporii au puţină apă, în special
29
apă legată. Bacteriile sunt finţe „acvatice” prin excelenţă. Vacuolele sunt formaţiuni sferice
care conţin diferite substanţe în soluţie apoasă. Au o membrană lipoproteică
numită tonoplast. Au fost descrise în special la bacteriile acvatice şi ar putea avea un rol
în plutirea acestora.
Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti faptul că apa reprezintă un mediu de
dispersie, este reactiv în reacţiile metabolice, reprezintă etapa fnală a unor reacţii
oxidative etc.
Prin deshidratare (desicare) este posibilă prezervarea culturilor bacteriene timp
îndelungat. O metodă des utilizată datorită efcienţei sale este lioflizarea (criodesicarea).
Studiile ştiinţifce au arătat că, în general, germenii Gram-negativi rezistă mai puţin timp
lioflizării decât cei Gram-pozitivi, fenomen care a fost pus pe seama stratului mai subţire
de peptidoglican. (1)
3. 1. 2. Substanţele minerale
Substanţele minerale reprezintă 2-30% din greutatea uscată a bacteriei şi variază în
funcţie de specie, vârsta culturii, compoziţia chimică a mediului. Unele elemente intră în
compoziţia diferitelor structuri (exemplu sulful intră în structura aminoacizilor, fosforul în
structura fosfolipidelor etc).
Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti următoarele:
· favorizează schimburile cu mediul,
· participă la reglarea presiunii osmotice,
· pot stimula creşterea şi funcţia bacteriei (de exemplu ferul în cazul bacilului
difteric, care condiţionează şi producerea de toxine),
· activează unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH-ului şi a
potenţialului de oxido-reducere.
Aşa cum am menţionat anterior, la nivel ribozomal se găsesc Mg ++ şi K+.
3. 1. 3. Glucidele
În structura bacteriană se pot găsi glucide simple cu rol în metabolismul intermediar
glucidic, precum şi glucide complexe, de exemplu poliozide. Acestea din urmă au o serie de
roluri, spre ex. participă la realizarea structurii peretelui celular, fac parte din capsula unor
bacterii etc.
Există teste biochimice în care se urmăreşte utilizarea sau imposibilitatea utilizării unui
anumit zahar de către o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru identifcarea bacteriei
respective (în special în cazul enterobacteriilor folosind mediile TSI, MIU, sistemele API etc).
Testările biochimice sunt de mare utilitate şi în studiul fungilor (auxanogramă, zimogramă).
3. 1. 4. Proteinele
Există proteine simple (cu rol în metabolismul intermediar protidic) şi proteine
complexe, cum ar f:
· mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul
hialuronic din structuri de tip capsular),
· cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi),
· nucleoproteinele (ex. în acizii nucleici).
30
Este de remarcat prezenţa în structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul
diaminopimelic, precum şi a aminoacizilor în forma D (ceea ce reprezintă o adaptare
biochimică a bacteriilor faţă de acţiunea nocivă a enzimelor proteolitice).
3. 1. 5. Lipidele
Reprezintă mai puţin de 10% din greutatea uscată a bacteriilor şi variază cantitativ în
funcţie de specie, vârsta culturii (cresc în celulele „îmbătrânite”, reprezentând probabil un
semn de degenerescenţă) şi compoziţia mediului. La mycobacterii, sunt în cantitate mai
mare (circa 20-40%), în special la nivel parietal şi determină o serie de proprietăţi specifce,
inclusiv afnitatea tinctorială. Lipidele se pot găsi libere în vacuole, combinate sau făcând
parte din diferite structuri ale celulei bacteriene (perete, membrană, mezozomi).
Dintre lipidele bacteriene putem aminti:
· acizii graşi speciali (ex. acidul mycolic la mycobacterii),
· cerurile (acizi graşi plus alcooli monovalenţi superiori), care se găsesc în cantitate
mare la bacteriile acid-alcoolo-rezistente (ex. în peretele mycobacteriilor, nocardiilor etc).
Dintre acestea, ceara D pare a f implicată în inducerea hipersensibilităţii întârziate (de tip
IV).
· fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) din Treponema
pallidum (agentul etiologic al siflisului) sau lipidul A din structura lipopolizaharidului
bacteriilor Gram-negative, cu activitate toxică.
3. 1. 6. Pigmenţii
Pigmentogeneza este caracteristică bacteriilor cromogene şi este dependentă de
condiţiile de cultivare.
Producerea de pigmenţi poate reprezenta un criteriu de identifcare (ex. în cazul
tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa sau în cazul unor specii din genul Staphylococcus).
Trebuie să reţinem încă de la început faptul că în cazul staflococilor, pigmentogeneza este
doar un caracter orientativ şi nu vom clasifca drept „patogenă” o tulpină de staflococ în
funcţie de „culoarea” coloniei. Staflococii sunt condiţionat patogeni. Testul orientativ
privind patogenitatea este testul coagulazei care ar trebui efectuat în mod obligatoriu
pentru toate tulpinile izolate de la pacienţi.
După localizarea pigmentului, bacteriile pot f:
· cromofore (pigmentul este legat în citoplasmă);
· paracromofore (pigmentul este prezent în perete sau în stratul mucos, de
exemplu la S. aureus sau laStaphylococcus epidermidis);
· cromopare (pigmentul este difuzibil în mediu, de exemplu la Pseudomonas
aeruginosa).
În afară de faptul că datorită producerii de pigmenţi (albastru, galben-verde, maro etc.
în cazul Ps. aeruginosa sau auriu, citrin, alb în cazul tulpinilor de Staphylococcus) medicul
de laborator se poate orienta în alegerea testelor de identifcare într-un anumit context
clinic şi microbiologic.
31
Putem aminti și faptul că pigmenţii pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de protecţie
faţă de radiaţiile UV (pigmenţi carotenoizi), rol antibiotic (exemplu piocianina elaborată
de P. aeruginosa faţă de B. anthracis) şi rol enzimatic.
3. 1. 7. Enzimele
În cazul bacteriilor se poate aprecia că metabolismul este foarte intens. Capacitatea de
a elabora anumite enzime este determinată genetic (există peste 2000 de determinanţi
genetici diferiţi), precum şi prin mecanisme de control care pot modifca bagajul enzimatic
în funcţie de necesităţi.
După locul de acţiune, enzimele bacteriene se pot împărţi în:
· enzime extracelulare (exoenzime), de exemplu hidrolazele;
· enzime ectocelulare (în membrana citoplasmatică, reglând permeabilitatea
selectivă), de exemplu permeazele;
· enzime intracelulare.
În raport cu reacţia catalizată, enzimele pot f: hidrolaze, transferaze, oxidoreductaze,
liaze, izomeraze etc.
După modul de apariţie, enzimele pot f:
· constitutive (există totdeauna în celulă, indiferent de natura mediului);
· inductibile (sunt sintetizate de către bacterie numai ca răspuns la anumiţi
compuşi apăruţi în mediu).
Studierea comportamentului enzimatic este foarte utilă în taxonomie. Fiecare unitate
taxonomică bacteriană (gen, specie) are un spectru de activitate enzimatică propriu;
studierea acestuia poate avea o deosebită importanţă în identifcarea bacteriilor.
3. 1. 8. Substanţe cu acţiune antibiotică:
· plasmidul „Col” codifcă proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine, cu
efect asupra altor bacterii receptive înrudite (de exemplu colicinele elaborate de E. coli);
· unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice (de exemplu, B.
licheniformis produce bacitracina, B. brevis sintetizează gramicidina, iar B.
polymyxa sintetizează polimixina; ultimele 2 specii fac parte, astăzi, din alte genuri, vezi
capitolul nr. 48).
3. 1. 9. Vitaminele bacteriene
Dintre vitaminele produse de bacterii putem aminti: biotina, care poate f secretată de
exemplu de E. coli, B. subtilis, B. anthracis etc; tiamina (B1), care poate f sintetizată de E.
coli, ribofavina sintetizată de B. subtilis, vitaminele B2 şi B12 sintetizate de B.
megaterium etc. sau vitaminele din grupurile B şi K, care pot f sintetizate sub infuenţa
forei bacteriene intestinale umane.
3. 1. 10. Factorii de creştere
Factorii de creştere sunt metaboliţii esenţiali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe
baza substanţelor care se găsesc în mediul extern. Factorii de creştere trebuie neapărat
incluşi în mediul de cultură în cazul în care dorim să izolăm microorganismul respectiv,
numit „microorganism pretenţios” (ex. factorii X şi V trebuie incluşi în mediul de izolare
pentru Haemophilus infuenzae).
32
Bacteriile patogene sunt heterotrofe. Adaptându-se la viaţa parazitară, devin
dependente de o serie de astfel de factori de creştere (unele sunt atât de dependente încât
nu pot f cultivate „in vitro”, de exemplu bacilul leprei - Mycobacterium leprae).
3. 2. Metabolismul bacterian
3. 2. 1. Nutriţia bacteriană
Nutriţia bacteriană reprezintă suma proceselor metabolice care conduc la producerea
de materiale convertibile în energie şi în diferite componente celulare. Nutrienţii sunt
substanţe ale căror soluţii pot traversa membrana citoplasmatică pentru a f antrenaţi în
reacţiile metabolice care asigură creşterea şi multiplicarea celulară.
În raport cu sursa de energie, bacteriile se împart în:
· bacterii care folosesc energie luminoasă şi trăiesc la lumină (photobacterii) şi
· bacterii care îşi procură energia prin procese de oxidoreducere catalizate
enzimatic şi trăiesc la întuneric (scotobacterii, chimiosintetizante).
În raport cu sursele folosite ca material de sinteză în ambele diviziuni se diferenţiază:
· bacterii autotrofe, capabile să-şi sintetizeze toţi compuşii organici din materie
anorganică şi
· bacterii heterotrofe, dependente de prezenţa unor compuşi organici.
3. 2. 2. Respiraţia bacteriană
34
Respiraţia reprezintă suma reacţiilor biochimice aerobe sau anaerobe producătoare de
energie. Mecanismul de bază este reprezentat de oxido-reducerea biologică (pierderea
ionilor de hidrogen sau a electronilor) de către o substanţă chimică (donor) şi transportul lor
pe molecula unei alte substanţe numită acceptor (prima se oxidează, a doua se reduce:
AH2 + B <=> A + BH2). În funcţie de natura acceptorului fnal, respiraţia poate f: aerobă
sau anaerobă.
Respiraţia aerobă (oxibiotică)
În respiraţia aerobă, acceptorul fnal de electroni este reprezentat de oxigen. Respiraţia
aerobă necesită existenţa membranei celulare. Electronii sunt pasaţi de la un reducător la
un oxidant prin membrană cu ajutorul unui set specifc de transportori. Substratul reducător
frecvent utilizat este NADPH-ul.
Enzimele catenei respiratorii sunt:
- nicotinice (cu coenzima NAD şi NADP);
- favinice (cu gruparea proteică FMN sau FAD);
- ferice (grupul prostetic conţine Fe sub formă de derivaţi ai protohemului, spre
exemplu citocromi, citocromoxidază, peroxidază etc).
NAD (nicotin adenin dinucleotid), NADP (nicotin adenin dinucleotid fosfat), FMN (favin
mononucleotid); FAD (favin adenin dinucleotid).
Pentru sinteza ATP-ului se utilizează fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator)
cuplată cu partea terminală a lanţului respirator.
Respiraţia anaerobă (anoxibiotică)
În respiraţia anaerobă acceptorul fnal de electroni este reprezentat de orice substanţă
anorganică diferită de oxigen sau de orice substanţă organică (fermentaţia); fosforilarea se
face la nivelul substratului.
Tipul fermentativ este reprezentat de ansamblul acizilor care rezultă prin fermentaţia
zaharidelor şi reprezintă un caracter fziologic stabil, foarte important din punct de vedere
taxonomic şi biochimic. Etapele fermentaţiei sunt mai reduse, câştigul energetic find mai
mic. De exemplu în cazul genului Clostridium, prin fermentaţie acetică se obţine 1 mol ATP,
iar prin fermentaţie butirică se obţin 0,5 moli ATP. Fermentaţia butirică a fost descoperită
de Louis Pasteur în anul 1861 (produsă deVibrion butyrique, numit ulterior Clostridium
butyricum). Rolul biologic al fermentaţiei este reprezentat de producerea energiei şi nu de
obţinerea unor produşi fnali.
Sinteza ATP-ului
Sinteza ATP-ului se realizează prin cuplarea reacţiilor de oxidoreducere cu reacţiile de
fosforilare.
În respiraţia aerobă se utilizează mai ales fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator)
cuplată cu partea terminală a lanţului respirator.
În respiraţia anaerobă fosforilarea se face la nivelul substratului, donatorii şi acceptorii
find metaboliţi anorganici (dar nu O2) sau organici (fermentaţia).
Energetica respiraţiei bacteriene
Prin fosforilarea oxidativă se pot obţine 38 moli ATP pentru 1 mol de glucoză.
Prin fosforilarea substratului se pot obţine circa 2 moli ATP pentru 1 mol de glucoză.
35
Energia este folosită apoi în procese metabolice de asimilaţie.
Tipul respirator
În raport cu utilizarea proceselor pentru obţinerea energiei şi de relaţia cu oxigenul din
mediu, bacteriile se pot grupa în 4 „tipuri respiratorii” principale (vezi și Tabelul nr. 1):
- strict aerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Bordetella pertussis) se dezvoltă
numai în prezenţa unei presiuni crescute a O 2, care este folosit ca acceptor fnal unic.
Aceste bacterii posedă catalază, peroxidază, citocromi (de exemplu catalaza desface
H2O2 toxic pentru celula bacteriană; vezi Figura nr. 1) şi utilizează numai procese de
respiraţie. Unele specii aerobe (exemplu Pseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta în medii
lipsite de oxigen, dacă în mediu sunt prezenţi nitratul sau nitritul;
- strict anaerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium
botulinum, Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc) cresc numai în absenţa O2.
Nu pot supravieţui în prezenţa O2, care nefind redus are o acţiune bactericidă. Nu au
catalază, peroxidază (care acţionează asupra ionilor de O 2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii
folosesc pentru obţinerea energiei numai procese de fermentaţie. Pentru cultivarea lor este
necesară utilizarea unui mediu cu potenţial redox foarte scăzut.
- aerob facultativ anaerob, atunci când bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc)
se dezvoltă mai bine în mediile cu oxigen, prin procese de respiraţie, dar pot prezenta
ambele tipuri respiratorii, în funcţie de potenţialul redox. Majoritatea au catalază sau
citocromoxidază, dar nu au peroxidaze favoproteice. În acest tip se încadrează majoritatea
bacteriilor studiate.
- anaerob microaerofl, atunci când bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolerează
mici cantităţi de O2.
3. 3. Căi metabolice
Metabolismul glucidic
Polizaharidele utilizabile de către bacterii nu pot pătrunde ca atare în celulă. Ele sunt
degradate de 2 categorii de enzime extracelulare: exohidrolaze (care scindează unităţile
monozaharidice din extremităţile lanţurilor polizaharidice) şi endohidrolaze (care
hidrolizează unităţile interne). Polizaharidele existente în celulă ca materiale de rezervă au
o degradare diferită, prin fosforoliză, rezultând hexozo-monofosfaţi.
Principalele căi metabolice (de catabolism) sunt:
a). calea hexozo-difosfaţilor (Embden-Meyerhof-Parnas), prin care în fnal pentru 1 mol
de glucoză se obţin 1 mol de acid piruvic şi 2 moli ATP;
b). calea pentozo-monofosfaţilor;
c). calea Entner-Doudorof (pentru bacterii din grupul Pseudomonas).
Metabolismul lipidic
Multe bacterii degradează trigliceridele prin lipaze exocelulare în glicerol şi acizi graşi
liberi. Activitatea lipazică poate f cercetată pe medii care conţin glicerol-tributirat. Pentru
degradarea lipidelor unele bacterii, de exemplu Clostridium perfrigens, posedă enzime
36
specifce (lecitinaza D, fosfolipaza C). Prin degradarea fosfolipidelor din membrana
hematiilor, fosfolipaza C conferă bacteriilor proprietatea de hemoliză.
Acizii graşi sunt degradaţi preponderent prin procesul de beta-oxidare; acizii graşi
reprezintă surse de energie foarte utile (ex. 1 mol de acid palmitic generează 129 moli de
ATP).
Bacteriile saprofte au proprietăţi lipolitice intense, participând la biodegradarea
grăsimilor şi uleiurilor (mai ales în mediul marin).
Metabolismul proteic
În lumea bacteriană mai răspândiţi sunt D-aminoacizii. Aceştia pot forma diferite
polipeptide cu activitate antibiotică (gramicidina, polimixina, bacitracina) sau de exemplu
capsula bacilului anthraxului. Participă de asemenea şi la formarea peretelui celular (de
exemplu D-Ala).
Căile de degradare sunt reprezentate mai ales de:
a). transaminarea şi dezaminarea aminoacizilor (de exemplu, enterobacteriile au căi
proprii de catabolism, utile în identifcare);
b). decarboxilarea aminoacizilor.
37
Sinteza este asemănătoare cu cea a peptidoglicanului; în ambele situaţii, o serie de
subunităţi se asamblează pe un lipid transportor la nivelul membranei şi apoi sunt
transferate în „fabrica” polimerului în creştere pentru realizarea peretelui celular. Toate
componentele LPZ sunt sintetizate şi ansamblate la nivelul membranei citoplasmatice.
3. 4. 4. Sinteza capsulei extracelulare
Capsula se sintetizează enzimatic din subunităţi activate. În sinteza capsulei
extracelulare (poate avea structură polizaharidică sau peptidică) nu sunt implicate lipide
transportoare de provenienţă membranară. Prezenţa capsulei este adesea determinată de
condiţiile de mediu. De exemplu, dextranii se pot sintetiza pornind de la sucroză şi acest
lucru se va realiza doar dacă există sucroză în mediu.
3. 4. 5. Sinteza substanţelor de rezervă
Când nutrienţii sunt în exces, bacteria poate converti o parte din ei în granule de
rezervă (vacuole), de exemplu glicogen, polihidroxibutirat, volutină, care diferă de la o
bacterie la alta.
3. 5. Cultivarea bacteriilor
3. 5. 1. Defniţii utile
Populaţia reprezintă o multitudine de indivizi ai unei specii care convieţuiesc într-un
anumit biotop.
Clona este populaţia care rezultă dintr-o singură celulă prin înmulţire vegetativă
(diviziune binară).
Tulpina reprezintă populaţia microbiană alcătuită din descendenţii unei singure izolări
în cultură pură.
Temperatura de dezvoltare
În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot f:
- mezofle, cu temperatura optimă de 30-37CC;
- psichrofle, cu temperatura optimă în jur de 20CC (unele acceptând temperaturi
apropiate de 0CC; Listeria spp. poate supravieţui sau se poate chiar şi multiplica la
temperatura din frigider). Ele sunt adaptate la acest mediu prin numărul mare de acizi graşi
nesaturaţi conţinuţi de membrana plasmatică. Gradul de nesaturare al unui acid gras se
corelează cu timpul de solidifcare sau stadiul de tranziţie termică (temperatura la care se
topeşte sau se solidifcă lipidul). Acizii graşi nesaturaţi rămân în fază lichidă la temperaturi
joase, dar sunt denaturaţi la temperaturi moderate. Fie că acizii graşi din membrană se afă
în fază lichidă sau solidă, ei afectează fuiditatea membranei, care afectează în mod direct
capacitatea de a funcţiona.
- termofle, cu temperatura optimă de 50-60CC (unele putând să se multiplice şi la
temperaturi apropiate de 95CC, ca de ex.Thermus aquaticus). Bacteriile termofle sunt
adaptate să reziste la temperaturi de peste 60°C printr-o varietate de modalități. Acizii
graşi din membrana bacteriilor termofle sunt acizi grași saturaţi, permiţând membranelor
să rămână stabile şi funcţionale la temperaturi ridicate.
38
- extrem termofle sau hipertermofle, cu temperatura optimă de 80°C sau mai mare şi
o temperatură de dezvoltare maximă de 115°C. (2) Nu sunt patogene.
Bacteriile studiate de microbiologia medicală sunt în marea lor majoritate mezofle.
3. 5. 2. Noţiuni de creştere şi multiplicare bacteriană
Creşterea oricărui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece creşterea
volumului celular raportată la creşterea suprafeţei este mai mare, în cursul creşterii se
ajunge la un punct critic. Multiplicarea celulară este o consecinţă a creşterii. Se restabileşte
raportul optim dintre volumul şi suprafaţa celulei.
Multiplicarea majorităţii bacteriilor se face prin diviziune simplă (binară). Sporii nu
reprezintă forme de multiplicare (aşa cum se întâmplă în cazul fungilor sau paraziţilor).
3. 5. 3. Cultivarea bacteriilor
Pentru a identifca agentul etiologic al unei infecţii, trebuie ca din produsul recoltat de la
pacient să obţinem mai întâi respectivul microorganism în cultură pură, pentru ca ulterior
să îi putem studia diferitele caractere în vederea identifcării.
Metodele de cultivare a bacteriilor urmăresc mai multe obiective:
· obţinerea unei populaţii microbiene sufciente cantitativ pentru investigaţiile
propuse,
· prevenirea contaminării produsului cercetat cu un microorganism străin şi
· izolarea fecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicrobian în
culturi monomicrobiene denumite „culturi pure”.
Nu există un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricărei bacterii. Termenul
„însămânţare” defneşte operaţia de introducere a unei cantitaţi de germeni într-un mediu
de cultură artifcială, în timp ce pentru culturile celulare, ouă embrionate şi mai ales
animale de experienţă folosim termenul „inoculare”.
Cultivarea se realizează prin însămânţarea bacteriilor pe medii de cultură. Mediile solide
sau lichide care asigură nutrienţii şi condiţiile fzico-chimice necesare creşterii şi
multiplicării bacteriene se numesc medii de cultură.
Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea într-un mediu de cultură poartă
numele de cultură bacteriană.
Mediile de cultură
Microorganismele pot f cultivate pe gazde vii şi pe medii artifciale.
Există anumite microorganisme (de exemplu virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot
f cultivate decât pe gazde vii, aşa cum se întâmplă în cazul virusurilor, respectiv: animale
de laborator, ouă de găină embrionate sau culturi de celule.
Majoritatea bacteriilor, fungii şi unele protozoare se pot cultiva şi pe medii artifciale.
Mediile de cultură artifciale trebuie să fe nutritive (să conţină factorii de creştere
necesari), să fe sterile, să aibă un anumit pH (de obicei între 7,2-7,6), să aibă o anumită
presiune osmotică, să aibă umiditatea favorabilă multiplicării germenilor etc.
Factorii de creştere reprezintă substanţe esenţiale pe care microorganismele nu sunt
capabile să le sintetizeze din nutrienţii de care pot să dispună. Ei sunt necesari în cantitaţi
mici. Îndeplinesc anumite roluri în biosinteză. Factorii de creştere pot f grupați în:
1. Purine si pirimidine: necesare pentru sinteza acizilor nucleici (ADN şi ARN);
39
2. Aminoacizi: necesari pentru sinteza proteinelor;
3. Vitamine: necesare în calitate de coenzime şi grupări funcţionale pentru enzime.
Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesită factori de creştere. Aceste bacterii pot
sintetiza purinele esenţiale, pirimidinele, aminoacizii şi vitaminele pornind de la o sursă de
carbon.
Alte bacterii necesită purine, pirimidine, vitamine şi anumiţi aminoacizi pentru a creşte.
Aceşti compuşi trebuie adăugaţi în prealabil în mediile de cultură.
Factorii de creştere nu sunt metabolizaţi direct ci sunt asimilaţi de către bacterii pentru
a-și îndeplini rolul în metabolism. Tulpinile mutante care necesită anumiţi factori de
creştere ce nu sunt necesari tulpinii din care au provenit sunt numiteauxotrofe. Spre
exemplu, o tulpina de E. coli care necesită triptofan pentru dezvortare se va numi auxotrof-
triptofan şi va f desemnată E. coli trp- (2).
Clasifcarea mediilor de cultură artifciale
Aceste medii se pot clasifca după starea de agregare, după natura ingredientelor, după
complexitatea ingredientelor (de exemplu medii speciale), după scopul urmărit (de
transport, de izolare, de identifcare etc.), după conţinutul în apă, etc. Există medii de
cultură simple (agar, apă peptonată, bulion simplu etc) şi medii de cultură mai complexe
(agar-sânge, bulion glucozat, agar Muller-Hinton etc). (vezi anexa nr. 2)
Medii speciale
Mediul electiv conţine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumite
bacterii (de exemplu mediul Lőfer, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric) (Figura
nr. 5).
Prin conţinutul său în substanţe antimicrobiene, mediul selectiv inhibă dezvoltarea
altor bacterii decât cea a cărei izolare se urmăreşte. De exemplu, mediul cu telurit de
potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii în care includem antibiotice (faţă de care
bacteria care se doreşte a f izolată este rezistentă) (Figura nr. 6)
Mediul de îmbogăţire favorizează înmulţirea anumitor bacterii patogene, inhibând
dezvoltarea forei de asociaţie dintr-un produs patologic. Funcţionează concomitent ca
mediu selectiv şi ca mediu electiv (de exemplu, mediul hiperclorurat pentru staflococ sau
mediile de îmbogăţire utilizate pentru izolarea Salmonella typhi).
Mediul diferenţial conţine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate
f sau nu metabolizat, determinând modifcarea culorii sau aspectului culturii. De exemplu,
agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) care diferenţiază bacteriile lactoză-
pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactoză-negative (Shigella, Salmonella). Alte
exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoză), TSI (3 zaharuri şi fer), MIU (mobilitate
indol uree). (Figurile nr. 7-10).
Colonia izolată
Pe medii solide, germenii însămânţaţi în suprafaţă produc colonii. Colonia este
totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie
este o clonă bacteriană.
Coloniile izolate se pot obţine de exemplu prin tehnica însămânţării prin
dispersie (cu ansa bacteriologică sau cu tamponul). După prelevarea cu ansa a unei
40
porţiuni din produsul patologic, inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se
resterilizează ansa; se verifcă temperatura, prin atingerea mediului într-o zonă
neînsămânţată, cât mai periferic; cu ansa sterilă se trasează a doua latură a poligonului; se
resterizează ansa şi se repetă procedeul descris până la realizarea a 4-5 laturi, fără a atinge
prima latură. În acest mod, pe ultimele „laturi” ale poligonului se vor putea observa după
trecerea timpului necesar multiplicării bacteriene, colonii izolate, bine individualizate.
(Schema nr. 1)
Incubarea constă în menţinerea mediilor de cultură însămânţate, în condiţiile necesare
pentru dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvoltă şi duc la apariţia
unei culturi în circa 18-24 de ore de incubare la temperatura optimă de dezvoltare
(asigurată în termostat) pentru că timpul de generaţie este de circa 30
minute. Mycobacterium tuberculosis are un timp de generaţie de 12-27 ore şi în acest caz
cultura devine pozitivă în 2-8 săptămâni. Pentru bacteriile strict anaerobe este necesară
incubarea în anaerobioză (ex. în medii la care s-au adăugat ingrediente cu activitate
reducătoare sau în anaerostat); dorim să subliniem că dacă transportul nu se face în
condiţii de anaerobioză, nu vom mai obţine nici un rezultat indiferent de mediile utilizate
(Figura nr. 11).
Dinamica multiplicării bacteriilor în culturi
Culturile bacteriene sunt discontinue când se realizează în volum limitat de mediu,
care nu este reînnoit şi continueatunci când mediul de cultură este continuu reînnoit. O
populaţie bacteriană poate f menţinută indefnit în faza de multiplicare exponenţială dacă
se adaugă continuu mediu de cultură proaspăt, cu omogenizare prin curent de aer steril şi
evacuare a unei cantităţi corespunzătoare de cultură (de exemplu în dispozitivul numit
chemostat sau turbidostat).
Chemostatul utilizează un mediu de cultură în care unul dintre nutrienţi, afat în
concentraţie mai redusă decât ceilalţi, funcţionează ca factor limitant al creşterii. Mediul de
cultură proaspăt este admis în vasul de cultură în ritmul în care este consumat factorul
limitant, iar cultura este evacuată cu acelaşi ritm. Cultura este menţinută astfel la o valoare
constantă şi submaximală ratei de creştere, reglată prin factorul limitant. Chemostatele
sunt foarte utile pentru obţinerea de tulpini mutante pentru că după ce rata de multiplicare
a fost determinată şansa de selectare a acestor tulpini este mai mare (Figura nr. 12).
În laboratorul de microbiologie clinică, de regulă se utilizează culturile discontinue.
Timpul de generaţie
Populaţia care rezultă prin diviziunea unei bacterii creşte în progresie geometrică cu
raţia 2. Timpul necesar pentru dublarea populaţiei se numeşte timp de dublare sau timp de
generaţie. Timpul de generaţie în faza exponenţială şi în condiţii optime de cultivare este
determinat genetic. De exemplu, pentru E. coli este de circa 20 minute (ca şi pentru
majoritatea bacteriilor studiate). Pentru Mycobacterium tuberculosis timpul de generaţie
poate avea o valoare între 12-27 ore.
Fazele dezvoltării unei culturi bacteriene
Teoretic, dinamica unei populaţii bacteriene ar trebui să evolueze exponenţial.
Dinamica reală a populaţiei bacteriene în cultură discontinuă are însă o evoluţie
41
caracterizată printr-o curbă la care distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare
logaritmică; faza staţionară şi faza de declin (Figura nr. 13).
Faza de lag
Numărul bacteriilor însămânţate rămâne staţionar sau scade; germenii se adaptează la
condiţiile mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, îşi consumă până la dispariţie
incluziile, cresc mult în dimensiuni, sintetizează enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu
se divid; sunt foarte sensibile la antibiotice. Faza de lag durează aproximativ 2 ore. Această
fază este aparent dependentă de o varietate de factori incluzând dimensiunea inoculului,
timpul necesar pentru a-şi reveni din şocul fzic datorat transportului, timpul necesar pentru
sinteza coenzimelor esenţiale sau a factorilor de diviziune şi timpul necesar pentru sinteza
a noi enzime ce sunt necesare pentru a metaboliza substratul prezent în mediu. (2)
Faza de multiplicare logaritmică (exponenţială)
Celulele bacteriene prezintă caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt însă ceva
mai mari), citoplasma este intens bazoflă şi omogenă, lipsită de incluzii. Bacteriile sunt
foarte sensibile la antibiotice. Această fază este adecvată pentru studierea bacteriilor sau
pentru recoltarea lor în vederea preparării de vaccinuri. Faza de multiplicare exponenţială
durează aproximativ 2-3 ore.
Faza staţionară
Multiplicarea este realizată în progresie aritmetică, dar pentru că numărul bacteriilor
care sunt distruse este aproximativ egal cu numărul bacteriilor nou apărute rata de
creştere devine nulă.
Germenii au morfologia caracteristică speciei; în această fază realizăm identifcarea
germenilor. Apar incluziile caracteristice. La speciile sporogene începe formarea sporilor.
Faza staţionară durează aproximativ 2-3 zile.
Faza de declin
Substratul nutritiv sărăceşte, apar metaboliţi toxici, bacteriile sunt distruse progresiv,
se produc şi enzime autolitice, rezervele de hrană din incluzii (ex. acidul poli-β-hidroxi
butiric sau glicogenul) se consumă, pentru un timp sursa de energie rămâne doar ARN-ul
celular. Unele bacterii pot persista 2-3 luni. În acest scop se pot activa mecanisme speciale
de reglare şi se exprimă o serie de gene care duc la sinteza unor proteine speciale care
permit adaptarea pentru o durată limitată de timp. La speciile sporogene, fenomenul de
sporogeneză devine foarte intens.
Aspectul culturilor pe medii solide
Condiţiile de cultivare şi aspectul culturii sunt caractere cheie în identifcarea
bacteriilor. Aspectul coloniilor variază între diferitele bacterii, fără a permite diferenţieri
defnitive de specie (dar au utilitate în contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene şi
în contextul general al diagnosticului de laborator, care la rândul său trebuie să aibă loc
într-un context în care punem în balanţă şi alte elemente, clinice, paraclinice; colaborarea
între medicii de diferite specialităţi este esenţială). Se examinează:
· dimensiunea (coloniile pot f mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm şi mici,
sub 1 mm),
· conturul (circular, lobat, zimţat),
42
· relieful (plat, bombat, acuminat, papilat),
· suprafaţa (lucioasă, granulară, rugoasă),
· culoarea (pigmentate, nepigmentate),
· opacitatea (transparente, opace),
· consistenţa,
· aderenţa la mediu,
· prezenţa sau absenţa hemolizei (pe medii de tipul geloză-sânge). (Figura nr. 14)
Colonia S (smooth) are suprafaţă bombată şi netedă, margini circulare şi adesea aspect
strălucitor. Germenii păstrează structura antigenică şi nu aglutinează spontan cu soluţie
salină fziologică. Germenii capsulaţi îşi păstrează capsula. Virulenţa este conservată.
Majoritatea bacteriilor studiate formează colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E.
coli etc). (Figura nr. 15)
Colonia R (rough) este plată, suprafaţa ei prezintă rugozităţi, marginile sunt crenelate.
Structura antigenică nu este caracteristică. Nu păstrează capsula. Virulenţa nu este
conservată (excepţii Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis,Corynebacterium
diphteriae). O bacterie care în mod caracteristic duce la apariţia unei colonii de tip S (ex. o
enterobacterie), în cazul în care testele de identifcare prin reacţii antigen-anticorp (ex.
aglutinare pe lamă, folosind anticorpi cunoscuţi) nu se efectuează la timpul potrivit ci mai
târziu, prin „înbătrânire” va suferi anumite modifcări, coloniile vor deveni de tip R iar
identifcarea pe baza caracterelor antigenice nu va mai f posibilă. (Figura nr. 16)
Colonia M (mucoid) este mare, strălucitoare, mucoasă. Este dată de exemplu de
bacteriile care prezintă capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae). (Figura nr. 17)
Coloniile de Streptococcus pneumoniae pot f şi de tip S şi de tip M.
În cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus spp.) pe mediile obişnuite nu vom
putea obţine colonii izolate (a fost descris fenomenul de „invazie”). (Figura nr. 18) Cultura
se întinde pe toată suprafaţa plăcii în strat continuu sub forma unor valuri succesive.
Fenomenul de „invazie” poate f inhibat prin incorporarea în mediu de acizi sau săruri
biliare, tiosulfat de sodiu etc.
Aspectul culturilor pe medii lichide
Bacteriile şi fungii facultativ anaerobi se dezvoltă în toată masa de lichid, tulburându-l.
Bacteriile strict aerobe se dezvoltă preponderent la suprafaţa mediului. Ca un aspect
particular, în apa peptonată Vibrio cholerae se poate dezvolta şi formează un „văl” la
suprafaţa mediului. În acest caz, pH-ul mediului este 9-9,5.
Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbură omogen
mediul (majoritatea bacteriilor). (Figura nr. 19)
Variantele R realizează o tulburare mai puţin omogenă. Pot lăsa mediul limpede,
formând focoane care se depun sau un strat (văl) la suprafaţa mediului (de exemplu bacilul
difteric sau bacilul tuberculos). (Figura nr. 20)
Alte informaţii privind mediile de cultură, diferitele tehnici de cultivare, examinarea
culturilor bacteriene şi diferitele tehnici de identifcare fenotipice utile în diagnosticul
microbiologic sunt prezentate în anexa nr. 2.
43
3. 6. Povestiri adevărate
3.6.1. Penicilina, o mare descoperire ... născută dintr-o mică neglijenţă
Era prin anul 1928 când Alexander Fleming, investigând caracteristicile staflococilor, a
descoperit în mod accidental penicilina printr-o „eroare de cultivare”. Fleming era deja
cunoscut drept un cercetător de excepţie prin activitatea deja desfăşurată, de ex. datorită
descoperirii lizozimului (1922); pe de altă parte, omul de ştiinţă demonstra un grad de
neglijenţă în activitatea de laborator.
Întors din concediu în septembrie 1928, a găsit câteva dintre plăcile cultivate anterior,
contaminate cu un fung din genulPenicillium şi a decis să le arunce într-o soluţie de
dezinfectat. Puţin mai târziu, vrând să arate unui coleg câteva dintre rezultatele activităţii
sale, a găsit câteva plăci care nu fuseseră încă „dezinfectate” iar de această dată a
observat o mică zonă, la contactul dintre cultura fungică şi cultura bacteriană, zonă în care
bacteriile nu s-au dezvoltat.
Pornind de la această observaţie, Fleming a obţinut un extract din cultura fungică, cu
proprietăţi bactericide. Pentru că fungul făcea parte din genul Penicillium a denumit acest
extras penicilină.
A publicat rezultatele acestei descoperiri în anul 1929.
Au mai trecut aproape 16 ani, timp în care s-a reuşit izolarea şi stabilizarea acestui
extract, şi în anul 1945 s-a înregistrat producerea antibioticului revoluţionar numit
penicilină.
Pentru descoperirea sa, Fleming împreună cu biochimistul Ernst Chain şi farmacologul
Howard Florey au fost laureaţi cu Premiul Nobel pentru Fiziologie şi Medicină în anul 1945.
3.6.2. O fostă rickettsie rescrie vechile clasifcări
În 2009, o echipă de cercetători i-a oferit Coxiellei burnetii mijloacele de a „evada” din
mediul intracelular. Până la această dată, agentul etiologic al febrei Q era unul dintre
exemplele stereotipe de bacterie strict parazită, imposibil de cultivat pe medii artifciale.
Nu a fost una dintre acele descoperiri rapide, neaşteptate, ci a încununat o muncă
minuţioasă de studiere a necesităților metabolice ale acestor bacterii. Cercetările au
evoluat progresiv: într-o primă etapă, a fost obţinut un mediu de cultură artifcial, care
reproducea condiţiile de pH acid din interiorul vacuolelor asemănătoare lizozomilor, în
care Coxiella spp. se multiplică în celulele gazdei. Pe acest mediu, denumit
ulterior Complex Coxiella Medium (CCM), Coxiella burnetii şi-a putut desfăşura activitatea
metabolică timp de aproximativ 24 de ore.
Într-o a doua etapă, cercetătorii au reuşit să dovedească faptul că bacteria
este microaeroflă. Au adaptat mediul în consecinţă şi l-au numit ACCM (Acidifed Citrate
Cysteine Medium).
Cultivarea Coxiella burnetii pe medii de cultură artifciale ar putea permite studierea
factorilor de patogenitate, studierea structurii genetice și poate și realizarea unui model de
abordare pentru alţi germeni strict intracelulari. (3-4)
3. 7. Evaluarea cunoştinţelor
44
La următoarele întrebări alegeți un singur răspuns corect:
1. Care dintre următoarele bacterii este cromopară?
A. Staphylococcus aureus
B. Staphylococcus epidermidis
C. Pseudomonas aeruginosa
D. Escherichia coli
E. Bacillus anthracis
45
4. Acţiunea factorilor fzici,
chimici şi biologici asupra
bacteriilor
4. 1. Defniţii de bază
Septic înseamnă contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecţia unei
plăgi).
Aseptic înseamnă lipsit de microbi, indiferent dacă microbii sunt patogeni sau
nepatogeni.
Asepsia reprezintă ansamblul de metode prin care evităm contaminarea mediului
ambiant cu germeni microbieni sau prin care putem menţine „sterilitatea” ţesuturilor,
mediilor de cultură, medicamentelor injectabile etc.
Antisepsia reprezintă înlăturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de
pe tegumente, mucoase sau din plăgi. Se realizează cu ajutorul substanţelor antiseptice,
netoxice pentru tegument (ex. alcool etilic 70°, tinctură de iod 5%, KMnO40,1%, detergenți
cationici etc).
Contaminare, este un termen utilizat în instituţiile sanitare (deosebit de contaminarea
radioactivă) care se referă, în general, la contactul cu microorganisme condiţionat
patogene sau patogene (capabile să producă infecţii sauboli infecțioase ).
Decontaminarea reprezintă utilizarea agenţilor fzici / chimici pentru a îndepărta, a
inactiva sau a distruge unele sau toate microorganismele condiţionat patogene sau
46
patogene de pe suprafeţe sau obiecte, astfel încât acestea să nu mai poată reprezenta o
sursă de infecţie sau de transmitere a infecției, iar obiectele sau suprafeţele să poată f
manipulate şi / sau utilizate în siguranţă.
Sanitizarea reprezintă totalitatea măsurilor pentru asigurarea sănătăţii publice.
Prezervarea presupune prevenirea multiplicării unor microorganisme în produse
farmaceutice, vaccinuri, alimente etc.
Curăţarea reprezintă utilizarea agenţilor fzici şi / sau chimici pentru a îndepărta
murdăria (materie organică şi anorganică) de pe suprafeţe (inclusiv tegument) sau obiecte,
prin procedee mecanice sau manuale, pregătind astfel suprafeţele sau obiectele pentru
utilizare în siguranţă sau, pentru trecerea la o altă etapă de decontaminare.
Detergentul este un produs sintetic pentru curăţare. Detergenţii pot f anionici,
cationici, amfoterici şi neionici. Nu prezintă acţiune antimicrobiană.
Detergentul enzimatic este un produs sintetic pentru curăţare care conţine o enzimă.
Echipamentul de protecţie este un echipament special (îmbrăcăminte, mănuşi, ochelari
etc) purtat de personalul care manipulează produse dezinfectante şi realizează dezinfecţia.
Enzima este o proteină care descompune murdăria într-o formă care poate f uşor
îndepărtată de produsul de curăţare. Are rol de catalizator pentru reacţie, mărind puterea
de curăţare a produsului. De exemplu: amilaza acţionează asupra urmelor de amidon;
lipaza acţionează asupra urmelor de grăsimi şi uleiuri; proteaza acţionează asupra materiei
proteice.
Produsul de curăţare este un agent chimic care îndepărtează murdăria (materie
organică şi/sau anorganică) de pe suprafeţe sau obiecte, dar nu prezintă activitate
antimicrobiană (bactericidă, virucidă, fungicidă sau sporicidă) şi care nu reduce nivelul de
contaminare microbiană.
Spălarea mâinilor este procedura prin care se elimină murdăria şi se reduce fora
tranzitorie prin acţiune mecanică, utilizând apă şi săpun (Figura nr. 1, Film nr. 1).
Factori care infuenţează efcacitatea metodelor de control:
- mărimea populaţiei bacteriene;
- timpul de expunere la agentul decontaminant (creşterea timpului de expunere creşte rata
distrugerii);
- efectul concentraţiei, a temperaturii și a pH-ului (o concentraţie mai mare creşte rata
distrugerii);
- stabilitatea agentului;
- structura microorganismului etc.
Dezinfecţia reprezintă distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori şi a sporilor)
din anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafeţe. Se realizează cu ajutorul unor
agenţi fzici sau cu ajutorul substanţelor dezinfectante bactericide (cu efecte negative
asupra ţesuturilor gazdei). Împiedică răspândirea bolilor infecţioase.
Dezinfecţia igienică a mâinilor, prin spălare, reprezintă utilizarea unui produs cu acţiune
directă asupra forei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia, fără a acţiona
asupra forei rezidente.
47
Dezinfecţia chirurgicală a mâinilor, prin spălare, reprezintă utilizarea unui produs cu
acţiune directă asupra forei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia şi cu acţiune
asupra forei rezidente.
Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel scăzut” este un agent chimic care distruge
bacteriile vegetative, unii fungi (ex. Candida albicans), virusurile capsulate şi virusurile mari
necapsulate.
Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel intermediar” este un agent chimic care distruge
bacteriile vegetative, fungii, virusurile capsulate, virusurile necapsulate şi mycobacteriile.
Produsul pentru dezinfecţie ”de nivel înalt” este un agent chimic care, în condiţii bine
defnite de timp şi temperatură, distruge microorganismele, are acţiune sporicidă şi
reprezintă un potenţial sterilizant chimic (Figura nr. 2).
Sterilizantul chimic este un agent chimic (nu în formă gazoasă), utilizat pentru
sterilizarea dispozitivelor medicale „critice”, care nu se pot steriliza prin metode fzice. Un
sterilizant chimic distruge toate categoriile şi formele viabile de microorganisme, nivelul de
supravieţuire al acestora find mai mic sau egal cu 10 -6 (probabilitatea prezenţei unui singur
microorganism viu pe un dispozitiv medical sterilizat este egală sau mai mică cu
1/1.000.000).
Termenul de valabilitate reprezintă perioada de timp în care un produs dezinfectant
este efcient, din punct de vedere al concentraţiei substanţei active şi efcacităţii
antimicrobiene.
Timpul de contact (timp de acţiune) reprezintă perioada de timp în care produsul
dezinfectant este în contact direct cu suprafaţa sau obiectul care trebuie dezinfectat.
Perioada de timp în care produsul antiseptic este în contact direct cu ţesuturile vii.
Sterilizarea reprezintă distrugerea sau îndepărtarea tuturor microorganismelor
patogene sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafaţă sau dintr-un
mediu (lichid sau solid). Toate materialele utilizate în laboratorul de microbiologie trebuie
să fe sterile înainte de utilizare. Există o mare diversitate de materiale care trebuie
sterilizate, astfel încât şi metodele de sterilizare sunt destul de variate, după cum urmează:
- Metode de sterilizare prin căldură (căldura uscată sau căldura umedă);
- Metode de sterilizare prin fltrare;
- Metode de sterilizare utilizând radiaţiile, dar şi
- Metode chimice de sterilizare.
Metodele de sterilizare care utilizează radiaţiile (cu excepţia radiaţiilor ultraviolete) şi
metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilenă) sunt utilizate rareori în laboratorul
de microbiologie.
Sterilizarea va f întotdeauna precedată de pregătirea materialului care urmează să
fe sterilizat, respectiv: spălare, uscare, ambalare (în cazul materialelor curate,
necontaminate) urmat de autoclavare, spălare, uscare, ambalare (în cazul materialelor
contaminate refolosibile). Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale
etc. trebuie curăţateperfect, de ex. prin spălare cu ajutorul unor detergenţi. Dacă aceste
materiale au fost contaminate cu sânge, înainte de spălare se vor dezinfecta. Sticlăria de
laborator este colectată în recipiente speciale şi se sterilizează prin autoclavare; pipetele
48
vor f menţinute în amestec dezinfectant până a doua zi. Instrumentarul metalic, seringile şi
acele (deşi este necesară utilizarea pe scară largă a seringilor şi acelor de unică
întrebuinţare) contaminate se vor introduce în baie de amoniac 1-2% timp de 15-30 minute,
se vor peria în soluţie de 1-2% detergent cationic şi se vor spăla cu jet de apă pentru
îndepărtarea substanţelor chimice (Figura nr. 3).
Instrumentele de unică utilizare sunt, în general, destinate chirurgiei moderne. Pot f
izolate (aparate de sutură mecanică toracică, abdominală, vasculară etc) sau pot f
furnizate în seturi de instrumente de unică utilizare. Sterilizarea acestor instrumente se
face industrial prin iradiere cu raze gamma sau etilenoxid. Utilizarea instrumentelor de
unică utilizare (”disposable”) conferă un plus de siguranță, în pofda unui preţ relativ ridicat.
Există o serie de metode pentru a controla efcienţa sterilizării, prin indicatorii fzici (ex.
termometru), chimici (ex. foare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus
stearotermophilus din genul Geobacillus). Pentru verifcarea efcacităţii sterilizării cu
ajutorul radiaţiilor, pot f utilizaţi spori de Bacillus pumilus, din genul Bacillus) (Figura nr. 4).
49
nativă. Ca urmare protoplasma se denaturează. Celulele bogate în apă sunt mult mai
sensibile la acţiunea căldurii decât microorganismele care conţin puţină apă sau sunt
lioflizate. Apa din compoziţia microorganismelor absoarbe căldura proporţional cu volumul
său. Sterilizarea prin căldura are loc în două variante principale: prin căldură uscată și
umedă.
Flambarea reprezintă trecerea prin facără (de câteva ori) a unui obiect, fără a se atinge
temperatura de incandescenţă. Flambarea se aplică pentru portansă, gâtul unui recipient
de sticlă (tub, eprubetă, facon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur şi nu reprezintă
sterilizare.
a2. Sterilizarea cu aer cald se realizează în etuvă (pupinel, cuptor Pasteur) (Figura nr.
6). Etuva este o cutie metalică cu pereţi dubli. Cu ajutorul unor rezistenţe electrice şi a unui
termostat se obţine şi menţine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii
în interiorul aparatului este realizată cu ajutorul unui sistem de ventilaţie (Schema nr. 1).
Pentru majoritatea materialelor care urmează a f sterilizate, temperatura din etuvă
trebuie să atingă 180CC, pentru o durată de 1 oră sau 160°C pentru o durată de 2 ore. Pot
exista și alte variante, de exemplu în funcție de dimensiunea obiectelor de sterilizat.
Sterilizarea cu aer cald este indicată pentru obiecte de sticlă, obiecte de porţelan,
pulberi inerte şi termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru
instrumentarul metalic este de menţionat faptul că repetarea sterilizării, în timp, conduce la
decălirea oţelului) etc.
Nu se vor steriliza în etuvă soluţiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc,
vată, bumbac, fbră sintetică, alte materiale termolabile, materiale contaminate din
laborator.
a3. Incinerarea reprezintă arderea până la obţinerea de cenuşă (Figura nr. 7). Există
anumite reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. În
cazul spitalelor, în România au existat astfel de incineratoare în structura unităţii sanitare
respective. Odată cu procesul de aderare la Uniunea Europeană şi respectiv necesitatea
aplicării unor reguli impuse pentru toate ţările membre, majoritatea incineratoarelor de
spital au fost închise. Modul în care s-a realizat în perioada 2003-2004 negocierea privind
stoparea activităţii acestor incineratoare nu a ţinut cont de situaţia reală din ţara noastră.
În lipsa unui incinerator propriu, unitatea sanitară trebuie să încheie un contract de prestări
servicii cu o frmă de profl. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea
50
f supuse incinerării materiale de unică folosinţă din plastic, reziduuri organice solide, gunoi,
cadavrele animalelor de experienţă etc.
b). Sterilizarea prin căldură umedă este cea mai efcientă metodă de sterilizare şi are ca
mecanism coagularea proteinelor şi degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite
substanţe în soluţie, sticlărie (cu excepţia pipetelor şi lamelor), instrumentar chirurgical
(metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultură, aparate de fltrat etc.
b1. Autoclavarea este esenţială atât pentru laboratoarele de microbiologie cât şi
pentru unităţile sanitare în general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de apă
realizează
· la 0,5 atmosfere o temperatură de 115CC,
· la 1 atmosferă o temperatură de 121CC şi respectiv
· 134CC la 2 atmosfere.
Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereţi metalici, care se închide etanş cu
un capac prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul căruia, vaporii de apă
sunt comprimaţi la presiunea necesară în vederea sterilizării (Schema nr. 2).
Există mai multe tipuri de autoclave:
- autoclave cu perete simplu
· verticale
· orizontale
- autoclave cu manta de aburi
· verticale
· orizontale.
În continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu,
vertical, la care vaporii provin din apa afată în cazanul de presiune şi ajung în camera de
sterilizare de jos în sus (Figura nr. 8). Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de
un manometru. Pentru punerea în funcţiune a autoclavului, în dotare există 2 robinete: unul
superior (robinetul de aer şi vapori, care permite legătura între cazan şi mediul exterior) şi
unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele
există o supapă de siguranţă care se deschide şi permite evacuarea vaporilor atunci când,
accidental, presiunea vaporilor depăşeşte limita de siguranţă. În momentul de faţă pentru
evitarea riscului de a veni în contact cu vapori de apă ferbinţi afaţi sub presiune,
autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului până când
presiunea din interior nu o egalizează pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus
într-un perete exterior solid care la partea inferioară are un spaţiu în care se afă sursa de
căldură.
În partea inferioară a cazanului de presiune se afă un suport pe care se aşează o placă
de metal perforată (Figura nr. 9). Pe suport se aşează materialele care trebuie sterilizate iar
faptul că placa este perforată permite trecerea vaporilor de apă produşi după încălzirea
apei. În vederea sterilizării se procedează astfel:
· verifcăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului, care trebuie să fe
până la o distanţă de 2-3 centimetri de suport; dacă nivelul a scăzut, se completează
(recomandabil se va utiliza apă distilată);
51
· aşezăm pe suport obiectele şi materialele de sterilizat, ambalate
corespunzător;
· închidem etanş capacul, folosind sistemul special de etanşeizare cu care
este dotat autoclavul pe care îl avem la dispoziţie;
· conectăm sursa de căldură;
· deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne
aer în cazanul cu presiune efcienţa sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă find
mai uşori, vor încălzi în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul, care va
atinge temperaturi inferioare, find mai greu, va rămâne în partea inferioară a cazanului) ;
· închidem robinetul după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu
de vapori;
· presiunea din cazan începe să crească şi este urmărită cu ajutorul
manometrului; atunci când presiunea atinge valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm
sursa de căldură în aşa fel încât această presiune să fe menţinută pentru toată durata
sterilizării (de ex. 30 minute) ;
· după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm
autoclavul să se răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii
atmosferice;
· deschidem lent robinetul de vapori;
· deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului;
· lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis;
· atunci când temperatura scade sufcient de mult putem scoate
materialele sterilizate.
b2. Tindalizarea (sterilizarea fracţionată) este o metodă de sterilizare prin căldură
umedă care evită depăşirea unei temperaturi de 100CC. Substanţele de sterilizat se menţin
la 56-100CC timp de 30-60 minute, 3 până la 8 zile succesiv. Astfel, utilizând medii care
permit germinarea, după prima încălzire timp de 30-60 minute sunt distruse formele
vegetative iar după răcire are loc germinarea sporilor. În ziua următoare sunt distruse prin
încălzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar după răcire are loc
germinarea sporilor care nu au germinat în prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot f
utilizate autoclave la care se va menţine permanent deschis robinetul de vapori (şi astfel nu
se va depăşi în interior temperatura de 100CC), băi de apă sau băi de nisip. Prin tindalizare
se pot steriliza alimente, unele medii de cultură etc.
b3-4. Pasteurizarea şi ferberea nu reprezintă metode de sterilizare, dar sunt utilizate
în anumite situaţii.
Pasteurizarea foloseşte căldura umedă şi are aplicaţii în conservarea pentru scurtă
durată a unor alimente (lapte, bere etc). Există o pasteurizare joasă (30 minute la 56-65CC),
o pasteurizare medie (15 minute la 65-75CC) şi o pasteurizare înaltă (2-5 minute la 85-
90CC). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile în formă vegetativă dar nu şi sporii.
Fierberea poate f utilizată atunci când nu dispunem de alte metode efciente de
sterilizare, iar mecanismul de acţiune este denaturarea proteinelor. Fierberea timp de 30
minute la 100oC, distruge bacteriile în formă vegetativă, fungii şi virusurile, dar nu şi sporii
52
bacterieni. Timpul se înregistrează după ce apa a început să farbă. Efcienţa acestei
metode poate f crescută prin adăugarea de carbonat de sodiu 1-2%.
^inapoi sus
4. 2. 1. 2. Infuenţa temperaturii scăzute asupra microorganismelor
Temperaturile joase (în jur de 0-4CC) au în general un efect bacteriostatic. La
temperaturi scăzute, reacţiile biochimice încetinesc, multiplicarea poate f stopată.
Majoritatea produselor biologice/patologice pot f transportate (menţinând viabilitatea
germenilor şi încetinind în acelaşi timp multiplicarea acestora) la o temperatură de circa
4CC. O serie de culturi pot f de asemenea menţinute la temperatura frigiderului pentru o
durată limitată de timp în vederea prezervării şi posibilităţii de a repeta anumite teste de
identifcare etc.
În funcţie de viteza cu care are loc răcirea, întâlnim situaţii diferite, cu următoarele
posibile efecte asupra structurilor celulare bacteriene.
a). Congelarea lentă, la temperaturi mai mici -21,3CC are efecte bactericide prin
formarea de cristale de gheaţă şi prin hiperconcentrarea salină cu denaturarea proteinelor;
b). Congelarea bruscă la -70CC are efecte de conservare a bacteriilor prin solidifcarea în
masă a apei fără apariţia cristalelor de gheaţă;
c). Lioflizarea (criodesicarea) reprezintă congelarea bruscă concomitent cu desicaţia
(deshidratarea în vid). O suspensie microbiană în mediu protector, lioflizată, poate f
păstrată în fole închise timp îndelungat (de exemplu vaccinul BCG).
^inapoi sus
4. 2. 1. 3. Filtrarea
Microorganismele pot f reţinute mecanic şi electrostatic în porii unui fltru. Trecerea
unui lichid printr-o substanţă prevăzută cu pori care va reţine microorganismele din lichidul
respectiv poartă numele de sterilizare prin fltrare.
De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de fltre clasice (porţelan, sticlă poroasă,
azbest impregnat cu caolin, pământ de infuzori) (Figura nr. 10). Actualmente se folosesc din
ce în ce mai frecvent membrane fltrante din acetat de celuloză cu porozităţi între 8 şi
0,025 mm (Figura nr. 11). În vederea fltrării sunt necesare o serie de piese precum: un
recipient în care se introduce lichidul care urmează a f fltrat, un recipient în care se va
colecta lichidul sterilizat, o pâlnie care se montează etanş între cele 2 recipiente, o pompă
de vid care va aspira lichidul din primul în al doilea recipient, prin membrana fltrantă.
Toate aceste piese sunt sterilizate prin autoclavare înainte de începerea fltrării.
Există şi alte variante tehnice. Cu o importanţă practică particulară ar f de menţionat
fltrele pentru sterilizarea aerului din cabinetele de siguranţă biologică (clasa II şi clasa III),
fltrele HEPA (High Effciency Particulate Air Filters) (Figura nr. 12).
Sterilizarea prin fltrare este utilizată pentru decontaminarea aerului, a unor medii de
cultură (care nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la
temperaturile atinse în cazul sterilizării prin căldură etc.
^inapoi sus
4. 2. 1. 4. Radiaţiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) au efecte bactericide
prin ruperea legăturilor de hidrogen, oxidarea legăturilor duble etc. Radiaţiile UV sunt utile
53
în sterilizarea suprafeţelor de lucru (pentru repartizarea mediilor de cultură, alte manevre
aseptice etc) în cazul în care nu există cabinete de siguranţă biologică cu fux laminar dar şi
atunci când avem la dispoziţie astfel de cabinete de siguranţă biologică şi dorim să
sterilizăm incinta în care am prelucrat spre ex. produse în care există Mycobacterium
tuberculosis. Lămpile cu UV sunt numite lămpi germicide. Astfel de lămpi sunt plasate de
ex. şi în instituţiile sanitare în care sunt internaţi pacienţi cu tuberculoză (Figura nr. 13).
Radiaţiile ionizante se pot utiliza în sterilizări industriale (pentru alimente, medicamente,
seringi de unică întrebuinţare etc).
^inapoi sus
4. 2. 1. 5. Ultrasunetele au efecte bactericide prin acţiune mecanică, mişcare activă
a conţinutului celular, formare în mediul extern de bule mici de gaze dizolvate care se
mişcă energic şi se izbesc de membrană (fenomenul de cavitaţie) şi creşterea temperaturii
la 50-80CC. Sporii rezistă acestor efecte.
^inapoi sus
4. 2. 1. 6. Presiunea osmotică
Plasmoliza (pierderea apei, deshidratarea) în medii hipertone are efecte letale asupra
unor bacterii. În medii hipotone are loc acumularea de apă în celula bacteriană; aceasta
devine turgescentă şi peretele bacterian cedează.
4. 2. 2. Efectele antimicrobiene
ale factorilor chimici
Există o serie de substanţe chimice necesare creşterii şi multiplicării bacteriene. Alte
substanţe chimice (antibioticele şi chimioterapicele) au efect bactericid sau bacteriostatic
selectiv.
Antisepticele şi dezinfectantele sunt substanţe cu acţiune antimicrobiană neselectivă,
alterândstructuri şi funcţii comune microorganismelor şi organismelor superioare.
Antisepticele pot f utilizate pe tegumente şi mucoase.
Dezinfectantele pot f utilizate numai pe suprafeţe şi structuri care nu sunt vii.
O parte dintre dezinfectante au efect sterilizant. Aşa cum am menţionat anterior,
trebuie să existe o etapă de pregătire a materialelor în vederea sterilizării. Materialele de
laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc, trebuie curăţate perfect, de ex. prin
spălare cu ajutorul unor detergenţi. Dacă aceste materiale au fost contaminate cu sânge,
înainte de spălare se vor dezinfecta.
Substanţele antiseptice şi dezinfectante se pot clasifca în funcţie de mecanismul de
acţiune, după cum urmează:
a). Substanţe care denaturează proteinele (au în general efect bactericid): acizii, bazele,
alcoolii şi derivaţii lor (de exemplu alcoolul etilic, CH 3-CH2OH, de 70C, folosit pentru
antiseptizarea tegumentelor).
b). Substanţe care oxidează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH):
hipermanganatul de potasiu, KMnO 71‰, util în antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de
hidrogen, H2O2, soluţie 3% în apă, utilizat în antiseptizarea plăgilor, halogenii (Cl 2, I2, Br2) şi
54
derivaţii lor (hipocloriţi, cloramine, soluţii iodurate etc. Există și diferite clase de compuşi
halogenaţi cu potență mai mare, cum ar f cei care au în componenţa lor radicalul benzil
-C6H5. Indiferent de substanța folosită este necesară realizarea concentraţiei
corespunzătoare.
c). Substanţe care blochează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH):
metale grele [sărurile de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar f spre exemplu
merthiolatul de sodiu, C9H9HgO2SNa ), sărurile de argint, compuşi de argint coloidal
(exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide], grupările alchil ale formaldehidei,
glutaraldehidei (C9H9HgO2SNa), oxidului de etilen (C 2H4O) etc.
d). Substanţe care lezează membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizări
limitate datorită proprietăţilor caustice şi toxicităţii sale; este etalonul faţă de care se
măsoară activitatea antimicrobiană a antisepticelor şi dezinfectantelor (indicele fenolic),
crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc],
detergenţii [anionici (săpunuri, perlan etc), cationici (săruri cuaternare de amoniu, de
exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de
exemplu propilenglicolul)].
e). Substanţe care alterează acizii nucleici: coloranţii bazici (violet de genţiană, albastru
de metilen, fucsină bazică etc), derivaţii de acridină, de exemplu rivanolul.
Dintre exemplele prezentate mai sus,alcoolul etilic de 70C, diferiţi derivaţi halogenaţi,
hipermanganatul de potasiu 1‰, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de
substanţe antiseptice. Dorim să menţionăm şi să subliniem că atât în cazul antisepticelor
cât şi în cazul dezinfectantelor este important ca substanţa utilizată să
aibă concentraţia corespunzătoare, să fe aplicată pentru o durată de
timp corespunzătoare, să se afe în termenul de garanţie. Aceeaşi substanţă chimică (de
ex. cloramina) poate intra în categoria antisepticelor sau în categoria dezinfectantelor, în
funcţie de concentraţie (concentraţia este mai mare în al doilea caz).
În continuare vom prezenta pe scurt câteva exemple de substanţe dezinfectante. Dorim
să menţionăm faptul că, până în prezent, nu există nici un dezinfectant ideal. Există
numeroase substanţe şi numeroşi producători de antiseptice şi dezinfectante.
Hipocloriţii:
soluţiile de hipoclorit se prepară periodic (se inactivează după mai mult de 24 ore),
concentraţia în clor activ este diferită în funcţie de scopul urmărit (ex. 2.500 ppm clor
activ pentru dezinfectarea pipetelor contaminate);
au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, sporilor bacterieni,
fungilor (100 ppm în o oră), virusurilor (200 ppm în 10 minute);
efectul este diminuat considerabil în prezenţa substanţelor organice (în special
proteine), maselor plastice, detergenţilor.
Derivaţii fenolici:
din cauza toxicităţii, potenţialului carcinogenetic şi corozivităţii, fenolii nu se folosesc
ca atare, ci sub forma derivaţilor fenolici;
soluţiile fenolice se prepară periodic (după cel mult 24 ore);
55
concentraţia poate f diferită în funcţie de scopul urmărit (de obicei este de 2-5%);
au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, fungilor, unor virusuri
(ex. HIV este inactivat de soluţia 0,5%);
efectul este diminuat pe suprafeţele de cauciuc, lemn sau material plastic.
Glutaraldehida:
cel mai frecvent este utilizată concentraţia de 2%, la un pH alcalin;
are efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă (în cazul mycobacteriilor
este necesar un timp mai lung de expunere), fungilor, virusurilor;
datorită faptului că nu corodează metalele (aşa cum se întâmplă în cazul
substanţelor prezentate mai sus) se poate folosi şi la dezinfectarea suprafeţelor metalice;
nu poate f folosită pentru suprafeţe, datorită vaporilor iritanţi şi timpului mare de
expunere; ideală pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot f imersate o
perioada mai mare de timp în containere menţinute închise.
Iodoforii:
sunt substanţe care complexează iodul pe care îl eliberează în soluţii apoase;
au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, unor spori bacterieni,
fungilor, unor virusuri (ex. virusuri cu înveliş lipidic);
sunt inactivaţi de substanţe organice (în special proteice), mase plastice, detergenţi;
pot f utilizaţi pentru dezinfecţia suprafeţelor, dezinfecţia pipetelor contaminate.
Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH2O):
exercită activităţi bactericide prin alkilarea acizilor nucleici şi prin înlocuirea
hidrogenului labil printr-o grupare hidroxietil (-CH 2CH2OH);
sporii de Bacillus subtilis nu sunt distruşi;
acest tip de sterilizare se utilizează pentru materiale care nu rezistă atunci când sunt
supuse acţiunii temperaturii sau radiaţiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament
electronic etc.);
· find o substanţă explozivă, etilenoxidul este utilizat în camere speciale în care se
menţine o presiune negativă, iar pentru a preveni o explozie dioxidul de carbon poate f
combinat cu această substanţă în încăperi de oţel speciale; o altă variantă de protecție ar f
combinarea cu hidrocarburi fuorinate.
indiferent de varianta folosită trebuie respectate toate recomandările producătorului;
există o serie de inconveniente în ceea ce priveşte acest tip de sterilizare (pot să apară
efecte carcinogenetice și afectarea sistemului nervos etc., dar e posibilă afectarea
întregului organism);
sterilizarea este în principiu infuenţată de: concentraţia etilenoxidului, temperatură,
umiditatea relativă şi timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraţiei va reduce la
jumătate timpul necesar pentru sterilizare).
4. 2. 3. Produsele biocide
56
Directiva 98/8/CE defneşte produsele biocide după cum urmează: „Substanţe active
şi preparatele conţinând una sau mai multe substanţe active, condiţionate într-o formă în
care sunt furnizate utilizatorului, având scopul să distrugă, să împiedice, să facă inofensivă
şi să prevină acţiunea, sau să exercite un alt efect de control asupra oricărui organism
dăunător, prin mijloace chimice sau biologice” (vezi directiva CE).
Din categoria produselor biocide sunt excluse produsele de curăţenie, detergenţii sub
formă de pulbere sau lichidă şi alte produse similare, ce nu sunt destinate a avea efect
biocid.
Produsele biocide includ:
produsele utilizate pentru dezinfecţia suprafeţelor mari inerte, a aerului, a
echipamentului medical, a mobilierului, sau pentru dezinfecţia şi curăţarea acestora;
produsele pentru dezinfecţia / sterilizarea instrumentarului, endoscoapelor, ş.a., prin
imersie;
produsele dezinfectante / antiseptice pentru tegumente, săpunurile dezinfectante,
săpunurile antiseptice, săpunurile antibacteriene / antimicrobiene, gelurile de curăţare
antibacteriene / antimicrobiene, soluţiile de curăţare antibacteriene / antimicrobiene (după
cum sunt denumite de producător);
produsele dezinfectante/antiseptice pentru mucoase, ex. pentru igiena orală, ş.a.;
şerveţele umede dezinfectante,
detergenţii şi produsele de curăţare care au activitate biocidă dovedită (distrug sau
inhibă multiplicarea bacteriilor, fungilor sau a altor microorganisme).
În această categorie ar putea intra şi substanţele sintetizate de Bacillus
thuringiensis din genul Bacillus, cu efect biopesticid.
4. 2. 4. Efectele antimicrobiene
ale factorilor biologici
4. 2. 4. 1. Interrelaţiile microbiene în cadrul nişelor ecologice proprii
În natură microorganismele nu se dezvoltă izolat. Relaţiile pot f de comensualism,
simbioză sau antagonism, noţiuni care vor f prezentate ulterior.
În cadrul relaţiilor de antagonism, acesta se poate datora vitalităţii mai mari a speciilor
antagoniste sau elaborării de către specia antagonistă a unor substanţe nocive pentru
speciile concurente. Aceste substanţe pot avea (ex. antibioticele şi bacteriocinele) sau nu
(ex. acidiferea mediului) acţiune selectivă.
4. 2. 4. 2. Bacteriofagul
Bacteriofagii sunt virusuri care parazitează bacteriile (de exemplu, bacteriofagii T1-T7
cu specifcitate pentru E. coli). Bacteriofagii (fagii) au fost descoperiţi în 1915. Prof. Mihai
Ciucă obţine în anul 1921 primele tulpini lizogene. În 1949 se înfinţează în România un
Centru naţional pentru bacteriofagi. Fagii au o structură mai complexă decât cea a
virusurilor obişnuite. Se descriu (Figura nr. 14):
57
1. capul fagului are formă de prismă hexagonală bipiramidală. Conţine ADN dublu
catenar helicoidal sau ARN înconjurat de capsida formată din capsomere (înveliş proteic);
fagii ARN pot avea un număr mic de gene (ex. 3) în timp ce fagii ADN pot avea până la 150
gene;
2. coada fagului are structură proteică, simetrie helicoidală; are rol de adsorbţie,
ajutând fagul să penetreze bacteria. Se descriu următoarele formaţiuni:
- cilindrul axial;
- teaca cozii;
- placa bazală (cu croşetele de fxare);
- fbrele cozii (formând un strat în jurul tecii cozii).
Toate proteinele fagice pot conduce la apariţia de anticorpi, descoperire utilizată în
studierea înrudirii dintre diferiţi bacteriofagi.
Relaţii bacteriofag-bacterie
Între bacteriofag şi bacteria gazdă se pot stabili două tipuri de relaţii:
- de tip litic sau productiv (Figura nr. 15);
- de lizogenizare sau de tip reductiv (Figura nr. 16).
Relaţiile sunt strict specifce şi sunt mediate de receptori.
Ciclul litic are mai multe etape şi anume:
1. Adsorbţia: Ataşarea este specifcă. Există receptori strict specifci la nivelul
bacteriofagului, ce recunosc receptori de la nivelul bacteriei. Fixarea pe receptori este
iniţial reversibilă (prin fbrele cozii), apoi ireversibilă (prin croşetele plăcii bazale). Adsorbţia
fagică modifcă permeabilitatea membranei citoplasmatice bacteriene.
2. Penetrarea: Fagul eliberează muramidaza care lizează mureina din peretele
bacterian. Teaca cozii se contractă şi antrenează cilindrul axial prin peretele bacterian,
ducând apoi la injectarea ADN-ului fagic în citoplasma bacteriană;
3. Multiplicarea: După aproximativ 4-5 minute, funcţia ADN-ului bacterian este blocată
şi preluată de ADN-ul fagic ce coordonează sinteza componentelor proprii. Se sintetizează
un număr însemnat de proteine virale.
4. Maturarea (ansamblarea) fagului
5. Liza bacteriei (ex. datorită sintezei unor enzime asemănătoare lizozimului) şi
eliberarea bacteriofagului matur, virulent.
Bacteriile lizosensibile permit adsorbţia, penetrarea şi multiplicarea fagilor virulenţi
până la realizarea lizei celulei bacteriene.
Evidenţierea ciclului litic la nivelul culturilor bacteriene
· în mediu lichid (tulbure), inocularea fagului litic corespunzător duce după câteva
zeci de minute (uneori chiar şi câteva zile) la limpezirea mediului;
· pe mediu solid, însămânţat uniform, inocularea fagului litic duce la apariţia unei
zone de liză, clară, bine circumscrisă (spotul de bacteriofagie), metodă utilizată în lizotipie;
· dacă se amestecă o suspensie de fagi cu o picătură de cultură (pură) bacteriană,
iar tulpina respectivă are receptori potriviţi bacteriofagilor și această suspensie se
amestecă cu geloză încălzită putem transfera suspensia într-o placă Petri;
58
· bacteriofagii infectează bacteriile; după circa 30 minute bacteriile sunt lizate şi
eliberează fagii; aceştia difuzează prin geloză şi infectează bacteriile situate în apropiere şi
ciclul se reia;
· o parte dintre bacterii (cele care nu au receptori potriviţi) nu sunt infectate şi în
timp se multiplică iar cultura bacteriană opacizează mediul; după circa 18-24 de ore putem
observa arii cu celule lizate (transparente) pe un fond produs de cultura bacteriană (bacterii
nelizate), aceste arii numindu-se plaje de bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii
virulenţi sunt clare, în comparaţie cu plajele mai puţin clare produse de bacteriofagii
temperaţi (fagii virulenţi sunt acei bacteriofagi care nu pot evolua decât în ciclul litic)
4. 3. Povestiri adevărate
4. 3. 1. Epidemia de holeră din Peru - Legendă urbană
În 1991, în Peru, a izbucnit o epidemie de holeră. Boala nu este foarte frecventă pe
continentul american, motiv pentru care iniţial a fost difcilă stabilirea cauzelor.
Situaţia a apărut oarecum în paralel cu o dezbatere publică ce avea loc în SUA cu privire
la raportul risc / benefcii adus declorinarea apei. Dintre „istoriile adevărate” aceasta ca şi
istoria epidemiei de difterie în fostele state sovietice arată cât de mult poate f infuenţată
sănătatea publică de către dezbateri, de către mass-media etc (de multe ori în mod
negativ).
Este cunoscut faptul că prin clorinarea apei, pe lângă efectul de distrugere a unor
microorganisme ar putea să apară şi fenomene nedorite, datorită apariţiei unor produşi de
tipul trihalometanului. În USA se discută foarte mult despre efectul cancerigen al acestei
substanţe.
Diverşi ofciali americani, având se pare relaţii în industria chimică, şi care doreau ca
metoda clorinării să rămână cea mai importantă metodă de antiseptizare a apei, au folosit
multă vreme exemplul acestei epidemii pentru a demonstra ce se poate petrece dacă
clorinarea apei va f stopată. Pornind de la date reale (epidemia de holeră) dezbaterile au
ajuns să prezinte o situaţie foarte diferită (numeric) ajungându-se să se discute de 1,3
milioane de cazuri de holeră soldate cu peste 11.000 de decese. În aceste dezbateri s-a
afrmat că pentru a preveni apariţia unui număr foarte mic de cancere (ipotetice) s-a
precipitat apariţia unui număr extrem de mare de cazuri de holeră şi respectiv a unui
enorm număr de decese datorate infecţiei cu Vibrio cholerae.
A fost criticată şi aşa-zisa „Teorie a precauţiei”, principial corectă, bazată pe
următoarele idei generice: a. stabileşte un ţel în cadrul unui proces decizional deschis, care
să se adreseze tuturor celor implicaţi; b. analizează toate modalităţile de a realiza ceea ce
îţi propui şi alege varianta care va conduce la cele mai puţine efecte nedorite; c. dacă nu
eşti sigur de calea pe care vrei să o urmezi, asigură-te că o alegi pe aceea care creează
cele mai mici probleme mediului, sănătăţii publice, comunităţii în general; d. monitorizează
rezultatele şi asigură-te că iei măsuri rapide de remediere, în cazul în care ar apărea o
60
problemă şi e. consultă-te în permanenţă cu cei asupra cărora vor avea un efect măsurile
pe care le-ai stabilit.
Totuşi, nu aplicarea greşită a teoriei a fost cea care a provocat epidemia de holeră.
În fnal, reprezentanţi ofciali din Peru au afrmat că au decis să aplice clorinarea
intermitent şi nu continuu din motive economice (preţ prea mare pentru clorinarea
continuă) şi nu au fost infuenţaţi de „teoria precauţiei”; nu au luat în calcul riscul apariţiei
cancerului.
Investigaţia epidemiologică realizată împreună cu colegii de la CDC a demonstrat că
epidemia de holeră a avut o cauzalitate multiplă, factorii cei mai importanţi find
reprezentaţi de: a. clorinarea intermitentă a apei; b. diferite branşamente ilegale sau
amatoristic făcute la linia de aprovizionare cu apă a oraşului; c. conectarea instalaţiilor
ilegale de irigaţie la liniile de aprovizionare cu apă potabilă; d. perioade lungi în care apa a
avut o presiune scăzută sau nu a existat presiune deloc, situaţii în care colonizarea şi
multiplicarea bacteriană este favorizată; e. depozitarea apei potabile în butoaie, în condiţii
neigienice sau „la limită” şi f. lipsa unor canalizări construite corespunzător, care au permis
refularea apei din zonele poluate în reţeaua de apă potabilă etc.
Cu toate că la baza acestei epidemii au stat mai mulţi factori, cel mai important dintre
aceştia a fost lipsa clorinării (antiseptizării) corespunzătoare a apei potabile.
Datele reale cu privire la această epidemie sunt prezentate succint la punctul
44. 8. 2.
4. 3. 2. Epidemia de holeră din Dhaka - bacteriofagii
Holera se transmite cel mai frecvent prin consumul de apă contaminată cu tulpini
de Vibrio cholerae, în special în zonele cu educaţie sanitară precară. Datele epidemiologice
şi de mediu obţinute în urma unei izbucnirii epidemice („outbreak”) de holeră în
Bangladesh, au sugerat rolul bacteriofagului litic specifc pentru V. cholerae, care ar putea
limita gradul de severitate al epidemiei prin efectul de distrugere a bacteriilor prezente în
sursele de apă contaminată, sau chiar şi în cazul unor persoane infectate.
Au fost emise două ipoteze privind rolul potenţial al bacteriofagilor specifci: a. în cadrul
relaţiei bacterie-bacteriofag, bacteriofagii lizează un număr mare de bacterii, ulterior
densitatea bacteriofagilor scade şi la un moment dat bacteriile se pot multiplica
exponenţial şi densitatea bacteriană atinge nivelul la care pot determina o izbucnire
epidemică (severitatea izbucnirii epidemice va f cu atât mai mare cu cât densitatea
bacteriofagilor rămaşi în sursele de apă contaminate este mai mică); b. dacă izbucnirea
epidemică este datorată multiplicării bacteriene, necorelat cu diminuarea densităţii fagice,
introducerea bacteriofagilor în sursele de apă ar putea reduce amploarea izbucnirii
epidemice şi ar putea duce chiar şi la declinul acesteia.
În ambele situaţii amploarea efectului bacteriofagilor depinde de balanţa care se
stabileşte între rata de multiplicare a vibrionilor şi de rata de distrugere a fagilor.
În timpul izbucnirii epidemice din Dhaka, Bangladesh, au fost cuantifcate: a. incidenţa
infecţiilor, b. densităţile tulpinilor deV. cholerae implicate (serotipul O1, rezistent la
streptomicină) şi c. concentraţiile bacteriofagilor litici specifci pentru această tulpină (JSF4),
atât în scaunul pacienţilor spitalizaţi cât şi în rezervoarele de apă potabilă.
61
Studiul a fost posibil pentru că implica o singură tulpină, a cărei densitate a putut f uşor
monitorizată prin susceptibilitatea/rezistenţa la streptomicină.
Pe baza observaţiilor în dinamică, studiul a sugerat că infecţiile sunt cauzate de
consumul de apă dintr-un rezervor comun, în care bacteria şi fagul se reproduc şi
interacţionează independent de populaţia umană. Iniţial, schimbările temporare climaterice
au creat condiţiile unei descreşteri a concentraţiei fagice, cu o multiplicare exponenţială a
vibrionilor în sursele de apă. Populaţia a început să se infecteze consumând apa respectivă,
s-a creat un cerc vicios de multiplicare bacteriană în rezervor prin recontaminarea
rezervorului datorită igienei precare şi astfel epidemia s-a amplifcat. După un timp
producţia de fagi a început să crească, datorită concentraţiei mari de vibrioni din rezervor şi
în persoanele infectate. Amplifcarea densităţii fagice a dus la un declin al densităţii
bacteriene şi respectiv la scăderea numărului de persoane infectate, până la dispariţia
cazurilor.
Studiul (a fost realizat şi un model matematic foarte interesant) a sugerat şi
posibilitatea ca fagul să se dezvolte iniţial în gazdele infectate cu V. cholerae, şi abia apoi
să ajungă în rezervor (datorită lipsei de igienă). Această amplifcare (numerică şi
funcţională) a bacteriofagilor ar putea reprezenta o importantă componentă în prevenirea /
controlul epidemiilor de holeră.
5. Genetica bacteriană
5. 1. Suportul eredităţii
Genetica bacteriană studiază ereditatea şi variabilitatea la bacterii.
Suportul material al eredităţii este reprezentat de ADN (acidul dezoxiribonucleic).
Molecula de ADN conţine codifcată informaţia ereditară, care se exprimă prin sinteza unor
proteine şi se transmite prin replicare şi diviziune la descendenţi. Gena reprezintă unitatea
funcţională a eredităţii iar noţiunea de genă este cunoscută încă din anul 1909.
Dacă nu au loc modifcări genetice, toţi descendenţii unei bacterii vor f identici cu
bacteria „mamă” şi identici între ei. O celulă bacteriană inoculată pe un mediu de cultură
(având la dispoziţie nutrienţii necesari) va produce prin multiplicare în condiţii prielnice (de
pH, temperatură, umiditate etc.) o colonie bacteriană, o clonă.
Materialul genetic al unei celule bacteriene poate f modifcat fe prin incorporarea unui
fragment de material genetic exogen (prin procesul de recombinare genetică), fe prin
apariția spontană sau indusă a unei mutaţii care poate consta în adăugarea, pierderea,
substituirea sau inversarea ordinii unor baze în secvenţa ADN-ului.
Structura acidului dezoxiribonucleic
ADN-ul este un macropolimer de dezoxirbonucleotide.
Unitatea structurală este formată dintr-o bază azotată purinică (adenina, A; guanina, G)
sau pirimidinică (timina, T; citozina, C), o pentoză (dezoxiriboza) şi acid fosforic.
62
Legături fosfodiester unesc carbonul 5 al unei molecule de dezoxiriboză cu carbonul 3 al
moleculei adiacente, formând o catenă lungă polinucleotidică. Prin analiza compoziţiei în
baze azotate a ADNului (provenit din surse diferite) s-a demonstrat că există o anumită
compoziţie care diferă la diversele specii.
Compoziţia de nucleotide a ADN-ului este surprinzător de variabilă. Suma procentuală a
citozinei şi guaninei variază la bacterii de la 22% până la 74%, în timp ce la organismele
eucariote intervalul este ceva mai restrâns (28 - 58%). La om variază între 39-40% în
funcţie de tipul de ţesut (timus 39%; fcat 39,4%). Acest fapt se explică prin evoluţia în
decursul a mai multor mii de ani a procariotelor comparativ cu a eucariotelor în general şi a
omului în particular.
Comparaţiile conţinutului de C+G ale diferitelor organisme și microorganisme au fost
folosite drept fundament în vederea stabilirii relaţionării/legăturii genetice. Timina find
susceptibilă la alterări fotochimice (lumină UV), bacteriile cu un conţinut bogat de C+G este
posibil să f evoluat în medii supuse unei lumini solare foarte puternice sau unor
temperaturi înalte, iar cele cu conţinut redus de C+G s-ar f dezvoltat în locuri mai
protejate.
Așadar, compoziţia în baze azotate, numită şi procentul de C+G, este diferită în
funcţie de specie, dar se păstrează constantă în cadrul unei anumite specii.
Procentul de C+G se calculează după formula: (C+G)/ (C+G+A+T). De exemplu acest
raport diferă la diferitele specii bacteriene, sper exemplu este 26,8% la Clostridium
perfringens, 40% la Streptococcus pneumoniae, 40,5% la Proteus vulgaris,51,7%
la Escherichia coli, 53% la Proteus morgani şi67% la Pseudomonas aeruginosa. Aşa cum a
fost precizat de către diverși autori, compoziţia de baze azotate este un index
taxonomic. (1)
La celulele procariote ADN-ul este inelar, împachetat în nucleoidul din citoplasmă. La
bacteria intestinală E. coli cele 4,7 milioane de perechi de baze alcătuiesc o macromoleculă
de 1,4 milimetri lungime, dar numai 2 nanometri lăţime. Aceasta conţine 4.400 de gene
deja secvenţiate. În ciuda lungimii sale, de peste o mie de ori diametrul celular, ADN-ul este
extrem de bine înfăşurat în nucleoid, în aproximativ jumătate din diametrul celular.
ADN-ul apare ca o macromoleculă formată din două catene polinucleotidice antiparalele
şi complementare răsucite în dublu helix. Cele două catene sunt unite prin punţi de
hidrogen formate între bazele azotate opuse (A=T şi G≡C). Modelul structural al ADN-ului a
fost propus de către Watson şi Crick în anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este
cea mai importantă proprietate a acizilor nucleici şi condiţionează toate proprietăţile ADN-
ului, mai ales cea de autoreplicare şi cea de transfer al informaţiei genetice.
Rolul genetic al ADN-ului a fost dovedit prin experienţe succesive, iniţial prin cercetările
lui W. Griffth (1928) privind fenomenul de transformare bacteriană, ulterior prin experienţe
care au confrmat rezultatele obţinute de Griffth, dar abia în 1944 Avery, MacLeod şi Mc
Carthy demonstrează faptul că ADN-ul este substratul chimic al eredităţii şi reprezintă
materialul genetic al oricărei celule (funcţie îndeplinită așa cum știm astăzi de ARN, la
ribovirusuri).
63
La temperatura camerei ADN-ul este o structură stabilă în condiţii fziologice normale,
datorită legăturilor intercatenare (2 între A şi T şi 3 între C şi G). Dacă temperatura
depăşeşte 65CC, stabilitatea punţilor de hidrogen începe să cedeze, dublul helix începe să
se desfacă şi rezultă două catene complementare (proces numit denaturare termică).
Denaturarea devine completă la temperaturi care depăşesc valoarea de 90CC.
Renaturarea („reannealing”) reprezintă refacerea structurii bicatenare a ADN-ului, iar
prin acest proces se poate stabili relaţia flogenetică între două specii (în funcţie
de procentul de renaturare). De exemplu dacă se utilizează ADN denaturat provenit de la E.
coli şi ADN denaturat provenit de la Salmonella spp., fecare marcat cu acelaşi izotop (ex.
C14), fracţiunea de ADN marcată şi evaluată prin diferite tehnici va f fracţiunea din ADN
care este complementară pentru cele două specii (aceste experienţe au stat la baza
brevetării tehnicilor de hibridare moleculară). Renaturarea este un proces mai lent decât
denaturarea.
Denaturarea şi renaturarea acizilor nucleici sunt procese fzice importante, folosite fe în
tehnologia ADN-ului recombinant, fe în studierea relaţiilor flogenetice între diferite specii.
Cu cât speciile sunt mai înrudite, cu atât secvenţele de baze azotate au un mai mare grad
de similitudine (lanţurile lor monocatenare renaturează mai rapid).
65
ADN-ului plasmidic). Spre exemplu, o variantă poate f reprezentată de cultivarea în mediu
cu timidină tritiată, astfel încât rezultă marcarea radioactivă a ADN-ului cu tritiu. ADN-ul
extras din fecare microorganism este tratat pentru a obţine fragmente monocatenare.
ADN-ul dublu catenar se reface, dacă fragmentele de ADN (ţintă) ale bacteriei testate au
secvenţe nucleotidice complementare cu fragmentele ADN (sondă moleculară) de referinţă.
Cu cât gradul de complementaritate dintre sonda moleculară şi ţintă este mai mare, cu atât
structura hibridă formată va f mai stabilă şi mai greu de disociat. Actualmente sondele
moleculare sunt sintetizate chimic sau enzimatic.
Utilitatea hibridizării acizilor nucleici
Această tehnică se utilizează în taxonomia microbiană şi stă la baza funcţionării
sondelor nucleotidice, care depistează rapid şi cu foarte mare sensibilitate microorganisme
sau numai unii determinanţi genetici ai acestora. Un alt aspect important este reprezentat
de specifcitatea sondei utilizate. Se apreciază, că pentru a elimina riscul unei hibridizări
întâmplătoare, sonda nucleotidică ar trebui să aibă cel puţin 20 nucleotide.
5. 3. Amplifcarea genetică
conceptul amplifcării cantităţii de acizi nucleici a fost introdus în 1983 de către Mullis,
dar anul 1955, odată cu descoperirea ADN polimerazei I, a reprezentat un moment crucial.
Folosind ADN-polimeraza şi două secvenţe scurte de ADN (oligonucleotide, primeri), s-a pus
la punct un test repetitiv de sintetizare a ADN-ului care a fost numit „Reacţia de
polimerizare în lanţ” (Polymerase Chain Reaction, PCR).
ADN-polimeraza este capabilă să conducă la sinteza unui al doilea lanţ de ADN,
întotdeauna orientat 5’-3’, folosind ca substrat patru nucleotide trifosfat, un lanţ de ADN ca
„matrice” (model) şi un fragment scurt de ADN complementar utilizat drept „primer”
(amorsă). Pentru un lanţ polinucleotidic, vom utiliza de fapt doi primeri, care sunt
complementari pentru două secvenţe specifce şi diferite ale ADN-ului ţintă.
Iniţierea sintezei de ADN va putea avea loc numai după ce ADN-ul dublu catenar este
denaturat (termic). Urmează o etapă de răcire, permiţând astfel ataşarea primerilor (care
sunt furnizaţi în exces) de fragmentele de ADN complementar. Sinteza de ADN mediată de
ADN-polimerază va produce două molecule dublu catenare. Dacă procesul se repetă, vor
rezulta patru molecule de ADN. ADN-ul se multiplică exponenţial (dublându-se de fecare
dată) ori de câte ori se repetă reacţia. Teoretic, PCR poate amplifca un fragment scurt de
ADN pornind de la o singură moleculă la 1.000 de copii, dacă procesul se repetă de 10 ori şi
la circa un milion de copii, dacă procesul se repetă de 20 de ori. Acest proces poate avea
loc automat într-un aparat numit termociclor; aparatul repetă ciclul constând în
denaturarea prin căldură (la 94-96CC), ataşarea primerilor (la 40-60CC) şi sinteza ADN-ului
(la 65-75CC), folosind ADN-polimeraza termostabilă (Taq-polimeraza) izolată de la o
bacterie, care trăieşte în izvoarele termale din Yellowstone National Park, Thermus
aquaticus.
Aplicaţiile tehnicii de amplifcare genetică
66
PCR a început să fe aplicată în numeroase domenii ale cercetării medicale
fundamentale.
Succesul depinde de puritatea sursei de ADN, precum şi de metoda de extragere şi de
recuperare a ADN-ului. Datorită sensibilităţii extrem de mari a procesului, contaminarea
datorată manipulării produselor de amplifcare PCR obţinute anterior în acelaşi laborator
poate reprezenta o problemă deosebit de serioasă. Contaminarea se poate realiza fe între
probe, în timpul desfăşurării protocolului de lucru, fe datorită diferitelor manipulări. Prima
variantă este mai uşor de evitat, astfel încât sursa majoră de contaminare în laboratorul de
biologie moleculară rămâne eventuala contaminare a reactivilor. Verifcarea acestei posibile
erori este obligatorie pentru orice reacţie PCR, printr-o reacţie de control (control negativ)
la care nu se adaugă ADN. Această problemă a contaminării nu este superpozabilă cu cea a
rezultatelor fals-pozitive. O contaminare între probe este mult mai difcil de identifcat.
Principalele măsuri de precauţie ar f reprezentate de: utilizarea unor camere de lucru
separate pentru manipularea produselor care conţin ADN şi respectiv pentru prepararea
celorlalţi reactivi, folosirea micropipetelor (două seturi de micropipete, pentru produse cu şi
fără ADN), utilizarea conurilor cu fltru, lucrul într-o nişă special amenajată şi dotată cu hotă
cu fux laminar de aer.
Recent s-a demonstrat faptul că lumina ultravioletă are capacitatea de a inactiva ADN-
ul dublu catenar contaminant.
Alte modalităţi de a elimina (diminua) riscurile contaminării sunt reprezentate de:
includerea unei nucleotide modifcate în PCR (înlocuirea deoxiuridinei-P cu deoxitimidină-
3P) şi respectiv folosirea enzimelor de restricţie pentru îndepărtarea ADN-ului contaminat
din RT-PCR (transcriere inversă).
Utilizarea PCR în diagnosticul bolilor infecţioase
PCR poate f utilă în diagnosticul bolilor virale, bacteriene, fungice sau parazitare.
În infecţia cu HIV, PCR şi-a dovedit utilitatea atât în diagnostic (secvenţele HIV-1 sunt
detectabile în 100% din cazuri atunci când virusul este cultivabil şi în 64% din cazuri în
situaţia unor culturi negative), cât şi în stabilirea prognosticului. În cazul infecţiilor cu
citomegalovirus (CMV), PCR poate detecta ADN viral în sânge cu 7-10 zile mai devreme
decât sunt identifcate antigenemia sau viremia. În mod asemănător, PCR este utilă în
identifcarea altor agenţi etiologici (în contextul general epidemiologic, clinic şi paraclinic)
precum virusurile hepatitei B şi C, virusurilor papilloma, herpes virusurilor sau a unor
enterovirusuri.
Diagnosticul infecţiilor bacteriene poate benefcia de asemenea de tehnicile moleculare
prin amplifcare genică. Actualmente sunt puse la punct protocoalele de lucru utile
identifcării agenţilor etiologici ai tusei convulsive (Bordetella pertussis), legionellozei
(Legionella pneumophila), pneumoniei atipice (Mycoplasma pneumoniae), tuberculozei
(Mycobacterium tuberculosis), proceselor infamatorii pelviene (Chlamydia trachomatis),
gonoreei (Neisseria gonorrhoeae), siflisului (Treponema pallidum), meningitei
(Haemophilus infuenzae, Neisseria meningitidis), gastritelor şi ulcerului (Helicobacter
pylori), febrei tifoide (Salmonella typhi), dizenteriei bacteriene (Shigella dysenteriae),
septicemiei cu E. coli (enterotoxigen), bolii Lyme (Borrelia burgdorferi), leprei
67
(Mycobacterium leprae) etc. Dacă în cazul majorităţii bolilor enumerate există alternative
bacteriologice sau imunologice clasice decisive, atunci când sunt implicate
microorganismele aparţinând genului mycobacterium (Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium leprae) se ridică anumite probleme. În tuberculoză, agentul etiologic se
izolează relativ difcil din produsele patologice, se multiplică lent, coloniile vizibile apărând
pe mediile de cultură după 2-8 săptămâni, iar testele necesare identifcării fenotipice
clasice necesită 2-6 săptămâni suplimentare şi nu au relevanţă în 100% din cazuri. Pe de
altă parte,Mycobacterium leprae nu se multiplică pe nici un tip de mediu de cultură. Cu alte
cuvinte, aplicarea unor metode sensibile şi specifce este foarte necesară.
Sunt puse la punct protocoalele de lucru PCR utile în scopul diagnosticării infecţiilor
grave produse de Candida albicans, pneumoniei la pacienţi imunodeprimaţi (Pneumocystis
carinii), meningitei cu Cryptococcus neoformans sau al unor infecţii cuCoccidioides
immitis (ex. la persoane infectate cu HIV), pentru a enumera câteva din aplicaţiile biologiei
moleculare în domeniul afecţiunilor produse de fungi.
În domeniul parazitologiei, exemplele cele mai bine cunoscute sunt legate de
diagnosticul dizenteriei amoebiene (Entamoeba histolytica), altor diarei de origine
parazitară (de exemplu, cele produse de Giardia lamblia), malariei (Plasmodium falciparum)
sau diagnosticul toxoplasmozei (Toxoplasma gondii).
Actualmente s-au pus la punct şi alte metode de amplifcare genetică utile în
diagnosticul sau în identifcarea agenţilor etiologici ai maladiilor transmisibile. În mod
suplimentar dorim să menţionăm faptul că dacă iniţial tehnicile de bază ale biologiei
moleculare (hibridizarea moleculară, utilizarea sondelor nucleotidice marcate radioactiv sau
neradioactiv, amplifcarea genică) erau utilizate individual, majoritatea protocoalelor de
lucru actuale cuprind combinaţii de tehnici, din ce în ce mai complexe şi mai subtile. Pe de
o parte, există şi o întregă serie de variante tehnice ale reacţiei de amplifcare genică, de
ex. Invers-PCR (pentru amplifcarea unei regiuni la care nu este cunoscută secvenţa, dar
zonele învecinate au secvenţe cunoscute); LCR (ligase chain reaction) în care este necesar
să cunoaştem integral secvenţa ADN-ului ţintă; RT-PCR (PCR înainte de care are loc o
revers-transcriere, pornind de ex. de la ARNm şi obţinând ADNc); Nested PCR (în care are
loc o amplifcare dublă a acidului nucleic folosind 2 perechi de primeri diferiţi) etc. Pe de
altă parte, tehnica PCR este utilizată din ce în ce mai frecvent ca o completare esenţială a
unei alte tehnici (de exemplu RFLP, restriction fragment length polymorphism; SSCP-PCR;
DRE-PCR, double repetitive element PCR; DRV-PCR, direct variable repeat-PCR; UP-PCR,
single universal primer-PCR; spoligotyping etc).
5. 4. Organizarea genomului
bacterian
Plasmidele
Genomul bacterian este alcătuit din două categorii de determinanţi genetici:
68
1. genele esenţiale, localizate în structura cromozomului bacterian şi
2. genele accesorii extracromozomale prezente în structura:
- plasmidelor şi
- elementelor genetice transpozabile.
Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomiale, capabile de replicare fzic
independentă de cromozom (replicon), dar depinzând de factori codifcaţi de nucleul
bacterian. Conţin informaţie genetică neesenţială pentru viaţa celulei bacteriene. Sunt
transmise stabil de-a lungul generaţiilor. Dimensiunea plasmidelor variază între 1kb şi circa
200 kb. Majoritatea sunt alcătuite din molecule de ADN circular, dar există şi plasmide
liniare (ex. la Borrelia burgdorferi). Unele plasmide sunt ADN dublu catenar, dar există şi
plasmide de ADN monocatenar (se consideră că plasmidele de ADN monocatenar
reprezintă de fapt o situaţie intermediară în cursul procesului de replicare; au fost detectate
de ex. la Staphylococcus aureus).
Unele plasmide (numite şi epizomi) pot exista alternativ în stare autonomă (libere în
citoplasmă) sau integrate în cromozomul celulei gazdă (de exemplu factorul F,
bacteriofagul temperat etc). Celelalte plasmide persistă indefnit numai în stare autonomă
(de exemplu plasmida R, Col, F etc).
Clasifcarea plasmidelor
În raport cu caracterele exprimate fenotipic, plasmidele se pot clasifca în:
1. plasmide care codifcă rezistenţa la agenţi antibacterieni:
- factorii R (primul factor R a fost izolat de la o tulpină de Shigella dysenteriae);
- plasmidele de rezistenţă la UV etc.
2. plasmide care codifcă sinteza unor agenţi antimicrobieni:
- factorii Col (conferind capacitatea de producere de colicine cu activitate antibiotică)
etc.
3. plasmide de patogenitate care codifcă sinteza de:
- hemolizine;
- factori de colonizare;
- enterotoxine sau alte exotoxine etc.
4. plasmide care codifcă enzime ale unor căi metabolice particulare:
- în anumite condiţii, unele bacterii pot utiliza ca sursă de C diferite substanţe cu
potenţial toxic, precum octanul sau toluenul, iar plasmidele care permit supravieţuirea şi
dezvoltarea în aceste condiţii se numesc plasmide degradative;
5. plasmide care permit transferul genelor cromozomiale de la o celulă care deţine
respectivul plasmid (F) la alta, putând f transmis inclusiv plasmidul (factorul) F;
6. plasmide criptice, pentru care nu se cunosc caracterele fenotipice exprimate.
Plasmidele R
Plasmidele R (de rezistenţă la antibiotice) conferă celulei purtătoare rezistenţa la unul
sau la mai multe antibiotice. Plasmidele R au o structură genetică complexă, find alcătuite
din:
- gene care asigură proprietatea de rezistenţă la antibiotice;
- gene care formează „factorul de transfer al rezistenţei” (RTF).
69
Asigură capacitatea de replicare autonomă şi de transfer prin conjugare (cele două
tipuri de elemente pot exista independent sau se pot asocia).
Transferul plasmidelor R se poate face prin conjugare bacteriană sau prin transducţia
mediată de bacteriofagi.
Plasmidele „Col”
Plasmidele „Col” codifcă proprietatea unor bacterii de a elabora substanţe antibiotice
de tip special, numite bacteriocine (colicine, pesticine, vibriocine, piocine etc).
Plasmidele „Col” sunt transferabile de la tulpinile Col + la tulpini Col- prin transformare
genetică, transducţie fagică sau prin conjugare.
Bacteriocinele sunt bactericide, au un spectru de activitate limitat (faţă de specia
omologă), iar biosinteza lor nu are efect letal pentru specia producătoare.
Factorul F (factorul de „sex”, factorul de „fertilitate”)
Factorul F controlează capacitatea unor bacterii de a acţiona ca donoare de material
genetic în procesul de conjugare. Factorul F codifcă structurile (de exemplu pilul „F”) şi
enzimele necesare transferului de ADN.
În funcţie de prezenţa plasmidelor F, de raportul lor cu cromozomul bacterian şi de
modul în care facilitează transferul de material genetic, bacteriile se pot grupa în patru
categorii distincte: bacterii F-; bacterii F+; bacterii Hfr; bacterii F’.
Bacteriile F-
Bacteriile F- sunt lipsite de factorul F. Sunt echivalente unor celule „femele” care se
comportă ca receptoare de material genetic.
Bacteriile F+
Bacteriile F+ deţin factorul F autonom în citoplasmă. Sunt echivalente unor celule
„masculine”, donoare de material genetic, capabile să transmită factorul F.
Bacteriile Hfr (High frequency of recombination)
Bacteriile Hfr (cu mare frecvenţă de recombinare) deţin factorul F integrat în
cromozomul bacterian. Se comportă ca donoare de material genetic, au o mare frecvenţă
de conjugare şi recombinare. De obicei prezenţa factorului F integrat determină transferul
unui număr variabil de gene cromozomale şi mai rar, chiar transferul factorului F.
Bacteriile F’
Bacteriile F’ deţin o structură plasmidică de tip special (factor de fertilitate
recombinant) care a fost anterior integrată în structura unui cromozom şi s-a desprins din
acesta, încorporând în structura sa unele gene cromozomale. Aceste bacterii au caracter de
„mascul” şi se comportă ca donoare de material genetic (factorul F’).
Elemente genetice transpozabile
O anumită secvenţă specifcă de ADN constituie un element genetic transpozabil dacă
îşi menţine integritatea fzică, structurală şi genetică, funcţională în cursul translocaţiei de
la o poziţie la alta în acelaşi genom, replicon (intramolecular) sau în genomuri diferite
(intermolecular). De obicei fenomenul de transpoziţie poate avea loc la nivelul oricărui
replicon, la „întâmplare”, dar există şi situaţii în care un transpozon „are” anumite zone
specifce unde se va insera (zone „calde”).
70
Pe baza complexităţii lor, elementele care îndeplinesc această condiţie se pot grupa în
trei categorii:
- secvenţe de inserţie (IS);
- transpozoni (Tn);
- bacteriofagi.
Secvenţele de inserţie (IS)
Secvenţele de inserţie nu conţin nici o genă şi nu au nici o altă funcţie (cunoscută) în
afară de cea de inserţie. Sunt cele mai simple elemente transpozabile. După inserţia lor pot
apărea modifcări în expresia unor gene sau modifcări în rata incidenţei deleţiilor în
regiunile adiacente situsului lor de inserţie.
Există anumite secvenţe de inserţie care au intrat în istoria practică medicală datorită
importanţei în diagnosticul anumitor afecţiuni. De ex. IS6110 se întâlneşte în una sau mai
multe copii în genomul Mycobacterium tuberculosis şi poate f pus în evidenţă prin reacţia
PCR pornind fe de la cultură, fe chiar şi de la produsul patologic, permiţând un diagnostic
mai rapid.
Transpozonii (Tn)
Transpozonii diferă de secvenţele de inserţie prin complexitate şi prin faptul că poartă
gene care conferă bacteriilor funcţii noi, detectabile, de exemplu:
- rezistenţa la antibiotice;
- capacitatea de sinteză a unor enzime;
- producerea de enterotoxine;
- sinteza antigenelor bacteriene de suprafaţă (de exemplu K 88 la E. coli);
- sinteza unor factori de colonizare intestinală etc.
Există transpozoni compuşi, care pe lângă funcţia de transpoziţie includ şi o serie de
determinanţi genetici şi transpozoni complecşi. Dintre aceştia din urmă, transpozonul Tn3 a
fost identifcat la o tulpină de E. coli. El codifcă 3 elemente: tnpA- cu activitate de
transpozază, rezolvaza tnpR şi beta-lactamaza (produsul genic notat „bla”) cu activitate
beta-lactamazică.
Bacteriofagii
Spre exemplu bacteriofagul Mu (numele rezultă prin prescurtarea „mutator”, pentru că
a fost identifcat ca factor mutagen la tulpini de E. coli) are un genom de 30kb şi o structură
lineară. După infectarea celulei bacteriene, bacteriofagul Mu se inseră în cromozom la
„întâmplare” şi ulterior în diferite poziţii ale cromozomului bacterian apar copii ale acidului
nucleic Mu. Atunci când structura genetică Mu va părăsi genomul bacterian va prelua o
parte din structura genetică bacteriană (circa 100-150 pb)
5. 5. Mecanismele de variabilitate
bacteriană
Bacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepţiile prezentate anterior), au un
singur cromozom iar pentru remanierea prin recombinare a genomului este necesară
transferarea de material genetic de la o tulpină („donoare”) la tulpina receptor
71
(„acceptoare”). În mod clasic poate avea loc un transfer „pe orizontală” între tulpini care fe
fac parte din aceeaşi specie fe fac parte din specii foarte înrudite, chiar dacă genotipic sunt
diferite. Relativ recent a fost demonstrată posibilitatea unor schimburi genetice între tulpini
din specii diferite (ex. în ecosistemul intestinal). Variabilitatea bacteriană presupune
modifcarea la un moment dat a comportamentului celulei bacteriene sau a descendenţilor
ei şi pot exista în principiu două variante:
- variabilitatea fenotipică şi
- variabilitatea genotipică;
Variaţiile fenotipice reprezintă modifcări morfologice sau fziologice de tip adaptativ,
care nu se transmit ereditar. Genomul nu este afectat.
Variaţiile genotipice reprezintă modifcări defnitive ale materialului genetic
(cromozomial sau extracromozomial) care se transmit descendenţilor.
Mecanismele variaţiei genotipice sunt reprezentate de:
- mutaţie;
- transfer genetic urmat de recombinare genetică.
Mutaţia
Mutaţia reprezintă o modifcare accidentală în secvenţa nucleotidică a unei gene,
ducând la modifcări ale mesajului genetic.
Mutaţiile pot apărea la nivelul materialului genetic prin:
- substituţii;
- inversii;
- inserţii;
- deleţii.
Mutaţia spontană
Mutaţiile care apar în condiţii de mediu obişnuite şi fără intervenţia unui factor decelabil
se numesc mutaţii spontane.
Mutaţia indusă
Mutaţiile care se produc sub acţiunea unor factori fzici (de exemplu raze UV, radiaţii
ionizante etc.) sau chimici (de exemplu agenţii alchilanţi), care acţionează ca agenţi
mutageni, se numesc mutaţii induse.
Rata mutaţiilor induse este semnifcativ mai mare decât rata mutaţiilor spontane.
Mutaţia punctiformă are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui
singur codon.
Mutaţiile extinse reprezintă alterări care depăşesc limitele unui codon, putând afecta
secvenţe mai mari ale uneia sau mai multor gene (mutaţie poligenică).
Mutaţiile regresive (retromutaţii) afectează celule mutante, determinând revenirea
acestora la tipul iniţial, restabilind secvenţa nucleotidică originară.
Mutaţiile supresoare permit exprimarea funcţiei anterioare a genei, deşi o modifcare a
secvenţei bazelor nucleotidice persistă.
Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o
bacterie receptor sunt:
- transformarea;
72
- transferul mediat de bacteriofagi (transducţia);
- conjugarea.
Transformarea
Transformarea este un transfer genetic realizat atunci când bacteria acceptă ADN liber
provenit de la o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie să fe
„competentă” în a accepta ADN-ul de la bacteria donor.
Prima transformare a fost descrisă în 1928 de către Griffth, în experimente referitoare
la virulenţa pneumococilor faţă de şoarecele alb.
Transformarea poate avea loc doar atunci când bacteriile intră în faza staţionară a
ciclului celular. Pătruns în celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate înlocui (prin
recombinare genetică) o secvenţă nucleotidică omologă, bacteria receptoare dobândind un
caracter genetic nou (de exemplu sinteza unei structuri capsulare/capsidice).
Unele bacterii sunt „competente” în mod natural. În cazul bacteriilor care nu sunt
„natural competente”, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesară
tratarea chimică a acestora, de ex. cu ioni de calciu.
Transferul genetic mediat de bacteriofagi se poate realiza prin:
- transducţie;
- conversie lizogenică.
Transducţia reprezintă transferul unui fragment genetic (cromozomial sau
extracromozomial) de la o bacterie la alta prin intermediul unui bacteriofag (de obicei un
fag temperat). Fagul se numeşte transductor. Bacteria receptoare se numeşte
transductant.
Transducţia specializată (restrictivă) este caracteristică fagilor transductori care au
proprietatea de a transfera numai un număr restrâns de gene bacteriene situate în
imediata apropiere a situsului de legare a profagului în cromozomul bacterian.
Transducţia generalizată (nerestrictivă) presupune că teoretic, oricare din genele
cromozomului bacterian, indiferent de poziţia lor în genom, pot f încorporate în mod
accidental în particula virală matură pentru a forma un fag transductor, care le poate
transmite unor bacterii receptoare. Transducţia generalizată poate f realizată de un mare
număr de fagi neintegraţi în cromozomul bacterian atunci când aceştia intră în ciclul litic.
Conversia lizogenică reprezintă apariţia unui caracter nou la bacteriile care găzduiesc
un profag, de exemplu producerea toxinei difterice este realizată numai de către C.
diphtheriae purtător al fagului temperat (profagul β care deţine gena tox) iar producerea
toxinei scarlatinoase este posibilă numai în cazul în care Streptococcus pyogenes de grup A
este lizogenizat. Există şi fagi care sunt integraţi în regiuni care codifcă un anumit produs
din genomul bacterian (ex. fagul P4 de la E. coli se integrează într-o genă care codifcă
leucina).
Conjugarea bacteriană reprezintă un proces de transfer de material genetic
(cromozomial sau extracromozomial) realizat prin intermediul unei legături intercelulare
directe. Este condiţionată de prezenţa factorului F în celula donoare.
Receptorii specifci
73
Pentru realizarea legăturii intercelulare este necesară existenţa unor „receptori” de
suprafaţă atât la celula donoare, cât şi la celula receptoare. Aceştia vor permite
„recunoaşterea reciprocă”.
Fiziologia conjugării bacteriene
După un număr de alipiri întâmplătoare, bacteriile F + formează cu bacteriile F- „perechi
de recombinare” şi între celulele alăturate se formează un canal de conjugare. Prin canalul
de conjugare se realizează transferul unidirecţional al materialului genetic. Fragmentul
transferat poate f apoi integrat parţial sau total în genomul celulei receptoare, ducând la
apariţia unor proprietăţi noi ale acesteia, manifeste sau nu.
5. 6. Povestire adevărată
„Folosirea cunoştinţelor din domeniul geneticii, în munca de detectiv”
Îmbinarea examinării foarte detaliate a secvenţelor genomice microbiene cu o
cunoaştere aprofundată a evoluţiei bacteriilor poate f utilă atât în obţinerea unor
diagnostice de mare precizie, cât şi în aplicarea unor teste de diagnostic relevante în
medicina legală.
Spre exemplu, dorim să amintim situaţia creată în 2001 în urma atentatelor teroriste
din SUA, când o serie de instituţii, dar şi persoane particulare, au primit plicuri având un
praf alb sau maroniu, care în unele cazuri (au existat şi „alarme false”) s-a dovedit a
conţine spori de Bacillus anthracis. Câteva elemente concrete cu privire la situaţia din acea
perioadă vor f prezentate în capitolul dedicat genului Bacillus.
După cartograferea genomului de B. anthracis s-au evidenţiat ca find posibile circa
3.500 de mutaţii nucleotidice unice. În funcţie de acestea se ştie actualmente, că tulpinile
cunoscute pot f împărţite în 8 grupe, fecare grup find la rândul său divizat în mai multe
subgrupe. Toate aceste grupe studiate sunt foarte stabile privind o posibilă variaţie
genetică (nu există „cross-link”-uri între grupe), ceea ce face ca Bacillus anthracis să
reprezinte un „candidat ideal” pentru studii de biologie moleculară folosite în scopul punerii
la punct a unor teste, care să identifce cu mare fneţe o anumită tulpină, inclusiv „originea”
acesteia.
Prin metode ale biologiei moleculare s-a demonstrat de exemplu că tulpina de B.
anthracis folosită în atacurile teroriste făcea parte din grupul Ames. Această încadrare a
putut să fe stabilită prin evidenţierea a 6 mutaţii specifce grupului Ames (4 la nivel
cromozomial, una la nivelul plasmidului pX01 şi una la nivelul plasmidului pX02).
Aşadar, iată cum, pentru o bacterie stabilă din punctul de vedere al unei posibile variaţii
genetice, se poate realiza o adevărată „muncă de detectiv” şi prin metode specifce de
laborator se poate stabili originea şi apartenenţa sa, pornind de la caracteristicile genetice.
6. Antibiotice şi Chimioterapice
74
6. 1. Defniţie
Antibioticele şi chimioterapicele antimicrobiene reprezintă un grup de substanţe
medicamentoase capabile să distrugă sau să inhibe multiplicarea unor
microorganisme implicate etiologic în bolile infecţioase. Au o acţiune selectivă asupra
celulelor microorganismelor, exercitând acţiuni minime asupra celulelor organismului
gazdă. Aceste substanţe pot f:
- antibacteriene,
- antivirale,
- antifungice,
- antiparazitare.
În mod clasic, în această grupă de medicamente au fost incluse şi antineoplazicele (ex.
dactinomycina, doxorubicina, bleomycina). Există și antibiotice folosite ca:
· inhibitori enzimatici (ex. Lipstatin, sintetizat de Streptomyces toxytricini),
· imunosupresori (ex. Ciclosporina, sintetizată de Tolypocladium infatum),
· hipocolesterolemiante (ex. Lovastatin, sintetizat de Aspergillus terreus),
· insecticide,
· ierbicide etc (1).
6. 2. Date cu privire la
descoperirea antibioticelor
(Figura nr. 1)
Antibioticele au revoluţionat lumea în multe aspecte. Nenumărate vieţi au fost salvate.
Din nefericire însă, există şi aspecte mai puţin plăcute legate în special de apariția și
dezvoltarea rezistenţei la antibiotice și chimioterapice precum și de înregistrarea diferitelor
reacții adverse. O bază de date recent întocmită arată prezenţa a mai mult de 20.000 de
gene potenţial rezistente (2).
Încă din 1820 chinina a fost folosită drept chimioterapic în tratamentul malariei,
antimalaricele de sinteză find introduse în practică o sută de ani mai târziu, în 1926. În
acelaşi an (1926) Fleming testează penicilina pentru efectul ei antimicrobian „in vitro”,
pentru ca în 1946 să se demonstreze în practică utilitatea acestui antibiotic (cu ajutorul
penicilinei este vindecat un pacient cu septicemie staflococică). În 1935 sunt descoperite
primele molecule de sulfonamide (Domagk) iar rezistenţa la aceste molecule a fost
raportată spre sfârşitul anilor 1930. Primul medicament anti-tuberculos este descoperit în
anul 1944 (streptomicina, Scharty, Bugie, Waksman). În 1949 se pune în evidenţă în
structura penicilinei nucleul betalactam, iar din acest moment toate substanţele
antibiotice cu o astfel de particularitate structurală au primit numele de betalactamine. În
1950 sunt descrise betalactamazele, eveniment urmat începând cu 1977 de obţinerea
75
inhibitorilor de betalactamaze (acid clavulanic, sulbactam, tazobactam). Din 1960 se
folosesc deja penicilinele semisintetice antistaflococice, anul 1976 aducând cu sine
utilizarea în clinică a ureidopenicilinelor cu spectru ultralarg.
Sulfamidele (sulfonamidele) au fost medicamentele antimicrobiene utilizate aproape
exclusiv în perioada 1946-1950 (numită din acest motiv „era sulfamidelor”). Anul 1948
impune în tratamentul antiinfecţios clasa tetraciclinelor, începînd cu clortetraciclina şi
continuând cu oxitetraciclina, tetraciclina, rolitetraciclina, minotetraciclina, doxitetraciclina.
Primul medicament din clasa macrolidelor, eritromicina, este obţinut în
1952. Cotrimoxazolul este introdus pe scară largă în clinică începând cu anul 1969.
În 1979 este pus în evidenţă nucleul carbapenem, descoperire care duce la apariţia
unei noi clase de substanţe antibiotice: tienamicinele. Printre reprezentanţii acestei clase se
numără tienamicina, imipenemul, care este asociat în terapie cu cilastatina. Ulterior s-au
realizat structuri chimice rezistente la acţiunea dihidropeptidazei 1 renale, respectiv
biapenemul şi meropenemul.
În perioada 1979-1982 sunt descoperite fuorochinolonele (norfoxacina, enoxacina,
ofoxacina, pefoxacina, ciprofoxacina etc) iar în 1982 sunt produşi monobactamii, cu
activitate pe germenii Gram-negativi (ex. aztreonam).
La începutul secolului 21 se utilizau la nivel mondial peste 250 de molecule de
antibiotice şi chimioterapice antiinfecţioase diferite. Având în vedere utilizarea mai puţin
raţională a acestor medicamente, Organizaţia Mondială a Sănătăţii elaborează periodic o
listă a medicamentelor esenţiale, inclusiv antibiotice şi chimioterapice. În această listă apar
medicamente betalactamice (penicilină, amoxicilină, cloxacilină, piperacilină etc),
medicamente antituberculoase şi antileproase (clofazimină, dapsonă, ethambutol,
izoniazidă, pirazinamidă, rifampicină etc), alte medicamente antiinfecţioase (cloramfenicol,
co-trimoxazol, doxiciclină, eritromicină, gentamicină, metronidazol, spectinomicină,
sulfadiazină etc), medicamente „complementare” (ciprofoxacină, clindamicină, acid
nalidixic etc) dar nu apar pe lista principală nici cefalosporinele şi nici chinolonele ceea ce
demonstrează cel puţin indirect recomandarea de reducere a utilizării în exces a
medicamentelor antimicrobiene, aceasă noţiune având o legătură directă cu subiectul
prezentului capitol. În acelaşi sens, este recomandată citirea unui document relativ recent
(„How to improve the use of medicines by consumers”, OMS, 2007), adresat atât
specialiştilor în sănătate cât şi celor care utilizează diferitele medicamente, inclusiv
antibiotice şi chimioterapice. Interesul pentru acest subiect este dovedit şi de faptul că
editarea acelui manual a fost făcută cu asistenţă fnanciară de la Comunitatea Europeană.
6. 3. Clasifcarea antibioticelor şi
chimioterapicelor
Clasifcarea se poate face după:
a) originea lor;
b). efectul bacteriostatic sau bactericid;
c). mecanismul de acţiune;
76
d). spectrul de acţiune şi
e). structura chimică (Tabelul nr. 1).
6. 3. 1. În funcţie de originea lor, agenţii antimicrobieni pot f clasifcaţi în următoarele
categorii:
a). Substanţe cu origine biologică elaborate de anumite microorganisme (antibioticele),
de exemplu penicilina G; bacteriocinele (piocine, colicine etc) au origine biologică, dar nu
pot f utilizate în tratamentul infecţiilor umane;
b). Produşi de semisinteză realizaţi pornind de la un nucleu elaborat de un
microorganism, nucleu care suferă apoi prelucrări chimice (de exemplu meticilina);
c). Produşi de sinteză chimică integrală (chimioterapice antiinfecţioase), de exemplu
acidul nalidixic sau sulfamidele (sulfonamidele).
Deoarece în momentul actual o mare parte a medicamentelor antimicrobiene sunt
produse prin metode chimice, diferenţierea netă dintre antibiotice şi chimioterapice este
mai rar întâlnită în limbajul medical curent, cel mai frecvent toate aceste medicamente
find numite „antibiotice” (totuşi trebuie să cunoaştem că există această diferenţă).
6. 3. 2. în funcţie de efectul lor, medicamentele antimicrobiene pot f bacteriostatice şi
bactericide.
Un antibiotic este bacteriostatic dacă efectul său se limitează la oprirea multiplicării
bacteriene (ex. tetraciclinele, cloramfenicolul, eritromicina, clindamicina, sulfonamidele
etc).
Un antibiotic este bactericid dacă acţiunea sa duce la distrugerea bacteriilor (ex.
penicilinele, cefalosporinele, polimixinele, aminoglicozidele, rifampicina, vancomicina,
streptograminele etc).
Trebuie cunoscute situaţiile patologice în care se poate administra un antibiotic
bacteriostatic, precum şi situaţiile în care este absolut necesară administrarea unui
antibiotic cu efect bactericid (spre exemplu la persoanele care prezintă imunodepresie).
77
d). agenţi antimicrobieni care acţionează prin inhibarea sintezei acizilor nucleici, de
exemplu rifampicina, chinolonele, sulfonamidele, trimetoprimul, pirimetamina, novobiocina
etc.
Antibioticele beta-lactaminice inhibă selectiv sinteza peretelui celular în mod diferit la
bacteriile Gram-pozitive faţă de cele Gram-negative (datorită diferenţelor dintre acestea în
ceea ce priveşte structura peretelui). Pentru realizarea acestei acţiuni este necesară
legarea de receptori celulari numiţi PBPs (penicillin-binding proteins). Beta-lactaminele
inhibă de exemplu reacţia de transpeptidare (de formare a punţilor peptidice) între lanţurile
adiacente de peptidoglican. Rezistenţa la beta-lactamice apare de ex. atunci când
microorganismele produc enzime numite beta-lactamaze, care „desfac” inelul beta-
lactamic. Alte mecanisme de rezistenţă sunt reprezentate de: alterarea porinelor din
membrana externă (Gram-negativi) ceea ce afectează transportul beta-lactaminelor către
sediul de acţiune, mutaţii care afectează structura PBSs şi respectiv afnitatea faţă de beta-
lactamine etc.
Polimixinele (polimixina B, colistinul) acţionează selectiv pe membrana germenilor
Gram-negativi, printr-un mecanism asemănător cu cel al detergenţilor cationici deteriorând
membrana. Se leagă şi de lipo-poli-zaharid şi acţionează asupra membranei externe a
microbilor Gram-negativi. Nu se recomandă (de primă intenţie) pentru administrare pe cale
generală. Rezistenţa la polimixine apare rar.
Aminoglicozidele (streptomicina, kanamicina, gentamicina, spectinomicina, tobramicina
etc) se ataşează iniţial de o proteină receptoare specifcă afată pe subunitatea 30S a
ribozomului bacterian şi blochează ulterior activitatea normală a complexului de iniţiere
necesar formării de peptide. În fnal determină dezintegrarea poliribozomilor şi separarea
lor în ribozomi, incapabili de sinteză proteică. Rezistenţa la aminoglicozide apare în special
dacă există o modifcare a procesului de transport activ în interiorul celulei bacteriene. La
streptococi, enterococi, germeni anaerobi etc. nu există un astfel de sistem de transport şi
în aceste condiţii aceste bacterii nu sunt sensibile la aminoglicozide. În cazul bacteriilor
sensibile, rezistenţa poate apărea de ex. prin producerea de enzime care adenilează sau
fosforilează grupul hidroxil de pe molecula aminoglicozidului. Dintre cele mai redutabile
reacții adverse putem aminti nefrotoxicitatea și ototoxicitatea.
Ciclinele (ex. tetraciclina) se leagă de subunitatea 30S a ribozomilor bacterieni şi nu
permit introducerea de noi aminoacizi într-un lanţ polipeptidic în curs de formare.
Rezistenţa este de regulă mediată plasmidic, dar şi prin intermediul transposonilor, ducând
de ex. la sinteza unei proteine membranare care mediază un afux excesiv de tetraciclină şi
astfel nu se mai pot atinge concentraţiile bacteriostatice. Ciclinele se absorb în stomac şi
intestin. Sunt bacteriostatice. Acţionează pe germeni gram pozitivi și gram negativi,
spirochete, mycoplasme, rickettsii, chlamydii. Printre reacţiile adverse amintim senzațiile
de greaţă, voma, diareea, toxicitatea renală şi hepatică, acumularea la nivel osos şi dentar.
Cloramfenicolul se leagă de subunitatea 50S a ribozomilor bacterieni şi inhibă peptidil-
transferaza, interferând cu legarea de noi aminoacizi în lanţul peptidic în curs de formare.
Rezistenţa poate apărea de ex. prin sinteza de către bacterii a unei acetil-transferaze sau a
unei nitrat-reductaze. Acţionează pe germeni aerobi şi anaerobi gram pozitivi și gram
78
negativi. Este un medicament bacteriostatic). Are indicații în abcesul cerebral, febra tifoidă,
salmoneloze sistemice, infecţii severe cu anaerobi. Printre reacţiile adverse cele mai grave
la care poate să ducă enumerăm anemia aplastică cu leucopenie şi agranulocitoză.
Macrolidele (eritromicina, claritromicina etc) şi lincosamidele (lincomicina și
clindamicina) se leagă de subunitatea 50S a ribozomului bacterian, interferând cu formarea
complexului de iniţiere pentru sinteza lanţurilor proteice. Rezistenţa poate apărea datorită
unei alterări a proteinelor ribozomale sau datorită sintezei unei enzime care metilează
reziduuri de adenină la nivelul ARNr. Macrolidele sunt bacteriostatice. Acționează pe cocii
gram pozitivi și gram negativi, bacili gram pozitivi și unii bacili gram negativi. Pot acționa
pe specii de Mycobacterium. Au efect asupra Treponema, Mycoplasma și Chlamydia. Sunt
indicate în infecţiile strectococice la bolnavii cu hipersensibilitate la betalactamine dar și în
difterie, tuse convulsivă, pneumonii atipice etc. Dintre reacţiile adverse amintim: greaţă,
vomă, diaree, febră, rash, reacţii anaflactice. Lincosamidele (bacteriostatice) acționează pe
germeni gram pozitivi aerobi şi anaerobi şi pe germeni gram negativi anaerobi.
Rifampicina inhibă creşterea bacteriană prin legarea de ARN-polimeraza ADN-
dependentă. Acţionează pe mycobacterii, coci gram pozitivi și gram negativi, unii bacili
gram negativi, germeni anaerobi gram pozitivi și gram negativi. Dintre indicații putem
menționa tratamentul tuberculozei, leprei, infecţiilor staflococice meticilino-rezistente
sensibile (testarea sensibilității tulpinilor respective este necesară).
Chinolonele (de exemplu acidul nalidixic, norfoxacina, ofoxacina, ciprofoxacina) inhibă
sinteza ADN-ului microbian prin blocarea ADN-girazei. Acţionează pe unii bacili gram
negativi și gram pozitivi, coci gram negativi și gram pozitivi, micoplasme, chlamydii. Dintre
posibilelel reacții adverse am putea aminti: fotosensibilitate, cefalee, vertij, convulsii.
Sulfamidele (sulfonamidele) sunt analogi structurali ai acidului paraaminobenzoic
(PABA) şi inhibă dihidro-pteroat-sintetaza. Se formează analogi nefuncţionali ai acidului
folic, metabolismul celulei bacteriene find astfel inhibat. Rezistenţa apare prin alterarea
dihidropteroat-sintetazei scăzând capacitatea de legare a sulfonamidelor şi este mediată
plasmidic. Rezistenţa la un membru al familiei trebuie înregistrată ca rezistenţă şi faţă de
celelalte substanţe cu structură similară.
Trimetoprimul, omolog al acidului dihidrofolic, inhibă reductaza acestui acid.
Sulfamidele şi trimetoprimul pot f utilizate separat pentru a inhiba creşterea
bacteriană. Dacă sunt însă utilizate împreună, vor produce o blocare dublă în secvenţa
sintezei de ADN, rezultând o creştere marcată a activităţii lor (sinergism). O astfel de
substanţă, frecvent folosită în practica medicală, este cotrimoxazolul (ex. biseptol),
conţinând sulfametoxazol şi trimetoprim.
Pirimetamina, la fel ca şi trimetoprimul, inhibă dihidro-folat-reductaza.
Unele antibiotice, cum ar f actinomicinele, sunt inhibitori efcienţi ai sintezei de ADN;
dar realizează această inhibiţie atât la nivelul celulei bacteriene cât şi la nivelul celulei
animale, nefind sufcient de selective pentru a putea f utilizate în terapia antibacteriană.
6. 3. 4. Clasifcarea antibioticelor şi chimioterapicelor după spectrul de acţiune
Prin spectrul de acţiune antimicrobiană se înţelege lista grupurilor (speciilor) de bacterii
asupra cărora un anume antibiotic sau chimioterapic este activ. În practică, trebuie
79
cunoscut nu numai spectrul antimicrobian iniţial al fecărui preparat antimicrobian, ci şi
modifcările ulterioare, survenite în urma apariţiei germenilor rezistenţi.
Spectrul antimicrobian iniţial este stabilit pentru fecare antibiotic în parte, o dată cu
introducerea sa în terapeutică.
Antibiotice cu spectru „îngust”
Aceste antibiotice pot f subîmpărţite în două subgrupuri:
- antibiotice cu spectru „de tip penicilinic”, active pe bacili Gram-pozitivi, coci Gram-
pozitivi şi coci Gram-negativi. Din acest grup fac parte majoritatea penicilinelor,
macrolidele, lincosamidele etc;
- antibiotice cu spectru „de tip streptomicină”, active pe bacili Gram-negativi, coci
Gram-negativi, coci Gram-pozitivi. În acest grup sunt incluse aminoglicozidele, polimixinele
etc.
Antibiotice cu spectru „larg”
Antibioticele din acest grup sunt active pe bacili Gram-pozitivi şi negativi, coci Gram-
pozitivi şi negativi. Sunt active şi pe spirochete, leptospire, rickettsii, chlamydii,
mycoplasme. În acest grup au fost incluse cloramfenicolul şi tetraciclinele.
La acest grup clasic de antibiotice cu spectru larg se pot adăuga alte antibiotice, cum ar
f: penicilinele cu spectru lărgit (ampicilina, amoxiciclina etc), ureidopenicilinele,
tienamicinele, cefalosporinele din generaţiile II-IV, unele fuorochinolone, unele sulfamide
etc.
6. 3. 5. Clasifcarea antibioticelor şi chimioterapicelor antibacteriene după structura
chimică
1. Antibioticele betalactaminice
a). Penicilinele
- penicilinele naturale (de exemplu penicilina G);
-penicilinele penicilinazorezistente (de exemplu meticilina, oxacilina, cloxacilina,
dicloxacilina, fucloxacilina, nafcilina);
- aminopenicilinele (de exemplu ampicilina, amoxicilina);
- alte peniciline cu efect asupra enterobacteriilor (mecilinamul, pivmecilinamul,
ciclacilina, epicilina);
- peniciline stabile în prezenţa unor beta-lactamaze produse de enterobacterii
(temocilina; în această categorie ar putea intra şi ampicilina, amoxicilina, ticarcilina şi
piperacilina);
- peniciline cu efect asupra Pseudomonas aeruginosa (carbenicilina, ticarcilina,
azlocilina, mezlocilina, piperacilina, apalcilina);
- alte peniciline şi inhibitori de beta-lactamaze (de exemplu acid clavulanic +
amoxicilină / ticarcilină, sulbactam + ampicilină, tazobactam + piperacilină);
b). Cefalosporinele
- din generaţia I (de exemplu cefalotina, cefaloridina);
- din generaţia a II-a (de exemplu cefamandola, cefoxitina, cefuroxima);
- din generaţia a III-a (de exemplu cefotaxima, ceftriaxona);
- din generaţia a IV-a (de exemplu cefepima, cefpiroma).
80
Cefalosporinele se mai pot clasifca şi în:
- cefalosporine de uz oral (cefacitril, cefapirin, cefazedon, ceftezol etc);
- cefalosporine de uz parenteral (cefalotina, cefaloridina, cefazolina, cefamandola
etc);
- cefalosporine care prezintă o mai bună stabilitate în prezenţa beta-lactamazelor
(cefuroxima, cefoxitima, cefotetanul, cefxima etc);
- cefalosporine cu activitate faţă de Pseudomonas aeruginosa (ceftazidima,
cefpiroma, cefepima, cefoperazona, cefsulodimul etc).
c). Alte antibiotice beta-lactaminice
- monobactamii (de exemplu aztreonamul);
- penemii (de exemplu ritipenemul);
-carbapenemii (de exemplu imipenenul, meropenemul, imipenemul + cilastatina;
cilastatina este un inhibitor al dehidro-peptidazei);
- oxacefemii (ex. latamoxef);
- carbacefemii (ex. loracarbef).
d). Inhibitori de beta-lactamaze (ex. acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul).
2. Glicopeptidele (teicoplanina şi vancomicina);
Vancomicina este utilizată în tratamentul infecţiilor cu S. aureus meticilino-rezistent. Se
administrează intravenos deoarece nu se absoarbe în tractul gastrointestinal. Printre
reacţiile adverse amintim reacţiile anaflactice, febră, eozinoflie, neutropenie, pierderea
auzului.
3. Aminoglicozidele
- streptomicina (care este de fapt un oligozaharid);
- kanamicina, gentamicina, amikacina, spectinomicina, tobramicina, netilmicina etc.;
4. ciclinele (ex. tetraciclina, oxitetraciclina, minociclina, doxiciclina etc);
5. Ansamicinele (ex. rifampicina, rifabutina);
6. Macrolidele (ex. eritromicina, claritromicina, azitromicina, telitromicina); 7.
Polipeptidele ciclice (polimixina B, colistinul);
8. Antibioticele care nu se încadrează în nici una din grupele de mai sus
- cloramfenicolul;
- lincosamidele (lincomicina şi clindamicina);
- acidul fusidic (cu o structură asemănătoare steroizilor);
- streptograminele (pristinamicin, quinupristin, dalfopristin);
- oxazolidinonele (linezolid);
- mupirocinul; ultimele 4 grupe de medicamente au fost descoperite în special ca
răspuns la apariţia tulpinilor de staflococ rezistente la meticilină etc.
Chimioterapicele
1. Sulfamidele (sulfonamidele) (ex. sulfadiazina, sulfafurazolul);
2. Co-trimoxazolul (asociere trimetoprin + sulfametoxazol)
3. Dapsona (diaminodifenilsulfona);
4. Ethambutolul;
5. Hidrazida acidului izonicotinic (HIN, izoniazida);
81
6. Chinolonele (ex. acidul nalidixic, ofoxacina, ciprofoxacina, norfoxacina,
levofoxacina, moxifoxacina, gatifoxacina, gemifoxacina etc);
7. Nitrofuranii (ex. furazolidonul, nitrofurantoina);
8. Nitroimidazolii (ex. metronidazolul, tinidazolul, ornidazolul) etc.
6. 4. Lantibioticele
Denumirea de „lantibiotice” a fost introdusă relativ recent, find vorba de un grup
special de substanţe antimicrobiene cu o serie de proprietăţi datorită cărora au fost
clasifcate între antibiotice şi bacteriocine. Lantibioticele sunt sintetizate de bacterii Gram-
pozitive (ex. din genurile Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Streptomyces) şi prezintă
un spectru de activitate specifc faţă de anumite bacterii Gram-pozitive. Din punct de
vedere al structurii chimice lantibioticele sunt polipeptide policiclice.
Masa moleculară a acestor substanţe se situează între 1.825 daltoni (mersacidina) şi
3.488 daltoni (Pep5). Pe baza structurii lor diferite, s-au descris două tipuri de lantibiotice: A
şi B.
Tipul A: sunt lantibiotice produse de staflococi, lactococi şi bacili Gram-pozitivi, de ex.
nisina, subtilina, epidermina, gallidermina şi Pep5.
Lantibioticele îşi au originea în proteine precursoare inactive (pre-lantibiotice)
sintetizate la nivel ribozomal, convertite enzimatic în polipeptide active din punct de vedere
biologic. În privinţa mecanismului de acţiune se ştie de ex. că nisina şi Pep5 au activitate
bactericidă depolarizând membrana citoplasmatică a celulei bacteriene, formând pori şi
inducând autoliza acesteia. Datorită faptului că există o specifcitate a lantibioticelor faţă de
anumite bacterii se consideră că există şi alte mecanisme implicate.
Genele responsabile de sinteza lantibioticelor pot f localizate cromozomial sau
plasmidic. De ex. în cazul nisinei, genele sunt localizate pe cromozonul celulei bacteriene
(15) de Lactococcus lactis, iar informaţia genetică pentru biosinteza epiderminei este
localizată pe plasmidul pTu 32.
Utilizarea lantibioticelor în industria alimentară şi în practica medicală
Dintre lantibioticele cunoscute, nisina are cea mai largă aplicabilitate practică. Nisina
inhibă tulpinile din genurileStreptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium, Listeria la
o concentraţie ≥ 30 ml / ml, activitatea inhibitorie find maximă la pH < 5,5. Nisina inhibă
sporularea bacteriilor din genurile Clostridium şi Bacillus; nu are efect asupra bacteriilor
Gram-negative sau asupra fungilor. Nisina este folosită pe scară largă în industria
alimentară drept „conservant natural” pentru vegetale, fructe, brânzeturi proaspete şi
procesate, carne, peşte, cacao, băuturi alcoolice (vinuri). Nu prezintă dezavantajele
nitraţilor şi nitriţilor (produc nitrozamină cu acţiune carcinogenă). În practica medicală este
utilizată în unguente cosmetice. Este folosită şi ca agent terapeutic în medicina veterinară
(în tratamentul local al infecţiilor bacteriene).
Epidermina, produsă de Staphylococcus epidermidis, are acţiune antimicrobiană faţă de
germeni care pot acţiona patogen la nivel tegumentar: Propioniibacterium
acnes, Streptococcus spp., Staphylococcus spp. Astfel, epidermina şi gallidermina
82
(sintetizată de Staphylococcus gallinarum) constituie alternative terapeutice pentru
derivatele de vitamina A şi eritromicină, de ex. în cazurile de acnee juvenilă, eczemă,
foliculite etc.
Dintre lantibioticele de tip B putem exemplifca lanthiopeptina, care are acţiune
antivirală faţă de virusul Herpes simplex.
6. 5. Rezistenţa microbiană la
antibiotice
Utilizarea cu succes a oricărui agent terapeutic poate f compromisă de dezvoltarea
rezistenţei. Rezistența poate să apară atât pentru antibioticele utilizate în tratamentul
infecțiilor bacteriene cât şi pentru antifungice, antivirale, antiparazitare sau pentru
medicamentele utilizate în tratamentul unor boli cronice.
Trei condiţii trebuiesc îndeplinite ca un anumit antibiotic să inhibe bacteria susceptibilă:
antibioticul trebuie să poată să ajungă la ţintă într-o concentraţie sufcientă;
antibioticul nu trebuie să fe inactivat înainte să se lege de ţintă;
trebuie să existe în celula bacteriană o ţintă vitală susceptibilă la acţiunea
antibioticului.
Cititorul este rugat să consulte și http://ecdc.europa.eu/en/eaad/pages/video.aspx.
Rezistenţa microbiană la antibiotice reprezintă capacitatea unor microorganisme de a
supravieţui şi de a se multiplica în prezenţa antibioticului.
Fenomenul de rezistenţă la antibiotice a fost descris relativ rapid după introducerea
acestora (ex. Streptococcus pyogenesrezistent la sulfonamide, Staphylococcus
aureus rezistent la penicilină sau Mycobacterium tuberculosis rezistent la streptomicină) în
practica medicală.
Pe măsură ce au fost descoperite mecanismele prin care medicamentele antiinfecţioase
afectează multiplicarea sau distrug diferitele tipuri de bacterii (ex. mecanismul de acţiune
al beta-lactaminelor) au fost descoperite şi mecanismele prin care bacteriile pot rezista faţă
de acţiunea medicamentului antibacterian (ex. producerea de enzime numite beta-
lactamaze / penicilinaze, cefalosporinaze etc).
Rezistenţa poate f naturală sau dobândită.
6. 5. 1. Rezistenţa naturală (intrinsecă) reprezintă rezistenţa tuturor membrilor unei
specii bacteriene faţă de un antibiotic şi este determinată genetic, de exemplu rezistenţa
bacilului tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis) la penicilina G.
6. 5. 2. Rezistenţa dobândită este acea rezistenţă necaracteristică unei specii
bacteriene, dar achiziţionată de anumite subpopulaţii din acea specie în circumstanţe date;
de exemplu, antibioticul acţionează ca un presor selectiv (pacientul are o infecţie în care
majoritatea populaţiei bacteriene este sensibilă la agentul antimicrobian, dar există tulpini
care prezintă rezistenţă; în aceste condiţii, tulpinile sensibile vor f inhibate sau distruse în
timp ce tulpinile rezistente vor f „selectate”; această situaţie nu poate f detectată decât
83
utilizând tehnicile de testare a sensibilităţii bacteriilor la antibiotice şi chimioterapice, de ex.
antibiograma difuzimetrică standardizată).
Rezistenţa dobândită poate f cromozomială sau extracromozomială.
Mecanisme biochimice implicate în rezistenţa la antibiotice
- producerea de către bacterie a unei enzime care inactivează antibioticul, de exemplu
penicilinaza staflococului auriu (codifcată plasmidic) care inactivează nucleul beta-
lactamic al penicilinelor sau diferitele tipuri de beta-lactamaze produse de bacteriile Gram-
negative (ex. de enterobacterii);
- scăderea permeabilităţii peretelui sau membranei citoplasmatice pentru antibiotic (de
exemplu formele L);
- elaborarea în exces de către bacterie a unor enzime complementare, care limitează
sau anulează acţiunea antibacteriană a antibioticului, exercitată la nivelul enzimei
respective;
- alterarea ţintei intracelulare (ex. modifcarea proteinelor ribozomale);
- amplifcarea sintezei de acid paraaminobenzoic, anulându-se astfel prin „diluare”
acţiunea inhibitorie a sulfamidelor etc. (Tabelul nr. 2)
6. 5. 2. 1. Rezistenţa cromozomială se poate dezvolta ca rezultat al unei mutaţii
spontane, la întâmplare, la nivelul unui locus ce controlează sensibilitatea faţă de un
anumit produs antimicrobian (deleţie, substituţie sau adiţie de bază). Prezenţa substanţei
active antimicrobiene serveşte ca un mecanism selector, suprimând organismele sensibile
şi favorizând dezvoltarea unei populaţii provenite din organismele mutante, rezistente la
antibiotic. Mutaţia spontană apare cu o frecvenţă variind între 10 -12-10-7. Mutaţiile
cromozomiale sunt defnitive, afectează numai un anumit antibiotic sau o familie de
antibiotice şi se transmit vertical la toţi descendenţii suşei bacteriene devenite rezistentă.
Pot f clasifcate în:
· mutaţii într-un singur pas (single large step mutations) – o singură mutaţie duce
la creşterea CMI pentru un anumit antibiotic. Pot duce la eşuarea tratamentului atunci când
acesta este instituit cu un singur antibiotic.
· mutaţii în mai mulţi paşi (multistep mutations) – mutaţii secvenţiale care duc la
creşterea gradată a CMI.
6. 5. 2. 2. Rezistenţa extracromozomială este mult mai frecventă decât cea
cromozomială, reprezentând circa 90% din cazurile de rezistenţă. În acest caz, transmiterea
materialului genetic pentru rezistenţă se poate face transversal (orizontal), la toţi membrii
populaţiei bacteriene existente la un anumit moment dat, prin plasmide, material plasmidic
sau transpozoni.
Transferul materialului genetic se poate realiza prin:
- transducţie;
- transformare;
- conjugare;
- transpoziţie.
Transducţia apare prin intervenţia unor bacteriofagi care pot transporta ADN bacterian
încorporat în capsida sau genomul propriu. Dacă acest material genetic include gene pentru
84
rezistenţa la un antibiotic (factor R sau RTF), o celulă bacteriană infectată ulterior poate
deveni rezistentă la antibioticul respectiv şi este capabilă să transmită descendenţilor
această rezistenţă fără a veni în contact cu antibioticul respectiv.
Transformarea reprezintă un mod de transfer al informaţiei genetice care implică
încorporarea de ADN liber din mediu (rezultat de exemplu în urma lizei unor bacterii care-l
conţin) într-o altă bacterie.
Conjugarea reprezintă pasajul genelor de la o celulă la alta prin contact direct realizat
prin intermediul unui pil sexual (pil F). Acest mecanism este considerat foarte important în
răspândirea rezistenţei la antibiotice. ADN-ul astfel transferat poate codifca simultan
pentru germenul receptor rezistenţa faţă de mai multe antibiotice.
Transpoziţia este un transfer al unor secvenţe scurte de ADN (transpozoni, elemente
transpozabile) în interiorul unei celule bacteriene între două plasmide sau între o plasmidă
şi o porţiune a cromozomului bacterian.
6. 5. 3. Tipuri de rezistenţă
6. 5. 3. 1. Rezistenţa faţă de un agent antimicrobian poate f:
- monovalentă (monorezistenţa), atunci când germenii rezistă la un singur antibiotic;
- plurivalentă (rezistenţa multiplă, la mai multe antibiotice);
6. 5. 3. 2. Din alt punct de vedere, rezistenţa se poate manifesta:
- direct (leagă o anumită bacterie de un singur anumit antibiotic);
- încrucişat (rezistenţa unei bacterii faţă de mai mulţi agenţi antimicrobieni cu structură
şi/sau mecanism de acţiune asemănător); de ex. rezistenţa la o sulfonamidă sau la o
tetraciclină conferă rezistenţă la toate sulfonamidele sau la toate tetraciclinele în timp ce
staflococii rezistenţi la meticilină (MRSA) sunt rezistenţi la toate medicamentele beta-
lactamice;
6. 5. 3. 3. După ritmul de instalare, rezistenţa poate f:
- cu ritm rapid de instalare (monostadială), „tip streptomicină”;
- de ritm intermediar, „tip eritromicină”;
- cu ritm lent de instalare (pluristadială), „tip penicilină”;
- cu ritm foarte lent de instalare, „tip vancomicină”.
6. 5. 4. Modifcări ale spectrului antimicrobian iniţial
Implicaţiile clinice, terapeutice, epidemiologice şi materiale ale fenomenului de
rezistenţă bacteriană la antibiotice şi chimioterapice sunt extrem de mari. Selectarea
tulpinilor rezistente prin antibioticoterapia excesivă, de multe ori abuzivă, exercitată în
spitale, alte unităţi sanitare sau în ambulator (inclusiv prin fenomenul numit
„automedicaţie”), duce la variate aspecte negative: infecţii cu germeni rezistenţi, apariţia şi
transmiterea germenilor de spital, devalorizarea şi pierderea unor medicamente
antibacteriene etc. O problemă deosebită este şi utilizarea medicamentelor antibiotice şi
chimioterapice în domeniul veterinar. Se estimează că anual se consumă circa 100.000
tone de antibiotice şi chimioterapice, o bună parte în ferme de animale, piscicole etc (Levy
2002). Acest exces de utilizare produce şi un fenomen de „poluare” a mediului cu
substanţe de acest tip, prin excreţia acestora de către animalele „tratate”.
85
Atunci când vorbim de utilizarea raţională a antibioticelor şi chimioterapicelor ar trebui
să avem în vedere: utilizarea acestora în benefciul pacientului; evaluarea clinică riguroasă
însoţită de teste de laborator sugestive sau care să confrme infecţia şi respectiv
sensibilitatea la medicamente a tulpinilor izolate; instituirea tratamentului în cel mai scurt
timp posibil în cazul pacienţilor cu infecţii severe, ameninţătoare de viaţă; tratamentul
trebuie să fe „ţintit”, să fe îndreptat strict către bacteria care a produs respectiva infecţie,
să se utilizeze calea de administrare cea mai potrivită, doza corespunzătoare, intervalul
între doze, durata optimă a tratamentului iar pacientului să i se explice toate elementele
care vor permite ca acesta să fe compliant şi să respecte indicaţiile medicale.
Este strict necesară supravegherea fenomenului de rezistenţă la antibiotice şi
chimioterapice, testarea sensibilităţii germenilor, notifcarea şi evaluarea statistică,
publicarea periodică a datelor şi punerea lor la dispoziţia sistemului sanitar. Cu toate
acestea, datele menţionate mai sus nu sunt disponibile la nivel naţional. În România,
profesioniştii din sistemul sanitar se bazează fe pe experienţa proprie, fe pe datele
statistice din literatura internaţională.
Se vorbeşte tot mai des în zilele noastre despre „superbugs”, şi anume, bacterii
rezistente la foarte multe antibiotice. Printre acestea amintim Acinetobacter baumannii,
Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Clostridium difcile,
Enterobacterspp., Escherichia coli, Haemophilus infuenzae, Klebsiella pneumoniae, M.
tuberculosis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Staphylococcus
aureus, Streptococcus pneumoniae etc. Termenul de „superbug” se refer la microbi care
duc la o mortalitate şi morbiditate ridicată datorită mutaţiilor multiple și respectiv
rezistenței la antibiotice și chimioterapice rezultate. Variantele terapeutice devin limitate
iar spitalizarea este de durată mare şi poate duce la costuri deosebit de mari. (3)
NDM (New Delhi metallo-beta-lactamase gene; blaNDM-1) este o genă nou
descoperită. Bacteriile care dețin gena devin ”impermeabile” pentru o serie de antibiotice și
inactivează carbapenemazele. Gena se găseşte la nivelul unei plasmide și din această
cauză poate f ușor transmisă. A fost prima dată identifcată în India; a fost ulterior
recunoscută în Pakistan, Bangladesh, UK, SUA, Canada, Australia, Belgia etc (4-7).
6. 5. 5. Date privind controlul extinderii rezistenţei la antibiotice
Utilizarea oricărui antibiotic în mod potențial duce la rezistenţă. De-a lungul anilor s-au
realizat și aplicat diferite strategii de către CDC, Organizația Mondială a Sănătății și mai de
curând de către ECDC, pentru prevenirea şi controlul rezistenţei la antibiotice, spre
exemplu:
· controlul strict al folosirii acestor medicamente după o prescriere corectă (ex. nu
pentru un guturai sau altă infecție insensibilă la antibiotice anti-bacteriene)
· achiziţionarea antibioticelor și chimioterapicelor doar în baza prescripției
medicale
· controlul strict al medicamentelor utilizate la animale şi în agricultură (multe
dintre moleculele de antibiotice și chimioterapice folosite în terapie la om se găsesc sub
alte denumiri comerciale şi în tratamentul animalelor)
· prevenirea bolilor infecţioase etc.
86
Rezistenţa la antibiotice datorată răspândirii utilizării acestora de către om şi pentru
animale a devenit o problemă tot mai mare în ultimele decenii. În 2001 ”European Union
Ministers of Health” a adoptat Recomandările legate de folosirea prudentă a antibioticelor
în medicina umană. Prima recomandare a fost ca statele membre să întocmească şi să
întărească un sistem de supraveghere pentru folosirea antibioticelor şi prevenirea
rezistenţei la acestea. Din 1999, Sistemul European de Supraveghere Antimicrobiană
(European Antimicrobial Surveillance System – EARSS) oferă date legate de prevalenţa şi
răspândirea majorităţii bolilor cauzate de bacterii rezistente la unul sau mai multe
antibiotice. În raportul anual din 2007 EARSS afrmă că „datele pe care EARSS le-a adunat
de-a lungul anilor aduc un mesaj neplăcut dar important: rezistenţa la antibiotice devine o
problemă tot mai mare de sănătatea publica an după an şi doar un efort cumulat poate
schimba această situaţie”. (8)
Copiii sunt cei care primesc cele mai multe antibiotice în UE mai ales pentru infecţii ale
tractului respirator superior. Există date care arată că în acest caz apare și rezistenţa la
antibiotice și chimioterapice. Tulpinile rezistente sunt răspândite printre copiii care sunt
duşi la creşă sau la altă formă de educație preșcolară. La nivelul UE deşi au existat câteva
iniţiative, s-a făcut mult prea puţin în ceea ce priveşte această grupă de vârstă. Ar f totuși
de menționat înfinţarea Reţelei de Prescriere şi Rezistenţa la Antibiotice a Copiilor din UE
(The Antibiotic Resistance and Prescribing in European Children network – ARPEC) care are
următoarele scopuri:
· să folosească metodologia şi datele oferite de celelalte sisteme de supraveghere
pentru a dezvolta un sistem de supraveghere a rezistenței la antibiotice, pentru copiii din
UE
· să determine diferenţele legate de alegerea antibioticului, doza şi indicaţiile care
apar între diferite comunităţi şi spitale
· să pună la punct recomandări privind dozele de antibiotice și chimioterapice
administrate zilnic copiilor
· să colecteze date
· să initieze referinţe legate de rata prescrierii şi rezistenţei în colaborare cu
Societatea Europeană pentru Bolile Infecţioase Pediatrice (European Society for Paediatric
Infectious Diseases – ESPID)
· să trimită rezultatele obținute în cadrul fecărui proiect către toate ţările membre.
(9)
CDC a dezvoltat la rândul său un plan de acţiune cu privire la rezistenţa la antibiotice
care cuprinde patru mari puncte:
· Supraveghere,
· Prevenire şi Control,
· Cercetare şi
· Producţie. (10)
87
6. 6. Noţiuni legate de alegerea
corectă a antibioticelor în
tratamentul bolilor infecţioase
Instituirea şi continuarea unei terapii cu antibiotice pe o durată optimă (nici prea scurtă
şi nici prea lungă, existând recomandări specifce în funcţie de agentul etiologic şi respectiv
în funcţie de patologie) trebuie să urmeze întotdeauna parcurgerea unor etape minimale
care să justifce această opţiune terapeutică. În acest mod s-ar putea evita principalele
erori în utilizarea antibioticelor, erori extrem de frecvente în momentul actual, inclusiv la
nivel mondial, erori care favorizează în principal abuzul de antibiotice / chimioterapice şi
permit selectarea de microorganisme rezistente.
6. 6. 1. Etape de urmat în vederea instituirii corecte a unui tratament cu antibiotice
Etapa în care se ia decizia de instituire a antibioticoterapiei
Această etapă se bazează pe o serie de date concrete (însă uneori pornim doar de la
ipoteze) într-un anumit contextclinic, epidemiologic, paraclinic şi de laborator. Este strict
necesar să reţinem că întotdeauna există un context şi că nici una dintre informaţii luată
singular nu permite luarea celei mai bune decizii. Nu există o prioritate pentru clinică sau o
prioritate pentru laborator; datele trebuie interpretate şi integrate în contextul general.
Pentru a susţine decizia încercăm să răspundem cât mai precis posibil la cel puţin două
întrebări, respectiv:
1. Este în discuţie o infecţie certă sau cel puțin foarte probabilă?
Argumentele principale în favoarea unei infecţii pot f: creşterea temperaturii, prezenţa
frisoanelor, identifcarea unor supuraţii sau infamaţii locale, modifcarea evidentă a stării
generale, icterul (colorarea în galben a tegumentelor şi mucoaselor), prezenţa unor erupţii
la nivel tegumentar sau pe mucoase, modifcări ale tranzitului intestinal însoţite de
eliminarea de scaune mai numeroase sau de consistenţă scăzută (diaree), tusea,
condensările pulmonare percepute auscultator sau prin examinare radiologică, sindromul
meningian (foarte important de sesizat prin manevre clinice relativ simple), leucocitoza
(atât ca număr cât şi ca procent în analiza formulei leucocitare), testele nespecifce de
infamaţie (număr de leucocite, VSH, proteină C reactivă, fbrinogen etc.), identifcarea
prezenţei bacteriilor la nivel tisular sau în umori în mod normal sterile prin examene simple
în cadrul diagnosticului bacteriologic direct etc.
Sindromul de răspuns infamator sistemic (SIRS) sugerează de cele mai multe ori o
infecţie, dar el poate f produs şi de cauze neinfecţioase (imunologice, cancer,
politraumatisme, alte agresiuni fzice etc.). În acest sindrom este evaluată prezenţa a cel
puţin două din următoarele condiţii: temperatură centrală peste 38°C sau mai mică de
36°C, frecvenţă cardiacă peste 90 de bătăi pe minut, frecvenţă respiratorie peste 20 de
respiraţii pe minut sau PaCO2 sub 32 mmHg, numărul leucocitelor periferice peste 12.000
pe mm3 sau sub 4.000 pe mm3 sau cu peste 10% forme imature (în bandă).
88
Noţiunea de sepsis include prezenţa infecţiei alături de sindromul de răspuns infamator
sistemic. În prezent, este recomandată o nouă terminologie care să înlocuiască vechile
denumiri de septicemie, stare septică, septicopiemie etc. Sepsisulreprezintă SIRS
determinat de infecţie. Sepsisul sever se defneşte ca un sepsis asociat cu disfuncţie
organică, hipoperfuzie sau hipotensiune. Şocul septic este sepsisul însoţit de hipotensiune
(indiferent de aportul normal de lichide) şi de anomalii de perfuzie (cel puţin acidoză
lactică, oligurie sau alterarea acută a stării mentale). Hipotensiunea este defnită ca
tensiune arterială (maximă) sub 90 mmHg sau reducerea tensiunii arteriale maxime cu
peste 40% faţă de nivelul obişnuit. Prezenţa sau suspiciunea sepsisului, şocului septic sau a
sindromului de disfuncţie multiorganică, chiar şi atunci când nu sunt clar demonstrate,
constituie un argument hotărîtor pentru administrarea de antibiotice sau chimioterapice
datorită gravităţii deosebite a acestor entităţi clinice. Totuşi, chiar şi în această situaţie nu
există nici un argument logic de a institui antibioticoterapia înainte de a recolta produse
pentru a f examinate în cadrul diagnosticului bacteriologic direct.
2. Care este terenul pe care s-a instalat infecţia?
Evaluarea terenului, a situaţiei gazdei care urmează a f tratată, are un rol important în
stabilirea oportunităţii antibioticoterapiei. Infecţiile uşoare, apărute la persoane tinere
anterior sănătoase, de obicei nu necesită tratament cu antibiotice sau chimioterapice.
Aceleaşi infecţii apărute la pacienţii cu imunodepresie fac antibioticoterapia strict necesară
(şi este indicat să utilizăm medicamente bactericide). Existenţa unor factori favorizanţi
măreşte prezumţia de infecţie şi necesită instituirea terapiei cu antibiotice, chiar în
contextul unor semne fzice (exemplu febră) aparent minore. Aceşti factori sunt de obicei
reprezentaţi de imunodepresia la nivelul întregului organism (la pacienţi cu diabet, ciroză,
cancer, SIDA, politraumatisme, operaţii extinse etc.) sau de imunodepresie locală (datorită
prezenţei unor catetere, sonde, şunturi, proteze implantate etc.). La bolnavii
imunodeprimaţi se va opta de obicei pentru antibiotice bactericide; în această situaţie este
de obicei acceptată asocierea de antibiotice.
Etapa în care se alege medicamentul antimicrobian care urmează a f administrat
Din gama largă de antibiotice disponibile la ora actuală (peste 250 de molecule
diferite), selectarea celui mai indicat se face după mai multe criterii.
Relativ frecvent, alegerea se bazează pe criteriul prezumţiei etiologice, cu condiţia
începerii diagnosticului microbiologic direct anterior începerii terapiei (nu există nici o
justifcare, indiferent de eventuala gravitate a maladiei, pentru a administra întâi antibiotice
şi apoi a-ţi aduce aminte că era preferabil să recoltezi produsul patologic, să îl trimiţi către
laborator în vederea izolării, identifcării şi stabilirii sensibilităţii/rezistenţei la antibiotice şi
chimioterapice a germenului implicat în respectiva patologie). Ulterior, alegerea poate f
corectată pe baza precizării defnitive a etiologiei (cu condiţia ca diagnosticul microbiologic
direct să f fost „lansat”), dar şi pe baza aprecierii efcienţei clinice şi a efectelor adverse ale
terapiei iniţiale.
În vederea alegerii medicamentului antimicrobian pe care urmează să îl administrăm
pacientului cu o boală infecţioasă este strict necesar să: a). stabilim diagnosticul etiologic,
să încercăm şi să reuşim diferenţierea infecţiilor bacteriene (tratabile cu antibiotice şi
89
chimioterapice anti-bacteriene) de infecţiile virale; elementele care ne permit orientarea
spre etiologia bacteriană ar f: un tablou clinic mai sever (există şi infecţii virale foarte
grave, însoţite de modifcări substanţiale ale stării generale a pacienţilor), febra mai
„înaltă”, frisoanele, infamaţia mai accentuată, prezenţa supuraţiilor, leucocitoza (numeric
şi procentual în analiza formulei leucocitare). Trebuie să realizăm de asemenea o
examinare clinică în detaliu a pacientului („din creştet şi până la tălpi”), examenul
microbiologic (inclusiv examinarea microscopică citobacteriologică); b). testăm
sensibilitatea la antibiotice a bacteriei izolate şi implicate în infecţia supusă
antibioticoterapiei (de ex. antibiograma); c). realizăm sau primim informaţii privind
diagnosticul anatomo-clinic al bolii; d). cunoaştem proprietăţile farmacologice ale
antibioticelor propuse a f folosite; e). avem în vedere şi criteriul economic (raportul cost-
efcienţă); f). analizăm necesitatea unei eventuale asocieri de antibiotice.
Trebuie de asemenea să avem în vedere şi să decidem care este calea şi modul de
administrare pentru antibioticul ales în funcţie de gravitatea, localizarea infecţiei, caracterul
acut sau subacut al bolii, tipul antibioticului ales, toleranţa pentru acest antibiotic a
pacientului tratat. Spre exemplu, putem folosi penicilina V (de administrare orală) în infecţii
de gravitate medie sau chiar şi în unele infecţii grave, în funcţie de localizare, ca alternativă
pentru penicilina G sau alte preparate beta-lactamice, dacă bacteria izolată îşi păstrează
sensibilitatea faţă de penicilină, dacă gazda nu prezintă hipersensibilitate de tip I faţă de
penicilină şi dacă vom reţine care este procentul de absorbţie al acestui medicament şi în
acest sens vom administra doze duble comparativ cu dozele utilizate pentru administrarea
parenterală şi „pe stomacul gol”.
În cazul în care analiza noastră a permis răspunsul la toate întrebările listate mai sus se
vor stabili dozele necesare, intervalele între administrări, durata tratamentului, precum şi
momentul opririi acestuia. Controlul terapiei antimicrobiene se va realiza pe tot parcursul
administrării incluzând metode clinice (de ex. ameliorarea semnelor şi simptomelor) şi
metode de laborator (examene paraclinice, dozarea antibioticelor în ser etc.).
6. 7. Erori în practica
antibioticoterapiei
Antibioterapia se afă într-un impas constatat clinic prin diferite eşecuri terapeutice (în
cadrul tuturor specialităţilor atât medicale dar mai ales chirurgicale) şi confrmat de
numeroase studii de laborator (aceste studii sunt realizate în special în SUA şi Europa de
Vest şi sunt mai puţine şi mai puţin semnifcative în ţara noastră; constatările diferitelor
eşecuri există, chiar dacă sunt prezentate de regulă „anecdotic” şi nu în publicaţii
accesibile întregului sistem sanitar). În străinătate, există o tendinţă de a atrage în echipe
mixte microbiologi, farmacişti etc. cu scopul de a monitoriza calitatea utilizării antibioticelor
şi chimioterapicelor, mai mult, de a pregăti specialişti pentru formarea de echipe
multidisciplinare cu participarea managerilor unităţilor sanitare, pentru limitarea
problemelor legate de numeroasele erori comise în antibioticoterapie (Arnold 2004).
90
Principalele cauze ale situaţiei actuale sunt un număr imens de prescrieri abuzive şi
folosirea iraţională a unor antibiotice; se estimează că 60% din antibioticele şi
chimioterapicele produse anual se risipesc inutil. Principalele „rezultate” sunt: apariţia de
specii sau de tulpini („mutante”) bacteriene cu rezistenţă la antibiotice, înmulţirea reacţiilor
adverse la antibiotice şi chimioterapice precum şi modifcarea tablourilor clinice „clasice
ale patologiei infecţioase.
Cel puţin teoretic soluţia ar f descoperirea de noi antibiotice (însă din ce în ce mai
multe companii farmaceutice transferă interesul pentru descoperirea de medicamente
antivirale şi antifungice şi au tendinţa de a renunţa la cercetarea fundamentală în vederea
producerii de medicamente antibacteriene, Shlaes 2003) dar mult mai logic, mai corect şi
mai la îndemână estefolosirea raţională a medicamentelor antimicrobiene deja existente
şi evitarea erorilor făcute în practica antibioticoterapiei.
Dar, care sunt cele mai frecvente erori în folosirea antibioticelor?
În primul rând este incorect să începem un tratatament antibiotic fără să f examinat
clinic (complet) pacientul şi fără să utilizăm informaţiile pe care le putem obţine printr-o
anamneză riguroasă. Este incorect să indicăm folosirea acestor medicamente în stări febrile
în care există doar „bănuiala unei infecţii”. Este incorect să decidem antibioticoterapia „la
întâmplare” sau „pe încercate” (cu o eventuală eroare suplimentară reprezentată de
schimbarea succesivă a antibioticului în „raţionamentul” că „poate de data aceasta va
merge” fără să încercăm să ne fundamentăm decizia pe criterii raţionale (cel puţin pe
criterii de probabilitate). „Raţionamente” simpliste de tipul febră = infecţie = antibiotice şi
chimioterapice (deseori întâlnite în practică, din păcate) nu pot conduce decât la eşec, la
modifcarea evoluţiei bolii şi la împiedicarea stabilirii ulterioare a diagnosticului („mascare”
clinică şi bacteriologică) şi tratamentului corect. Cu privire la criteriile de probabilitate este
adevărat că în România nu există ghiduri şi recomandări privind utilizarea corectă a
antibioticelor, bazate pe studii actuale, realizate peeşantioane reprezentative
statistic pentru România şi în aceste condiţii „referinţa” este reprezentată de studiile
făcute în SUA sau în Europa de Vest şi de manualul domnului profesor Mircea Angelescu
(1998).
În al doilea rând este incorect să utilizăm antibiotice fără a solicita, fără a obţine şi
fără a interpreta corect datele de laborator. Indiferent de specialitate (medicală,
chirurgicală) şi indiferent de supra-specialitate este necesară cunoaşterea şi utilizarea
corectă a unor noţiuni elementare de bacteriologie. Este absolut incorect să începem
antibioticoterapia înainte de recoltarea produsului patologic. În funcţie de contextul clinic şi
de gravitatea patologiei în cazul căreia presupunem drept etiologie o infecţie bacteriană
este recomandabil să solicităm şi efectuarea unor examene paraclinice de bază
(leucogramă, VSH, radiografe, sumar de urină etc). Nu trebuie să uităm că atunci când
suspicionăm o infecţie bacteriană, indiferent de specialitate (aceste analize pot f efectuate
chiar şi personal; ca alternativă trebuie să stabilim o foarte bună colaborare între
clinică şi laborator) avem la îndemână posibilitatea şi necesitatea efectuării de preparate
între lamă şi lamelă (native) şi frotiuri (colorate Gram, cu albastru de metilen, Giemsa etc.)
din produsul obţinut prin recoltare de la pacientul cu o presupusă infecţie bacteriană.
91
Realizarea şi examinarea frotiurilor poate dura chiar şi numai 5 minute, permiţând în scurt
timp obţinerea unui rezultat orientativ, uneori foarte important. Nu ar trebui să indicăm
tratamentul cu antibiotice fără a ţine seama de sensibilitatea la antibiotice a germenului. În
cazul unor infecţii grave se poate începe antibioticoterapia, după „criterii de
probabilitate”. Însă, în cazul în care produsul patologic a fost recoltat anterior, a fost
transmis către laborator, a fost prelucrat iar agentul etiologic a fost identifcat şi s-a stabilit
care este sensibilitatea la antibiotice şi chimioterapice iar evoluţia clinică şi paraclinică nu
este favorabilă, demonstrând că antibioticul ales nu a fost cel mai potrivit, pentru că avem
rezultate de laborator vom putea „schimba” tratamentul, de această dată pe criterii
ştiinţifce evitând schimbări repetate şi „la întâmplare” sau chiar inducerea unui prognostic
rezervat pacientului supus tratamentului din clinica în care ne desfăşurăm activitatea).
Trebuie să nu greşim şi să luăm în considerare drept agenţi etiologici diferiţi germeni
saprofţi sau condiţionat patogeni, cultivaţi din focare sau cavităţi septice deschise, sau
izolaţi din produse contaminate în cursul recoltării.
O altă eroare ar f ignorarea posibilităţii ca germenul izolat să fe doar unul dintre cei 2
sau mai mulţi germeni implicaţi.
Încă din anul doi de studiu se obţin primele date cu privire la toate aspectele descrise
mai sus precum şi cu privire la testarea sensibilităţii la antibiotice (de ex. antibiograma),
metodă care nu trebuie interpretată mecanic, nu trebuie nici subestimată şi nici
supraevaluată (mai ales atunci când este efectuată difuzimetric şi / sau nu este
standardizată).
Aşa cum am mai subliniat în cadrul acestui capitol, nu trebuie niciodată să absolutizăm
datele clinice, datele paraclinice, datele de laborator, luate fecare în parte şi „scoase” din
contextul general. Nu există o prioritate pentru clinică sau o prioritate pentru laborator;
datele trebuie interpretate, integrate şi utilizate în contextul clinic, paraclinic şi de
laborator general. Aceasta reprezintă, după opinia noastră, un aspect esențial al
medicinii pe care dorim să o practicăm la cel mai înalt nivel, în favoarea pacienţilor pe care
trebuie să îi tratăm.
În al treilea rând este incorect să prescriem fără justifcare antibiotice şi
chimioterapice, spre ex. în stări febrile neinfecţioase (maladii cu mecanism prin
hipersensibilitate, maladii ale ţesutului colagen, neoplazii etc), în boli infecţioase cu agenţi
patogeni care nu sunt sensibili la antibiotice (ex. este absurd să utilizăm penicilină sau orice
alt antibiotic antibacterian în „tratamentul” gripei). Este de subliniat că este incorect să
indicăm antibioterapia (şi să aşteptăm ca indicaţia noastră să aibă efect curativ) în cazul
unor supuraţii colectate neglijând şi / sau temporizând incizia şi drenajul (antibioticul nu
difuzează în focarul purulent; în plus, va f inactivat la acest nivel).
În al patrulea rând, atunci când este necesară antibioterapia, este incorect să alegem
eronat un antibiotic sau o asociere de antibiotice (în cazul în care această asociere este
strict necesară), prin necunoaşterea sau nerespectarea spectrului antimicrobian, prin
nefolosirea antibioticului de elecţie (ex. folosirea augmentinului sau cloramfenicolului sau
tetraciclinei în angina streptococică la pacientul care nu prezintă hipersensibilizare la
penicilină), prin utilizarea de antibiotice nedifuzibile în focar (infecţia urinară nu se poate
92
trata cu cloramfenicol deoarece cloramfenicolul se elimină prin bilă sau prin urină sub
formă de metabolit inactiv). În plus nu trebuie să uităm faptul că lucrăm cu bolnavi şi nu cu
boli şi în acest sens pentru un anume pacient pot exista anumite contraindicaţii specifce
(ex. hipersensibilizare faţă de antibioticul pe care dorim să îl utilizăm, cu posibilitatea
apariţiei unui şoc anaflactic).
Este incorect să indicăm asocierea antibioticelor antagoniste din punct de vedere al
mecanismului (ex. penicilină G + tetraciclină) sau să indicăm asocierea de antibiotice cu
acelaşi spectru (eroare poate f dramatică în cazul asocierii a două aminoglicozide sau a
două antibiotice cu spectru larg). Primul exemplu a fost ales pentru a atrage atenţia privind
eroarea de a asocia antibiotice care pot da reacţii adverse serioase (ex. afectarea până la
determinarea apariţiei surdităţii prin afectarea nervului acustico-vestibular), reacţie de
notorietate în cazul aminoglicozidelor (streptomicină, kanamicină, gentamicină, amikacină
etc.).
În al cincilea rând, este incorect să indicăm „din start” antibiotice şi chimioterapice
într-un aşa-zis scop proflactic. Spre ex. în cazul în care pacientul prezintă un panariţiu la
degetul inelar singura atitudine corectă este de realiza incizia, drenajul, antiseptizarea şi
pansarea locală, vindecarea urmând a se produce; nu este necesar ci este chiar
contraindicat să recomandăm administrarea de antibiotice şi chimioterapice. Încă din primii
ani de studenţie se poate reţine faptul că, în principiu, utilizarea antibioticelor în scop
proflactic trebuie privită cu rezerve serioase. Pe de altă parte, trebuie cunoscute situaţiile
în care antibioticoproflaxia este utilă şi recomandabilă (de ex. înainte şi după efectuarea
unei extrageri dentare, manevră sângerândă, la un pacient care are stenoză mitrală).
În al şaselea rând, este incorect să nu studiem şi să nu acumulăm cunoştinţele
necesare de microbiologie, farmacologie, fziopatologie, semiologie medicală, medicină
internă, chirurgie etc. care contribuie la evitarea erorilor în conducerea tratamentului sau /
şi greşelilor în tehnica de administrare; cunoştinţele acumulate ne permit să avem în
vedere posibilele reacţii adverse şi să evităm situaţii care pot deveni dramatice.
Circulaţia substanţelor antimicrobiene în organism din momentul resorbţiei şi până în
momentul eliminării (farmacocinetica substanţelor antimicrobiene) trebuie cunoscută atât
pentru evaluarea efectului terapeutic cât şi pentru prevenirea acumulării şi apariţiei
fenomenelor toxice (de ex. vom indica substanţe antimicrobiene la pacienţi cu insufcienţă
renală numai în condiţiile monitorizării valorii creatinei şi creatininei sanguine, a ureei
sanguine, a ratei de fltrare glomerulare, a ionogramei şi a sedimentului urinar).
Există anumite caracteristici farmacocinetice pentru fecare substanţă antimicrobiană.
Datele farmacocinetice condiţionează „biodisponibilitatea” medicamentului în cazul concret
al bolnavului tratat. Aceste proprietăţi caracteristice privesc absorbţia de la locul de
administrare, difuziunea în organism (ţesuturi şi fuide), metabolizarea substanţei în
organism, eliminarea (căi şi forme de eliminare) etc.
După mecanismul patogenic reacţiile adverse la antibiotice şi chimioterapice ar putea f
reprezentate de: a. efecte toxice directe, la locul administrării (fenomene iritative, febite
etc.), sau la distanţă (hepatice, renale, hemopoietice etc.); b. reacţii de hipersensibilizare
93
(erupţii, şoc anaflactic etc.) şi c. efecte secundare (dismicrobisme de ex. prin utilizarea
antibioticelor cu spectru larg, inducerea de suprainfecţii, reacţii autoimune etc.).
În al şaptelea rând, este incorect ca atunci când avem un dubiu cu privire la decizia
pe care urmează să o luăm să nu ne consultăm cu alţi colegi, pentru a alege întotdeauna
cea mai bună variantă posibilă. Considerăm că tăria este atunci când ne recunoaştem
limitele şi nu atunci când încercăm să demonstrăm că acestea nu ar exista.
6. 8. Povestiri adevărate
6. 8. 1. Gentamicina administrată în aerosoli
Datorită conjuncturii actuale internaţionale, s-a concluzionat că probabilitatea unui atac
terorist cu arme biologice este din ce în ce mai mare. Având în vedere că prevenirea poate
f o mai bună formă de apărare, specialiştii occidentali au hotărât să pună la punct un
program naţional de protecţie anti-bioterorism. În Statele Unite, acest program poartă
numele de „BioShield”.
Iniţial au fost identifcate structurile microbiene sau tulpinile care ar putea f utilizate în
cazul unui atac biologic, cele mai importante find: toxina botulinică, Bacillus anthracis,
virusurile febrei hemoragice, Yersinia pestis, Francisella tularensis şi virusul variolic.
În afară de identifcarea problemelor potenţiale a fost necesară găsirea soluţiilor de
prevenire / control / combatere.
În cadrul acestui capitol vom discuta numai subiectul legat de un antibiotic cunoscut,
dar condiţionat într-o formă specială, prezentând astfel o serie de avantaje. Gentamicina şi
respectiv mecanismul de acţiune al acesteia sunt elucidate. Condiţionarea în aşa fel
încât administrarea să poate f făcută pe care inhalatorie prezintă o serie de avantaje,
spre exemplu: a. eliberare mai rapidă; b. biodisponibilitate mai bună; c. remanenţă mai
bună; d. posibilitate de dozare mai bună; e. capacitatea de a ajunge mai uşor şi mai direct
la nivelul organelor afectate. Atât în cazul tularemiei cât şi în cazul pestei, formele
pulmonare sunt cele mai grave, cu cea mai mare mortalitate şi cu cea mai mare
contagiozitate, cu alte cuvinte tratamentul acestor forme de boală reprezintă o prioritate.
Având în vedere toate aceste menţiuni, gentamicina administrată pe cale inhalatorie
trebuie avută în vedere atât pentru tratament cât şi pentru proflaxia post-expunere în
cazul unui atac bioterorist.
Aceste studii sunt foarte recente iar informaţiile au devenit disponibile în ultima parte a
anului 2007.
6. 8. 2. „A da sau a nu da” aceasta este intrebarea!
Când administrăm antibiotic? Mai ales că, spre exemplu, administrarea unui antibiotic
adecvat la pacienţii cu sepsis diminuă mortalitatea într-un procent semnifcativ cu cât se
face mai precoce (de ordinul orelor). Aşadar, administrarea de urgenţă a unui antibiotic
depinde de capacitatea de a recunoaşte bolnavul „critic”. „Legarea” ulterioară de etiologia
infecţioasă a stării critice nu face decât să confrme decizia. Dacă va f incriminată, ulterior,
o altă etiologie a stării critice (IMA, pancreatita acută, HDS cu şoc etc) oprirea antibioticului
nu afectează în sens negativ evoluţia, aşa cum ar f fost afectată de întârzierea
94
administrării acestuia. La vârstnici, infecţia urinară poate f frecvent o cauză de sepsis. La
un pacient vârstnic, febril, cu hipotensiune, cu imagine EKG nespecifcă pentru un IMA
(posibil in primele ore), aşteptăm chiar şi 4 ore fără să administrăm antibiotic, până la
elucidarea modifcărilor EKG, dar dacă sursa hipotensiunii era un sepsis cu punct de plecare
renal, sau altul, atunci mortalitatea poate creşte de la simplu la dublu (17%-30%).
La pacientul care nu e critic, se pot monitoriza semnele clinice şi se poate aştepta cu
administrarea antibioticului până la determinarea posibilei etiologii infecţioase.
Dar pe de altă parte nu trebuie să uităm că nimeni nu ne opreşte, indiferent de decizia
care va f luată, să recoltăm sânge pentru hemoculturi, urină pentru uroculturi sau alte
produse, care pot f trimise către laborator înainte de începerea tratamentului
antibiotic.
6. 8. 3. S-a întâmplat nu demult în România ...
Vă aducem la cunoştinţă cazul pacientei în vârstă de 21 de ani, care s-a prezentat la
medic pentru o plagă tăiată la nivelul falangei distale a policelui mâinii stângi. Pacienta se
tăiase în marginea unei conserve pe care o desfăcuse de curând. Plaga era în aparenţă
profundă şi secţionase coronar pulpa degetului pătrunzând şi în patul unghial. Sângerarea
abundentă şi îndelungată a plăgii, dar şi durerea pulsatilă la nivelul policelui, apărută după
aproximativ o oră, au fost motivele prezentării la medic. Pacienta a menţionat faptul că
acasă a aplicat apă oxigenată pe plagă (a procedat corect, findcă apa oxigenată, prin
efectul de spumare, antrenează cheagurile de sânge şi resturile anorganice de la nivelul
leziunii, dar realizează şi o uşoară hemostază, oxigenând totodată plaga şi prevenind astfel
dezvoltarea germenilor anaerobi). De asemenea, a aplicat local un antibiotic sub formă de
pulbere (ceea ce nu este la fel de corect).
La spital, din cauza durerii intense care a cuprins între timp întreaga mână până la
articulaţia pumnului, medicul a evitat aplicarea unui prişnit alcoolizat, realizând hemostaza
plăgii şi efectuând în continuare toaletarea marginilor şi interiorului acesteia, aplicând şi
apă oxigenată. Leziunea s-a dovedit a f minoră şi în mod cert nu necesita suturare. Totuşi,
medicul curant cunoştea faptul că pacienta este studentă la facultatea de medicină şi
studiind în diferite spitale, lua aproape zilnic contact cu bolnavii, cu echipamentul medical,
dar şi cu celelalte cadre medicale. În mediul spitalicesc, atât pacienţii cât şi membrii
personalului sanitar se pot infecta dacă există soluţii de continuitate şi dacă nu se respectă
măsurile de prevenire şi control. În acest context, medicul i-a propus pacientei iniţierea
unei antibioterapii cu oxacilină (menţionând că staflococul alb şi auriu „răspund bine”),
timp de cinci zile, pentru a preveni apariţia unei infecţii piogene a degetului. Un motiv de
îngrijorare îl constituia durerea chinuitoare, pulsatilă la nivelul mâinii (apare de obicei ca un
fenomen însoţitor pentru un panariţiu subcutanat pulpar, însă abia după 24 - 48 de ore; în
cazul de faţă durerea s-a instalat la o oră de la lezarea zonei).
Deşi iniţial reticentă la ideea de a lua antibiotice în scop proflactic, pacienta a acceptat,
convinsă de către medic că riscul apariţiei unei infecţii era mare.
A doua zi, sfătuindu-se cu un medic din universitate, pacienta a „cântărit” mai bine
acest risc, ajungând la concluzia că antibioterapia pe care o urma nu era nici pe departe
necesară. Medicul de la spital a tratat leziunea ca pe o plagă chirurgicală pentru care
95
antibioterapia ar f putut să fe instituită în scop proflactic (înainte de realizarea
contaminării plăgii) sau metaflactic (în contextul unei inoculări bacteriene prezumtive). O
altă eroare, de această dată a pacientei, a fost aplicarea locală de pulbere antimicrobiană
imediat după lezarea zonei. Evident că riscul apariţiei unei infecţii exista, la fel ca şi în
„povestea drobului de sare”. Pacienta a decis să urmeze antibioterapia timp de trei zile în
loc de cele cinci recomandate; evoluţia a fost favorabilă, iar plaga s-a cicatrizat fără
complicaţii. Suntem convinşi că acest lucru a fost posibil nu datorită antibioticelor
administrate, ci datorită faptului că leziunea a fost minoră, precum şi datorită capacităţii de
răspuns a organismului. Pacienta a decis ca pe viitor, în situaţii similare, să analizeze mai
atent benefciile şi riscurile administrării de antibiotice, acest caz constituind un elocvent
contra-exemplu.
În concluzie, chiar dacă fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice este bine cunoscut
şi înţeles, iată că în România anului 2007 încă se mai prescriu antibiotice pentru orice
„zgaibă”!
6. 8. 4. Antibiotice folosite ca biostimulante
Nu doar finţele umane sunt supuse uzului iraţional al antibioticelor, ci şi animalele de
fermă. Situaţiile de necesitate, în care acestea chiar sunt bolnave, reprezintă numai o mică
parte din totalul situaţiilor în care le sunt administrate antibiotice. În majoritatea cazurilor,
medicamentele antimicrobiene sunt introduse în doze mici în hrana sau apa lor pentru
efectul biostimulant.
Încă din anii ’40, antibioticele au început să fe folosite în fermele din toată lumea
pentru capacitatea de a determina o creştere mai rapidă în greutate a animalelor. O altă
consecinţă este că acestea devin adevărate rezervoare de germeni rezistenţi, care pot f
apoi transferaţi omului. Producţia de carne creşte spre benefciul câtorva producători, dar
creşte concomitent şi ponderea bacteriilor rezistente la antibiotice, în dauna sănătăţii unei
lumi întregi.
În UE, de la 1 ianuarie 2006 a intrat în vigoare o directivă a Comisiei Europene, care
interzice folosirea antibioticelor în scop biostimulant. Lista antibioticelor utilizate în alt scop
decât cel terapeutic s-a micşorat treptat, de la an la an, pentru ca în 2006 responsabilii
europeni, pe deplin convinşi de concluziile cercetătorilor în domeniul microbiologiei, să le
interzică complet.
Fenomenul rezistenţei microbiene la antibiotice are o istorie aproape la fel de lungă ca
și cea a antibioticelor. În discursul rostit cu ocazia primirii Premiului Nobel, Alexander
Fleming avertiza în legătură cu uşurinţa cu care pot f produse microorganisme rezistente la
invenţia sa - penicilina. Nu este nevoie de altceva decât ca acestea să fe expuse la doze
mai mici decât doza bactericidă. Aceasta se întâmpla în 1945. Foarte curând temerile sale
s-au adeverit, începând să apară primele tulpini rezistente.
În 2009 s-a dovedit clar transmiterea de la animal la om a unui germen redutabil -
staflococul auriu rezistent la meticilină (MRSA).
Aşadar, în condiţiile eforturilor pentru prevenirea apariției și răspândirii germenilor
rezistenţi, sistarea abuzului de antibiotice în ferme ar trebui să se găsească în lista de
priorităţi. (11)
96
6. 8. 5. Antibiotice fără rețetă?
Tot în 2009 câţiva cercetători s-au adunat şi au avut ca scop verifcarea numărului de
site-uri care oferă antibiotice fără reţetă. Cu ajutorul motoarelor de căutare Google şi Yahoo
au găsit 138 de astfel de site-uri. Dintre acestea, 36,2% vindeau antibiotice fără reţetă iar
63,8% ofereau o reţetă online. Penicilinele erau disponibile pe 94,2% din aceste site-uri,
macrolidele pe 96,4%, fuoroquinolonele pe 61,6% iar cefalosporinele pe 56,5%. 98,6%
exportau spre SUA.
Rezultatele descrise în acest studiu sugerează că există o sursă mare de antibiotice în
SUA care nu este afectată de iniţiativele legate de schimbarea prescrierii antibioticelor şi
care poate contribui la extinderea rezistenţei la antibiotice și chimioterapice.
Comunitatea medicală împreună cu instituţiile de sănătate publică şi companiile
farmaceutice trebuie să-şi extindă eforturile pentru a controla rezistenţa la antibiotice. În
timpul anamnezei medicul poate oferi informaţii legate de antibiotice, rezistenţa la
antibiotice şi posibilele interacţiuni între antibiotice. Pacienţii au nevoie să fe educaţi în
acest sens! (12)
6. 8. 6. Și care să fe soluția?
În SUA şi UK se estimează că un foarte mare procent din infecţiile nosocomiale cu S.
aureus este produs de tulpini meticilino-rezistente (MRSA) şi o bună parte sunt MDR. O mai
mică parte din aceste tulpini (şi totuşi numărul este în creştere) prezintă nivele joase de
rezistenţă la vancomicină. S-au descoperit noi antibiotice care pot f utilizate în tratamentul
MRSA şi chiar şi a tulpinilor rezistente la vancomicina (ex. daptomicina) dar nu o să treacă
mult timp până se va dezvolta rezistenţa şi la ele. Este o soluţie inventarea continuă de noi
antibiotice?
Unele tulpini de E. coli (una din cauzele comune de ITU) sunt rezistente la antibiotice
din şase clase diferite incluzând cele mai nou recomandate, fuoroquinolonele. Mai mult
decât atât, în sudul Asiei şi în China, 60-70% E. coli sunt rezistente la fuoroquinolone. (13)
Aşa că rămâne întrebarea - ce este de făcut?
Sau mai bine zis, ce va face cititorul după ce va citi aceste rânduri?
Care este atitudinea pe care o va adopta medicul curant, studentul viitor medic sau
omul care doreşte pur şi simplu să se informeze?
Am avea o propunere: în cazul în care nu va reuși să învețe sau să aplice noțiunile
învățate ”secundum arte”, măcar să nu participe la ”implementarea” în practică a celor mai
frecvente erori în utilizarea antibioticelor și chimioterapicelor.
6. 9. Evaluarea cunoştinţelor
Alegeți răspunsul corect
1. Neutralizează acţiunea unei clase de antibiotice:
A. nucleul betalactam
B. nucleul carbapenem
C. betalactaminele
D. betalactamazele
97
E. inhibitorii de betalactamaze
7. Testarea sensibilităţii la
antibiotice şi chimioterapice
Testarea sensibilităţii la medicamentele antimicrobiene se realizează (din punct de
vedere didactic) în ultima etapă a diagnosticului de laborator microbiologic, pentru
majoritatea microorganismelor implicate etiologic. Testarea este necesară datorită apariţiei
şi extinderii rezistenţei microorganismelor la antibiotice şi chimioterapice. Rezistenţa poate
98
f naturală sau dobândită. Rezistenţa naturală este determinată genetic. Rezistenţa
dobândită este „achiziţionată” de anumite subpopulaţii dintr-o anumită specie microbiană,
în circumstanţe date, ex. prin „presiunea de selecţie” exercitată de antibiotic.
Noţiuni privind evaluarea sensibilităţii la agenţi antimicrobieni
În general, o tulpină poate f considerată sensibilă atunci când germenii sunt în mod
efcient afectaţi de către antibiotic, iar efectul terapeutic poate f obţinut cu doze şi pe căi
de administrare „obişnuite”. Tulpina va f considerată moderat sensibilă dacă germenii sunt
afectaţi într-o măsură mai mică, iar efectul terapeutic nu poate f obţinut decât în condiţii
speciale (ex. prescrierea unor doze mai mari decât cele „obişnuite”, calculate de exemplu
pe kilogram/corp; utilizarea unor căi de administrare speciale – injectare intravenoasă,
intrarahidiană etc) (Figura nr. 1, Figura nr.2). În mod absolut se consideră că o tulpină este
rezistentă dacă rezultatul testării sensibilităţii in vitro este negativ. Totuşi, trebuie să avem
în vedere că între rezultatele „in vitro” şi efectul „in vivo” pot exista diferenţe.
7. 1. Metode de testare a
sensibilităţii bacteriilor la agenţi
antimicrobieni
Deoarece între rezultatele testării „in vitro” şi efectul terapeutic „in vivo” pot exista
anumite diferenţe, metodele de testare a sensibilităţii pot f diferenţiate în:
a. metode de testare a sensibilităţii „in vitro”;
b. metode „in vivo” (metode care ţin cont de relaţia agent terapeutic-infecţie).
7. 1. 1. Metode de testare a
sensibilităţii in vitro
Antibiograma face parte din prima categorie de metode menţionate. Reprezintă metoda
de laborator prin care se apreciază sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltaţi de la
bolnavii cu infecţii bacteriene, după cultivare pe medii îmbogăţite, care să permită
dezvoltarea optimă a microorganismului pentru care se efectuează testarea (de exemplu
pe agar Mueller-Hinton).
Pentru antibiograme trebuie să folosim culturi pure (reprezentând o singură tulpină
bacteriană), chiar în cazul infecţiilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici
sunt:
· Tehnicile calitative
o antibiograma difuzimetrică comună (cu discuri)
o antibiograma difuzimetrică comparativă
o antibiograma difuzimetrică standardizată
o antibiogramele difuzimetrice rapide
· Tehnicile cantitative
o metoda diluţiilor în mediu lichid
99
o metoda diluţiilor în agar
o metoda microdiluţiilor în agar
o metoda „punctelor de ruptură”
o testul „E”
o metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.
7. 1. 1. 1. Antibiograma difuzimetrică comună
Din punct de vedere tehnic însămânţăm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar
Mueller-Hinton) turnat în plăci Petri. Însămânţarea se poate realiza de exemplu prin
„inundarea” plăcii urmată de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui
tampon (există şi alte variante tehnice). După circa 20 minute (timp în care placa Petri se
lasă cu capacul întredeschis în vecinătatea becului de gaz, aprins) se aplică
microcomprimatele în care sunt încorporate antibiotice în concentraţie standardizată.
Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, în condiţii aseptice, sau
cu ajutorul unui aplicator „automat” (la minim 30 mm distanţă între ele şi minim 15 mm de
marginea plăcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite pentru o placă Petri cu diametrul de 9 cm).
Microcomprimatele trebuie să vină în contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu
ajutorul unei pense le presăm uşor (după caz). După încă 15-20 minute, incubăm plăcile
peste noapte în termostat, la 28 sau 35-37°C, în funcţie de temperatura optimă de
multiplicare a microorganismului testat.
Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzează în mediu, realizând zone de inhibiţie
în care coloniile microbiene nu se dezvoltă (Figura nr. 3).
Cu cât zona de inhibiţie este mai largă, cu atât germenul va f considerat mai sensibil.
Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (chiar dacă diametrul înregistrat este foarte mare) se
dezvoltă colonii, „mutanţi rezistenţi”, germenul va f considerat rezistent (Figura nr. 4).
Această metodă, cu toate că este folosită pe scară largă în laboratoare, permite de fapt
numai eliminarea antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor
foarte active, pentru că tehnica nu este standardizată.
7. 1. 1. 2. Antibiograma difuzimetrică comparativă (Stokes, Balş)
Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de
referinţă, din aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Spre exemplu, pentru cocii
Gram-pozitivi putem alege pentru comparaţie o tulpină de Staphylococcus spp. Tulpina de
referinţă are o sensibilitate cunoscută la diferitele antibiotice pe care le utilizăm.
Prin această metodă se înlătură o parte din factorii de eroare ai metodei precedente,
spre ex. calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor f identice pentru
microorganismul de referinţă şi pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprimă cu
termenii: „sensibil”, „intermediar”, „rezistent”, în funcţie de diametrul zonelor de inhibiţie a
multiplicării celor doi germeni, faţă de acelaşi antibiotic (jumătăţile de cerc se examinează
comparativ). În cazul în care cunoaştem CMI (concentraţia minimă inhibitorie) a
microorganismului de referinţă, putem face aprecieri cu privire la CMI pentru
microorganismul testat.
Din punct de vedere tehnic, pe o placă de forma unui pătrat („împărţită” în 3 zone egale
marcând pe partea externă a plăcii liniile de demarcaţie) se inoculează în treimea medie
100
microorganismul de referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru
care dorim să realizăm testarea. Inoculul trebuie să fe astfel realizat încât să conducă la
apariţia după incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care să nu fe confuente. Plasăm
microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaţie dintre culturi. Incubăm peste
noapte la 35-37°C urmând ca în ziua următoare să citim şi să interpretăm rezultatele.
(Figura nr. 5)
7. 1. 1. 3. Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer, NCCLS)
Din punct de vedere tehnic se realizează asemănător cu prima metodă prezentată, dar
este standardizată, find singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional,
care permite obţinerea unor rezultate reproductibile şi corelabile între laboratoare diferite
(Film nr. 1).
Elementele necesare standardizării sunt:
· mediul (în majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru că are o valoare
nutritivă corespunzătoare şi nu conţine substanţe cu acţiune inhibitoare)
o există elemente minerale care trebuie adăugate în cazul testării anumitor
microorganisme (ex. Mg2+ şi Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa, atunci când
este testată sensibilitatea la aminoglicozide);
o se va verifca pH-ul mediului (de obicei cuprins între 7,2 şi 7,4);
o există suplimente nutritive care trebuie adăugate în cazul testării unor
microorganisme pretenţioase;
o grosimea mediului trebuie să fe de 4 mm (25 ml de mediu/placă de 9 cm);
· inoculul, care se obţine de preferat din 5 colonii izolate (cultură pură) şi trebuie să
aibă o turbiditate corespunzătoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa
108 unităţi formatoare de colonii/ml) în majoritatea cazurilor;
· timpul de incubare (în majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37°C, nu mai mult de
2-3 plăci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare;
· concentraţia substanţelor antimicrobiene din microcomprimate şi dimensiunea
microcomprimatelor (6 mm diametru);
· alegerea substanţelor antimicrobiene pentru care se face testarea;
· păstrarea plăcilor cu mediu până în momentul utilizării (maxim 7 zile, în pungi de
polietilenă, la +4°C);
· utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate;
· interpretarea rezultatelor (se măsoară diametrul zonei de inhibiţie şi se compară
rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziţie de producători şi/sau centrele de
referinţă).
Metodele difuzimetrice au dezavantajul că nu permit aprecierea concentraţiilor efcace
ale antibioticului la nivelul focarului infecţios.
101
concentraţie de agent antimicrobian, exprimată în micrograme/ml, care mai exercită o
acţiune bacteriostatică asupra germenului testat.
Din punct de vedere tehnic, pentru fecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi
cu bulion Mueller-Hinton în concentraţii descrescânde (diluţii binare) pornind spre ex. de la
16 micrograme/ml şi până la 0,125 micrograme/ml, în total 8 tuburi, plus 2 tuburi martor,
fără antibiotic (cantitatea fnală va f de 1 ml în fecare tub). Preparăm un inocul
standardizat turbidimetric şi în condiţii aseptice inoculăm toate cele 10 tuburi cu câte 1 ml
de inocul. Agităm pentru a omogeniza. Incubăm cele 8 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor
timp de 16-20 ore la 35-37°C iar al doilea tub martor îl menţinem pentru aceeaşi perioadă
la temperatura frigiderului (Figura nr. 6). Pentru controlul de calitate utilizăm şi un şir de
tuburi pe care le inoculăm cu o tulpină de referinţă corespunzătoare. În ziua următoare
citim şi interpretăm rezultatele.
Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egală cu cantitatea de mediu, concentraţia
fnală de antibiotic se va înjumătăţi (de ex. în tubul în care diluţia iniţială a fost de
16 mg/ml, diluţia fnală va f 8 mg/ml etc.). În tubul martor menţinut la +4°C ar trebui să nu
fe prezentă creşterea, în tubul martor menţinut la 35-37°C creşterea trebuie să fe
prezentă (Figura nr. 7).
În tuburile inoculate cu tulpina de referinţă trebuie să avem rezultatul corespunzător
datelor pe care le cunoaştem privitor la respectiva tulpină.
În tuburile cu microorganismul testat, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea
microorganismului corespunde CMI. Se consideră (în general, pentru că CMI diferă în funcţie
de specia microbiană) că microorganismele în cazul cărora CMI este £ 3mg/ml vor f efcient
inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo.
CMI nu are aceeaşi valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. De ex. CMI la
amoxicilină în cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 mg/ml pentru Staphylococcus aureus,
0,03 mg/ml pentru Streptococcus pneumoniae, 0,25 mg/ml pentruHaemophilus infuenzae,
2 mg/ml pentru E. coli, 16 mg ml (şi practic aceasta semnifcă „rezistenţă in vivo”)
pentru Bacteroides fragilis iar în cazul Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
aeruginosa sau Chlamydia trachomatis tulpinile sunt rezistente.
7. 1. 1. 5. Determinarea CMB (concentraţia minimă bactericidă)
Pornind de la rezultatul obţinut prin metoda diluţiilor în mediu lichid, se vor utiliza ca
sursă de inocul tuburile în care dezvoltarea microbiană a fost inhibată (Figura nr. 8).
Este necesară o placă Petri cu agar Mueller-Hinton care va f împărţită în sectoare,
numărul de sectoare find corespunzător numărului de tuburi fără creştere microbiană.
Însămânţăm în condiţii aseptice din fecare tub fără creştere microbiană, fecare în sectorul
de placă corespunzător (Figura nr. 9). Incubăm pentru 16-18 ore la 35-37°C. CMB va
corespunde ultimei concentraţii de antibiotic care a distrus microorganismele însămânţate
(sectoare de placă fără apariţia culturii) (Figura nr. 10). Se consideră că antibioticul va f
efcient in vivo dacă în serul pacientului se pot atinge concentraţii de antibiotic care să
depăşească de 4-8 ori CMB.
Determinarea CMI şi CMB este extrem de importantă pentru aprecierea efcacităţii
antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul
102
infecţiilor severe (de exemplu endocardite, meningite, sepsis etc), precum şi la
imunodeprimaţi, efectuarea acestei metode este indispensabilă.
7. 1. 1. 6. Metoda „punctelor de ruptură” (breakpoints)
Metoda este folosită în laboratoarele moderne de microbiologie şi este utilizată pentru a
defni sensibilitatea şi rezistenţa la antibiotice. Depinzând de metoda de testare rezultatele
sunt exprimate sub forma unei concentraţii (mg/l sau µg/ml) sau sub forma unui diametru
(mm). (1)
Metoda este practicată de multe dintre laboratoarele din Europa de Vest, mai ales dacă
volumul de muncă este mare sau foarte mare. Prin această metodă se pot testa mai multe
microorganisme, în acelaşi timp. Antibioticele sunt incorporate în mediul de cultură, la o
anumită concentraţie „limită”, în funcţie de cunoştinţele şi datele acumulate în ceea ce
priveşte activitatea „in vivo” a respectivelor medicamente. Plăcile sunt inoculate simultan
cu mai multe tulpini bacteriene, în „spot”, folosind un inoculator construit special, sunt
incubate în condiţii corespunzătoare pentru 16-18 ore. În cazul în care tulpina sau tulpinile
din diferitele specii bacteriene nu se dezvoltă la această concentraţie „limită” de antibiotic
(considerată ca find efcace „in vivo”), bacteria izolată este considerată sensibilă. În cazul
în care bacteria se dezvoltă (apare cultură bacteriană), bacteria izolată este considerată
rezistentă.
Această concentraţie limită (breakpoint) trebuie setată în funcţie de următoarele date:
distribuţia CMI, evaluarea raportului PK/PD (farmacocinetic/farmacodinamic) şi rezultatele
obţinute în clinică în tratamentul pacienţilor. PD reprezintă studiul efectelor medicamentului
de-a lungul timpului şi este în strânsă legătură cu PK care reprezintă modifcările
concentraţiilor medicamentului în timp.
”Punctele de ruptură” trebuie stabilite înainte ca un antibiotic să fe folosit în clinică şi
trebuie să fe revăzute când apar cazuri de rezistenţă la antibiotice. Totuşi setarea de
”puncte de ruptură” nu este perfectă. Metoda este utilă şi în realizarea unor studii
epidemiologice în ceea ce priveşte modifcarea rezistenţei la antibiotice în anumite zone
geografce. (1-2)
7. 1. 1. 7. Testul E; Determinarea CMI prin „E test”
„E test” reprezintă o metodă de testare in vitro a sensibilităţii la antibiotice pentru
diferite microorganisme, inclusiv pentru bacteriile pretenţioase şi germenii anaerobi. „E
test” se aseamănă metodei diluţiei în agar combinând principiile metodei difuzimetrice cu
cele de diluţie. „E test” este uşor de utilizat şi spre deosebire de metoda difuzimetrică
permite determinarea valorii CMI. (3)
Din punct de vedere tehnic sunt necesare: o placă Petri cu agar Mueller-Hinton, inoculul
standardizat şi langhetele din plastic pe care au fost fxate antibiotice în gradient, de ex. la
un capăt 256 mg/ml ajungând la celălalt capăt la 0,016 mg/ml (câte o langhetă pentru
fecare antibiotic, câte 15 diluţii marcate pe fecare langhetă). Însămânţăm
microorganismul care urmează a f testat în condiţii standardizate şi depunem radiar
langhetele cu antibiotice (Figura nr. 11 - Aplicarea benzii E-test” pe suprafaţa mediului de
cultură; Film nr. 2).
Principiu:
103
Asemănător metodei difuzimetrice, „E test” necesită un inocul bacterian ajustat ca
turbiditate (standardizat), ce urmează a f depus pe mediul de cultură potrivit
microorganismului studiat (ex. mediul Mueller-Hinton, geloză-sânge etc), în plăci Petri.
Benzile „E test” conţin un gradient de agent antimicrobian şi se aplică după însămânţare.
În funcţie de antibiotic, gradientul „acoperă” un şir continuu de concentraţii între 0,002-
32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,064-1024 mg/ml. După incubare (timp de 16-18 ore la
35-37°C) se formează o zonă eliptică de inhibiţie. Valoarea CMI se citeşte acolo unde
creşterea bacteriană intersectează banda „E test” (Figura nr. 12 ).
Materiale şi reactivi necesari:
· plăci Petri cu agar Mueller-Hinton (păstrate la 2-8CC până în momentul utilizării);
· bulion Mueller-Hinton (cu 20-25 mg Ca2+ şi 10-12,5 mg Mg2+/litru; se repartizează
câte 5 ml în tuburi sterile cu capac; se păstrează la 2-8CC);
· medii de cultură pentru menţinerea în stare viabilă a tulpinilor bacteriene
necesare efectuării controlului de calitate ;
· tulpini martor;
· inocul bacterian;
· soluţie salină sterilă (0,85% NaCl) sau bulion Mueller-Hinton, pentru ajustarea
inoculului bacterian;
· benzi „E test” (a. cu agenţi antimicrobieni cu nucleu β lactam, b. cu alţi agenţi
antimicrobieni); se păstrează în congelator la -20CC până în momentul utilizării (Figurile nr.
13-14. Modul de prezentare a benzilor E-test”); au o durată de utilizare de 1-2 ani (pentru
prima grupă) şi respectiv de 2-3 ani
· tampoane sterile;
· standard de turbiditate McFarland de 0,5 şi 1,0;
· pipete Pasteur sterile;
· foarfece;
· plăci Petri sterile cu diametrul de 90 mm şi respectiv de 150 mm;
· incubator cu atmosferă obişnuită reglat la 34-35CC; incubarea în atmosferă
îmbogăţită cu CO2 este necesară în cazul testării anumitor microorganisme;
· sursă de lumină;
· aplicator „E test”şi bandă adezivă (opţional).
Tehnica de lucru (Film nr. 2):
A. Benzile „E test”
· scoatem plăcile cu mediul de cultură şi benzile „E test”din congelator, le lăsăm la
temperatura camerei pentru echilibrare termică timp de 20 minute sau până când nu mai
observăm nici o urmă de umezeală
· înainte de a deschide folia care include benzile, inspectăm pentru a observa dacă
există perforări; dacă folia respectivă nu este intactă, atunci benzile din interiorul ei nu se
mai pot folosi; dacă nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai întâi tăiem cu o
foarfecă de-a lungul liniei întrerupte apoi între compartimentele ce conţin benzile
· scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete şi le punem în plăci Petri
sterile; apoi le putem aplica pe mediul de cultură care conţine inoculul microbian de testat
104
· păstrăm restul benzilor în tuburi în care introducem o substanţă desicantă pentru
a le proteja faţă de umezeală; este necesară protecţia şi faţă de căldură şi expunerea
directă la lumină (punem tuburile în congelator, la -20°C)
B. Inoculul bacterian:
· cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferăm mai multe colonii dintr-o cultură
bacteriană de 18-24 de ore într-un tub cu soluţie salină sterilă sau bulion; omogenizăm
(există şi varianta să transferăm mai multe colonii în bulion, să incubăm timp de 2-8 ore
până când obţinem densitatea dorită)
· ajustăm (vizual) densitatea folosind soluţie salină sterilă 0,85% sau bulion, la un
standard de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta la
standardul dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizuală a turbidităţii inoculului nu
garantează numărul corect al unităţilor formatoare de colonii).
C. Inocularea plăcilor:
· introducem tamponul steril în tubul care conţine suspensia bacteriană de testat,
rotim de câteva ori, apoi eliminăm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereţii
interiori ai tubului;
· depunem inoculul pe suprafaţa plăcii cu mediul de cultură având grijă să
acoperim complet suprafaţa mediului (ex. inoculăm pe 3 direcţii diferite, rotind placa cu
câte o treime);
· lăsăm placa timp de circa 10 minute, ca să se usuce, înainte de a aplica benzile
„E test”.
D. Aplicarea benzilor „E test”:
· luăm cu grijă o bandă fără să atingem sau zgâriem partea pe care este depus
agentul antimicrobian; dacă folosim pensa sterilă, apucăm cu grijă de capătul benzii notat
cu E (benzile trebuie să fe complet separate una de cealaltă înainte de a le aplica pe
suprafaţa mediului de cultură inoculat cu tulpina de testat); dacă se foloseşte aplicatorul „E
test”, banda adezivă trebuie să fe în poziţia corectă (la fecare capăt al aplicatorului);
· aplicăm banda „E test” pe suprafaţa mediului de cultură, cu capătul ce conţine
concentraţia cea mai mare aproape de marginea plăcii;
· dacă lucrăm cu plăci cu diametrul de 90 mm, aplicăm una sau două benzi; dacă
lucrăm cu plăci cu diametrul de 150 mm, putem aplica şase benzi „E test” (benzile se pun
la distanţe egale, radial, pornind din centrul plăcii; marginea capătului benzii notată
cu E trebuie să atingă marginea plăcii);
· banda trebuie să fe în contact cu suprafaţa agarului; eliminăm eventualele bule
de aer de sub bandă cu ajutorul unei pense începând de la marginea bulei şi mutând-o în
sus pe gradient până la capătul notat cu E (prezenţa bulelor mici nu va afecta rezultatul
testării);
· banda aplicată pe suprafaţa agarului nu se mută în altă poziţie (luând contact cu
mediul de cultură, agentul antimicrobian de pe partea posterioară se eliberează imediat);
dacă banda a fost aplicată cu partea posterioară în sus atunci se apucă cu grijă, se întoarce
şi se pune corect pe suprafaţa mediului; dacă banda a atins suprafaţa mesei de lucru sau
105
un alt obiect, se poate folosi în continuare atât timp cât nu a luat contact cu o substanţă
lichidă.
E. Incubarea:
· timpul şi temperatura de incubare depind de variantele de microorganism-agent
antimicrobian ce urmează a f testate;
· incubarea în atmosferă de CO2 modifcă pH-ul mediului de cultură şi poate afecta
activitatea agenţilor antimicrobieni; se foloseşte numai în cazul în care microorganismele
supuse testării necesită pentru multiplicare CO 2 (Haemophilus spp.,Neisseria
gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae etc).
Interpretarea rezultatelor:
· putem citi rezultatul în cazul în care creşterea bacteriană este confuentă sau
aproape confuentă (Figura nr. 15 - Interpretare rezultate E-test pentru E. coli);
· ţinem placa lângă o sursă de lumină (atunci când mediul este Mueller-Hinton);
citim valoarea CMI în punctul în care creşterea bacteriană intersectează banda „E test”;
dacă am utilizat agar Mueller-Hinton suplimentat cu 5% sânge de oaie, sau geloză-
chocolate Mueller-Hinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o sursă
de lumină refectantă şi o lupă;
· pe geloză-sânge citim zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie
a hemolizei;
în cazul în care nu apare nicio zonă de inhibiţie, raportăm valoarea CMI ca find mai
mare decât cea mai mare concentraţie a agentului antimicrobian de pe banda „E test”
(Figura nr. 16 Interpretare rezultate E-test pentru staflococ); dacă zona de inhibiţie nu
intersectează banda (zona de inhibiţie se afă sub banda „E test”), valoarea CMI se
raportează ca find mai mică decât concentraţia cea mai scăzută a agentului antimicrobian
de pe banda „E test”;
· în cazul unei valori CMI situată între două marcaje ale gradientului benzii,
rezultatul pe care îl notăm va f valoarea cea mai mare;
· raportăm rezultatul obţinut pentru tulpina studiată după ce verifcăm rezultatul
obţinut pentru tulpina de referinţă (control de calitate);
· rezultatele CMI se interpretează conform criteriilor stabilite de NCCLS (National
Committee for Clinical Laboratory Standards) (Figura nr. 17 - Tabel NCCLS pentru
enterobacterii).
7. 1. 1. 8. Alte tehnici de testare clasice
· Testarea sensibilităţii la antibiotice a bacteriilor anaerobe
o metodele sunt utile în special din punct de vedere al supravegherii epidemiologice,
dar sunt rezervate pentru laboratoarele de referinţă
o se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid, tehnici de microdiluţii în
mediu lichid, teste pentru producerea de β-lactamază etc.
· Testarea sensibilităţii mycobacteriilor
o se efectuează respectând prevederile Programului Naţional de Control al
Tuberculozei (care indică situaţiile în care vor f efectuate aceste testări)
106
o se pot utiliza metoda concentraţiilor absolute, metoda proporţiilor, metoda
rapoartelor de rezistenţă, metode radiometrice etc (Figura nr. 18).
· Testarea sensibilităţii altor bacterii
o există şi alte bacterii pentru care trebuie respectate condiţii particulare
o spre exemplu pentru testarea sensibilităţii staflococilor la oxacilină/meticilină se
recomandă ca mediul să conţină 4% NaCl, pentru testarea sensibilităţii la antibiotice a
streptococilor se recomandă ca mediul să conţină 5% sânge defbrinat de berbec etc. (4)
· Testarea sensibilităţii fungilor (antifungigrama)
o ţine cont de temperatura şi durata de incubare, care diferă faţă de cele pentru
bacterii, mediul utilizat find mediul Sabouraud
o se pot utiliza tehnici de diluţie în mediu lichid sau solid (Figura nr. 19).
· Testarea producerii de β-lactamaze
o este utilă atunci când se verifcă sensibilitatea la antibiotice a microorganismelor
care pot produce β-lactamază (ex.Haemophilus spp., Staphylococcus aureus etc)
o se pot utiliza teste iodometrice, teste acidimetrice, teste cu cefalosporine
cromogene etc; există şi metode puse la punct pentru testarea sintezei de β-lactamaze cu
spectru extins (ESBL) (Figura nr. 20).
· Există şi sisteme automate (ex. ATB şi rapid ATB) sau sisteme semiautomate (ex.
ATB Expression sau miniAPI), pentru testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice,
utilizând criteriile de interpretare NCCLS (Figura nr. 21).
7. 1. 1. 9. Tehnici de biologie moleculară utilizate în testarea sensibilităţii la
antibiotice şi chimioterapice
Au fost imaginate o serie de metode semi-automatizate sau automatizate pentru a
optimiza obţinerea unor rezultate corecte şi în timp cât mai scurt, cu privire la
sensibilitatea/rezistenţa microorganismelor la antibiotice şi chimioterapice. Metodele care
au la bază tehnicile de biologie moleculară pot f foarte utile (chiar dacă costurile sunt mai
ridicate). De ex. se cunoaşte că agentul etiologic al tuberculozei se multiplică lent pe medii
de cultură şi în aceste condiţii rezultatele vor f obţinute în circa 2 săptămâni prin metodele
clasice. Se pot utiliza diferite tehnici şi în fnal hibridizarea moleculară pentru a studia
diferite mutaţii care pot să dea informaţii cu privire la sensibilitatea/rezistenţa tulpinilor
studiate. Spre ex. INNO-LIPA Rif. TB (LIPA= Line Probe Assay), se realizează cu ajutorul unei
truse comerciale puse la punct în USA. Metoda permite concomitent identifcarea M.
tuberculosis precum şi testarea sensibilităţii la rifampicină, după o amplifcare genetică a
unui material (ADN) provenit fe din culturi mycobacteriene, fe chiar din produse clinice
(Figura nr. 22).
Principiul INNO-LIPA este hibridizarea ADN-ului rezultat dintr-o amplifcare prin PCR
(Polymerase Chain Reaction) cu sonde nucleotidice specifce, imobilizate sub forma unor
linii (benzi) paralele, pe fâşii de nitroceluloză. Sondele nucleotidice (S1-S5) sunt biotinilate
(cuplate cu biotină). După hibridizare se adaugă streptavidină conjugată cu fosfatază
alcalină, acest conjugat ataşându-se de produşii de hibridizare rezultaţi anterior. Incubarea
în prezenţa unui reactiv cromogen conduce, în cazul existenţei hibridizării, la apariţia unor
benzi colorate, vizibile. În cazul testării rezistenţei la rifampicină, se urmăreşte apariţia
107
unei/unor mutaţii la nivelul genei care codifcă pentru subunitatea β a ARN polimerazei
(gena rpoB). (5-6)
Identifcarea apartenenţei tulpinii testate la specia M. tuberculosis, este certifcată cu
ajutorul unei oligonucleotide specifce, situată în poziţia a 3-a, după linia care marchează
fecare fâşie-test şi respectiv linia care permite verifcarea calităţii conjugatului (conjugate
control).
Produsul unei tulpini sensibile la rifampicină deţine fragmente amplifcate, care
hibridizează cu sondele specifce S1, S2, S3, S4 şi respectiv S5. Absenţa uneia sau a mai
multor benzi demonstrează că tulpina este rezistentă la rifampicină (Figura nr. 23).
Pentru tulpinile rezistente la rifampicină, trusa comercială INNO-LIPA permite
suplimentar aprecierea locusului mutaţiei. De exemplu, o tulpină poate prezenta o mutaţie
în regiunea R5 (serină-leucină) în timp ce altă tulpină prezintă o mutaţie în regiunea R4a
(histidină), aceste mutaţii apărute la nivelul genei rpoB find dintre cele mai frecvente şi pot
f identifcate prin această metodă.
7. 1. 2. Metode de testare a
sensibilităţii in vivo şi de
apreciere a efcienţei terapeutice
Efcienţa terapeutică poate f apreciată clinic, paraclinic şi prin teste de laborator. Există
unele criterii nespecifce de laborator care sunt utile în aprecierea efcienţei terapeutice,
precum leucograma, examenul sedimentului urinar, examenul citologic al LCR, VSH,
proteina C reactivă etc.
Dintre metodele specifce utilizate pentru aprecierea efcacităţii terapeutice sau pentru
evaluarea eventualei nocivităţi a medicamentelor folosite, vom enumera:
· determinarea NEI (nivel de efcienţă inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte
umori (Figurile nr. 24-26 - Citirea NEI din hemocultură sub terapie cu ertapenem; Film nr.
3);
· determinarea NEB (nivel de efcienţă bactericidă) pentru ser, LCR sau alte
umori; puterea bactericidă a serului celor trataţi (NEB) măsoară capacitatea diluţiilor din
serul unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul conţinând germenul infectant;
se determină diluţia cea mai înaltă de ser care mai manifestă capacitate bactericidă
(Figurile nr. 27-29);
· utilizarea acestor metode a fost indicată în cazul endocarditelor bacteriene,
osteomielitelor, fbrozei chistice sau sepsisului la pacienţi cu variate grade de
imunodepresie; produsele se recoltează de obicei la o oră după administrarea unei doze şi
cu câteva minute înainte de administrarea următoarei doze de antibiotic; (Film nr. 4 –
Citirea NEI, Efectuarea NEB)
· determinarea nivelului de antibiotic realizat în sânge, LCR sau în alte umori (prin
metode microbiologice, enzimatice, HPLC etc).
108
7. 2. Povestiri adevărate
7.2.1. Rezistenţa la antibiotice a tulpinilor de S. aureus în România,
comparativ cu EU
În statele Uniunii Europene, serviciile de sănătate publică şi-au îndreptat atenţia în
ultimii ani către staflococul auriu meticilino-rezistent (MRSA), incidenţa acestei specii
microbiene find într-o permanentă creştere atât în infecţiile nosocomiale, cât şi în cele
comunitare. Alături de alţi agenţi patogeni care stau la baza declanşării de infecţii
nosocomiale (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella
spp., Aspergillus spp. etc.), MRSA este agentul etiologic izolat în aproximativ 5% din totalul
acestor infecţii.
În vederea monitorizării în timp şi spaţiu a susceptibilităţii, dar şi a rezistenţei la
antibiotice a diferitelor specii bacteriene cu potenţial patogen crescut, s-a pus la punct
EARSS (European Antimicrobial Resistance Surveillance System) – un program de
supraveghere a sensibilităţii la antibioticele folosite în practica medicală curentă a tulpinilor
izolate de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, E. coli, Enterococcus faecalis
/ faecium, K. pneumoniae şi P. aeruginosa). Supravegherea tulpinilor de S. aureus şi implicit
a MRSA este realizată începând cu anul 1999.
În anul 2006, 31 de state din Europa au raportat către EARSS efectuarea testării
sensibilităţii la antibiotice pentru un număr de 29.552 de tulpini de S. aureus izolate. Dintre
acestea, 7.037 (23,81%) au fost identifcate ca find MRSA. Dintre cele 31 de state, 15 au
raportat o incidenţă a infecţiilor cu MRSA mai mare de 25%. În ţări precum Croaţia, Grecia,
Islanda, Malta, Turcia, MRSA s-a izolat cu precădere în unităţile de terapie intensivă (peste
60% din totalul tulpinilor de MRSA).
Din raportul pe 2006 al EARSS reiese faptul că în statele din Europa Centrală, rata
infecţiilor nosocomiale şi comunitare cu MRSA se situează între 7-22%, comparativ cu
partea de nord a continentului, unde rata este sub 4%. Marea Britanie a raportat între 1.500
şi 4.000 de tulpini de MRSA pe an, Franţa între 1.700 şi 3.900 de tulpini pe an, Suedia între
1.300 şi 2.000 de tulpini pe an, Germania între 800 şi 1.300 de tulpini pe an, Slovenia între
150 şi 365 de tulpini pe an, iar Bulgaria a raportat între 100 şi 170 de tulpini pe an.
În comparaţie cu aceste stateRomânia a raportat în perioada 2002-2006 un număr
foarte scăzut de tulpini, variind între 78 şi 92 de tulpini pe an (circa jumătate din numărul
de tulpini raportate de Slovenia şi de circa 16 ori mai puţine decât Suedia); în acest
context, datele raportate la ECDC nu au valori statistic semnifcative.
În anul 2005 s-a efectuat în ţara noastră, la Institutul de Boli Infecţioase „Matei Balş”,
un studiu al cărui obiectiv principal a fost stabilirea spectrului de sensibilitate la antibiotice
pentru un număr de 589 de tulpini de S. aureus izolate. Peste jumătate din tulpini au fost
izolate de la nivel faringian, dar s-au izolat tulpini şi din leziuni cutanate, prin hemocultură
etc. Testarea sensibilităţii la antibiotice a fost efectuată prin E-test, evidenţiindu-se 92
(15,61%) tulpini de MRSA. Acest nivel redus al meticilino-rezistenţei poate f corelat, printre
altele, cu numărul mare de tulpini izolate din exsudat faringian, la care nivelul de
meticilino-rezistenţă este mai mic de 10%. Studiul a relevat faptul că macrolidele, ciclinele
109
şi cotrimoxazolul constituie în prezent alternative terapeutice compromise, rămânând
active (pentru tulpinile identifcate în institut) în antibioterapie clindamicina, rifampicina şi
aminoglicozidele. Procentul de tulpini de S. aureus penicilino-rezistente raportat a fost de
26% (şi nu de 100% cum ar putea părea că este sugerat atunci când, în relaţie cu o tulpină
de S. aureus, penicilina este „uitată” complet).
Tulpinile de MRSA constituie o problemă de sănătate publică pe tot cuprinsul Europei.
Totuşi, faptul că în unele ţări (cum ar f Cipru sau Turcia) incidenţa infecţiilor cu MRSA este
în scădere, reprezintă o speranţă în încercarea de a controla rata infecţiilor nosocomiale şi
respectiv a celor comunitare în care sunt implicate tulpinile de MRSA.
7.2.2. Este începutul sfârşitului erei antibioticelor?
Conform unor studii recente s-a descoperit o nouă genă numită New Delhi metallo beta
lactamază sau NDM 1. Această genă se găseşte la nivelul plasmidelor şi astfel poate f
copiată cu uşurinţă şi transmisă altor tipuri de bacterii. Pentru prima dată bacteria care
purta gena NDM a fost izolată de la un pacient suedez de origine indiană care a avut
infecţie urinară în timp ce vizita New Delhi. Studiile arată că între 1 şi 4% dintre bacteriile
Gram negative din sudul Asiei poartă gena NDM.
NDM a fost identifcată cu precădere la E.coli şi Klebsiella pneumoniae, tulpinile
devenind înalt rezistente la toate antibioticele cu excepţia tigecycline şi colistin. Dar există
cazuri în care nici aceste antibiotice nu sunt efciente. În prezent nu există alte antibiotice
pentru a distruge bacteriile purtătoare ale acestei gene. Pot apărea infecţii obişnuite
precum infecţiile tractului urinar cauzate de microorganisme rezistente la antibiotice. O
încercare pentru tratarea acestor infecţii ar putea f administrarea unor ”cocktail-uri” de
antibiotice în sparanţa că acestea vor avea un efect sau se pot folosi doze foarte mari dar
există pericolul de intoxicaţie sau a altor reacții adverse.
Din cauza turismului medical în general mai ales pentru proceduri precum chirurgia
estetică această nouă superbacterie se poate răspândi în întreaga lume. În urma unui
studiu s-a constat că NDM1 a fost identifcată mai ales în Bangladesh, India şi Pakistan şi a
ajuns în Marea Britanie prin intermediul unor pacienţi care s-au întors din aceste ţări după
tratament.
Rezistenţa la antibiotice trebuie considerată o problemă globală, mondială. (7)
8. Relaţiile microorganism -
gazdă
Fiinţa umană poate intra în contact cu microorganismele încă din perioada intrauterină,
însă acest contact se realizează numai în cazuri patologice (infecţioase, traumatice etc). În
perioada postnatală începe stabilirea relaţiilor operaţionale între finţa umană şi populaţia
microbiană din mediul înconjurător, fe prin colonizare saproftică, fe prin agresiune ce
110
devine evidentă. Imediat după naştere, microorganismele se stabilesc treptat pe
tegumente şi pe majoritatea mucoaselor. Este vorba în principal de microorganismele care
vor alcătui microfora normală a organismului.
Aceasta joacă un rol important în protejarea gazdei faţă de o invazie microbiană
ulterioară, acţionând prin următoarele mecanisme:
- competiţia faţă de aceiaşi nutrienţi (interferenţă);
- competiţia pentru aceiaşi receptori de pe celulele gazdei (tropism);
- producţia de bacteriocine (colicine, piocine);
- producerea de acizi graşi volatili sau alţi metaboliţi;
- stimularea continuă a sistemului imun pentru a menţine un nivel scăzut (dar constant)
al exprimării moleculelor din clasa a II a de histocompatibilitate (DR) pe macrofage şi alte
celule prezentatoare de antigen;
- stimularea producerii unor factori imuni de protecţie încrucişată, ca de exemplu aşa-
numiţii anticorpi naturali.
Cu alte cuvinte, trebuie avute în vedere toate aceste aspecte atunci când se utilizează
antibiotice cu spectru larg, care vor scădea numărul microorganismelor la nivel intestinal şi
vor permite multiplicarea fungilor şi a microorganismelor rezistente la aceste antibiotice. Ca
urmare, la oprirea terapiei pot apărea fenomene de „rebound”, manifestate prin
repopularea tractului digestiv în avantajul enterobacteriilor faţă de germenii anaerobi.
8. 1. Flora microbiană a
organismului
Flora microbiană a organismului poate f divizată în două grupuri:
- fora normal rezidentă, care se găseşte în mod regulat şi care dacă este perturbată se
restabileşte prompt (sau destul de prompt)
- fora tranzitorie care poate coloniza gazda pe o perioadă variabilă de timp, de la ore la
săptămâni.
Flora microbiană prezintă tropism pentru anumite regiuni anatomice. (Tabelul nr. 1)
a). La nivelul tegumentului
În funcţie de contactul cu mediul înconjurător, fora bacteriană prezintă un grad marcat
de variabilitate. Mai frecvent, la nivel tegumentar se pot găsi Staphylococcus epidermidis,
Corynebacterium spp., Micrococcus spp., dar,temporar, tegumentul poate f contaminat cu
germeni coliformi, chiar staflococi potențial patogeni precum Staphylococcus aureus, însă
fără manifestări nete de agresivitate.
b). La nivelul conjunctivei oculare
Conjunctiva este puţin colonizată, deoarece secreţiile lacrimale conţin substanţe
bactericide (ex. lizozim), iar clipitul asigură îndepărtarea mecanică a corpilor străini,
inclusiv a bacteriilor. Pot f totuși identifcați Staphylococcus epidermidis,Propionibacterium
spp., Corynebacterium spp.
c). La nivelul mucoasei nazale
111
În mod normal se pot găsi staflococi aurii şi albi, streptococi, corynebacterii,
pneumococi etc, foră supusă numeroaselor contaminări prin contacte şi traumatisme
locale.
d). La nivelul cavităţii bucale
La nivelul cavităţii bucale fora conţine diferiţi coci şi bacili Gram-pozitivi şi Gram-
negativi, aerobi şi anaerobi (de exemplu staflococi, streptococi precumS. salivarius, S.
sanguis, S. mutans, lactobacili, spirochete, neisserii saprofte, sau anaerobiiVeillonella spp.,
Actinomyces spp., Fusobacterium spp., Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyromonas
spp.), de origine aeriană sau alimentară. Există o adevărată microbiologie orală, cu
diferenţe în funcţie de localizare. Spre exemplu, pentru o celulă de la nivelul dosului limbii
există aproximativ 100-150 bacterii, într-un ml de salivă sunt circa 100.000.000 bacterii, iar
la nivelul plăcii dentare, circa 100.000.000.000 bacterii (aproximativ 35 de specii
bacteriene diferite, cele dominante findStreptococcus sanguis şi Streptococcus mutans).
Placa dentară, cariile şi boala parodontală sunt cauzate de bacteriile ce constituie fora
normală bucală.
e). La nivelul tractului respirator
Mucoasa nazală este întotdeauna bogat colonizată, find supusă unor numeroase
contaminări prin contacte şi traumatisme locale. În mod normal se pot găsi Staphylococcus
epidermidis, Staphylococcus aureus (la aproximativ 20% din populaţie), streptococi,
corynebacterii, pneumococi etc.
Flora de la nivelul faringelui se aseamănă în compoziţie cu fora cavităţii bucale. Astfel
se pot găsi streptococi, neisserii saprofte, bacili Gram-negativi-Lactobacillus spp,
Bacteroides spp.
Tractul respirator inferior este steril, fapt datorat și clearance-ului mucociliar.
f). La nivelul tractului digestiv
La acest nivel există o diferenţă evidentă în funcţie de segmentele acestuia, exprimate
mai ales prin chimismul local. Luând ca exemplu colonul copilului mare şi al adultului, la
acest nivel se găsesc o serie de bacili Gram-negativi (enterobacterii), precum şi foarte
numeroşi germeni anaerobi (Bacteroides spp., enterococi) etc, în total existând aproximativ
1011 bacterii la 1 g de materii fecale. Se va detalia mai jos (8.2) despre compoziţia şi
funcţiile forei normale digestive.
g). La nivel urogenital
Urina este în mod normal sterilă, iar în timpul micţiunii bacteriile de pe tractul urinar
inferior sunt cel mai frecvent îndepărtate. Totuşi, în uretra anterioară poate exista o foră
care este cel mai frecvent alcătuită din fungi, stafococi, corinebacterii şi enterobacterii.
Flora vaginală este dominată de lactobacili (fora Döderlein) asociaţi în proporţii diferite
cu mycoplasme nepatogene, staflococi, streptococi, enterococi, clostridii, Candida spp.,
Bacteroides spp. etc. Predominanţa lactobacililor menţine local un pH acid nefavorabil
multiplicării altor germeni (în special patogeni). Mucusul cervical are în plus o acţiune
bactericidă prin lizozim. La femeile fără activitate sexuală predomină lactobacilii, pe când la
restul compoziţia forei este mixtă.
112
8. 2. Flora microbiană normală
din sistemul intestinal
Cea mai puţin înţeleasă parte a organismului îndeplineşte funcţii esenţiale fziologice,
nutriţionale şi de protecţie. Complexitatea acestui sistem ascunde mecanisme ce
infuenţează anatomia, fziologia, cât şi patologia umană. Flora normală intestinală
cântăreşte aproximativ 1 kg şi conţine o bună parte din celulele corpului uman.
Speciile bacteriene ce colonizează sistemul intestinal sunt foarte variate. Flora normală
este unică, variind semnifcativ de la un individ la altul, iar compoziţia ei se menţine
constantă lungi perioade de timp. Astfel a apărut noţiunea de „amprentă microbiană
unică”.Aceste bacterii sunt de 10 ori mai numeroase decât celulele eucariote ale corpului
uman. În colon există cele mai multe microorganisme comensale: 10 11-1012 UFC/ml. Colonul
este organul cel mai activ metabolic din întreg organismul. (Figura nr. 1)
8. 2. 1. Achiziţia forei normale
Înainte de naştere, în condiţii fziologice, fătul este „germ-free” (nu prezintă
microorganisme). Apoi, întreg corpul uman și implicit şi tractul gastro-intestinal este
colonizat de bacterii aerobe ce aparţin microforei materne, de ex. Escherichia
coli sauStreptococcus spp.
După aproximativ o săptămână, încep să predomine bacteriile anaerobe.
În cazul în care nou-născutul este hrănit cu lapte matern, vor exista mai multe bacterii
Gram-pozitive, de tipulBifdobacterium spp. sau Lactobacillus spp.
În cazul alăptării artifciale, situaţie nedorită şi nerecomandată pentru dezvoltarea
sugarului, vor predomina bacteriile Gram-negative, iar fora microbiană intestinală va
deveni foarte asemănătoare cu cea a adultului incluzând Enterobacteriaceae şi specii din
genul Bacteroides.
Flora normală a adultului conţine reprezentanţi din toate cele 3 domenii de
viaţă: Eukaryota, Bacteria, Archaea, după cum urmează.
Din domeniul Bacteria, regăsim microorganisme din genurile Bacteroides (care
reprezintă circa 30% din fora
normală),Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostre
ptococcus, Bifdobacterium, Escherichia şi Lactobacillus.
Din domeniul Archaea, regăsim microorganisme din genul Methanobrevibacter.
Iar din domeniul Eukaryota, regăsim microorganisme din
genurile Candida, Sacharomyces, Aspergillus şi respectivPenicillium.
8. 2. 2. Cultivarea în laborator
Majoritatea speciilor bacteriene rezidente în intestin nu au putut f cultivate pe medii
standard de laborator. Acestea necesită condiţii speciale, cât mai asemănătoare celor din
sistemul intestinal. Fiziologia acestui ecosistem este extrem de complexă: interacţiunile
dintre factorii secretaţi de bacterii nu sunt înţelese complet, iar efectele per ansamblu ale
substanţelor proprii organismului asupra forei microbiene sunt, de asemenea, puţin
cunoscute.
113
Prin metode moderne ale biologiei moleculare, se poate studia, în timp util şi într-un
mod foarte efcient, ADN-ul bacterian.
Dintre toate structurile moleculare studiate, ARNr este cea mai puţin variabilă. S-a
demonstrat că anumite porţiuni ale secvenţei ADNr a diferitor organisme înrudite între ele
sunt remarcabil de similare. Astfel, se poate deduce următoarea idee: secvenţierea genelor
unor organisme apropiate flogenetic poate f aliniată foarte precis, astfel obţinându-se o
evaluare mult mai exactă a diferenţelor existente. Cum? Prin compararea zonelor
hipervariabile ale ARNr, extrem de specifce unei anumite specii. Din acest motiv, genele
care codifcă pentru ARNr (ADNr) au fost utilizate pentru a determina taxonomia, flogenia
şi pentru a specifca ratele de diferenţiere dintre speciile bacteriene. De asemenea, analiza
după realizarea secvenţierii ARNr 16S oferă numeroase informaţii asupra evoluţiei
bacteriene şi asupra relaţiilor dintre specii. Iniţiatorul acestor metode a fost Carl Woese, cel
care a propus ulterior clasifcarea microorganismelor în sistemul celor trei
domenii Archaea, Bacteria şi Eucarya.
Spre exemplu, într-un studiu s-a analizat prin secvenţierea ARNr 16 S (aparţine
subunităţii mici 30 S ribozomale) acid nucleic bacterian provenit de la 50 tulpini. Astfel, s-au
descoperit 1.250 secvenţe diferite, dintre care 85% nu au putut f identifcate. Majoritatea
nu aparţin grupurilor taxonomice cunoscute şi clasifcate până în momentul de faţă, în timp
ce mai mult de jumătate nu au mai fost descoperite în nici un alt situs sau în afara
organismului.
Până în prezent au fost identifcaţi aproximativ 420 membri ai forei normale, făcând
parte din 117 genuri diferite. Se presupune că există peste 1.000 de specii bacteriene în
sistemul nostru intestinal.
Un exemplu de algoritm de diagnostic/identifcare ar f următorul:
1. Prelevarea de produs (materii fecale)
2. Depozitarea preparatului în una din următoarele variante:
-procesare imediată
sau
- îngheţare la -80° C
sau
-depozitare într-un aparat de depozitare şi prelucrare special (PSP® Spin Stool DNA Plus
Kit), la temperatura camerei
3. Purifcarea acidului nucleic
-există și kituri comerciale
-liza celulară cu ajutorul unui kit
4. Amplifcarea ADN prin tehnica PCR utilizând primeri ale căror ţinte sunt regiunile
variabile ale genei ARNr 16S
5. Analiza şi interpretarea rezultatelor
8. 2. 3. Modifcări ale forei intestinale normale
Compoziţia forei microbiene normale este infuenţată de numeroşi factori, precum stilul
de viaţă, dieta, starea de sănătate versus starea de boală, vârsta. Astfel, dacă este
114
urmărită evoluţia în timp a prezenţei speciilor de Bifdobacterium şiEnterobacteriaceae în
sistemul intestinal, se vor observa diferenţe semnifcative:
Bifdobacterium spp. se afă în cantitate maximă la copil, în cantitate medie la adult şi
respectiv în cantitate minimă la persoanele în vârstă, în timp ce Enterobacteriaceaele se
afă în cantitate maximă tot la copil, în cantitate minimă la adult şi în cantitate medie la
persoanele în vârstă. (Schema nr. 1; Factori ce determină modifcarea compoziţiei forei
normale)
De-a lungul tractului gastro-intestinal se realizează o selecţie prin cooperarea dintre
gazdă şi diferitele bacterii. O serie de factori locali determină o distribuţie neuniformă a
forei, dintre aceştia putem aminti:
-factori fzici:
• temperatura;
• gradientul de oxigen (majoritatea speciilor bacteriene sunt anaerobe);
-factori chimici:
• pH-ul (între mese, nu există microorganisme la nivel gastric);
• procentul de H2O;
• acizii biliari;
• secreţia pancreatică;
• nivelele diferiţilor nutrienţi;
• secreţia locală de imunoglobuline;
• diferitele substanţe produse tocmai de către bacterie;
-factori mecanici:
• peristaltismul intestinal (bacteriile se pot ataşa de mucoasă atunci când
peristaltismul este scăzut; iată şi unul dintre motivele pentru care medicamentele anti-
peristaltice nu sunt benefce în infecţiile digestive); (Tabelul nr. 2)
• fenomenul de competiţie între diferitele specii bacteriene etc.
115
- celulele dendritice îl prezintă limfocitelor T naive şi determină proliferarea limfocitelor
Th1, cu adoptarea unui răspuns imun de tip celular .
Dacă în lipsa forei, organismul tinde spre un răspuns imun de tip umoral, realizat prin
limfocitele Th2, în prezenţa acesteia se echilibrează reacţia sistemului imunitar Th1-Th2.
Astfel, fora microbiană normală „educă” sistemul imun şi contribuie la dezvoltarea şi
funcţionarea normală a acestuia. Toleranţa faţă de bacteriile nepatogene, precum şi
sensibilitatea faţă de bacteriile patogene se dezvoltă începând cu primele zile de după
naştere, iar echilibrul dintre ele este esenţial. (Figura nr. 2)
8. 3. 1. 2. Flora microbiană intestinală ar putea reprezenta cheia în prevenirea
unor stări de hipersensibilitate
Conform acestor explicaţii, în lipsa forei, sistemul imun tinde „să se orienteze” spre un
răspuns de tip umoral. Acest tip de răspuns imun poate f implicat în apariţia stărilor de
hipersensibilitate (ex. de tip I), printr-o secreţie excesivă de imunoglobuline. Într-un studiu
al cercetătorilor de la University of Michigan Medical School, s-a observat o
hipersensibilitate la nivel respirator, apărută faţă de ovalbumină (un cunoscut alergen) la
şoarecii cu fora normală gastro-intestinală distrusă de antibiotice.
Un alt argument al implicaţiilor forei normale asupra sistemului imunitar este diferenţa
cunoscută dintre compoziţia forei normale a copiilor cu diversele forme de
hipersensibilitate, comparativ cu fora intestinală la copiii sănătoşi; copiii din prima
categorie prezintă un nivel crescut al speciilor de Clostridium difcile şi Staphylococcus
aureus, în timp ce speciile din genurileBacteroides şi Bifdobacteria sunt în cantitate mică.
8. 3. 1. 3. Stresul produs de către sistemul imunitar pare să reprezinte un
semnal de atac pentru bacterii
S-a descoperit faptul că Pseudomonas aeruginosa, ce aparţine forei normale la 3% din
oameni, deţine receptori pentru IFN-γ, mesager al sistemului imun, util în reglarea
răspunsului imun, inclusiv în cazul activării răspunsului imun anti-infecţios. Această citokină
este „recunoscută” drept o structură negativă şi, drept consecinţă, bacteria îşi activează
genele de patogenitate. În aceste condiţii, Pseudomonas aeruginosa reuşeşte să eludeze
răspunsului imun, se multiplică, selectează factori de rezistenţă la antibiotice, secretă
toxine, sau poate penetra peretele intestinal (P. aeruginosa a fost izolată în sepsis, iar unica
sursă posibilă era reprezentată de fora intestinală). În urma unor intervenţii chirurgicale
majore a fost raportată o frecvenţă crescută a sepsisului cu implicarea Pseudomonas
aeruginosa.
Ipoteza foarte interesantă şi relativ recentă, care decurge din diversele studii realizate
de cercetători din universităţile americane este că bacteriile nu „simt” nevoia şi nici nu
„intenţionează” să descopere o oportunitate de atac, dar, atunci când se simt ameninţate,
dezvoltă un plan de reacţie.
8. 3. 1. 4. Bacteriile au „propriul sistem imunitar”
La întrebarea privind modul de răspuns al bacteriilor faţă de informaţia genetică
externă sistemului în care se dezvoltă în mod obişnuit, cercetătorii au lansat o serie de
ipoteze. Se pare că bacteriile au capacitatea de a recunoaşte ADN-ul străin. În materialul
nuclear bacteriile deţin proteina H-NS care are funcţia unui receptor pentru moleculele de
116
adenină şi timină din structura ADN-ului existent în mediul exterior. Această proteină
previne activarea lui şi blochează exprimarea informaţiilor ce ar putea dăuna bacteriei. Se
pare că microorganismele pot folosi ADN din surse externe pentru a exprima caractere de
patogenitate. Cercetătorii sugerează un fapt foarte interesant: bacterii cunoscute în prezent
drept patogene, în trecut au fost nepatogene (Shigella spp., Vibrio cholerae, Yersinia
pestis etc., ar f devenit patogeneprin cooptarea de ADN-ului din mediul extern).
Aceste studii oferă şi o nouă viziune asupra evoluţiei bacteriilor dar şi asupra utilizării
capacităţii unor bacterii (modifcate genetic) de a produce proteine recombinate. La
bacteriile lipsite de H-NS, care nu inactivează structurile genetice umane, producţia de
proteine este mai efcientă.
8. 3. 1. 5. Diferenţierea bacteriilor comensale de cele patogene
Mecanisme ale gazdei
Organismul gazdă deţine sistemul PRR (pattern recognition receptor), care
include familia TLR (toll-like receptors) de receptori extracelulari şi NOD/CARD (nucleotide
binding oligomerization domain / caspase recruitment domain isoforms), familie de
receptori intracelulari. (Figura nr. 3)
Celule implicate în procesul de diferenţiere sunt:
- enterocitele de suprafaţă;
- celulele M din foliculii limfoizi şi
- celulele intestinale dendritice.
Enterocitele deţin receptori PRR, iar la contactul cu bacteriile patogene eliberează IgA,
chemokine, citokine şi peptide antibacteriene. Celulele M transportă antigenele luminale
către celulele prezentatoare de antigen (celule dendritice, macrofage etc.) care le prezintă
în continuare limfocitelor T naive. Celulele intestinale dendritice deţin receptori PRR. Ele îşi
trimit dendritele către suprafaţă, recunosc antigenele, le cooptează şi le transportă către
ganglionul limfatic. Aici prezintă antigenele limfocitelor T naive. În ganglion este declanşat
răspunsul imun care poate f efector, prin intermediul limfocitelor T helper (Th1, Th2), sau
reglator, prin limfocitele T cu rol în reglarea răspunsului imun.
La contactul dintre bacteria comensală şi receptori nu apare răspuns infamator sau
chiar poate să apară un efect de protecţie, prin inhibiţia reacţiilor infamatorii care ar putea
f declanşate de bacteriile patogene.
Molecule precum TOLLIP (Toll interacting protein), SIGIRR (single Ig IL-1 R-related
molecule) şi NOD2 determină toleranţa faţă de fora normală gastro-intestinală, prin
inhibarea TLR sau prin blocarea cascadei infamatorii. Limfocitele T reglatoare şi celulele
intestinale dendritice deprimă la rândul lor reacţia infamatorie.
Mecanisme ale forei
Toleranţa faţă de fora normală nu este determinată doar de structurile gazdei.
Bacteriile comensale deţin mecanisme efectoare care le permit supravieţuirea în sistemul
intestinal. Astfel, ele pot prezenta pe suprafaţă molecule asemănătoare cu cele ale gazdei
(ex. Bacteroides spp.) sau pot secreta molecule care mediază eludarea mecanismelor de
apărare ale gazdei. Recent s-a demonstrat că secreţia se realizează prin sisteme de
secreţie de tip III (injectarea unor molecule în celulele eucariote, prin intermediul unui
117
fagel) şi de tip IV (transportul ADN-ului sau a unor proteine în celulele eucariote,
asemănător mecanismului de conjugare), mecanisme până acum descrise doar la bacteriile
patogene. (Figura nr. 4)
Flora normală limitează semnalele infamatorii declanşate de bacteriile patogene prin
următorul mecanism (Figura nr. 5):
- NF-kB (transcription factor nuclear factor) este un factor prin care bacteriile patogene
transmit semnale infamatorii la nivelul celulelor epiteliale intestinale. Acest factor
determină transcripţia genelor p55-p65, cu producţia de chemokine şi citokine.
- fora microbiană intestinală activează PPAR (peroxisome proliferator-activated
receptor) care exportă p65 în citoplasma enterocitului. Astfel transcripţia este blocată, de
asemenea şi cascada infamatorie.
Spre exemplu, fora intestinală normală scade răspunsul infamator faţă de Salmonella
typhimurium.
8. 3. 2. Flora microbiană normală inhibă dezvoltarea bacteriilor patogene
prin „efectul de barieră” sau fenomenul de competiţie
Într-un organism gazdă sănătos, fora normală realizează un „strat protector” de-a
lungul sistemului intestinal. Bacteriile comensale ocupă situsurile de ataşare ale mucoasei
şi consumă factorii nutriţionali produşi de enterocite. La rândul lor, celulele intestinale
secretă produşi anti-bacterieni, chemokine, citokine şi IgA. (Figura nr. 6)
În anumite condiţii, spre exemplu atunci când:
- există o cantitate mai mare de tulpini din specii bacteriene patogene;
- este urmat un tratament îndelungat cu antibiotice (mai ales dacă au spectru larg);
- există factori care deprimă mecanismele de apărare ale gazdei (ex. o stare de
imunosupresie, o modifcare a tranzitului prin peristaltism scăzut etc.);
- se exercită acţiunea unor factori externi (ex. radiaţii, arsuri, substanţe chimice etc.)
fora microbiană este afectată, iar bacteriile patogene pot invada mucoasa intestinală.
8. 3. 3. Flora normală intestinală „determină” greutatea fecărui individ
Într-un studiu realizat în anul 2006 pe şoareci „germ-free”, hrăniţi cu alimente bogate în
polizaharide, s-a observat că animalele colonizate doar cu Methanobrevibacter smithii şi
cu Bacteroides thetaiotaomicron au prezentat o depunere semnifcativ mai mare de
grăsime în comparaţie cu animalele din alte grupuri de control. S-a demonstrat că:
- Bacteroides thetaiotaomicron intervine în dezvoltarea vascularizaţiei intestinale;
induce formarea reţelelor capilare şi stimulează absorbţia şi procesarea carbohidraţilor; în
timp ce
- Methanobrevibacter smithii deţine funcţia unui reglator caloric în intestinul distal şi
prin sinergie cu B. thetaiotaomicronstimulează digestia zaharurilor şi creşte absorbţia
caloriilor.
Mai recent, s-au descoperit numeroase mecanisme prin care fora microbiană normală
intervine în reglarea greutăţii corporale şi a depunerilor adipoase. (Figura nr. 7)
Primul dintre acestea ar f infuenţarea metabolizării nutrienţilor şi a reglării energetice.
S-a demonstrat faptul că bacteriile metabolizează polizaharide nondigerabile
transformându-le în produşi digerabili, astfel crescând extracţia energetică.
118
O altă ipoteză stabileşte o legătură între fora normală intestinală şi homeostazia
metabolică. O dieta bogată în lipide modulează populaţiile bacteriene dominante la nivel
intestinal: cresc bacteriile Gram negative şi scad bifdobacteriile, eubacteriile şi Bacteroides
spp. Această modifcare determină creşterea nivelului plasmatic
al lipopolizaharidelor (LPZ) care induce un răspuns infamator cronic de mică intensitate la
nivelul fcatului, al ţesutului adipos şi al hipotalamusului. Apare o creştere în greutate şi o
acumulare excesivă a lipidelor la nivel hepatic. În timp, creşte riscul apariţiei rezistenţei la
insulină şi al dezvoltării diabetului zaharat de tip 2. (Figura nr. 8)
Un al treilea mecanism este acela prin care fora normală induce reglarea unor gene ale
gazdei. Acestea sunt implicate în modularea depozitelor şi a consumului energetic.
Aceste descoperiri ar putea să aibă o mare importanţă atât în tratamentul obezităţii cât
şi în tratamentul celor subnutriţi. Ar putea explica de ce oameni care consumă aceeaşi
cantitate de hrană, prezintă modalităţi diferite de depunere a grăsimilor.
Totuşi ar rămâne un semn de întrebare: diferenţele observate în fora normală a
pacienţilor obezi este cauza sau consecinţa obezităţii?
8. 3. 4. Fermentarea şi absorbţia polizaharidelor în colonul proximal
Corpul uman nu deţine enzimele necesare fermentării polizaharidelor. Flora normală
îndeplineşte această funcţie. Prin fermentare zaharolitică, bacteriile produc acizi graşi cu
lanţ scurt de carbon şi gaz.
Microorganismele forei normale stimulează şi controlează dezvoltarea celulelor
intestinale (epiteliale şi ale ţesutului limfoid), prin furnizarea factorilor nutriţionali necesari.
Bacteriile previn lezarea mucoasei, aceasta constituind o posibilă funcţie anti-cancerigenă.
Acizii graşi cu lanţ scurt de carbon, produşi de foră, au ca efect scăderea pH-ului în
lumenul intestinal. Astfel este redus numărul bacteriilor patogene, deoarece acestea au o
rezistenţă scăzută la pH acid.
Prin fermentarea zaharolitică, fora are o importantă funcţie energetică, creşte
reabsorbţia apei, precum şi absorbţia unor nutrienţi (Ca, Mg, Fe).
8. 3. 5. Alte funcţii
8. 3. 5. 1. Fermentarea proteolitică în colonul distal - importanţa dietei reduse
în proteine
Prin fermentarea proteolitică fora normală intestinală produce o serie de toxine şi
substanţe cu posibil rol în carcinogeneză. Cantitatea acestor substanţe este în relaţie
directă cu cantitatea de proteine ingerate.
8. 3. 5. 2. Conversia acizilor biliari în cocarcinogeni
Bacterii precum Streptococcus faecalis, Veilonella spp. metabolizează prin deconjugare
sau hidroliză acizii biliari dezoxicolic şi litocolic, cu producţie
de cocarcinogeni. Lactobacillus bifdus blochează acidul colic intracelular şi astfel împiedică
formarea de cocarcinogeni.
8. 3. 5. 2. Biosinteza vitaminei K
Flora normală produce 50% din necesarul zilnic de vitamină K. Bacteroides
fragilis şi Escherichia coli participă la sinteza vitaminei K2.
8. 3. 5. 3. Absorbţia vitaminei B12
119
A fost dovedit rolul forei intestinale normale în absorbţia de vitamină B12.
8. 3. 6. Flora microbiană normală - partenerul silenţios în manifestarea bolii
Boala infamatorie intestinală (boala Crohn şi colita ulcerativă) reprezintă un exemplu
care trebuie luat în discuţie şi afat în relaţie cu fora intestinală normală. (Figura nr. 9)
Boala infamatorie intestinală include:
- boala Crohn, în care procesele infamatorii apar în principal la nivel intestinal, dar şi la
nivelul altor organe. Cel mai frecvent sunt afectate segmentele terminale ale intestinului
subţire; în cazul afectării colonice pot apărea fstule şi abcese în regiunea anală.
- colita ulcerativă include răspunsul infamator la nivelul mucoasei ce căptuşeşte
interiorul rectului (proctita) sau la nivelul întregului colon (colită ulcerativă).
În momentul actual, nu a fost stabilită cu exactitate cauza apariţiei acestei entităţi
patologice. Totuşi, s-a observat că există anumiţi factori declanşatori, prezenţi la
persoanele afectate:
- o predispoziţie genetică;
- lipsa alăptării la sân în perioada de sugar şi nou-născut;
- „igiena excesivă”în copilărie, cu o insufcientă dezvoltare a răspunsului imun;
- excese în consumul de grăsimi animale şi carbohidraţi;
- tratament cu antibiotice utilizat frecvent.
Se pare că unul dintre elementele de luat în consideraţie ar f pierderea toleranţei faţă
de fora normală intestinală, cu apariţia unui răspuns imun aberant, cu stări de
hipersensibilitate şi reacţii autoimune. Apare o permeabilitate intestinală crescută.
Compoziţia forei normale este modifcată (de ex. specii din genul Clostridium apar în
proporţie mai mare faţă de normal), dar nu s-a putut demonstra dacă aceasta determină
boala sau dacă este doar un efect al infamaţiei intestinale.
Se pare că există şi o serie de alte boli în care este implicată fora normală, spre ex.
neoplazii (digestive sau în afara sistemului digestiv), infecţii produse în alte sisteme după
modifcarea habitatului (ex. Escherichia coli în momentul în care ajunge la nivelul tractul
urinar), obezitate, stări de hipersensibilitate, autism, depresie etc.
8. 3. 7. Farmabioticele
Reprezintă orice formă de „exploatare farmaceutică” a forei normale (probiotice,
prebiotice, sinbiotice).
Probioticele sunt suplimente alimentare care conţin microorganisme vii (bacterii, fungi)
cu efecte benefce asupra corpului uman; bacteriile folosite sunt în general cele
producătoare de acid lactic (scad pH şi împiedică dezvoltarea bacteriilor patogene). (Figura
nr. 7) Genurile utilizate sunt Lactobacillus şi Bacteroides.
Prebioticele reprezintă ingrediente alimentare non-digerabile care afectează în mod
pozitiv gazda, stimulând în mod selectiv creşterea şi/sau activitatea unei sau a unui număr
limitat de bacterii din colon; majoritatea sunt carbohidraţi iar bacteriile stimulate
sunt Bifdobacteria sau bacteriile producătoare de acid lactic.
Sinbioticele sunt produse care conţin atât probiotice, cât şi prebiotice.
Există dovezi ce susţin rolul terapeutic al probioticelor în boala infamatorie intestinală,
infecţii, cancer, artrită.
120
8. 4. Relaţii microorganism-gazdă
Cu o parte din microorganismele întâlnite organismul stabileşte relaţii de simbioză,
convieţuirea find folositoare pentru ambii parteneri (de exemplu sinteza de vitamine la
care participă unii coliformi intestinali).
Foarte multe din microorganismele care alcătuiesc microfora normală se afă în relaţii
de comensualism cu organismul, germenii depinzând nutriţional de gazdă, căreia nu îi
creează prejudicii. Această convieţuire exprimă însă un echilibru instabil, care poate f uşor
tulburat. Diferiţi factori (ai gazdei, din mediul extern sau biologici intrinseci ai germenilor)
pot modifca aceste relaţii, astfel încât unele microorganisme din fora normală pot
manifesta aspecte patogene - este vorba de microorganismele condiţionat patogene.
Relaţia de parazitism tipic apare însă doar atunci când microorganismele se dezvoltă în
detrimentul gazdei, cu manifestări clinice mai mult sau mai puţin evidente.
Astfel, în cazuri extreme unele bacterii sunt obligatoriu parazite, nu se pot dezvolta
decât în organismul gazdei (de exempluMycobacterium leprae, Treponema
pallidum, Chlamydia pneumoniae etc). Alte bacterii sunt facultativ parazite, putând trăi şi
libere în natură, dar o dată pătrunse în organism stabilesc cu acesta relaţii de parazitism
(de exemplu Clostridium tetani, Clostridiile gangrenei gazoase, Salmonella typhi etc).
8. 5. Povestire adevărată
Rolul şi importanţa forei microbiene normale a organismului, sunt mai mult decât bine
stabilite. Rolul infecţionistului este, ca pe durata tratamentelor cu antibiotice pentru diverse
afecţiuni, să afecteze cât mai puţin această foră. O primă idee este utilizarea de antibiotice
cu spectru cât mai „ţintit” (îngust), cu efect asupra patogenului respectiv. Pe de altă parte
„piatra de încercare” a medicilor, credem, o reprezintă evitarea tratamentelor antibiotice
inutile. Câţi dintre medici nu recomandă scheme după scheme de medicamente anti-
staflococice doar pentru că la exsudatul faringian se izolează un staflococ, fe el chiar şi
„auriu”? Mai toţi. Încercăm „sterilizarea” de acel staflococ, doar dacă pacientul urmează să
primească un transplant (ex. medular sau hepatic) sau dacă va primi un tratament intens
imunosupresor, altfel nici nu trebuie căutat! Iar pe de altă parte, rămâne o întrebare pe
care o punem tuturor generaţiilor de studenţi cu care lucrăm: în câte dintre cazurile de
infecţii staflococice întâlnite şi raportate în foile de observaţie pe care le vor vedea este
menţionat şi testul coagulazei? Însă, revenind la subiectul acestui capitol, nu trebuie să
uităm niciodată că utilizarea medicamentelor antibiotice şi chimioterapice, în special a celor
cu spectru larg, afectează uneori decisiv fora microbiană normală a cărei utilitate este în
momentul de faţă binecunoscută.
8. 6. Ştiaţi că ...
....Gregor Reid, director al Centrului Canadian petru Cercetarea şi Dezvoltarea
Probioticelor a afrmat: Lactobacilul este doar o bacterie. Să spui că un produs conţine
lactobacil este ca şi cum ai spune că îl aduci pe George Cloney la o petrecere. Poate f
121
actorul sau poate f doar un tip de 85 de ani din Atlanta pe care întâmplător îl cheamă
George Cloney. În cazul probioticelor există diferenţe importante între tulpini”?
....atunci când doriţi să achizionaţi produse ce conţin probiotice ar trebui să le căutaţi
pe acelea pe a căror etichetă este specifcată tulpina conţinută şi care oferă cititorilor acces
liber la studiile ştiinţifce de suport? O sursă bună pentru informarea asupra efectelor
variatelor tulpini probiotice este www.PubMed.gov.
....puteţi să vă faceţi singuri iaurt cu probiotice? Aveţi nevoie de 1l lapte steril-orice tip,
chiar şi de soia, un iaurt-sursa de probiotice şi de un recipient în care doriţi să faceţi iaurtul.
Cuptorul se încalzeşte timp de 15 minute la 180 grade, se lasă să se mai răceasca timp de
10 minute. Se aşează în cuptor recipientul şi compoziţia pentru iaurt. Se închide uşa de la
cuptor şi se lasă 12 ore, peste noapte. Dacă dimineaţă observaţi că nu a ajuns la
consistenţa dorită mai lăsaţi-l în cuptor timp de 12-24 ore.
9. Patogenitate şi Virulenţă
9. 1. Agenţii infecţioşi
Agenţii cauzali ai bolilor infecţioase (microorganismele condiţionat patogene, dar mai
ales germenii patogeni) sunt foarte numeroşi. Ei se pot împărţi în următoarele grupe mari:
- virusuri = agent patogen care se reproduce numai în interiorul celulelor vii şi care
provoacă boli infecţioase numite viroze;
- chlamydii = bacterii Gram-negative, strict parazite, imobile, care se multiplică în
citoplasma celulelor gazdă printr-un ciclu de dezvoltare caracteristic;
- mycoplasme = cele mai mici microorganisme care pot trăi liber în natură şi care se
pot dezvolta pe medii artifciale îmbogățite;
- rickettsii = microorganisme care au dimensiuni mai mici decât bacteriile; de regulă nu
se pot cultiva în afara celulelor vii;
- bacterii propriu-zise;
- fungi;
- protozoare = grup de organisme unicelulare, din grupul protistelor;
- metazoare.
În ultimii 25-30 de ani se discută din ce în ce mai mult despre rolul jucat de prioni,
constituiţi dintr-o particulă de natură proteică având caracter infecţios, lipsită de acid
nucleic, cu potenţial patogen destul de subtil exprimat. Prionii rezistă la acţiunea a
numeroşi factori fzici şi chimici care inactivează virusurile. Sunt capabili de a se reproduce.
Afectează atât oamenii cât şi mamiferele. Sunt implicaţi etiologic în maladii cu evoluţie
122
lentă, precum encefalopatia spongiformă transmisibilă care include spre exemplu boala
Creutzfeldt-Jacob, insomnia fatală familială etc, afecţiuni în care sunt prezente leziuni
degenerative la nivelul SNC. Pornindu-se de la encefalopatia spongiformă bovină, începând
cu anul 1996 au fost descrise afecţiuni umane, după consumul de carne de vită; maladia
poartă numele de „Creutzfeldt-Jacob noua variantă”. Principalele manifestări sunt
reprezentate de: depresie, anxietate, alterarea ritmului somn-veghe. La o treime din
pacienți, manifestările oculare pot masca demența. Deteriorarea mentală este rapid
progresivă, de la descoperirea simptomelor până la deces trecând în medie 7-9 luni. (1)
Microorganismul patogen este capabil să colonizeze diferite zone ale gazdei, producând
un proces infecţios în primul rând prin invazia şi penetrarea barierelor dermice şi ale
mucoaselor, multiplicarea ducând la distrucţia tisulară şi invadarea arborelui limfatic şi
vascular (sepsis). Aceste aspecte sunt infuenţate în largă măsură de:
- factorii de patogenitate ai microorganismului;
- factorii de apărare ai gazdei.
9. 2. Patogenitate şi virulenţă.
Caracterele de patogenitate ale
bacteriilor
Patogenitatea reprezintă capacitatea unui germen de a declanşa în organismul gazdă
fenomene morbide, patogene, modifcări locale, generale şi „functio laesa”. Patogenitatea
este un atribut de specie şi este determinată genetic.
Virulenţa reprezintă gradul diferit de patogenitate exprimat în cadrul unei specii. Este
un atribut al tulpinii microbiene agresoare. Variabilitatea în exprimarea patogenităţii
depinde de condiţiile în care trăieşte microorganismul respectiv (de exemplu, o populaţie
bacteriană care a pierdut virulenţa în condiţii nefavorabile poate redeveni virulentă în
anumite condiţii, aşa cum se întâmplă cu tulpina vaccinală BCG la pacienţii cu infecţie HIV /
SIDA). Virulenţa poate f cuantifcabilă de ex. prin numărul de microorganisme necesare în
condiţii standard pentru a omorî 50% dintr-un grup de animale (acest număr este numit
DL50, adică doza letală 50%).
Factorii care condiţionează patogenitatea şi virulenţa unei specii (tulpini) microbiene
pot f:
- multiplicarea şi invazivitatea manifestată de germenii patogeni;
- multiplicarea şi elaborarea de toxine de către germenii toxigeni (în general
„exotoxine”).
9. 2. 1. Multiplicarea şi
invazivitatea
123
Germenii patogeni se multiplică la poarta de intrare şi invadează organismul prin
formarea de abcese şi prin propagarea din aproape în aproape în „pată de ulei”, dar pot
trece şi direct în circulaţia generală. În acest caz produc infecţii la distanţă. Pentru a avea
loc această succesiune a evenimentelor, germenii trebuie să poată rezista reacţiilor de
apărare nespecifcă a gazdei (de exemplu fagocitozei) şi să poată adera de celulele
mucoaselor (prin adezine) sau de anexele dermului. Există o aderenţă nespecifcă, de fapt
un proces chimic şi fzic, reversibil, cu implicarea atracţiei hidrofobe, electrostatice dar şi a
mişcării browniene şi a existenţei bioflmului de polimeri. Aderenţa specifcă poate f la
rândul său reversibilă dar, dacă implică sufcient de mulţi factori (structurali, diferite forţe
de legătură), poate deveni ireversibilă.
Bioflmul include populaţii bacteriene aparţinând uneia sau mai multor specii,
înconjurate de polimeri extracelulari (EPS -extracellular polymeric substances).
Microorganismele aderă între ele, dar şi la suprafeţe, formându-se o structură
asemănătoare unui sistem circulator ce permite accesul nutrienţilor şi eliminarea
substanţelor reziduale, precum şi comunicarea interbacteriană. Dezvoltarea bioflmului
cuprinde 5 etape (Figura nr. 1):
· ataşarea reversibilă,
· ataşarea ireversibilă,
· maturarea 1,
· maturarea 2 şi
· dispersia.
Industrial, bioflmele sunt responsabile de ancrasarea rezervoarelor de stocare şi de
înfundarea conductelor de apă. Din punct de vedere medical, se pot observa în cazul
endocarditei (pe valve), otitei medii, plăcii dentare şi pot reprezenta o problemă pentru
pacienţii cu fbroză chistică. Bioflmele se dezvoltă şi pe implanturi sintetice cum ar f:
catetere intravasculare, valve, pacemakere, instrumente ortopedice, lentile de contact etc.
O caracteristică foarte importantă a bioflmelor este reprezentată de rezistenţa crescută
la antibiotice, de până la 500 de ori mai mare. Responsabile de aceasta sunt atât EPS, care
acţionează ca o barieră sau care pot chiar inactiva antibioticele, cât şi faptul că în cadrul
bioflmului bacteriile cresc mult mai greu, astfel încât o activitate metabolică scăzută va
conduce la o asimilarea mai lentă a antibioticelor.
Dintre bacteriile implicate în producerea de bioflme amintim: Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, streptococi α şi
β hemolitici etc. (2)
Poate f luat în discuţie şi „tropismul”, care poate f specifc pentru anumite structuri ale
gazdei [ex. tulpinile de E. coliuropatogene aderă cu ajutorul unei
adezine papG (pyelonephritis-associated pili), numai la anumiţi receptori situaţi la suprafaţa
celulelor epiteliale renale] sau ar putea f specifc de specie (de ex. streptococul piogen din
grupul A, meningococul sau gonococul infectează numai gazda umană).
9. 2. 1. 1. Factori somatici care permit multiplicarea şi invazivitatea germenilor
- pilii comuni (fmbriile), cu rol în aderare. Bacteriile pot produce unul sau mai multe
tipuri de pili, astfel că cele care produc pili specifci, vor f asociate cu capacitatea de a
124
infecta un anumit tip de ţesut. De exemplu, E. coli uropatogenă prezintă pili de tip P sau
Pap, având tropism pentru tractul urinar. (3)
- lectinele (proteine care au tropism pentru carbohidraţi);
- liganzii (molecule care realizează legături specifce cu anumite molecule
complementare de la nivelul substratului);
- glicocalixul (componentă structurală externă a polizaharidului de la suprafaţa celulei
bacteriene);
- „noroiul” (un mediu vâscos peribacterian, constând dintr-o subclasă de substanţe
polimerice extracelulare ce conţin în general polizaharide şi mediază ataşarea nespecifcă a
bacteriilor într-un strat vâscos);
- capsula (are proprietăţi antifagocitare şi uneori este implicată în aderare, spre ex. în
cazul Streptococcus mutans, cu efecte cario-genetice);
- adezinele (de fapt, toţi factorii enumeraţi mai sus pot f defniţi drept „adezine”);
- substanţe componente ale peretelui bacterian
- proteina M a streptococului beta-hemolitic de grup A (Figura nr. 2); Proteina M este un
dimer ancorat în membrana citoplasmatică, ce va proemina la suprafaţa peretelui
bacterian, măsurând de la acest nivel 50-60 nm. Aceasta are rolul de a împiedica fagocitoza
sau opsonizarea de către PMN, în lipsa anticorpilor specifci; anticorpii se vor lega la capătul
variabil N-terminal al dimerilor.
- antigenul Vi de suprafaţă al unor bacili Gram-negativi (de exemplu, Salmonella
typhi etc). Antigenul Vi este un polizaharid capsular ce are capacitatea de a împiedica
acţiunea anticorpilor, are proprietăţi antifagocitare şi creşte rezistenţa la peroxid.
Serotipurile care prezintă acest antigen sunt: Typhi, Paratyphi C şi Dublin. Unele tulpini
de Citrobacter freundii produc un compus asociat bacteriei identic cu Vi al primelor două
serotipuri, find sursa ideală de antigen Vi, necesar preparării antiserului.
- polizaharidul A al S. aureus (un acid teichoic);
- antigenul O al bacteriilor Gram-negative (Figura nr. 3); Antigenul O face parte din
lipopolizaharid/lipooligozaharid (LPZ/LOZ), structură ce are rolul de a proteja bacteria de
enzime ce au capacitatea de a degrada peptidoglicanul (de exemplu, lizozimul) şi oferă
rezistenţă împotriva sărurilor biliare, complementului (diminuând activitatea MAC –
membrane attack complex) şi fagocitozei; prezintă şi activitate mitogenă, stimulând
diferenţierea policlonală şi multiplicarea limfocitelor B, determinând astfel secreţia de
imunoglobuline, precum IgM şi IgG. LPZ cuprinde 3 regiuni: lipidul A (regiunea I), o porţiune
centrala rugoasă polizaharidică (regiunea II) şi polizaharidul O / antigenul O (regiunea III).
- antigenele de tip K (cu structură polizaharidică sau polipeptidică - pentru Bacillus
anthracis) etc.
În ceea ce priveşte procesul aderenţei, se cunoaşte faptul că orice obiect afat în
imersie atrage particulele suspendate, inclusiv microorganismele, la suprafaţa lui. Teoria
coloidală DLVO (după numele autorilor) menţionează că la nivelul suprafeţei de imersie
există 2 poziţii de stabilitate termodinamică, prin intervenţia gravitaţiei, chemotaxiei,
forţelor de tip van der Waals, forţelor electrostatice şi tensiunii superfciale (Schema nr. 1).
125
Contrabalansarea forţelor de atracţie şi repulsie conduce la împingerea dezordonată a
particulelor spre un „minim secundar”, poziţie ce se situează la suprafaţa de imersie. Acest
„minim secundar” corespunde fenomenului de adsorbţie sau reţinere (docking), proces
reversibil.
Ulterior sunt implicate şi alte forţe de legătură (covalente, de hidrogen, ionice,
hidrofobe) care vor duce la atingerea „minimumului primar”, când particulele devin legate
ireversibil de substrat. Aderenţa se produce atunci când particulele părăsesc „minimumul
secundar” şi intră în „minimumul primar”. Pentru unele bacterii (ex. V. cholerae, unele
tulpini de E. coli, B. pertussis, Helicobacter pylori) ataşarea este destinaţia fnală, în timp ce
pentru altele (ex. Salmonella, Shigella, Yersinia) reprezintă doar o etapă, urmând
penetrarea tisulară şi / sau diseminarea în organism.
9. 2. 1. 2. Factori solubili care permit multiplicarea şi invazivitatea germenilor
(agresine) (Tabelul nr. 1)
- coagulaza liberă şi/sau legată a S. aureus care transformă fbrinogenul în fbrină şi pe
de o parte poate „masca” bacteria înconjurată de structuri asemănătoare cu ale gazdei, pe
de altă parte poate preveni fagocitarea sau chiar împiedica ajungerea antibioticelor şi
chimioterapicelor la sediul infecţiei;
- leucocidina secretată după ce staflococul a fost fagocitat şi care transformă leucocitul
în piocit (se inseră în membrana leucocitului şi produce pori sau degradează enzimatic
fosfolipidele de la nivelul membranei);
- producerea unor substanţe care cresc concentraţia intracelulară de AMPc până la
concentraţii ce inhibă fuzionarea fagozom-lizozom (de exemplu la Mycobacterium
tuberculosis);
- producerea de catalază (de exemplu: Staphylococcus aureus, Mycobacterium
fortuitum), glutation peroxidază, superoxid dismutază, citocrom oxidază (Vibrio spp.,
Pseudomonas aeruginosa, Neisseria spp.) care inhibă sau inactivează radicalii activi de
oxigen;
- producerea unor factori care conferă rezistenţă la enzimele lizozomale, după
fuzionarea fagozom-lizozom (Salmonella enteritidis, Mycobacterium leprae etc);
- producerea de enzime litice:
1. colagenaza (este produsă de Clostridium histolyticum şi Clostridium perfringens şi
distruge colagenul prezent în muşchi facilitând răspândirea procesului infecțios),
hialuronidaza (scindează acidul hialuronic, o componentă a ţesutului conjunctiv),
fbrinolizina (determină liza cheagului prin convertirea plasminogenului în plasmină) etc
(streptococ, staflococ, unele clostridii);
2. lecitinaza (distruge lecitina din structura membranei celulare, de
exemplu Clostridium perfringens, Bacillus anthracis);
3. fosfolipaza (toxina a) (realizează hidroliza fosfolipidelor din membrana celulară, prin
îndepărtarea capetelor polare, de exemplu Clostridium perfringens);
4. neuraminidaze (degradează acidul sialic, de exemplu V. cholerae, Shigella
dysenteriae);
126
5. proteaze, nucleaze ( DN-aze, RN-aze – cu activitate endo- şi exonucleazică asupra
ADN şi ARN, generând 3’-nucleotide), carbohidraze, lipaze etc;
6. hemolizine sunt enzime ce lizează hematiile din mediile de cultură cu sânge
(streptococ, staflococ, unele clostridii) etc.
- producerea unor substanţe care inhibă sau modifcă răspunsul imun
1. IgA proteaza (clivează IgA în regiunea balama, de exemplu gonococ, meningococ, H.
infuenzae);
2. proteina A staflococică (inhibă opsonizarea);
3. endotoxina care creşte sinteza de IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α etc;
4. inducerea apariţiei unor reacţii autoimune;
5. producerea superantigenelor (de exemplu S. aureus prin producerea toxinei implicată
în sindromul de şoc toxic, TSST-1), molecule care pot activa independent celulele T4 (sunt
printre cei mai puternici mitogeni ai limfocitelor T); stimularea datorată lor poate determina
atât anergie, cât şi hiperactivarea sistemului imun. (Figura nr. 4) Rezultă o secreţie în exces
de IL-2 care interferă cu sinteza altor citokine (TNF-α, IL-1, IL-8 etc). Alte exemple de
superantigene ar f: toxina pirogenică streptococică (produsă de tulpinile lizogenizate),
enterotoxinele staflococice (S. aureus), subtanţe cu efecte asemănătoare hormonilor (ex.
toxina stabilă termic produsă de E. coli enterotoxigen) etc.
Fiecare din substanţele de mai sus are un rol bine defnit în evoluţia reacţiei infamatorii
locale.
9. 2. 2. Multiplicare şi
toxinogeneză
Germenii se multiplică la poarta de intrare şi elaborează exotoxine care produc alterări
celulare şi distrucţii tisulare la distanţă, prin inhibarea metabolismului celulei eucariote şi
prin „functio laesa” („toxikon” era otrava în care erau înmuiate săgeţile luptătorilor greci).
Din punct de vedere didactic trebuie menţionate următoarele noţiuni:
9. 2. 2. 1. Exotoxinele
Exotoxinele sunt elaborate în general de microbi Gram-pozitivi lizogenizaţi (de exemplu
bacilul difteric, streptococul beta hemolitic de grup A, Clostridium botulinum) sau codifcat
plasmidic (Clostridium tetani, Bacillus anthracis), dar şi de bacili Gram-negativi, prin
mecanism cromozomial (V. cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas
aeruginosa) sau sub control plasmidic (unele tulpini de E. coli). (Tabelul nr. 2)
Au structură proteică, find formate dintr-un domeniu B (bind) obligatoriu, necesar
legării de receptorii celulei gazdă şi internalizării ulterioare a porţiuni enzimatice A (active).
Exotoxina nu îşi exercită efectele toxice decât după ce porţiunea A este eliberată din
structura iniţială. Sunt secretate în timpul vieţii germenilor. Sunt difuzibile la distanţă.
Toxicitatea lor este foarte mare, doza letală find de circa 0,1 µg/kg corp (până la 1 ng/kg
corp în cazul toxinei botulinice).
127
Au afnitate diferită în funcţie de specia care le-a elaborat (de exemplu pentru miocard,
SNC, rinichi în cazul bacilului difteric). Manifestările clinice apar după o perioadă de latenţă
(când toxina este deja fxată pe celulele ţintă).
Multe din bolile produse pot f considerate toxiinfecţii şi reprezintă urgenţe medicale,
toxina putând f neutralizată numai dacă este liberă în circulaţie.
Au putere antigenică mare, faţă de ele apărând anticorpi antitoxină.
Un alt exemplu important privind exotoxinele se referă la Tcd A şi Tcd B, produse
de Clostridium difcile și care acţionează asupra celulelor intestinului gros, find
responsabile de o boală diareică uşoară, până la colită fulminantă. Ele produc la acest nivel
leziuni microscopice, dar şi leziuni mari, asemănătoare unor plăgi; endoscopic, se vor
identifca noduli.
Prin degradarea proteinelor Rho, Rac şi Cdc 42, responsabile de reglarea proceselor
structurale dependente de polimerizarea actinei, se poate observa la microscopul electronic
alterarea microflamentelor de actină, rezultând marginalizarea nucleului, schimbări în
morfologia citoscheletului, dar şi alte modifcări (alterarea suprafeţei celulare şi rearanjarea
microvililor). (Figura nr. 5)
Astfel, modifcările produse de toxinele Tcd A şi Tcd B sunt: infamaţia, creşterea
permeabilităţii ţesutului epitelial intestinal, stimularea producerii de chemokine şi citokine,
acumularea de neutrofle, producerea intermediarilor reactivi ai oxigenului, activarea
mastocitelor, producerea substanţei P, distrugerea directă a mucoasei intestinale, ruperea
joncţiunilor strânse (Zonula occludens), degradarea actinei F. Substanţa P este responsabilă
de: activarea neuronilor din submucoasă, eliberarea TNF-α, activarea macrofagelor din
lamina propria; este implicată în diareea infamatorie.
9. 2. 2. 2. Antitoxinele
Având structură proteică, exotoxinele sunt imunogene şi determină apariţia de anticorpi
specifci (antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxică prin cuplare
specifcă cu toxina. (Tabelul nr. 3) Se pot obţine astfel seruri imune utile în seroterapia
specifcă. De regulă aceste seruri sunt preparate pe cal şi sunt utile în neutralizarea
exotoxinelor (ex. în tratamentul difteriei, tetanosului, botulismului).
Administrarea antitoxinelor trebuie făcută cu precauţie datorită faptului că anticorpii
preparaţi pe cal reprezintă în acelaşi timp şi antigene pentru gazda umană, dar în acelaşi
timp cât mai curând posibil.
Tratamentul acestor entităţi clinice este complex şi nu reprezintă subiectul acestui
manual. Administrarea antitoxinelor trebuie făcută după o testare a unei eventuale
hipersensibilităţi şi în cazul că aceasta există se recurge la desensibilizare şi abia ulterior la
seroterapie (administrarea de antitoxină). O alternativă ar f administrarea de
imunoglobuline umane specifce, dacă acestea sunt disponibile.
9. 2. 2. 3. Anatoxinele
Exotoxinele pot f detoxifate într-un anumit interval de timp sub acţiunea conjugată a
temperaturii şi formolului. Prin acest procedeu îşi pierd puterea toxică, dar îşi menţin
puterea imunogenă şi devin anatoxine. Anatoxinele se utilizează în proflaxia bolilor
produse de germenii respectivi (în cadrul vaccinurilor DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum
128
şi pentru hiperimunizarea animalelor în scopul obţinerii de seruri antitoxice (antidifteric,
antitetanic, antibotulinic etc).
9. 2. 2. 4. Endotoxinele
Endotoxinele au fost evidenţiate la germenii Gram-negativi, la nivelul membranei
externe. Sunt elaborate de aceştia şi apoi incluse în peretele bacterian, eliberându-se în
urma distrugerii germenilor. Au structură lipopolizaharidică (LPZ sau LOZ), în constituţia lor
intrând acizi graşi, un lipid A şi lanţuri de polizaharide. (Figura nr. 6)
Au efecte toxice la nivelul celulelor majorităţii mamiferelor; aceste efecte sunt similare
indiferent de specia bacteriană care le eliberează. Toxicitatea lor este ceva mai redusă (în
comparaţie cu exotoxinele), dar pot acţiona la mai multe nivele inducând apariţia febrei,
leucopeniei, hiperpermeabilităţii vasculare, hipotensiunii arteriale până la colaps,
sindromului de coagulare intravasculară diseminată etc. Sunt implicate între altele în
apariţia şocului endotoxic (se eliberează o cantitate de endotoxină proporţională cu
numărul germenilor distruşi). Studiile arată că mortalitatea în şocul endotoxic este în relaţie
destul de directă cu cantitatea de endotoxină / ml, find de circa 80% la cazurile la care se
identifcă 100 unităţi endotoxină / ml de plasmă.
Aşa cum am menţionat în capitolul privind structura bacteriană, componenta toxică
este reprezentată de lipidul A; totuşi, şi polizaharidul O (structură antigenică) contribuie la
patogenitate – s-a dovedit că bacteriile de la care s-a extras polizaharidul O sunt mai uşor
distruse prin mecanisme care implică sistemul complement. LPZ afat în circulaţie se
cuplează cu proteine plasmatice (LPS-binding plasma proteins) şi apoi este recunoscut prin
intermediul receptorilor CD14 de către monocite şi macrofage. Se activează răspunsul
infamator, coagularea intravasculară, apariţia de hemoragii şi în fnal poate rezulta şocul.
Sunt implicate mai multe citokine, de ex. IL-1, IL-6, IL-8 şi TNF-α care la rândul lor
stimulează „cutia Pandorei” şi respectiv producţia de leucotriene şi prostaglandine (cu efect
de creştere a fenomenelor infamaţiei). Sunt activate atât sistemele de coagulare cât şi
sistemul complement iar cascadele de reacţii care apar sunt rareori reversibile în urma
tratamentului.
Puterea antigenică şi imunogenă este mai redusă faţă de exotoxine. LPZ în calitate de
mitogen stimulează o activare policlonală a LB, cu secreţia de IgG şi IgM.
În afara LPZ sau LOZ, mai sunt şi alte endotoxine, prezente la bacteriile Gram-pozitive:
- delta endotoxina prezentă la Bacillus thuringiensis, toxină care nu afectează omul,
deoarece acesta nu prezintă enzime şi receptori care să o proceseze;
- Listeria monocytogenes produce o substanţă endotoxin-like” etc.
129
expuse, faţă de colonizarea şi multiplicarea germenilor în organism, prevenind invazia
agenţilor patogeni.
Principalele componente ale apărării antiinfecţioase sunt reprezentate de:
9.3.1. bariera anatomică cutaneo-mucoasă, care acţionează prin:
- Integritatea sa anatomică: Pielea este o barieră în fața invaziei microorganismelor
deoarece este formată din straturi de celule strâns unite între ele, dar şi datorită stratului
de keratină. Descuamarea continuă a straturilor pielii are rol în eliminarea
microorganismelor. În general bacteriile nu pot penetra pielea. Procesul infecțios poate
debuta în urma unor traumatisme, intervenţii chirurgicale, utilizarea de catetere iv,
intervenției unor vectori. (3)
- Sinteza unor peptide cu rol dezinfectant: dermicidină, β-defensină. Acestea au şi rol de
chemokine, favorizând migrarea celulelor cu rol în fagocitoză.
- Mucoasele sunt umede şi deţin mai multe bacterii decât pielea. Majoritatea celulelor
epiteliale secretă aceleaşi peptide ca şi cele ale pielii. În plus conţin salivă, mucus, lacrimi,
cu rol antimicrobian. Lacrimile au rol protector şi prin conţinutul crescut de lizozim.
- Prezenţa de:
· IgA secretorii (sunt secretate IgA şi IgG cu rol în aglutinarea, dar şi blocarea
competitivă a receptorilor celulelor. Cantitatea de IgA la nivelul fuidelor mucoaselor este
mai mare decât IgG datorită rezistenţei acesteia la proteoliză prin cuplarea cu un
polipeptid. IgA se poate lega de bacteriile patogene intracelulare împiedicând pătrunderea
acestora în celule.),
· lactoferină (proteină cu rol în legarea ferului. Fierul este un element important
pentru supravieţuirea bacteriilor. Cu toate acestea, bacteriile care colonizează pielea şi
mucoasele au mecanisme de achiziționare a ferului chiar în prezenţa acestor proteine),
· alfa 1 antitripsină, lizozim (joacă unul din rolurile cele mai importante, având
efect antimicrobian asupra bacteriilor gram pozitive prin hidroliza aminoacizilor din
componenţa peptidoglicanilor) etc.;
- pH-ul acid al unor secreţii locale: pH-ul acid şi fora bacteriană au rol în inhibarea
invaziei bacteriilor patogene. Zonele infamate au susceptibilitate crescută la colonizare.
- Prezenţa microforei normale, ce constituie nişa ecologică pe care germenii nou veniţi
tind să o ocupe. Flora comensală este un ecosistem cu rol în apărarea împotriva invaziei
microorganismelor patogene. Mecanismele competitive sunt: competiţia pentru aceleaşi
substanțe nutritive, competiţia pentru aceiasi receptori. Secretă şi bacteriocine, find toxice
pentru alte bacterii, dar de obicei din aceeaşi specie, acizi graşi volatili sau alţi metaboliţi
toxici.
9.3.2. barierele de organ
- Bariera hematoencefalică: este o barieră fziologică între sistemul sangvin și sistemul
nervos central (SNC). Aceasta servește la menținerea unei homeostazii constante în SNC.
Această barieră are rolul de fltru, împiedicând pătrunderea în creier a unor substanțe
toxice, germeni patogeni, care se pot afa în sânge. În același timp bariera permite
pătrunderea din sânge a substanțelor nutritive necesare SNC.
130
- Tractul respirator: particulele inhalate pot supravieţui fltrării în tractul respirator
superior şi traheobronșic. Fluxul turbulent determină depunerea particulelor de dimensiuni
mari la nivelul mucusului tractului respirator, iar sistemul mucociliar le îndepartează din
plămani. Efortul de tuse ajută la eliminare. Secreţiile bronşice conţin substanţe precum:
lizozim, β-defensine, lectine. Când particulele inhalate ajung la nivelul alveolelor
îndepărtarea este realizată de macrofage şi histiocite. Toate aceste mecanisme de apărare
pot f învinse de microorganisme prin cantitatea acestora sau prin expunere îndelungată.
Poluarea aerului, prezenţa traheostomei, agenţii ”alergici”, defectele genetice etc. pot
diminua mecanismele de apărare ale tractului respirator.
- Tubul digestiv: Bariera acestuia este reprezentată de aciditatea gastrică şi rolul
antibacterian al diferitelor enzime (pancreatice, intestinale, biliare). Peristaltismul şi
descuamarea celulelor epiteliale au şi ele rol în apărarea antimicrobiană.Salmonella
spp. şi M. tuberculosis produc infecţii la persoanele cu aclorhidrie, iar peristaltismul încetinit
favorizează infecţia cuShigella spp. Pierderea joncţiunilor strânse dintre enterocite poate
favoriza translocarea bacteriilor în circulaţie.
- Tractul genitourinar: urina este în mod normal sterilă. Factorii care împiedică
colonizarea bacterienă sunt pH-ul, ureea, hipertonicitatea, glicoproteina Tamm-Horsfall
(produsă de rinichi şi excretată în cantitate mare în urină). Glicoproteina Tamm-Horsfall
acţionează ca un burete, bacteriile leagându-se de aceasta şi astfel împiedicând
colonizarea ţesuturilor. Tractul urinar inferior este spălat de fuxul urinar de 4-8 ori pe zi,
eliminând organismele patogene. Retenţia urinară este una dintre principalele cauze ale
infecţiilor urinare.
9.3.3. ganglionii limfatici de pe traiectul vaselor limfatice; Link Capitolul 10
9.3.4. sistemul fagocitar: Fagocitoza este mecanismul de înglobare şi distrugere a
microorganismelor de către celulele dendritice, PMN, macrofage etc. Macrofagele se găsesc
în toate ţesuturile corpului, iar celulele PMN şi monocitele circulă prin sânge şi sistemul
limfatic. Chemokinele au rol în iniţierea migrării celulelor fagocitare spre ţesuturi, având rol
în infamaţie.
Când o bacterie este internalizată într-un fagozom, este distrusă de radicalii de oxigen,
şi de diverse peptide. Microorganismele sunt digerate, iar peptidele se cuplează cu
moleculele complexului major de histocompatibilitate, find ulterior prezentate limfocitelor
T, determinând multiplicarea acestora şi activarea răspunsului imun celular şi umoral.
Fagocitoza este mai efcientă în spaţiile intratisulare înguste (alveolele pulmonare),
decât la nivelul suprafeţelor întinse (sinovială) sau în sânge. Opsonizarea favorizează
fagocitoza.
9.3.5. sistemul complement; Link Capitolul 15 (Sistemul complement)
9.3.6. citokinele: Link Capitolul 13 (Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi)
- interferonii (alfa, beta, gamma);
- interleukinele;
- colony-stimulating factor (CSF);
- citolizinele-factorul de necroză al tumorilor (TNF) alfa şi beta;
- poliperforinele;
131
- factorii de creştere, de exemplu transforming growth factor (TGF) alfa şi beta;
- factorii supresori şi inhibitori ai multiplicării.
9.3.7. sistemul imun (umoral şi celular);
9.3.8. alţi factori:
- complexul major de histocompatibilitate (MHC); Link Capitolul 12
- imunitatea de specie (naturală, înnăscută);
- factorii nutriţionali (vitamine, fer, zinc etc): Scăderea ferului seric poate f rezultatul
răspunsului infamator. Bacteriile necesită fer pentru creștere. Transferina are rol în
legarea ferului şi transportarea sa în macrofage, scăzând astfel, cantitatea de fer pe care o
pot folosi bacteriile. Nivelul de zinc scade în timpul infamaţiei. Acesta grăbeşte vindecarea
rănilor, are rol în sinteza proteică şi creşte responsivitatea limfocitelor. Persoanele
malnutrite sunt predispuse la infecţii severe. Cele mai importante vitamine (din acest punct
de vedere) sunt vitaminele A şi D. Anecdotic, anterior descoperirii ”tuberculostaticelor”,
tuberculoza se trata prin dietă; pacientul consuma până la 30 de ouă zilnic.
- factorii endocrini: vasopresina, insulina, glucagonul cresc cantitativ. Catabolismul
proteic produce aminoacizi care ulterior vor f folosiţi la sinteza celulelor de apărare şi a
proteinelor. Estrogenii au rol în protecţie la nivel vaginal. Activitatea limfocitelor T
este inhibată în timpul sarcinii, astfel pot apărea infecţii severe cauzate de virusul
poliomielitei, streptococii β hemolitici de grup A, N. gonorrhoeae mai ales până în trimestrul
al III-lea de sarcină.
- factori genetici: Susceptibilitatea, mortalitatea şi morbiditatea legate de infecţie sunt
infuenţate de bagajul genetic. Cauzele pentru această susceptibilitate crescută sunt
polimorfsmul genetic, defecte ale componentelor complementului, citokinelor,
chemokinelor sau ale receptorilor acestora.
- stresul: Stresul creşte susceptibilitatea organismului la infecţii.
- sistemul nervos central.
9. 4. Povestiri adevărate
9. 4. 1. LPZ și CID
Coagulare intravasculară diseminată în cadrul unei enterocolite ulceronecrotice la un
prematur cu nutriţie parenterală totală (Punct de plecare: LPZ-ul germenilor Gram-
negativi)
În primăvara anului 2007, într-o maternitate din Bucureşti s-a născut pe cale naturală
un prematur cu vârsta de gestaţie de 30 săptămâni şi greutate de 1.600 g, cu scorul Apgar
7 (la 5 minute de la naştere). Mama copilului a prezentat în cursul sarcinii infecţii urinare
recidivante cu Escherichia coli. Cu circa 12-14 ore înainte de naştere a avut loc ruperea
prematură a membranelor (travaliul cu membrane rupte peste 12 ore implică riscul
producerii de infecţii).
Prematurul a prezentat de la naştere o detresă respiratorie, pentru care a necesitat
ventilaţie cu presiune pozitivă continuă şi nutriţie parenterală totală (având, în plus,
intoleranţă digestivă). Nutriţia parenterală continuă a presupus cateterizarea venoasă
132
centrală a copilului. Întrucât această cateterizare, asociată cu ventilaţia asistată cresc riscul
infecţios al nou-născutului, s-a instituit antibioterapia empirică de protecţie cu ampicilină şi
gentamicină.
Evoluţia copilului a fost iniţial favorabilă timp de o săptămână, pentru ca ulterior acesta
să dezvolte o patologie digestivă manifestată prin abdomen meteorizat (mărit de volum),
vărsături bilioase şi scaune sanguinolente, asociate cu febră (39°C).
S-a pus diagnosticul clinic şi radiologic de enterocolită ulceronecrotică (necroză
intestinală de etiologie incertă) şi sepsis neonatal.
Testele de laborator efectuate (procalcitonină, proteina C reactivă) au fost intens
pozitive. Culturile din aspiratul gastric şi materii fecale au evidenţiat prezenţa E. coli.
Hemocultura a fost negativă, ceea ce nu este surprinzător în contextul în care nou-născutul
a primit tratament cu antibiotice anterior recoltării probelor.
Pe parcursul următoarelor zile, copilul a dezvoltat simptome clinice şi paraclinice de CID
(coagulare intravasculară diseminată): sângerări la locurile de injectare, hemoragie
pulmonară, trombocitopenie, timp parţial de tromboplastină şi timp de protrombină
crescute, hipofbrinogenemie, prezenţa în cantitate mare a produşilor de degradare ai
fbrinei). S-a instituit terapia de urgenţă cu imipenem şi gentamicină (la care E. coli se
dovedise a f sensibil), cu plasmă proaspăt congelată şi cu concentrat trombocitar. Starea
copilului nu s-a ameliorat sub tratament, hemoragia pulmonară agravându-se. S-a efectuat,
ca ultimă alternativă, o transfuzie de sânge izogrup şi s-a recurs la ventilaţie asistată în
sistem IPPV – Intermittent Positive Pressure Ventilation. Evoluţia copilului a fost în
continuare nefavorabilă, hemoragia pulmonară continuând să se agraveze şi ducând în fnal
la stop cardiorespirator ireversibil la manevrele de resuscitare.
Nou-născutul a decedat după 10 zile din cauza sindromului de CID.
Discuţii
Sursa infecţiei cu E. coli nu a putut f precizată cu certitudine (medicii au suspicionat,
totuşi, ca sursă cea mai probabilă, lichidul amniotic infectat al mamei).
Detresa respiratorie, ventilaţia asistată şi cateterizarea venoasă centrală au constituit
factori de risc major în producerea enterocolitei ulceronecrotice. Necroza ţesutului intestinal
a favorizat diseminarea pe cale sanguină a E. coli existent la acel nivel. Astfel, s-a instalat
sepsisul neonatal, care s-a complicat ulterior cu CID.
Complexitatea cazului, prin multitudinea complicaţiilor apărute, a fost un factor de
gravitate care a condus în fnal la decesul copilului.
9. 4. 2. Infecțiile cu Staphylococcus aureus comunitar meticilino-rezistent la
pacienții transplantați renal
Tânăr de 32 ani, afro-american, cu hipertensiune și diabet zaharat tip 1, transplantat
renal în urmă cu 28 luni se internează pentru febră, durere în fancul stâng, și o scădere în
greutate de peste 10 kg în ultima lună. De aproximativ 6 luni pacientul acuză dureri
intermitente în fancul stâng. În ultimul an, pacientul a avut multiple episoade de
furunculoză și celulită fesieră. Culturile efectuate evidențiază un Staflococ auriu meticilino-
rezistent, cu următoarele rezultate la antibigramă: rezistent la oxacilină, eritromicină, dar
sensibil la vancomicină, biseptol, tetraciclină, rifampicină, linezolid. Leziunile au fost
133
incizate și drenate, iar apoi a primit tratament cu cefalexin, augmentin, biseptol și a
efectuat decolonizarea nazală cu mupirocin. (4)
În cursul anamnezei, pacientul relatează raporturi sexuale cu persoane de același sex și
i se efectuează serologia HIV, rezultatul find negativ. Cura posttransplant a fost efectuată
fără complicații cu tacrolimus, micofenolat mofetil și prednison.
La examenul obiectiv: temperatura 36,9˚C, puls 74/min, TA 100/68 mmHg, frecvența
respiratorie 19/min.
Analizele de laborator evidențiază o leucocitoză (20.200 cel/mm3) cu neutroflie, VSH de
107 mm/h, Proteina C reactivă 21,5 mg/dl, creatinina 1,8 mg/dl.
Examenul CT abdomino-pelvin evidențiază un abces la nivelul iliopsoasului de 6,6 pe
8,5 cm, iar pe IRM-ul de coloană lombară se observă osteomielită la nivelul corpului
vertebral L5 și a procesului stâng transvers.
Abcesul a fost drenat, iar în culturi a crescut Staphylococcus aureus meticilino-rezistent.
Culturile în anaerobioză au fost negative. Hemoculturile nu s-au pozitivat.
A efectuat 6 săptămani tratament parenteral cu vancomicină, urmată 2 săptămâni de
tratament cu linezolid per os datorită dorinței pacientului de a merge la muncă. A primit
apoi Biseptol încă 8 săptămâni.
După terminarea tratamentului VSH-ul a scăzut la 14 mm/h, cu o Proteină C Reactivă
0,7 mg/dl. La 6 luni nu s-au înregistrat recăderi.
În afară de identifcare bacteriei și antibiogramă s-a efectuat și latex aglutinare pentru
evidențierea PB2 (protein binding 2). Cu ajutorul tehnicii PCR a fost detectată fracțiunea
genică responsabilă de sinteza leucocidinei Panton-Valentine. (5)
Discuţii: Infecțiile reprezintă complicațiile cele mai frecvente la pacienții transplantați.
Infecțiile cu Staflococ auriu meticilino-rezistent sunt predominant infecții intraspitalicești și
au devenit o problemă de sănătate publică. (6)
Un alt factor de risc important pentru infecția cu Staflococ este și diabetul zaharat.
Leucocidina Panton–Valentine este un factor solubil, care permit multiplicarea şi
invazivitatea staflococului. Determină liza polimorfonuclearelor și monocitelor. Este
considerată un factor de virulență, care determină creșterea severității bolii atât în
afecțiunile cutanate, cât și în osteomielită sau pneumonii necrotizante.
9. 5. Evaluarea cunoștințelor
1. Prionii sunt constituiţi din:
A. ADN-înveliş proteic
B. ARN-înveliş proteic
C. o particulă proteică
D. miez glucidic + înveliş proteic
134
C. cuprului
D. magneziului
3. Bioflmul:
A. reprezintă o populaţie bacteriană aparținând unei specii
B. cuprinde bacterii ce aderă doar între ele
C. se poate dezvolta pe un cord transplantat
D. cuprinde bacterii sensibile la penicilină
E. cuprinde bacterii și polimeri extracelulari
Noţiuni de imunologie
Imunologia este o ştiinţă care a apărut relativ recent, iniţial ca un domeniu al
Microbiologiei, studiind mecanismele de apărare a organismelor (uman şi animal) faţă de
agresiunea din cursul procesului infecţios.
În Imperiul Roman „immunitas” însemna scutirea de anumite obligaţii.
În primul secol după Iisus Christos, descriind rezistenţa la veninul unor şerpi veninoşi,
Lucanus a considerat că „immunitas” înseamnă „scutit de a te îmbolnăvi”.
Observaţiile medicului englez Edward Jenner privind faptul că o parte dintre persoanele
care mulgeau vacile nu s-au îmbolnăvit în cursul epidemiei de variolă, dar şi faptul că
pustulele care apăreau pe ugerul vacilor, ca şi pe tegumentul mâinii persoanelor care
mulgeau se asemănau, au dus la concluzia că între aceste fenomene există o legătură. În
1796, Jenner a realizat una dintre primele experienţe pe om (a inoculat secreţie din
pustulele de la vaci la un copil; ulterior a inoculat secreţie de la pacienţi cu variolă, iar
copilul se pare că nu s-a îmbolnăvit de variolă). Cu toate acestea, reacţiile în „mass-media”
vremii nu au întârziat să apară. (Figura nr. 1) –vacile din poza de la RM
Imunologia a fost fundamentată de studiile realizate de către marii cercetători Pasteur
şi Metchnikof. Louis Pasteur a „vaccinat” găini împotriva holerei aviare, a „vaccinat” oi
împotriva antraxului şi a reuşit prevenirea infecţiei cu virusul rabic. Pasteur a decis să
denumească procedeul de inoculare cu germeni atenuaţi, urmat de protecţia faţă de
135
boală, vaccinare(probabil pentru că Jenner a obţinut primele sale rezultate recoltând şi
inoculând produsul obţinut de la vaci). Ilia Metchinikof a descoperit fagocitoza. Emil von
Behring şi S. Kitasato au studiat fenomenul prin care se obţin antitoxinele şi ulterior au
realizat experimentele care au stat la baza seroterapiei. Despre hipersensibilitate a început
să se discute în 1902, iar termenul de histocompatibilitate este cunoscut din 1946. Aceste
studii şi multe altele, care ar merita dedicarea unui volum întreg, mult amplifcate în
deceniile care au urmat sunt mai departe „în continuă mişcare”, cu numeroase descoperiri
chiar şi în prezent.
Relaţia între organismul gazdă şi sistemul imun (organe, celule, anticorpi, citokine etc)
ar putea f asemănată cu relaţia stabilită între o ţară şi armata ţării respective, cu sisteme
de control, sisteme de comandă, reacţii „la nevoie” (uneori în „regim de urgenţă”) în care
există implicare importantă şi din partea altor sisteme (nervos, endocrin). Mai mult decât în
exemplul privind situaţia la nivelul unei ţări, „soldaţii” din sistemul imun (de ex. LT
citotoxice, celulele NK) pot avea atât o activitate efectoare cât şi de control şi retro-control
(îşi „depăşesc” limitele de „simpli soldaţi”).
S-ar putea ridica o întrebare şi anume: de ce avem nevoie de un sistem imunitar?
Să nu uităm faptul că în fecare zi organismul nostru se întâlneşte cu nenumărabile
microorganisme: bacterii, virusuri, paraziţi etc. Unele microorganisme nu ne afectează în
nici un mod, altele au efecte benefce faţă de organismul nostru, în timp ce o mare parte
dintre microorganisme pot duce la apariţia unor îmbolnăviri. În acest context, sistemul imun
„a fost nevoit” să găsească modalităţi prin care să „lupte” împotriva microorganismelor
patogene şi condiţionat patogene.
Mai mult decât atât, chiar şi substanţe străine (non-self) neinfecţioase dar şi structuri
proprii modifcate pot duce la un răspuns imun. S-a demonstrat şi faptul că mecanisme care
în mod normal protejează organismul de eventualele infecţii pot f implicate în
determinarea unor leziuni tisulare sau de organ.
Având în vedere toate aceste aspecte (dorim să subliniem faptul că realitatea este cu
mult mai complexă), o defniţie a imunităţii ar putea f următoarea: imunitatea
reprezintă o reacţie faţă de orice structură non-self (fe microorganism sau o
substanţă străină de tipul unei macromolecule proteice, glicoproteice etc) sau faţă de o
celulă sau structură proprie care a suferit modifcări.
Informaţiile privind sistemul imun sunt prezentate în cadrul mai multor catedre şi
discipline. Având drept ţintă o cât mai bună înţelegere a capitolelor pe care ne-am gândit
să le introducem în „Manualul de Microbiologie” dorim să facem o scurtă „trecere în
revistă” a organelor, celulelor, moleculelor şi mecanismelor implicate în imunitate.
Menţionăm faptul că nu veţi găsi aici toate defniţiile şi explicaţiile; pentru aceasta
cititorul va trebui să parcurgă fecare capitol în parte. Etapele pe care le descriem au doar
scop didactic; în realitate fenomenele se petrec simultan şi sunt mult mai complexe decât
pot f explicate într-un „simplu manual” sau chiar şi decât ar putea f acestea explicate de
oamenii de stiinţă, în acest moment. Ceea ce noi cunoaştem este, de fapt, „o picătură într-
un ocean”.
136
Astfel, ne propunem să luăm ca exemplu un microorganism oarecare - un antigen. în
cazul în care acesta reuşeşte să depăşească barierele naturale ale organismului (piele,
mucoase etc) şi să pătrundă în ”gazdă”, următoarea linie de apărare este reprezentată de
imunitatea înnăscută.
Fagocitele reprezentate spre exemplu de macrofage şi granulocite recunosc microbii de
orice fel (recunoaşterea nu este specifcă) şi încep procesul de fagocitoză. Apare şi
răspunsul infamator.
Ulterior intră în acţiune imunitatea adaptativă care se manifestă cu ajutorul limfocitelor.
Aceasta din urmă este specifcă deoarece dezvoltă în timp (cateva zile) celule şi molecule
specifce pentru a „lupta” strict împotriva acestui antigen.
O altă deosebire majoră între cele două tipuri de imunitate este reprezentată de
capacitatea limfocitelor de a se transforma în limfocite cu memorie după întâlnirea cu un
anumit antigen. Astfel, spre deosebire de macrofage şi granulocite, la o a doua întâlnire cu
acelaşi antigen, limfocitele îl vor recunoaşte iar procesul de apărare se va declanşa mult
mai rapid.
Explicând puţin mai în în profunzime (menţionăm că explicaţii mai detaliate vor f
furnizate în capitolul 11 şi în alte capitole care urmează) avem în vedere faptul că antigenul
pătruns în organism este captat de către celulele prezentatoare de antigen (APC)
(macrofage, celule dendritice, limfocite B etc).
Antigenul nu poate f recunoscut ca atare de către sistemul imun deoarece doar o
anumită parte a lui numită epitopprezintă proprietatea de imunogenicitate la valoare
maximă şi poate declanşa un răspuns imun. Antigenul este endocitat de către APC,
prelucrat în lizozomi iar epitopii rezultaţi vor f prezentaţi limfocitelor în complex cu
moleculele sistemului major de histocompatibilitate (MHC). MHC include molecule prezente
pe celulele organismului uman (vezi capitolul 12). Limfocitele vor declanşa un răspuns
imun.
Există două tipuri principale de limfocite şi anume limfocitele T şi limfocitele B, după
cum există două tipuri de răspuns imun, umoral şi celular. Limfocitele T secretă citokine
care pot activa oricare din cele două tipuri de răspuns imun iar limfocitele B (după
proliferare şi blastizare) secretă imunoglobuline (anticorpi) implicate în răspunsul imun
umoral.
Antigenele pot f clasifcate în mai multe grupe: exogene/endogene, timodependente/
timoindependente etc.
Răspunsul imun umoral este declanşat de antigene exogene timodependente şi
independente prezentate pe MHC II, iar răspunsul imun celular este declanşat de antigene
endogene timodependente prezentate pe MHC I.
În cazul în care ne întrebăm: cine produce aceste celule şi unde se desfăşoară
răspunsul imun? O parte a explicaţiei ar include existenţa organor limfoide primare precum
măduva osoasă hematogenă (sediul producerii limfocitelor T şi B şi maturării limfocitelor B)
şi timusul (sediul maturării limfocitelor T) şi organe limfoide secundare precum pulpa albă a
splinei unde se desfăşoară răspunsul imun umoral şi este iniţiat cel celular care se
desfăşoară apoi la locul infecţiei şi ganglionii limfatici (vezi şi capitolul 10).
137
Sistemul imun se poate confrunta cu o mare problemă, şi anume, aceea de a menţine
balanţa între un răspuns imun efcace şi limitarea apariţiei de leziuni tisulare (în cadrul unui
RI exagerat). Când această balanţă „se rupe” apar bolile autoimune şi stările de
hipersensibilitate.
Povestire adevărată: Povestea vaccinului
Edward Jenner s-a născut pe data de 17 mai 1749 în Berkeley, Gloucestershire. Înca de
mic el a fost interesat de ştiinţe şi natură. Pe atunci circula zvonul cum că lăptăresele sunt
protejate de variolă, zvon pe care l-a auzit şi el.
La 21 ani a plecat în Londra şi a devenit studentul lui John Hunter, cel mai renumit
chirurg din Anglia şi un respectat şi cunoscut biolog şi anatomist. Între cei doi s-a închegat
o prietenie adevărată. Jenner a studiat geologia şi a făcut mai multe experimente cu sânge
uman. A câştigat experienţă în biologie şi bineînţeles, în chirurgie.
De-a lungul anilor, Jenner a tot auzit zvonul că lăptăresele erau protejate de variola.
Punând lucrurile în balanţă, Jenner a concluzionat că forma de ”variolă” făcută de vaci ar
putea avea o oarecare legătură cu un posibil mecanism de protecţie. În mai 1796 a găsit o
tânără lăptăreasă, Sarah Nelms, care avea leziuni nou apărute datorită ”variolei vacilor” pe
mâini şi braţe. Pe data de 14 mai 1796 a inoculat material din leziunile ei la băiatul unui
servitor în vârstă de 8 ani, James Phipps. Ulterior, băiatul a prezentat febră şi discomfort în
zona axilară. La 9 zile a prezentat simptomele unei răceli şi şi-a pierdut apetitul dar ziua
următoare era iar bine. În iulie 1796 Jenner l-a inoculat iar pe băiat, de data aceasta cu
material dintr-o leziune nou apărută de variolă umană. Baiatul nu a dezvoltat boala aşa că
Jenner a concluzionat că acesta era protejat complet.
În 1797, Jenner a trimis un scurt comunicat spre Societatea Regală descriind
experimentul şi observaţiile sale. Totuşi, lucrarea a fost respinsă. În 1798, după ce a mai
experimentat pe câţiva oameni, Jenner a publicat o mică carte numită O incursiune în
cauzele şi efectele vaccinului antivariolic, o boală descoperită în unele din ţările vestice ale
Angliei, mai ales înGloucestershire şi cunoscută sub numele de variola vacilor”.
Cuvântul latin pentru vacă este vacca” iar pentru variola vacilor este vaccinia”. Jenner
a decis să denumească această nouă procedură vaccinare. În 1798 publicaţia avea trei
părţi. În prima parte Jenner prezintă viziunea sa legată de variola vacilor ca o boală a cailor
transmisă la vaci. Teoria a fost infrmată în timpul vieţii lui Jenner. Apoi a prezentat ipoteza
că infecţia cu variola vacilor protejează de infecţia cu variolă umană. În cea de-a doua parte
sunt continuate observaţiile critice relevante pentru testarea ipotezei sale. A treia parte a
fost o discuţie lungă, în parte polemică, legată de descoperirile şi problemele variate legate
de variolă. Reacţiile la această publicaţie au fost din cele mai diverse.
Jenner a plecat la Londra în căutare de voluntari pentru vaccinare. După trei luni nu
găsise nici măcar unul singur. El a pornit un studiu la nivel naţional în căutarea persoanelor
care prezintă rezistenţă la variolă în rândul celor care făcuseră variola vacii. Rezultatul
acestui studiu i-a confrmat teoria. În ciuda erorilor şi controverselor nenumărate folosirea
vaccinării s-a răspândit rapid în întreaga Anglie şi până în 1800 a atins majoritatea ţărilor
Europene (Jenner a vaccinat în 1801 populaţia din Cluj şi Târgu Mureş, apoi această
procedură s-a extins în întreaga ţară în următorii 31 de ani (1).
138
Deşi a fost apreciat la nivel mondial şi i s-au acordat multe onoruri, Jenner nu a avut
intenţia să se îmbogăţească. În 1802, Parlamentul Britanic i-a oferit suma de £10,000
pentru descoperirea sa, iar cinci ani ulterior i-a oferit înca £20,000. Pe de alta parte, el a
fost şi subiectul ridiculei şi atacurilor, nu doar al onorurilor. În ciuda acestor lucruri el şi-
a continuat activităţile în slujba vaccinării.
Lucrarea lui Jenner reprezintă prima încercare ştiinţifcă de control a bolilor infecţioase
prin folosirea deliberată a vaccinării. Totuşi, nu el este cel care a descoperit vaccinarea, dar
a fost primul care a oferit un status ştiinţifc acestei proceduri. Benjamin Jesty este cel care
a vaccinat primul împotriva variolei.
La sfârşitul secolului XIX s-a descoperit că vaccinarea nu conferă imunitate pentru toată
viaţa şi de aceea este nevoie de revaccinare. Mortalitatea datorată variolei era în scădere,
dar epidemiile arătau că boala încă nu era ţinută sub control. În 1950 s-au implemantat mai
multe măsuri de control şi variola a fost eradicată în mai multe zone ale Europei şi America
de Nord. Procesul de eradicare la nivel mondial al variolei a fost discutat atunci când
Adunarea Mondială a Sănătăţii a primit un raport, în 1958, legat de consecinţele
catastrofale ale variolei în 63 de ţări. În 1967 s-a început o campanie globală condusă de
Organizaţia Mondială a Sănătăţii care a dus la eradicarea variolei în 1977. În data de 8 mai
1980 Adunarea Mondială a Sănătăţii a anunţat că lumea nu mai are variolă şi a recomandat
ca toate ţările să înceteze vaccinarea. (2)
Nu am dorit să povestim totul legat de vaccinare în cadrul acestui capitol, ci doar să vă
introducem puţin în povestea acestei tehnici pentru a arăta evoluţia lucrurilor şi efectul
benefc pe care l-a avut această descoperire în întreaga lume. Aşa cum se ştie, vaccinarea
rămâne momentan singura metoda cu cel mai bun raport cost-efcienţă. Pe această cale
dorim să sensibilizăm studenţii la medicină şi cititorii acestei cărţi în ceea ce priveşte
vaccinarea şi să infrmăm teoriile greşite care au circulat și continuă să circule în ultimul
timp.
139
situate în mezodermul intra-embrionar şi extra-embrionar (sacul vitelin). La făt, celulele
stem migrează şi se localizează la nivel hepatic. În cea de-a zecea săptămână de viaţă
intrauterină, apar primele celule stem în os. după cea de-a 20-a săptămână, la fătul uman,
hematopoieza devine exclusiv medulară.
10. 1. 3. Măduva osoasă
Teritoriul hematopoietic (MOH) se reduce odată cu vârsta: la copil, toate oasele au
funcţie hematopoietică; la adult, teritoriul hematopoietic se restrânge la oasele trunchiului
şi bazinului, atingând un volum de circa 5 litri la un subiect de 60 kg; la persoanele
vârstnice, funcţia hematopoietică se menţine la nivelul sternului, vertebrelor şi al oaselor
coxale.
140
Greutatea sa variază cu vârsta (este bine dezvoltat la făt, greutatea creşte până la
pubertate - dezvoltarea maximă se realizează la vârsta de 10-12 ani, apoi suferă o involuţie
lentă, fără să dispară total).
În zona corticală, trama de-a lungul căreia se plasează protimocitele (sosite în timus
de la MOH) cuprinde celule epiteliale, celule dendritice intratimice şi macrofage. Limfocitele
mici, denumite şi timocite corticale, sunt numeroase, grupate în grămezi, în jurul celulelor
epiteliale. Ele se divid activ, dar nu se structurează în noduli limfatici.
În zona medulară, celulele epiteliale sunt izolate sau grupate formând corpusculii lui
Hassal (formaţiuni de celule epiteliale care degenerează, find mereu înlocuite cu alte celule
similare), caracteristici timusului. Se consideră că au rol fagocitar. Cresc atât numeric cât şi
ca dimensiuni, probabil datorită contactului cu microorganismele din fora normală, dar şi
contaminării cu alte microorganisme. Medulara mai conţine şi celule dendritice, macrofage
şi timocite. Timocitele medulare sunt mult mai dispersate decât cele din zona corticală. La
acest nivel are loc selecţia negativă a timocitelor.
Timusul are capacitatea de a elimina prin selecţie pozitivă celulele care, odată
eliberate în circulaţie, nu ar f putut produce efectul scontat, deoarece nu ar f recunoscut
structurile non-self şi prin selecţie negativă celulele care ar f dat reacţii autoimune.
Populaţia limfocitară afată în proces de multiplicare în timus, este foarte sensibilă la
acţiunea corticosteroizilor, 95% din limfocite find distruse. Restul de 5% din limfocitele
cortico-rezistente sunt cele care, la fnalul maturaţiei, trec în circulaţie. Se pare că iniţial are
loc distrugerea a 80% dintre limfocite, 20% ajung la nivel medular şi dintre acestea
supravieţuiesc cele 1-5% limfocite cortico-rezistente. Timocitele ajunse în zona medulară
sunt mai rezistente la acţiunea cortizolului decât cele din zona corticală. (Figura nr. 1)
Rolul timusului se manifestă local şi la distanţă:
· rolul local, constă în transformarea limfocitelor nediferenţiate în limfocite T
mature, cu achiziţia de receptori pentru antigene (TCR). Procesul de multiplicare şi
diferenţiere are loc, în principal, în regiunea corticală. Celulele achiziţionează progresiv
markeri ai limfocitului T adult: molecule CD2, CD3, CD4, CD8 şi TCR. Urmează o dublă
selecţie, pozitivă şi negativă. Înselecţia pozitivă, timocitele care recunosc antigenele
străine fxate pe moleculele MHC pot prolifera (timocitele CD4+ recunosc moleculele MHC
clasa II, timocitele CD8+ recunosc moleculele MHC clasa I), în timp ce acele limfocite care
nu şi-au dezvoltat receptori pentru antigene sunt distruse. În selecţia negativă, timocitele
care recunosc structurile self sunt distruse, eliminându-se astfel timocitele puternic
autoreactive, care ar conduce la apariţia unor fenomene autoimune imediat după naştere.
În timus are loc multiplicarea, diferenţierea şi selecţia limfocitelor T. Tot la nivel timic are
loc producerea celulelor de control, cu rol în prevenirea bolilor autoimune (experienţele
realizate prin înlocuirea limfocitelor proprii cu limfocite de la persoane sănătoase a dus,
pentru un timp, la dispariţia semnelor de boală, dovedind astfel existenţa acestor celule
timice). (Figura nr. 2)
· rolul la distanţă se realizează prin factorii timici peptidici umorali (timostimulina,
timopoietinele, timozinele, factorul umoral timic etc). Aceşti factori au funcţii diverse, unii
dintre ei infuenţând diferenţierea limfocitelor T în ariile timodependente din organele
141
limfoide periferice. Acţionează atât la nivelul timusului cât şi la distanţă. Câteva informaţii
despre factorii timici:
Timozina are efecte asupra limfocitelor T, stimulându-le activitatea citotoxică şi
crescând sinteza de IL-6. In vivo, stimulează LH şi GnRH, iar in vitro Prolactina şi GH.
Timostimulina necesită Zn pentru a acţiona. Are efect asupra dezvoltării
protimocitelor în MOH.
Factorul umoral timic induce producerea de IL-2 (are potenţial antiviral).
Timopoietina intervine în procesul de diferenţiere a limfocitelor T.
10. 2. 2. Măduva osoasă hematogenă la mamifere
La mamifere, se menţine divizarea funcţională în limfocite T şi B, dar nu există bursa lui
Fabritzius. Transformarea celulei stem în limfocit B matur are loc în măduva osoasă
hematogenă (bone marrow, LB). La copii, rolul de organ limfoid primar este asigurat atât
de măduva din oasele late cât şi din oasele lungi; ulterior, măduva de la nivelul oaselor
lungi este înlocuită cu ţesut adipos, care mai târziu se fbrozează, iar măduva activă
rămâne la nivelul oaselor late (stern, coxal, coaste, vertebre). Cazurile cu defcit imunitar
selectiv pentru limfocite B (ex. maladia Bruton), confrmă existenţa unei autonomii a
acestei populaţii. Transplantul de măduvă osoasă hematogenărestaurează imunitatea
umorală, ducând la dispariţia perturbărilor.
Dintre funcţiile măduvei osoase hematogenă în imunitate amintim:
1. menţinerea unui procent de celule stem cu diferenţiere spre linia limfocitară şi
primele stadii ale seriei T şi B;
2. maturarea şi diferenţierea completă a limfocitelor B în celule B mature, apte să
colonizeze organele limfoide secundare.
La nivelul măduvei există mai multe tipuri de celule: celule „cap de serie” şi celule
tinere care derivă din acestea, celule din seria granulocitară, celule din seria
megakariocitară, celule din seria eritrocitară, celule din seria monocito-macrofagică,
celulele din seria limfoidă (dar nu există LT, ci doar protimocite, limfocite T nediferenţiate).
145
Infamarea apendicelui (apendicită) este o afecţiune frecvent întâlnită în secţiile de
chirurgie, iar apendicectomia a devenit o procedură de rutină, având puţine riscuri (în
general datorate efectelor anesteziei). Studii recente afrmă că apendicectomia
(desfăşurată în cazul unei apendicite acute şi nu atunci când nu există de fapt această
afecţiune) are efecte benefce în scăderea incidenţei dezvoltării colitei ulcerative. S-a
constatat că la pacienţii suferinzi de apendicită la vârste tinere care au fost supuşi
operaţiei, a scăzut riscul de apariţie a colitei ulcerative cu până la două treimi. Se pare că
efectul este dat de o stimulare a limfocitelor T supresoare ce survine în urma procedurii
chirurgicale. Însă apendicectomia nu reprezintă o soluţie în cazul celor la care boala s-a
instalat deja.
Colita ulcerativă este o boală infamatorie a intestinului caracterizată prin apariţia
ulceraţiilor în peretele colonului, diaree cu sânge şi crampe abdominale. Cauzele instalării
bolii sunt multiple, de natură genetică, cauză autoimună, alimentaţie necorespunzătoare.
Un parcurs de 10 ani netratat poate degenera în cancer de colon sau cancer rectal.
Chiar dacă apendicectomiile au devenit „foare la ureche” pentru mulţi medici chirurgi
iar pacienţii nu se tem de o operaţie „uşoară”, este de reţinut faptul că diagnosticul trebuie
instaurat corect de către medic care adesea uită că durerea la nivelul zonei inghinale
drepte nu este semnul patognomonic pentru apendicită şi nu se mai oboseşte să mai facă
alte teste, realizând uneori o operaţie inutilă şi netratând până la urmă suferinţa
pacientului.
2. Care este organul care pe lângă funcţia limfoidă, are şi funcţie hematoformatoare în
ansamblu?
1. splina;
2. ganglionul limfatic;
3. timusul;
4. măduva osoasă hematogenă.
147
GEMM), bipotente, unipotente (CFU-Eo, CFU-Baso, CFU-Mega). Prezintă capacitate de
autoîntreţinere („self-renewal”) şi generează descendenţi în lipsa stimulilor antigenici.
Răspunde la diferite mecanisme de control complexe. Din punct de vedere morfologic se
aseamănă foarte mult cu limfocitul imunocompetent. Este foarte uşor de distrus de către
radiaţii dar nu şi de către chimioterapice.
Descoperirea metodelor de izolare şi cultivare a celulelor stem (1998) a creat o nouă
speranţă: tratamentul cu celule stem ar putea ajuta la vindecarea unor boli grave
(considerate astăzi ca find incurabile). Celulele stem find progenitori nediferenţiaţi se pot
divide şi dezvolta într-o multitudine de alte tipuri de celule, putând duce la formare de
ţesuturi şi organe. Cercetătorii estimează că aceste celule ar putea f folosite, în viitor,
pentru repararea diferitelor structuri distruse sau în suferinţă, dar chiar şi pentru „sinteza”
de organe. Totuşi, sunt încă destul de multe probleme tehnice care trebuie surmontate.
(Figura nr.1 – Evoluţia celulei „stem”)
148
Aspectul morfologic nu ne permite să apreciem care este starea de activare celulară.
Dacă folosim culturi celulare, în prezenţa unor agenţi mitogeni nespecifci [ex.
ftohemaglutinină, concavalină A, lipopolizaharide, lectine cum ar f PWM (pokeweed
mitogen) etc] sau a unor antigene specifce, limfocitele T sau B afate anterior „în repaus”
cresc în dimensiuni, prezintă modifcări la nivelul nucleului (cromatină fnă, citoplasmă mai
abundentă şi mai albastră pe frotiu), find denumiteimunoblaste.
149
· efectoare
· cu memorie - care vor reacționa mai rapid la a doua stimulare cu același antigen.
153
exemplu, sub acţiunea IL-4 are loc comutarea izotipică a IgM în IgG sau IgE iar sub acţiunea
IL-5 în IgA.
Există şi limfocite B active care nu se transformă în plasmocite ci persistă sub formă
de limfocite B cu memorie, cu o durată de viaţă lungă (asigurând spre exemplu protecţia
faţă de o nouă îmbolnăvire, de ex. după scarlatină/infecție cu streptococul piogen de grup
A, lizogenizat).
Limfocitul B are următoarele funcţii: 1. Prezentarea antigenelor către LT; 2. Sinteza
imunoglobulinelor (anticorpilor). În cazul antigenelor timo-dependente, are loc trecerea de
la răspunsul primar cu secreţie predominentă de IgM, la un răspuns secundar cu
predominenţa IgG sau mai rar a IgA sau IgE. În cazul antigenelor timo-independente, se
menţine sinteza anticorpilor din clasa IgM.
Limfoblastul (lymphoid progenitor) dă naștere la trei linii celulare (LT, LB și NK). Există o
genă (Pax5) care este esențială pentru maturarea LB (5).
154
· limfocitele B;
- celulele ocazionale (îndeplinesc funcţia doar în anumite condiţii de activare celulară)
· neutroflele,
· celulele endoteliale şi
· celulele epiteliale.
Celulele prezentatoare de antigen (APC) au următoarele funcții (Figura nr. 3):
· recunosc antigenele T dependente prin receptorii membranari, le endocitează și
prelucrează,
· transportă antigenele native de la țesuturi la organele limfoide secundare,
· prezintă antigenele native LT urmând selecția clonei de limfocite specifce acelui
antigen,
· activează fe LTc fe LTh.
Celulele dendritice se găsesc în aproape toate țesuturile organismului, incluzând
sângele și organele limfoide. La nivelul țesuturilor periferice formează o rețea care se
extinde și în spațiile dintre celulele parenchimatoase astfel încât pot detecta orice
microorganism afat în acea zonă. Celulele dendritice posedă două sisteme de
supraveghere imunologică:
· macropinocitoză (în fecare oră ingeră echivalentul volumului lor; nu așteaptă
pasiv apariția antigenului care să le stimuleze),
· au pe membrană mai multe tipuri de receptori pentru mai multe tipuri de
particule.
Sunt clasifcate, în funcţie de distribuţia în organism şi de particularităţile fenotipice, în
trei mari clase și şase tipuri:
a). Celule dendritice tisulare
· celule Langerhans – CDL, care la nivel cutanat formează un strat continuu între
derm și epiderm (dar le găsim și la nivelul tubului digestiv și organelor genitale),
· celule interstiţiale - CDI, care se găsesc în interstițiul țesuturilor;
b). Celule dendritice limfoide (din organele limfoide secundare)
· celule interdigitate - CDID, în ariile T dependente din organele limfoide
secundare,
· celule foliculare - CDF, în ariile B dependente din organele limfoide secundare;
c). Celule dendritice circulatorii
· celule sanguine - CDS, în vasele sanguine, afate în tranzit,
· celule limfatice, „văluroase” - CDV, în vasele limfatice, afate în tranzit.
Toate celulele dendritice au origine medulară, provenind din aceeaşi entitate celulară -
CDS (o parte dintre CDS pătrund în ţesutul cutanat şi mucoase, iar altă parte în interstiţiu).
Pot să îndeplinească funcţia de APC deoarece prezintă receptori de tip CR, FcγR şi
sintetizează molecule MHC II (cu excepţia CDF).
Așadar, celulele dendritice sunt eliberate în circulație din măduva osoasă hematogenă
și se transformă în CDS. De aici pot urma două căi:
· în țesutul cutanat se transformă în CDL (captează antigenele opsonizate), apoi
iau calea vaselor limfatice transformându-se în CDV, ajung la nivelul organelor limfoide
155
secundare unde se transformă în CDID care prezintă pe membrana epitopi în conjuncție cu
MHC II.
· în interstițiu se transformă în CDI, apoi fe iau calea vaselor limfatice (și urmează
drumul de mai sus), fe trec în circulație, se transformă din nou în CDS și ajung în splină
unde fe
o ajung periarteriolar (zona cu LT) și se transformă în CDF care reprezintă fltre pentru
antigenele solubile,
o ajung în jurul zonei periarteriolare (zona cu LB) și se transformă în CDID.
Subliniem că este vorba despre aceeași celulă dendritică, în circulație prin organism; în
funcție de locul în care ajunge are alte caracteristici structurale și funcționale.
Celulele dendritice tipice (CDL, CDI, CDID) au formă neregulată, cu prelungiri
numeroase, lungi şi eflate (de unde vine şi denumirea lor). În citoplasma celulelor
dendritice se găsesc numeroase mitocondrii. CDF nu au atât de multe prelungiri și se
dispun în grămezi. CDS au aspect rotund ovalar iar CDL sunt celule văluroase.
Au rol important în maturizarea precursorilor LT.
Induc toleranța LT, eliminând LT autoreactive (cele care la nivel timic au interacționat
cu MHC și ar putea să reacționeze la fel de puternic și cu celulele somatice normale din
organismul uman și să genereze autoimunitatea). Astfel, CD elimina LT care au scăpat
selecției negative (vezi Cap. 10, paragraf 10.2.1.).
Se pare că aceste celule intervin în declanşarea RI înaintea macrofagelor.
Monocitele / macrofagele pot fagocita exo-antigenele într-o vacuolă numită endozom
primar. Fuziunea endozomilor secundari cu lizozomii permite degradarea antigenelor în
peptide imunogenice. Moleculele MHC II, produse la nivelul reticulului endoplasmic, pot
„încărca” aceste peptide. Fago-lizozomii fuzionează cu membrana plasmatică şi astfel,
peptidul de pe MHC II se exprimă la suprafaţa externă a macrofagelor.
Macrofagele reprezintă APC majoritare în organism, însă nu toate pot îndeplini funcţia
de APC, respectiv:
· cele care nu au capacitatea să funcţioneze ca APC vor rămâne implicate în
răspunsul infamator,
· celelalte vor funcţiona ca APC în cinci etape
1. captarea Ag (proces imunologic nespecifc, mediat de receptori);
2. endocitarea Ag captate (realizată doar de către macrofagele activate metabolic);
3. prelucrarea Ag native captate (are loc la nivel lizozomal iar la fnalul ei, rămâne un
epitop, format dintr-o haptenă cu specifcitate maximă şi o proteină „carrier”);
4. conservarea epitopilor în anumite sectoare subcelulare (în acest fel este asigurată
autoîntreţinerea RI în timp);
5. prezentarea epitopilor pe membrana APC, cuplaţi în permanenţă cu molecule
MHC. Sistemul MM exprimă molecule MHC II, mai ales după activarea prin interferonul
gamma (IFN-g). După contactul cu limfocitul T, macrofagele secretă IL-1 şi IL-6 şi TNF-a;
TNF-a activează RI şi procesul infamator local.
Limfocitele B pot funcţiona ca APC profesionale numai în condiţii de activare
metabolică. Au capacitatea de a recunoaşte epitopii conformaţionali ai antigenelor şi de a-i
156
prezenta limfocitelor T (de peste 30 de ani a fost dovedit faptul că RI la antigenele timo-
dependente necesită cooperarea LB-LT). Prezintă pe suprafaţa lor receptori de tip CR şi
FcγR şi pot sintetiza molecule MHC II.
LB recunosc şi prezintă numai Ag solubile. Există studii care afrmă faptul că LB au o
mai mare efcienţă în procesul de prezentare al antigenelor în comparaţie cu macrofagele.
LB naive dar mature (încă nu au avut contact cu antigenul, dar au fost maturate în
măduva osoasă hematogenă) sunt stimulate de antigen. Ag este captat prin intermediul
BCR (receptor pentru antigen de pe LB). LB captează antigenul, îl procesează, prezintă apoi
epitopii în complex cu molecule MHC II spre LTh CD4+. Acesta din urmă trimite semnale
către alte LB prin citokine şi molecule de suprafaţă iar LB încep să prolifereze, se
transformă în limfoblaste B, apoi în plasmocite care vor secreta anticorpi.
157
fagocitate, sistemul MM produce un anumit grad de distrugere, cu conservarea grupărilor
specifce, necesare stimulării răspunsului imun.
Citotoxicitatea exercitată de macrofage poate f
· directă (în cursul procesului de fagocitoză),
· în urma contactului cu membrana celulei ţintă sau
· prin citotoxicitate mediată celular, dependentă de anticorpi (ADCC) (în acest caz,
anticorpii se fxează cu capătul Fab pe epitopii celulei ţintă şi cu fragmentul Fc de
macrofag).
Macrofagul produce substanţe litice cu care perforează membrana celulei ţintă
(asemănător cu acţiunea ADCC a celulelor NK).
Macrofagele secretă un număr foarte mare de substanţe:
· cea mai mare parte a factorilor sistemului complement,
· enzime proteolitice (ex. colagenaze, serinproteaze, hidrolaze),
· proteine cu rol în adeziunea celulară (ex. fbronectină),
· factori de coagulare,
· interleukine (IL-1, IL-6, TNF-a, factorul de creştere al trombocitelor/fbroblastelor,
factorul de stimulare al coloniilor de granulocite/granulocite-macrofage, endorfne etc) etc.
Etapele fagocitozei (Schema nr. 1):
1. Migrarea macrofagelor la locul infecției,
2. Aderarea macrofagelor la celula țintă,
3. Ingestia celulei țintă,
4. Formarea fagolizozomului,
5. Inactivarea intracelulară a celulei țintă,
6. Digestia intracelulara a celulei țintă.
Iată câteva studii interesante legate de funcţiile macrofagelor și modul în care acestea
interacționează cu diferitele microorganisme.
Lipoarabinomananul (LAM) este considerat unul din factorii de virulență
ai Mycobacterium tuberculosis. S-a demonstrat că LAM este incorporat în plutele lipidice din
interiorul membranei macrofagelor prin intermediul glicozil-fosfatidil-inozitolui ducând la
reducerea maturării fagozomilor şi protejând astfel celula fagocitată (6).
Toxina pertusis (TP) produsă de Bordetella pertussis este implicată în tusea convulsivă.
S-a studiat interrelația dintre TP și macrofagele alveolare în cursul procesului infecțios. La
un lot de șoricei s-au ”eliminat” macrofagele alveolare ceea ce a condus la intensifcarea
manifestărilor procesului infecțios, cu toate că imediat s-a produs un infux de neutrofle la
locul infecției. Mai mult decât atât, lipsa macrofagelor a dus la declanșarea procesului
infecțios chiar și cu tulpini care erau defcitare în sinteza TP (7).
Endocardita poate f cauzată de streptococii orali. Mecanismul nu este complet elucidat,
dar se pare că monocitele au un rol important. Deși celulele monucleare din sângele
periferic sintetizează titruri crescute de IL-12, monocitele tind să dispară. Acest lucru scoate
în evidență faptul că monocitele infectate streptococic se transformă în celule dendritice
secretoare de IL-12 și nu în macrofage. Celule sanguine mononucleare periferice de la
subiecți sănătoși au fost infectate cu șase tulpini de streptococi orali. S-a observat că
158
monocitele stimulate de aceste antigene exprimă fenotipul și funcția celulelor dendritice
(8).
Mai multe studii au arătat că M. leprae activează puține macrofage și celule dendritice.
S-a demonstrat că la nivelul monocitelor naive M. leprae induce niveluri crescute de
citokine ce inhibă monocitele. M. leprae este implicat atât într-o stimulare cât și într-o
inhibare a monocitelor (9).
159
Pe de altă parte, eozinoflele produc histaminază şi arilsulfatază care inactivează
histamina şi respectiv leucotrienele produse de mastocite. Prin aceşti factori se reduce
răspunsul infamator şi migrarea leucocitelor în focarul infecţios.
Mai multe studii au demonstrat rolul eozinoflelor în cadrul imunității înnăscute și
adaptative îndreptate împotriva infecțiilor cu paraziți. Nu a fost dovedit că eozinoflele ar
iniția răspunsul imun față de paraziți. Plecând de la ipoteza că eozinoflele ar putea f celule
prezentatoare de antigen în infecțiile parazitare, eozinoflele au fost expuse la un anumit
parazit și s-a examinat expresia diferiților markeri de suprafață implicați în activarea
celulară. S-a remarcat o creștere de 6 ori a CD69 și MHC II, de 4 ori a CD86 (molecula
costimulatoare pentru LT). Abilitatea eozinoflelor de a prezenta antigenul a fost explorată
și prin cultivarea lor împreună cu LTCD4+. Eozinoflele au avut capacitatea de a transforma
LT naive în LTh2 producătoare de IL-5 (11).
Bazoflele şi mastocitele
Conţin granule metacromatice şi receptori pentru IgE. Au rol în reacţia de
hipersensibilitate mediată umoral (tip I). Principalul mediator în declanşarea HS de tip I este
histamina.
Ambele sunt implicate în apărarea anti-parazitară.
Mastocitele nu se găsesc în cantitate mare în sânge, dar sunt întâlnite la nivelul
țesuturilor conjunctive în apropierea vaselor sanguine și limfatice, aproape de sau în
interiorul nervilor și sub epiteliile organelor care vin în contact cu mediul extern (plămân,
intestin, piele).
Bazoflele se diferențiază și maturează în măduva osoasă hematogenă, apoi circulă
prin sânge. Atât bazoflele cât și mastocitele secretă citokine dar spre deosebire de
mastocite, bazoflele secretă și IL-4. A fost studiat un eventual rol în diferențierea
limfocitelor helper spre linia Th2 (proces care necesită IL-4) (12).
A fost demonstrată prezența bazoflelor în ganglionii limfatici, în apropierea LT ca și
faptul că secreția de IL-4 poate f declanșată de un stimul independent de IgE (13).
Mastocitoza (Figura nr. 4) - Mastocitoza) este o boală în care apare hiperplazia
mastocitelor cu exces de mediatori la nivelul pielii, tractului gastrointestinal, măduvei
osoase hematogene, fcatului, splinei și ganglionilor limfatici. Incidența bolii este de 3-
7/1.000.000 locuitori. Poate apărea la orice vârstă (valorile cele mai mari sunt înregistrate
în primii doi ani de viață și în decada a treia și a patra). Se datorează mutației genei ce
activează factorul de creștere pentru mastocite.
Plachetele
Plachetele au un rol accesoriu în reacţia imună. Ele conţin serotonină şi exprimă
receptori pentru IgG şi IgE. Plachetele aderă la endoteliul vascular, se agregă şi eliberează
substanţe care cresc permeabilitatea capilară şi activează sistemul complement. Datorită Ig
fxate pe membrana lor, plachetele pot adera la paraziţi şi pot elibera radicali liberi ai
oxigenului cu efect toxic pentru aceştia.
Globulele roşii
Alături de rolul principal de a transporta oxigenul la ţesuturi şi bioxidul de carbon la
plămâni, globulele roşii deţin receptori pentru sistemul complement, facilitează transportul
160
complexelor imune din sânge la celulele Kuppfer din fcat, prin fxarea lor pe receptorii
pentru complement.
161
Au fost descoperite ca alloantigene (alloantigen = antigen ce există în forme
alternative = alele în cadrul unei specii;alloantigenul induce răspuns imun atunci când este
transferat la indivizii din aceeaşi specie, cărora le lipsește respectiva formă a antigenului;
exemplu: sistemul ABO al grupelor sangvine) de care depindea compatibilitatea grefelor
cutanate sau de organ.
Un fragment de ţesut recoltat de la o gazdă şi grefat la un receptor diferit, chiar dacă
face parte din aceeaşi specie, este de regulă eliminat. Dacă după eliminare se încearcă o
nouă grefare, cu acelaşi tip de ţesut, eliminarea este mai rapidă.
Pornind de la aceste observaţii s-a pus numele de antigene de
histocompatibilitate [primul rol identifcat pentru acestea (dar existenţa lor nu este
legată doar de fenomenul de compatibilitate/respingere a grefelor de ţesut sau organ].
Eliminarea ţesuturilor este controlată genetic, de mai multe gene care codifcă pentru
sinteza de proteine diferite la subiecţi diferiţi (gene de histocompatibilitate).
Există antigene majore de histocompatibilitate (MHC) şi antigene minore (situaţie în
care eliminarea grefelor are loc, de regulă, tardiv).
Înţelegerea acestor fenomene este legată de 3 descoperiri succesive:
· Complexul major de histocompatibilitate. Cercetările lui Gorer (1963) pe
grefe tumorale prelevate de la un şoarece şi grefate la altul, au arătat că grefa este
respinsă în caz de histo-incompatibilitate sau tolerată în caz de histo-compatibilitate.
Rejetul sau toleranţa sunt dictate genetic. Aceasta a dus la descoperirea sistemului major
numit H2 la şoarece şi a mai multor sisteme minore. Ulterior, existenţa MHC a fost
confrmată la toate mamiferele, regiunea find denumită în funcţie de specie (ex. H2 la
şoarece, ChLA la cimpanzeu).
· Sistemul HLA. În 1958 se pune în evidenţă, în serul unui pacient cu aplazie
medulară şi politransfuzat, un alloanticorp care aglutinează leucocitele altor subiecţi.
Aceasta stă la originea descoperirii sistemului allotipic HLA (human leucocyte locus A),
evidenţiat la nivelul leucocitelor, apoi la majoritatea celulelor. Există o împărţire a
sistemului HLA pe mai multe gene HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP şi HLA-DQ. Studiul
supravieţuirii grefelor cutanate, între donor şi receptor HLA identic sau diferit a dovedit că
sistemul HLA corespunde genetic şi funcţional cu MHC uman.
· Răspunsul imun. Rolul fziologic a fost descoperit ulterior. Proprietatea de a
răspunde la un anumit antigen depinde de genele MHC, numite din acest motiv gene ale
răspunsului imun. Doherty şi Zinkeragel au demonstrat în 1974 că răspunsul imun este
limitat de complexul major de histocompatibilitate (MHC) individual.
162
HLA ce face ca organismul uman să fe capabil de recunoașterea a miliarde de antigene din
natură prin arsenalul de MHC cu conformație specifcă fecărui antigen.
2. codominanţa - la un subiect heterozigot, sunt exprimate două alele diferite;
3. legătura strânsă -toate genele situate pe acelaşi cromozom se transmit în bloc
descendentului, sub formă de haplotip.
Moleculele HLA aparţin superfamiliei imunoglobulinelor, modelul lor structural de bază
find motivul imunoglobulinic cu o punte disulfdică intramoleculară.
Sistemul HLA este împărțit în două grupe principale: HLA clasa I și HLA clasa II,
denumirea respectând cronologia descoperirii lor, și nu organizarea pe cromozom. Există și
HLA clasa III (nu este implicată în histocompatibilitate).
Moleculele HLA clasa I
Aceste molecule sunt heterodimeri formaţi prin legătură noncovalentă între un lanţ greu
polimorf a şi un lanţuşor nonpolimorf β2m (Figura nr. 2)
· lanţul greu a (44 kDa) este o proteină transmembranară cu polimorfsm alelic,
codată de o genă a sistemului HLA; cuprinde 3 domenii extracelulare, o porţiune
transmembranară şi o parte intracitoplasmatică scurtă;
· lanţul β2m (11,5 kDa) este codat de o genă de pe cromozomul 15 şi cuprinde un
singur domeniu; este extracelular, legat noncovalent de lanţul a.
Moleculele HLA-I sunt prezente pe majoritatea celulelor organismului, formând pe
suprafața acestora un receptor constitutiv. Dintre celulele anucleate, aceste molecule sunt
adesea absente la nivelul globulelor roşii dar prezente în cantitate mare la nivelul
plachetelor sanguine. Expresia lor pe celulele nucleate este variabilă, în funcţie de tipul
celular: pe limfocitele T sau B şi polimorfonucleare sunt exprimate 10 4-5
´105 molecule/celulă în timp ce pe hepatocite sunt slab exprimate iar pe celulele nervoase
şi spermatozoizi aproape lipsesc.
Pentru HLA-I există 3 gene ce codifcă antigene majore de histocompatibilitate: HLA-A,
HLA-B, HLA-C și 3 gene pentru antigene minore: HLA-E, HLA-F, HLA-G.
Moleculele HLA clasa a II-a
Aceste molecule sunt heterodimeri cuprinzând un lanţ polipeptidic a şi un lanţ
polipeptidic β (Figura nr. 3)
· lanţul greu a (33-34 kDa) cuprinde două domenii externe a1 şi a2, o porţiune
transmembranară şi o terminaţie carboxilică scurtă intracitoplasmatică;
· lanţul uşor β (28 kDa) are o structură asemănătoare, cu două domenii externe
β1 şi β2.
Moleculele clasei a II-a au o distribuţie mult mai restrânsă în comparaţie
cu moleculele clasei I. Ele sunt exprimate pecelulele prezentatoare de antigen (APC):
· celule dendritice (celule Langerhans din piele, celule interdigitate ganglionare şi
din timus, celule dendritice din epiteliul căilor respiratorii),
· monocite / macrofage şi
· limfocite B.
Limfocitele T nu exprimă astfel de molecule decât după activare.
163
Moleculele clasei a II-a au fost descoperite şi la nivelul endoteliului vascular şi al
celulelor epiteliale ale intestinului gros.
În cazuri patologice, moleculele clasei a II-a au fost depistate la nivelul celulelor β din
insulele lui Langerhans în diabetul insulinodependent, al canalelor biliare în ciroza biliară
primitivă şi al celulelor tiroidiene în afecţiunile tiroidiene autoimune.
Expresia moleculelor este indusă de mediatori precum: IFN-g, TNF-a şi β, IL-4, IL-13 şi
GM-CSF cu rol esențial în răspunsul imun. Prostaglandina E2 inhibă sinteza lor pe monocite /
macrofage.
Regiunea HLA-II conține gene ce codifcă HLA-DR, DQ, DP, DM, și pe lângă acestea,
câteva molecule accesorii: PSMB8, PSMB9, TAP1, TAP2, BTNL2.
Moleculele HLA-III nu sunt implicate în histocompatibilitate.
Sunt total diferite de cele de clasele I și II.
Nu se afă atașate pe membranele celulare și nu intervin în recunoașterea peptidelor
antigenice.
12. 3. Roluri
Limfocitele T protejează organismul uman de 2 mari categorii de agenţi patogeni:
virusurile, care preiau comanda celulei pe care o infectează (devenind astfel antigene
endogene) și bacteriile care se replică autonom, majoritatea extracelular.
Cele 2 clase ale MHC sunt esenţiale în recunoaşterea şi răspunsul imun față de peptide
derivate din „agresori”. În ”lupta” dintr-o infecţie virală, virusul este eliminat de către LT
CD8+ care recunoaşte peptide virale endogene ataşate de MHC-I. În schimb, o bacterie e
eliminată prin fagocitare de către macrofage sau neutrofle.
LT CD4+ recunoaşte peptidele bacteriene legate de MHC-II şi direcţionează răspunsul
imun către activarea macrofagelor şi producţia de anticorpi care opsonizează bacteria.
Moleculele de histocompatibilitate au așadar un rol fundamental în prezentarea
peptidului antigenic către:
· limfocitul T helper - HLA-II sau
· limfocitul T citotoxic - HLA-I.
În această comunicare intercelulară intră în contact 3 molecule:
· HLA
· peptidul antigenic
· TCR.
Rolul moleculelor HLA clasa I
Au rol în principal în reacţia imună care implică intervenţia LTc. Moleculele HLA I
prezintă un peptid endogen sintetizat de o celulă contaminată de o bacterie/un virus/un
parazit cu dezvoltare intracelulară sau un peptid endogen rezultat din degradarea unor
celule self tumorale sau îmbătrânite către receptorul de antigen (TCR) al limfocitului T
CD8+. Se va obţine astfel un răspuns imun celular prin activarea şi multiplicarea LTc având
ca rezultat liza celulelor ţintă ce au prezentat antigenul prin HLA-I. (Figura nr. 4)
Rolul moleculelor HLA clasa a II-a
164
Ele intervin în principal în răspunsul imun în care sunt implicate APC şi LTh. Moleculele
HLA II prezintă limfocitului Th CD4+ peptide de origine exogenă, provenite din proteinele
endocitate şi degradate de APC. (Figura nr. 5)
Etape:
a) Legarea antigenului exogen de molecula HLA clasa II:
1. Endocitoza - particulele antigenice (bacterii, proteine străine) sunt internalizate
nespecifc de monocite / macrofage sau specifc de limfocitele B prin IgM. Ele urmează
calea endocitozei;
2. Generarea peptidelor antigenice - prin fuzionarea endozomilor cu lizozomii,
proteinele sunt degradate în peptide prin activarea proteazelor lizozomale la un pH acid;
3. Asocierea cu HLA II - moleculele HLA clasa II-a sintetizate în reticulul endoplasmic
sunt asociate, sub forma unui complex, cu o proteină accesorie, lanţul invariabil II. Aceasta
împiedică legarea peptidelor endogene de HLA-II prin blocarea situsului de legare în timpul
sintezei sale și permite legarea peptidelor exogene prin distrugerea lanţului după
terminarea sintezei;
4. Trecerea prin membrana celulară - ansamblul HLA-II-peptid exogen este exprimat la
suprafaţa APC. (Figura nr. 6)
b) Interacţiunea între APC şi limfocitul T helper:
Peptidele antigenice sunt recunoscute de către LTh prin TCR numai dacă sunt
prezentate de către APC pe MHC-II.
Pe de alta parte, limfocitul helper CD4+, prin TCR-ul său nu poate interacţiona cu o APC
decât dacă recunoaşte antigenele cuplate cu moleculele MHC ale
individului (restricţie allogenică).
Molecula accesorie CD4 a limfocitului helper interacţionează cu domeniul β2constant al
HLA-II declanșând astfel primul semnal către limfocit pentru activarea sa. În urma unor
reacţii în cascadă LT va intra în mitoză, va secreta o serie de citokine şi va colabora cu LB
spre producţia de anticorpi având ca scop eliminarea antigenelor exogene. Specifcitatea
reacţiei este datorată asocierii trimoleculare TCR, HLA, peptid antigenic.
O parte din moleculele codifcate de regiunea HLA-II sunt implicate în procesarea şi
încărcarea peptidelor pe HLA-I. Astfel, PSMB8 şi PSMB9 sunt subunităţi ale proteozomului
iar TAP1 şi TAP2 transportă peptidele endogene din citoplasmă în RE. BTNL2 este implicată
în susceptibilitatea la sarcoidoză
Moleculele HLA-III sunt împărţite în două categorii în funcţie de rol:
a.) cu rol în imunitate şi infamaţie: componentele complementului C2 şi C4, TNF, HSP
(proteina de şoc termic);
b.) cu rol enzimatic: CYP21
165
Orice celulă care prezintă un tip de HLA diferit de cel al organismului este considerată
non-self, un „invadator”, iar rezultatul este acela de rejecţie a ţesutului compus din
respectivele celule. Din cauza importanţei HLA în transplant, locusurile HLA sunt printre
cele mai frecvent serotipate sau analizate prin PCR faţă de oricare alte alele autozomale.
În diferite studii, s-a analizat importanţa compatibilităţii HLA în transplantul de inimă,
rinichi, celule stem hematopoietice.
Polimorfsmul sistemului HLA este foarte mare şi de aceea probabilitatea ca organele
donoare să fe potrivite primitorului este foarte mică. În transplanturi a existat practica de a
se aloca organe fără a se lua în considerare compatibilitatea HLA donor-receptor. De aceea,
în trecut, nu a fost posibilă analizarea corespunzătoare a ratei de succes a transplantului cu
organe compatibile HLA. Într-un studiu realizat pe 8.331 de pacienţi, internaţi în 104 centre
din 24 state din USA, doar 128 subiecţi au primit câte o grefă cardiacă compatibilă HLA (A,
B sau DR) sau doar cu o singură incompatibilitate. S-a observat supravieţuirea ţesutului pe
o durată de 3 ani, iar rezultatele au fost dependente de sistemul HLA. Astfel, au avut
succes: la compatibilitate maximă 83±4% transplanturi faţă de 76 ±2% transplanturi la 2
nepotriviri. Aşadar, supravieţuirea grefei în transplantul de cord este semnifcativ
infuenţată de compatibilitatea HLA.
Există două tipuri de incompatibilitate: a antigenelor (detectabilă serologic) şi a alelelor
(detectabilă prin metode de analizare a ADN-ului). Într-un studiu s-a testat ipoteza conform
căreia incompatibilitatea alelelor este mai puţin imunogenă decât incompatibilitatea
antigenelor şi, astfel, este mai puţin asociată cu rejecţia de transplant cu celule stem
hematopoietice. Peste 450 de pacienţi cu leucemie mieloidă cronică au primit transplant de
măduvă de la donori diferiţi. Prin secvenţierea ADN, s-au analizat alelele clasei I HLA (A, B,
C) şi s-au observat ratele de respingere a grefei la transplanturile fără nici o
incompatibilitate, la cele cu o singură incompatibilitate a alelelor sau a antigenelor sau la
transplanturile cu 2 sau mai multe nepotriviri. Rezultatele au confrmat ipoteza şi, astfel,
riscul rejecţiei de transplant a fost semnifcativ mai mare la cei cu o incompatibilitate
antigenică HLA, faţă de cei cu o incompatibilitate alelică. Riscul a fost de asemenea crescut
la cei cu mai multe nepotriviri HLA şi la primitorii homozigoţi HLA în locusul de
incompatibilitate. În concluzie, transplanturile de la donori cu o singură incompatibilitate a
alelelor HLA au un risc scăzut de rejecţie şi pot f realizate cu succes. În schimb,
incompatibilitatea de antigene HLA, detectabilă serologic, creşte riscul de respingere a
ţesutului.
12.4.2. Asocierea subtipurilor HLA cu susceptibilitatea la boli
Studii epidemiologice au demonstrat că peste 40 de boli se întâlnesc mai frecvent la
indivizi purtători ai anumitor alele HLA I sau II decât la populaţia generală. Importanţa
acestor efecte este extrem de mare, deşi nu vor f probabil niciodată demonstrate ca
absolute. De exemplu, între 90% şi 95% din pacienţii caucazieni cu spondilită ankilozantă
posedă HLA-B27 (1), iar 30%-50% din pacienţii caucazieni cu diabet zaharat tip I sunt HLA-
DQ2/DQ8 heterozigoţi. Interesant este faptul că HLA-DQ6 pare a f responsabilă de protecţia
împotriva diabetului zaharat de tip I.
166
Majoritatea bolilor care au legătură cu anumite gene HLA au un caracter autoimun.
Baza moleculară a acestei legături este necunoscută din cauza lipsei identifcării
autoantigenului primar care reprezintă „trigger-ul”. (2) Cu toate că mecanismele prin care
genotipurile HLA controlează susceptibilitatea la aceste boli sunt încă incomplet defnite, se
crede că participarea moleculelor MHC în stabilirea toleranţei imunologice şi în
recunoaşterea antigenelor stă la baza acestor fenomene.
Alelele HLA ce oferă protecţie pot media eliminarea în timus a LT potenţial patogene
responsabile de autoimunitate, în timp ce alelele HLA susceptibile pot eşua în eliminarea LT
patogene.
Pe de altă parte, genotipurile HLA pot guverna receptivitatea la anumite vaccinuri. Spre
exemplu, subiecţii care au alela HLA-DR3 sunt, într-o proporţie crescută substanţial,
nereceptivi la vaccinarea cu antigenul de suprafaţă al hepatitei B. Totodata, indivizii cu
HLA-DRB1*03 sau HLA-DQA1*0201 au o incidenţă crescută de seronegativitate la
vaccinarea împotriva pojarului. (3)
Un studiu realizat de curând pe cetăţeni americani caucazieni certifcă faptul că
homozigoţii HLA-DR13-DQ6 prezintă risc crescut de asociere a distoniei cervicale. (4)
O altă boală cu caracter autoimun şi conexiuni certe cu sistemul HLA este scleroza
multiplă. (5-6)
12.4.3. Prezentarea de antigene independent de MHC
Recent s-a fundamentat ideea conform căreia există o clasă nouă de LT care recunosc
antigene prezentate de molecule ce nu sunt MHC-I sau MHC-II. Una dintre aceste clase de
LT foloseşte un receptor pentru antigen ce recunoaşte antigene lipidice prezentate pe
molecule CD1. CD1 sunt asemănătoare structural cu MHC-I, însă lanţurile CD1 formează un
situs ce poate acomoda componente glicolipidice ale patogenilor microbieni. Astfel,
complexele CD1-glicolipide servesc drept ţintă pentru recunoaşterea de către LT ce au un
tip special de receptor: γδ TCR. Această prezentare a glicolipidelor microbiene pe molecule
CD1 pare să fe responsabilă de recunoaşterea independentă de MHC a mycobacteriilor. (3)
167
E. limfocite
168
13. 1. 1. Clasifcarea structurală a
moleculelor de adeziune
Clasifcarea structurală a moleculelor de adeziune se bazează pe caracteristicile chimice
ale moleculei care permit legarea sa de o anumită superfamilie sau familie de
proteine. Expresia lor pe suprafaţa celulei poate f constitutivă sau indusă în urma activării
celulare.
Selectinele (LECAM-family, leucocyte-endothelial cell adhesion molecule)
Selectinele sunt glicoproteine transmembranare cu un domeniu N-terminal lectinic-
calciu-dependent şi domenii reglatoare pentru sistemul complement. Selectinele au rol în
adeziunea intercelulară; joacă un rol important în amorsarea procesului infamator.
· L-selectinele sunt exprimate constitutiv pe suprafaţa leucocitelor, în timp ce
expresia E-selectinelor pe endoteliu este indusă de către TNF-a, IL-1 şi lipopolizaharidele
bacteriene iar a P- selectinelor de către C5b, histamină şi trombină.
· L-selectinele joacă un rol important pentru LT imature şi APC (celule dendritice)
care sunt astfel direcţionate către situsuri cu rol imunologic important, precum nodulii
limfatici sau GALT.
· P-selectinele formează împreună cu factorul Willebrand granule denumite
corpusculii Weibel-Palade. P-selectinele sunt primele expuse pe versantul circulator, find
stocate în vezicule.
Integrinele
Familia integrinelor cuprinde peste 20 de membri, glicoproteine transmembranare cu
structură heterodimerică (a, β). Iniţial au fost caracterizate 3 subfamilii, cu lanţul β comun
şi lanţul a diferit, pentru ca în prezent să se cunoască faptul că lanţul a se poate asocia cu
mai multe lanţuri β (β 1-8). Localizarea integrinelor este ubicuitară (cel puţin un membru al
acestei familii pe toate celulele nucleate). Leucocitele pot exprima cel puţin 13 astfel de
receptori. Celulele epiteliale exprimă la rândul lor o serie de integrine, constitutiv sau indus,
în urma procesului infamator.
Integrinele intervin în legarea intercelulară şi între celulă şi substrat, prin care
contribuie la organizarea tisulară şi migrarea celulară, alături de superfamilia
imunoglobulinelor; subfamilia β2-integrinelor stimulează proliferarea limfocitelor T, la
contactul cu celulele dendritice; cresc sinteza de citokine (β 1 şi β2-integrinele stimulează
producţia de TNF-a şi β a celulei T; β2-integrinele stimulează producţia de IL-1β a
monocitelor, la contactul cu limfocitul T).
Integrinele au două stadii conformaţionale, cu specifcitate diferită faţă de
substrat (Figura nr. 1). Acestea sunt infuenţate de procese celulare interne de fosforilare ce
induc schimbări conformaţionale, ca răspuns la factori din mediu (vezi secţiunea de
integrare a cunoştinţelor: recrutarea celulelor din torentul sangvin).
Superfamilia imunoglobulinelor (imunoglobulin-like)
169
Moleculele de adeziune din această clasă au o structură „imunoglobulin-like” prin
expresia extracelulară a unor domenii repetitive de tip imunoglobulinic. Sunt clasifcate în
trei subfamilii:
· ICAM (intercellular adhesion molecule),
· VCAM (vascular cell adhesion molecule) şi
· PECAM (platelet-endothelial cell adhesion molecule).
Moleculele de adeziune din această clasă intervin în legarea intercelulară, mai ales în
interacţiunea leucocit-endoteliu. Prin cuplarea lor cu liganzii de selecţie (integrine) intervin
în legarea leucocitară şi prin aceasta în controlul infltratului infamator local. Expresia lor
pe suprafaţa celulară este constitutivă sau indusă de citokine.
Caderinele
Caderinele sunt formate dintr-un singur lanţ polipeptidic şi sunt exprimate constitutiv
pe suprafaţa celulelor. Au rol în legarea intercelulară prin aderarea unora de altele, pe
celulele adiacente, printr-un mecanism calciu-dependent. Prin funcţia lor asigură
integritatea epiteliilor. Caderinele sunt clasifcate în patru subfamilii:
· E-caderine (pe epitelii),
· V-caderine (pe endoteliu),
· P-caderine (placentare),
· N-caderine (în sistemului nervos central şi ochi).
adresine vasculare
Sunt glicoproteine exprimate pe suprafaţa celulelor endoteliale şi intervin în „homing-
ul” limfocitar, respectiv în direcţionarea limfocitelor spre ganglionii limfatici şi ţesuturile
extraganglionare.
Carbohidraţii
Reprezintă liganzii specifci pentru selectine şi nu constituie o clasă distinctă de
molecule de adeziune.
171
Cuplul CD40 şi CD40L
· Molecula CD40 se exprimă pe toate celulele prezentatoare de antigen în repaus -
celule dendritice, LB şi monocite/macrofage dar şi pe progenitorii hematopoietici şi celulele
epiteliale.
· Molecula CD40L (L pentru ligand) nu se exprimă decât pe LT activate CD4+ sau
CD8+ şi nu pe cele în repaus. Este de asemenea prezentă pe bazofle şi mastocite.
Sindromul hiper-IgM, X-linkat se caracterizează prin absenţa moleculei CD40L funcţionale.
· Mecanismul prin care interacţiunea CD40-CD40L stimulează răspunsul LT pare a f
reprezentat de intensifcarea secreţiei de IL-12 şi creşterea numărului de molecule B7 de pe
membrana APC („APC licensing”), ducând la recrutarea mai multor celule prezentatoare de
antigen şi potenţarea semnalului costimulator transmis de aceste celule.
13. 1. 2. 3. Moleculele de adeziune necesare costimulării între celulele
prezentatoare de antigen şi limfocitele T helper sau limfocitele T citotoxice şi
ţintă.
Aceşti liganzi cuprind următoarele două cupluri:
Cuplul LFA2 (CD2) şi LFA3 (CD58) (LFA - leukocyte function - associated
antigen)
· Molecula LFA2 (CD2) permite formarea rozetelor E (E pentru eritrocite) între LT
umane şi eritrocitele de oaie. Fenomenul se datorează prezenţei LFA3 pe eritrocitele de
oaie.
· Molecula LFA3 (CD58) are o distribuţie largă, care cuprinde celulele endoteliale
vasculare, fbroblaştii, limfocitele şi macrofagele.
Cuplul LFA1 şi ICAM 1, 2 şi 3
· Molecula LFA1 corespunde integrinei aL/β2 (CD11a/CD18). Prezenţa sa este relativ
difuză la nivelul diferitelor leucocite (neutrofle, monocite, LT, LB şi LT de memorie).
· ICAM1 (CD54), ICAM2 şi ICAM3 sunt puternic exprimate la nivelul LT citotoxice şi
permit activarea lor. ICAM1 se găseşte pe neutrofle în repaus, celule endoteliale,
monocito/macrofage şi LB activate.
172
de citokine. O parte dintre citokine au în special efecte „chemotactice” şi din acest motiv au
fost numite chemokine.
Termenii de limfokine (substanţe sintetizate de limfocite) sau de monokine (provenind
din monocite) nu se mai folosesc deoarece citokinele sunt sintetizate de o gamă mult mai
largă de celule. Termenul de interleukine, care indică o acţiune între două leucocite, a
persistat şi continuă să persiste în denumirea prescurtată, de la IL-1 la IL-35.
Termenul de citokine pare să fe cel mai adecvat. În unele cazuri, denumirea provine de
la una din activităţile care au permis descoperirea citokinei: TNF (tumor necrosis factor),
IFN (interferon), GM-CSF (granulocyte/monocyte-colony stimulating factor), G-CSF
(granulocyte-CSF), M-CSF (monocyte-CSF), TGF (transforming growth factor). În afara
sistemului imun şi hematopoietic au fost descoperiţi şi alţi factori de creştere: NGF (nerve
growth factor), FGF (fbroblast growth factor), EGF (epithelial growth factor) etc.
Citokinele acţionează datorită prezenţei receptorilor specifci, desemnaţi prin denumirea
lor engleză: IL-1R, IL-2R, TNF-R etc. Ei sunt prezenţi uneori pe aceeaşi celulă care a
sintetizat citokina (efect autocrin) sau pe alte celule (efect exocrin). O clasifcare
atotcuprinzătoare a citokinelor este foarte difcilă, din punct de vedere funcţional, pentru
motivele prezentate (şi care reprezintă un „punct” din „cutia Pandorei” la care se face
uneori referire, atunci când sunt luate în discuţie aceste structuri). Din punct de vedere
didactic (şi funcţional), vom încerca să prezentăm în continuare o grupare a celor mai
cunoscute dintre citokine.
173
şi celule NK şi are acţiuni identice cu TNF-α, acţionând pe acelaşi tip de receptori. În
momentul de faţă este clasifcat între limfotoxine (LT-α).
· IL-1 şi IL-6
Sunt două citokine cu rol asemănător. Sunt produse de numeroase celule: monocite,
macrofage, LT, LB, celule endoteliale vasculare, keratinocite (din piele), astrocite şi celule
gliale (din creier) etc.
IL-1 se găseşte sub două forme: IL-1a fxată la membrană şi IL-1β secretată.
Experimental a fost demonstrat că stimularea cu orice structură microbiană a celulelor care
în mod potenţial sintetizează IL-1 va duce la sinteza acestor molecule (IL-1a şi IL-1β). Ele
sunt codifcate de gene diferite dar recunosc aceeaşi receptori: primul receptor IL-1R1
induce transducţia informaţiei la nivel celular, în timp ce IL-1R2 nu induce un semnal
celular. IL-1α are funcţie imunologică, activând la nivel superior LTh, care se vor divide
mitotic şi se vor diferenţia în diverse clase. IL-1β, eliberată în spaţiul extracelular şi în
sânge, exercită o puternică acţiune proinfamatorie.
Celulele care sintetizează IL-1 produc câteva ore mai târziu un antagonist al
receptorului de IL-1, numit IL-1Ra, care face ca acţiunea IL-1 să fe tranzitorie. IL-1 induce
creşterea expresiei moleculelor de adeziune; activează limfocitele T şi B; creşte sinteza
proteinelor de fază acută la nivel hepatic; creşte catabolismul celulelor musculare şi al
osteoclastelor (rezorbţie osoasă); activează sistemul nervos central cu febră, anorexie şi
insomnie. Fiind şi prima interleukină numită ca atare, IL-1 a fost considerată iniţial drept o
moleculă piretogenă. Inocularea de IL-1 la subiecţi umani conduce la apariţia febrei şi
frisonului. Concentraţia de IL-1 din plasmă poate să crească şi în condiţii fziologice (ex. în
stres nepatologic, exces de vitamină A, în timpul menstruaţiei).
IL-6 are o acţiune atât asupra sistemului imun cât şi asupra unor celule care nu aparţin
acestuia, asemănătoare cu aceea a Il-1, cu o singură diferenţă: ea acţionează mai ales pe
maturaţia terminală a LB în plasmocite şi pe diferenţierea LT citotoxice. Ca şi IL-1, produce
proteoliză endogenă, induce sinteza proteinelor infamatorii la nivel hepatic (fbrinogen,
haptoglobină, α1-antitripsină, proteină C reactivă etc) şi activează sistemul nervos central
conducând la apariţia febrei, anorexiei, somnolenţei etc. IL-6 induce sinteza de
imunoglobuline; are şi rol în maturarea celulelor pe linia megakariocitară. Sinteza IL-6 este
stimulată de IL-1.
· Limfotoxinele
Limfotoxina (LTx) a fost identifcată în urma efectului citotoxic exercitat de limfocitele
activate, ulterior a fost sintetizată şi caracterizată, dar s-a dovedit că nu există un singur
factor de acest tip, ci o serie de substanţe care ar putea f grupate într-o „superfamilie”.
Iniţial LT-α, o limfotoxină solubilă, a fost defnită drept factor de necroză tumorală (TNF-β).
Dintre numeroşii membri ai superfamiliei limfotoxinelor menţionăm LT-α şi LT-β, sintetizate
în special de LT şi LB activate, dar şi de către celulele NK sau celule LAK (lymphokine
activated killer cells). Au rol în etapele de iniţiere a infamaţiei şi se pare că au un rol în
realizarea unei protecţii faţă de agresiunea microbiană.
· IFN-g
174
Dintre efectele pro-infamatorii ale IFN-γ amintim activarea macrofagelor (acest
interferon este probabil cea mai importantă substanţă care produce „trecerea”
macrofagelor de la o stare „în aşteptare” la starea activă, bactericidă) şi astfel intervine în
fazele iniţiale ale infamaţiei dar şi în diferenţierea clonelor de limfocite care reacţionează
faţă de structurile bacteriene agresoare (Figura nr. 7). Alte efecte vor f prezentate în
următoarele subpuncte.
· IL-10
Acţionează atât asupra celulelor hematopoietice cât şi asupra altor celule. Dacă iniţial s-
a considerat că are efecte pro-infamatorii, în momentul de faţă se cunoaşte faptul că, prin
efectele inhibitorii asupra monocitelor, neutroflelor, celulelor dendritice, este de fapt o
interleukină cu efect anti-infamator. A fost numită şi „factor de inhibare al macrofagelor”.
· IL-11
Sinteza IL-11 poate avea loc la nivelul fbroblastelor, condrocitelor, sinoviocitelor,
keratinocitelor, celulelor endoteliale, celulelor epiteliale etc. Administrarea de IL-11
stimulează sinteza unor reactanţi de fază acută, la fel ca şi IL-6. Totuşi, efectul esenţial al
IL-11 se adresează creşterii trombocitare. Are şi efecte anti-infamatorii la nivelul
adipocitelor şi osteoclastelor. Relativ recent, a fost avizată utilizarea IL-11 în tratamentul
asociat chimioterapiei din cancer, pentru a preveni apariţia unei trombocitopenii severe la
pacienţii care primesc medicaţie citotoxică, anti-tumorală.
· IL-12
Cunoscută drept o substanţă care induce sinteza de IFN-γ, IL-12 are şi alte efecte de
stimulare a răspunsului infamator al gazdei, în urma unui proces infecţios. Sursa cea mai
importantă de IL-12 este reprezentată de celulele dendritice.
· IL-16
Iniţial a fost considerată o chemokină pentru LT Helper (CD4 +), dar poate exercita
astfel de activităţi şi faţă de alte celule implicate în procesul infecţios şi în infamaţie. Sursa
principală de IL-16 este reprezentată de LT CD8+.
· IL-17 (A, B, C, F)
Au efecte proinfamatorii şi de stimulare a hematopoiezei.
· IL-18
A fost considerată drept o moleculă care induce sinteza de IFN-γ. Ulterior s-a dovedit că
singură, nu duce la o stimulare efcientă, dar în asociere cu IL-12, efectul de stimulare al
sintezei de IFN-γ demonstrează sinergism. IL-18 este sintetizată în special de macrofagele
activate şi de către celulele dendritice, dar există şi alte celule producătoare de IL-18
(monocite, keratinocite, celule epiteliale intestinale etc). Are efecte pro-infamatorii, efecte
în procesul infecţios declanşat de o serie de bacterii (ex. Listeria spp.), paraziţi
(ex. Cryptococcus neoformans) sau virusuri (ex. virusul gripal), efecte anti-tumorale şi
intervine în patogenia unor boli în care există infamaţie cronică sau în boli autoimune.
· IL-22
Este o citokină înrudită cu IL-10, dar cu puternice proprietăţi pro-infamatorii. Într-un
studiu pe celule pulmonare, s-a demonstrat un răspuns semnifcativ IL-22 mARN la 6 ore de
la debutul infecţiei cu Klebsiella pneumoniae. Răspunsul indus în celule cultivate în
175
prezența aceastei citokine, este de exprimare a moleculelor defensive în celulele epiteliale
traheale. Unul din efectele induse de această citokină este exprimarea moleculei lipocalin-
2, cu rol în sechestrarea ferului. Într-un model de infecţie colonică s-a demonstrat că lipsa
IL-22 duce la instabiltatea barierei epiteliale şi diseminare bacteriană.
· IL-23
Are efecte asemănătoare cu IL-12, exercitate în combinaţie cu IL-12. Este sintetizată
mai ales de celulele dendritice.
· HMGB1 (high mobility group box chromosomal protein 1)
Iniţial a fost caracterizată ca o proteină non-histonică cu rol în arhitectura cromozomilor.
S-a demonstrat că această citokină cu totul particulară are rol pro-infamator, find eliberată
din celulele necrotice (şi doar în mică măsură de cele apoptotice), jucând rol de DAMP
(Damage Associated Molecular Pattern) dar şi secretată activ de macrofage stimulate.
Receptorul membranar specifc, numit RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-
products) mediază efectele sale.
Această proteină are un rol patogenic important în sepsis şi medierea efectelor de fază
târzie ale LPZ-ului. Astfel, s-a demonstrat experimental, la animale, că mortalitatea în
sepsis a fost redusă prin administrarea pasivă de anticorpi anti-HMGB1.
176
13. 2. 3. Citokine activatoare ale
răspunsului imun celular
Citokinele cu rol în răspunsul imun celular au ca sursă de provenienţă limfocitele Th1. În
această categorie sunt incluse următoarele citokine.
· IL-2 este produsă în special de LT CD4+ de tip Th0 şi Th1 (cu rol în RIP de tip
celular) activate şi într-o mai mică măsură de celulele NK şi de celulele dendritice. Şi LT Th2
(cu rol în RIP de tip umoral) pot sintetiza IL-2. IL-2 acţionează asupra diferitelor celule cu rol
în imunitate [asupra limfocitelor T acţionează printr-un mecanism autocrin, antrenând
proliferarea şi activarea spre subsetul Th1 dar şi Th2; transformă celulele Nk în celule LAK
(lymphokine activated killer cells); antrenează proliferarea limfocitelor B]. Acţionează
sinergic cu IL-12 şi IFN-γ stimulând activitatea citotoxică a celulelor NK. IL-2 a fost prima
dintre interleukine care a fost caracterizată până la nivel structural. Este o interleukină cu
133 aminoacizi, o greutate moleculară de 15,5 kDa; gena care codifcă sinteza de IL-2 se
găseşte pe cromozomul 4.
· IFN-g este produs de limfocitele Th1; sursa esenţială pentru această interleukină
este reprezentată de celulele NK. Rolul principal al IFN-g este activarea macrofagelor, cu
producerea speciilor reactive ale oxigenului şi NO, cu efect bactericid asupra
microorganismelor intracelulare. Prin acţiunea sa anti-Th2, reduce răspunsul imun umoral.
IFN-γ controlează funcţii imune implicate în apărarea antibacteriană, antivirală şi
antiparazitară.
13. 2. 5. Chemokine
Aceste molecule de adeziune cuprind aproximativ 50 de membri divizaţi în mai multe
familii (CC, CXC, XC, CX3C). Denumirea familiilor şi moleculelor aferente a fost
standardizată în raport cu structura chimică, pe baza numărului şi poziţionării grupărilor de
cisteină. Numele receptorilor chemokinelor (citokine cu rol în chemotaxie) se stabileşte
pornind de la grupul de litere prezentat, la care se adaugă litera R şi un număr, în timp ce
liganzii conţin litera L şi un număr. Ele prezintă o activitate chemotactică faţă de limfocite,
monocite, eozinofle etc.
Neutroflele, de exemplu, exprimă receptori CXCR1 şi CXCR2, în timp ce eozinoflele,
bazoflele şi monocitele exprimă receptori CCR1, CCR2, CCR3 şi CCR5. Aceste structuri
există în permanenţă pe suprafaţa celulelor normale circulante şi pot f detectate prin
metode de laborator. Majoritatea liganzilor sunt molecule solubile, ce se secretă în torentul
circulator, în timp ce unii liganzi (CX 3CL1, CXCL16) conţin o porţiune transmembranară,
permiţând ancorarea celulelor de endoteliul vascular în condiţii de fux fziologic. Prin
intermediul acestor receptori, celulele menţionate vor reacţiona la stimulul primit de la
celulele endoteliale sau de la alte celule agresate de toxine bacteriene; un alt stimul este
reprezentat de citokinele pro-infamatorii (ex. IL-1, TNF, IFN etc). Trebuie menţionat că
studiile arată tot mai des rolul chemokinele în procese patologice, precum ateroscleroză,
scleroza multiplă etc.
13. 2. 6. Hematopoietine
Hematopoieza este controlată de către un sistem fziologic autoreglabil, prin care se
menţine un compartiment de celule stem şi un compartiment de diferenţiere pentru toate
liniile sanguine. Sistemul necesită un echilibru între sinteza osoasă şi menţinerea unui
spaţiu hematopoietic medular graţie echilibrului între osteoblaste şi osteoclaste. În procesul
de proliferare şi diferenţiere a celulelor stem intervin numeroase citokine:
178
· SCF (stem cell factor) provine în principal din celulele stromale ale măduvei
osoase. SCF este produs atât în formă solubilă cât şi într-o formă legată de membrana
citoplasmatică.
· IL-3 sau multi-CSF (multi-colony stimulating factor) este un polipeptid cu
greutatea moleculară 20-30 kDa, cu 133 aminoacizi. Sinteza IL-3 este apanajul LT activate
în urma stimulării antigenice dar şi al mastocitelor sau eozinoflelor. Gena care codifcă
pentru sinteza IL-3 se afă pe cromozomul 5. Rolul său este de-a stimula proliferarea şi
diferenţierea celulelor stem spre diferitele linii.
· IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-11 şi IL-15:
179
moleculele Iga şi Igβ ale BCR, moleculele gc ale receptorilor membranari pentru
interleukine. (Figurile nr. 9-10)
181
c. Integrine – Receptori de integrine
d. Integrine – Fibrină
2. Inducerea comutării izotipice IgM – IgG este realizată de:
a. TNF alfa
b. IL-1
c. IL-4
d. HMGB-1
3. Descrieţi cuplurile moleculare componente ale sinapsei imunologice.
4. Enumerati rolurile Interferonului Gamma.
5. Au efect imunoinhibitor (răspuns multiplu):
a. TLR
b. IL-4
c. IL-10
d. CTLA-4
e. IL-13
14. Imunoglobulinele
Imunoglobulinele sunt glicoproteine cu rol de anticorpi. Imunoglobulinele există în
plasmă, lichid interstiţial şi secreţii şi au capacitatea de a recunoaşte şi de a se combina
specifc cu antigenul inductor al răspunsului imun. Lor li se adaugă proteinele patologice cu
aceeaşi structură dar fără activitate de anticorpi. De exemplu, în mielomul multiplu sau în
macroglobulinemia Waldenström's a fost identifcată proteina patologică Bence-Jones
(poate f identifcată în sânge sau în urină; este vorba de o sinteză anormală de lanţuri
uşoare; a fost descrisă de H. Bence Jones în 1847). Termenul de imunoglobuline (Ig) îl
înlocuieşte pe cel de gama-globuline. Acest termen nu este corect, deoarece nu toţi
anticorpii migrează electroforetic în regiunea „gama”.
Toţi anticorpii sunt imunoglobuline. Imunoglobulinele pot f anticorpi, dar au şi alte
roluri.
Denumirea de anticorp se pare că a fost dată pentru substanţele „împotriva corpilor”
bacterieni, ceea ce nu este corect, deoarece există anticorpi şi faţă de alte structuri
(inclusiv împotriva structurilor proprii, în bolile autoimune) sau chiar şi în cazul bacteriilor,
pot exista anticorpi diferiţi faţă de structuri diferite ale aceleaşi bacterii (ex. anticorpi faţă
de cele peste 90 de tipuri capsulare ale Streptococcus pneumoniae).
Imunoglobulinele sunt diferite de alte structuri proteice:
- recunosc şi reacţionează specifc cu structura antigenică din cauza căreia au apărut;
- au funcţie de anticorp, dar dacă sunt inoculate la un individ dintr-o specie diferită vor
avea rolul de antigene pentru respectivul individ;
- sunt singurele structuri proteice care sunt sintetizate după un stimul antigenic;
182
- pot activa sistemul complement etc.
S-a reuşit sinteza de anticorpi monoclonali „himerizaţi”, alcătuiţi dintr-o parte de
moleculă umană şi alta animală; find de izotip uman nu vor mai apărea ca şi structuri
antigenice şi nu vor mai f „respinşi”.
183
- CL pentru fragmentul uşor constant (constant light), cu un singur lanţ Ck şi patru
Cl funcţionale.
Domeniile variabile VL şi VH formează locul unde anticorpul se cuplează cu
determinantul antigenic (epitop). Faţa interioară a situsului anticorpului (situs combinativ)
vine în contact direct cu epitopul şi se numeşte paratop. Faţa exterioară a situsului
combinativ se numeşte idiotip.
185
anti-allotipici la subiecţii care nu au allotipurile corespunzătoare, la 1% din subiecţii normali
şi la 3-5% dintre bolnavii cu poliartrită reumatoidă.
Diferitele sisteme cunoscute se notează folosind litera clasei de Ig şi litera K pentru
kappa, urmate eventual de numărul subclasei şi în fnal litera m pentru marker (ex.
sistemul Gm, sistemul A2m, sistemul Km).
Idiotipia
În defniţia iniţială, acest caracter antigenic era propriu unei imunizări, la un animal care
a produs anticorpi. Oudin a obţinut primii anticorpi anti-idiotipici în modul următor: într-o
primă etapă a imunizat un iepure împotriva Salmonella spp. şi a obţinut un prim tip de
anticorpi numiţi Ab1 împotriva acestei specii. Apoi un al doilea iepure a fost imunizat cu
acest imunoser şi s-au obţinut anticorpi numiţi Ab2 sau anticorpi anti-anti-Salmonella sau
anti-idiotip Ab1. Aceşti anticorpi nu recunosc decât serul primului animal imunizat şi nu
serul dinaintea imunizării sau serul unui alt animal imunizat pentru aceeaşi Salmonella. Un
anticorp Ab2 poate recunoaşte mai mulţi Ab1 de la animale diferite, recunoscând anticorpii
cu aceeaşi specifcitate anti-Salmonella.
Pornind de la Ab2 se poate imuniza un alt animal care sintetizează anticorpi Ab3, anti-
idiotip Ab2, aşa-zişi anti-anti-idiotip. Pentru anticorpii Ab2 se disting Ab2-a care nu inhibă
reacţia antigen-Ab1 şi Ab2-β care, dimpotrivă, inhibă această reacţie. Anticorpii Ab2-β sunt
numiţi „imagine internă a epitopului de plecare E1, ceea ce înseamnă ce au o structură
imunologică asemănătoare, recunoscută de Ab1. Determinanţii antigenici idiotipici se
găsesc la nivelul părţilor variabile ale lanţului greu şi lanţului uşor, şi uneori sunt constituiţi
din cele două lanţuri. Ei pot corespunde segmentelor hipervariabile, respectiv paratopilor
imunoglobulinelor.
186
· o singură şi subclasă de Ig, de exemplu IgA2;
· un singur lanţ uşor, de exemplu lambda;
· un singur allotip prezent, de ex. A2 m2 la un subiect heterozigot A2 m1/ A2 m2;
· o specifcitate unică, ce recunoaşte un anumit epitop;
· afnitate unică.
Acest aspect poate rezulta din proliferarea benignă (imunoglobulină monoclonală
benignă) sau malignă (mielom multiplu, boală Waldenstrom) a unui LB matur. Toate Ig
secretate de clonă au o structură chimică identică, cu mobilitate electroforetică unică,
astfel încât electroforetic proteinele prezintă un vârf cu bază îngustă, iar
imunoelectroforetic se caracterizează prin apariţia celei de-a doua curburi a arcului normal,
având următoarele 3 caracteristici: linie groasă, curbă foarte marcată, poziţie mai apropiată
de imunoserul revelator.
14. 5. Ontogenia
imunoglobulinelor
Fătul este capabil să sintetizeze, din a zecea săptămână, cantităţi foarte mici de IgM şi
cantităţi importante din a 12-a săptămână. IgG materne nu traversează bariera placentară
decât după a 20-a săptămână.
în absenţa unei infecţii congenitale (toxoplasmoză, siflis etc), în sângele nou născutului
se găseşte o cantitate de IgM fetală care nu depăşeşte 10% din valoarea adultului. Nivelul
IgG la nou-născut este de 110% din nivelul adultului normal, ca urmare a transferului activ,
de la mamă la făt.
După scăderea nivelului IgG materne (care pot persista până în lunile 3-6 de viaţă şi
chiar până la 18 luni) se observă o sinteză activă a diferitelor clase: IgM are nivel normal la
1 an; IgG ajunge la valori normale la 3 ani; IgA şi IgE au un nivel normal la 14 ani.
14. 6. Funcţii
Proprietăţile fragmentului Fab
Fragmentul Fv participă singur la formarea situsului de legare al anticorpilor, cu
intervenţia egală a domeniului VH al lanţului greu şi al domeniului VL al lanţului uşor.
Aminoacizii celor 3 regiuni hipervariabile ale fecărui lanţ, situaţi la distanţă în structura
primară, dar apropiaţi în structura cuaternară, contribuie la formarea acestuia.
Legătura antigen-anticorp se realizează prin legături non covalente, reversibile.
Proprietăţile fragmentului Fc
Unele dintre aceste proprietăţi nu apar decât dacă anticorpul a fxat antigenul sau a fost
alterat de căldură, formând agregate. Acest aspect este valabil pentru fxarea
complementului şi recunoaşterea factorului reumatoid. În cazul subclaselor de IgG ordinea
reactivităţii este următoarea: IgG3 > IgG1 > IgG2 > IgG4.
Viteza de catabolizare depinde de regiunea CH 2 a diferitelor clase şi subclase de Ig.
IgG (cu excepţia IgG3) au un timp de înjumătăţire de 21 de zile.
187
Toate IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) traversează activ placenta, IgG1 trecând cel mai
uşor. Aşa cum am arătat mai sus, nou-născutul are o concentraţie a IgG de 110% faţă de
cea maternă, ceea ce indică prezenţa unui transfer foarte activ. IgM şi IgA materne nu
traversează placenta, Ig din aceste clase găsite la nou-născut find de origine fetală.
Cunoaşterea acestor aspecte este foarte utilă pentru evidenţierea unei afectări intrauterine
sau a unui simplu transfer de Ig materne. În caz de suspiciune de toxoplasmoză
congenitală, se indică dozarea IgM şi IgA anti-toxoplasma în serul nou-născutului (au
existat, din nefericire, recomandări de întrerupere a sarcinii în cazul în care la mamă au fost
identifcaţi anticorpi anti-toxoplasma de tip IgG).
Fixarea complementului poate avea loc în calea clasică; IgG1, IgG2 şi IgG3 şi IgM au un
receptor ascuns în stare nativă pentru C1q, care va f activat în timpul fxării anticorpului pe
antigen. Acest receptor se afă în regiunea CH2 a IgG şi în domeniul CH4 al IgM. Teoretic, o
singură moleculă de IgM pentamerică este sufcientă pentru activarea complementului,
datorită celor două situsuri apropiate. ştiind că IgG sunt de 1.000 de ori mai puţin efcace
decât IgM, pentru activarea complementului sunt necesare două molecule IgG, apropiate
una de cealaltă. Calea alternă poate f activată de IgG sau IgA, prin fxarea pe C3b.
Receptorii pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor (Fc receptor, FcR) sunt molecule
membranare specifce pentru fecare clasă de Ig, care induc o activare a celulelor
purtătoare. Se disting receptori cu mare afnitate Fc RI, care fxează un monomer de Ig şi
sunt activaţi când antigenul se leagă de anticorp formând o punte între doi receptori cu
slabă afnitate Fc R II şi Fc R III, care nu pot fxa decât complexe antigen-anticorp
multivalente, formate în prealabil.
Celulele purtătoare de receptori pentru Ig sunt:
· macrofagele, monocitele şi neutroflele au următorii receptori: Fc g RI, Fc g RII,
Fc g RIII, care permit fagocitarea complexelor imune, a celulelor sau microorganismelor
acoperite cu anticorpi IgG;
· celulele NK cu receptori Fc g RIII, care permit inducerea unei citotoxicităţi faţă de
celula ţintă sau un microorganism, prin citotoxicitate anticorp dependentă (ADCC)
(antibody dependent cellular cytotoxicity). În acest mod celulele NK se pot fxa pe celula
ţintă şi o pot liza;
· bazoflele circulante şi mastocitele au receptori pentru IgE (Fc e RI şi Fc e RII),
inductoare ale hipersensibilităţii imediate;
· eozinoflele şi plachetele au receptori de slabă afnitate Fc e RII. Plachetele au şi
receptori Fc g care le conferă o activitate antiparazitară;
· limfocitele au diverşi receptori de slabă afnitate.
Receptorul numit poly Ig R (receptor Ig polimeric) permite fxarea de IgA dimerică
sintetizată pe plasmocite şi facilitează intrarea lor într-o vacuolă care traversează
citoplasma celulelor epiteliale intestinale. Este prezent şi la nivelul canalelor secretorii ale
glandelor exocrine.
191
defcitul imun a fost descoperit relativ tardiv (cu toate că în ambele cazuri a existat un
defcit absolut în sinteza de IgA, foarte probabil un defcit primar).
Pe de o parte, din aceste prezentări sesizăm, foarte concret, importanţa bunei
funcţionări a sistemului imun şi una dintre situaţiile care pot apărea în cazul existenţei unor
defcienţe, iar pe de altă parte este de subliniat că tratamentul bolilor infecţioase ar trebui
realizat numai după diagnosticul etiologic, cu testarea sensibilităţii la antibiotice şi
chimioterapice, singura variantă corectă, care poate veni în sprijinul pacienţilor pe care
trebuie să îi îngrijim.
192
· MBL este o proteină din clasa colectinelor, având domenii lectinice prin care se
ataşază glucidelor şi un domeniu colagen-like. MBL se găseşte în cantitate mică în serul
indivizilor sănătoşi, însă în cazul infecţiilor acute, concentraţia acesteia creşte semnifcativ.
S-a constatat că persoanele care au defcit de MBL dezvoltă în copilărie mult mai multe
infecţii decât copiii normali, lucru ce atestă importanţa apărării organismului prin activarea
complementului pe calea lectinică la vârste la care sistemul imun nu s-a constituit în
totalitate din punct de vedere funcţional.
Interacţiunea acestora formează un complex asemănător celui format în primele
subetape ale căii clasice (C1qrs) şi activează calea clasică fără a necesita prezenţa
complexelor antigen-anticorp.
· Pe lângă MBL, alte trei proteine pot, prin legarea lor de anumite structuri
antigenice, să declanşeze activarea complementului pe calea lectinică. Aceste proteine
sunt fcolina-1, fcolina-2 şi fcolina-3. Pot lega zaharuri sau compuşi acetilaţi prezenţi pe
suprafaţa microorganismelor. Dintre MBL şi fcoline, cea mai abundentă în plasmă şi cea
care intervine cel mai adesea în declanşarea căii lectinice, este fcolina-3, numită şi
antigenul Hakata sau β-2 macroglicoproteina termolabilă. (1)
Calea alternă poate f activată de bacterii, fungi, virusuri, paraziţi, venin de viperă,
produşi de coagulare, celule tumorale etc.
Calea clasică şi calea alternă (alternativă) converg către C3, apoi urmează o cale
efectoare comună, implicând ultimele componente ale sistemului complement (Figura nr.
3). În fecare dintre etape, intervin proteine activatoare, inhibitoare sau reglatoare precum
şi receptorii pentru complement. Aceste elemente se găsesc fe în plasmă fe la nivelul
peretelui celulelor autologe sau omologe.
În mod curent, sistemul complement este desemnat prin litera C. Pentru fecare
componentă studiată şi bine delimitată în cadrul „cascadei de activare” se adaugă o cifră,
de la C1 la C9, care este eventual urmată de o literă (care reprezintă o anumită
subdiviziune; spre exemplu, pentru C1 există C1q, C1r şi respectiv C1s).
Ca urmare a activării sistemului C', unele componente (C4, C2, C3, C5), sunt
fragmentate, aceste fragmente find desemnate printr-o literă ataşată componentei iniţiale
(exemplu C3a şi C3b). În general componenta b este de dimensiuni mai mari (excepţie C2a,
fragment înglobat într-un complex proteolitic şi care are dimensiuni mai mari decât C2b) şi
se fxează la nivelul structurii ţintă, în timp ce componenta a este mai mică, este solubilă şi
posedă o activitate anaflactoidă sau chimiotactică.
Anaflatoxinele sunt polipeptide mici, eliberate în cursul cascadei de activare a
complementului, care prezintă receptori pe mastocite, monocite, macrofage, neutrofle,
trombocite şi au efect proinfamator. Cea mai puternică dintre anaflatoxine este C5a.
Acţiunile anaflatoxinelor sunt de tipul:
· contracţie a musculaturii netede,
· creştere a permeabilităţii vasculare,
· degranulare bazoflică şi mastocitară,
· chemotactismul şi activarea granulocitelor care vor conduce la eliberarea
enzimelor litice şi a radicalilor liberi.
193
Compusul b poate f mai departe fragmentat (exemplu C3c şi C3d).
Un compus inactivat este indicat prin litera i (exemplu: C3bi sau iC3b). Componentele
sistemului complement sunt prezentate în tabelul nr. 1.
197
15. 5. Rolul biologic al sistemului
complement
Sistemul complement prezintă numeroase activităţi biologice:
15. 5. 1. În infamaţie sunt implicaţi diferiţi compuşi solubili de talie mică. C3a şi C4a
au o masă moleculară apropiată de 10.000 Da şi sunt numite anaflatoxine. Ele pot să se
fxeze pe bazofle şi pe mastocite atrăgând eliberarea de histamină precum şi vasodilataţie,
unul dintre primele elemente ale răspunsului infamator. C2b (kinina-C2) este capabilă să
crească permeabilitatea vasculară. C5a posedă o activitate chimiotactică pozitivă faţă de
neutrofle şi conduce la agregarea polinuclearelor, în urma activării complementului.
Complexul C5b7 fxat pe membrane sau pe complexele imune are de asemenea acţiune
chimiotactică pentru polinucleare.
15. 5. 2. În apărarea anti-infecţioasă. Agenţii infecţioşi extracelulari pot f acoperiţi de
componente ale sistemului complement fe în urma activării directe (calea alternativă
activând direct C3), fe prin intermediul anticorpilor care fxează complementul. În fnal,
complexele de atac ale membranei (componentele C5-C9) lizează diferite microorganisme:
bacterii, virusuri sau paraziţi. Aceasta reprezintă o activitate citolitică directă a
complementului cu sau fără prezenţa anticorpilor.
Prin mecanisme asemănătoare, agenţii infecţioşi pot f acoperiţi de C3b sau C3bi care
sunt recunoscuţi de diferiţi receptori, prezenţi la nivelul diferitelor celule fagocitare
esenţiale: neutrofle şi macrofage. După aderare, acestea vor fagocita microorganismele.
Diferite microorganisme au dezvoltat mecanisme de rezistenţă la acţiunea complementului:
ex. prezenţa unei capsule care împiedică activarea căii alternative (S. pneumoniae,
Haemophilus infuenzae), sintetizarea unor substanţe care fxează C3b sau antrenează o
rezistenţă la inserţia complexului de atac al membranei.
15. 5. 3. În metabolismul complexelor imune. Curăţarea (clearance-ul) complexelor
imune este facilitată în mare măsură de către sistemul complement. Simpla fxare a
complementului inhibă formarea complexelor imune de talie mare (calea clasică) şi le
solubilizează. Totuşi complexele circulante acoperite de C3b pot adera la hematii, iar apoi
pot f transportate până la nivelul celulelor Kuppfer hepatice, pentru a f fagocitate. C1q are
proprietatea de a precipita complexele imune in vitro. Această proprietate stă la baza
diverselor metode de detectare a complexelor imune circulante.
15. 5. 4. În reglarea răspunsului imun.Pe limfocitele B se găsesc receptori pentru C3d
sau C3dg (CR2).
15. 5. 5. În inducerea secreţiei de citokine de către monocite şi macrofage prin
intermediul receptorilor C3. (5)
Sistemul C' poate acţiona în sistem heterolog (C' recoltat de la animale, de ex. nurcă,
cobai se poate folosi în reacţii de diagnostic în microbiologia medicală, sistemul indicator
provenind de la un alt animal de ex. oaie, bou) şi din această cauză a fost şi este încă
folosit în foarte multe situaţii. Trebuie însă reţinut faptul că sistemul C' se degradează rapid
198
la temperaturi mai mari de 56CC şi din această cauză reactivii care conţin C' trebuie
menţinuţi la rece (0CC) inclusiv pe timpul transportului.
199
infamatorie a streptococului ar putea f efcientă. O astfel de terapie ar include şi
modularea căii alterne a complementului.
15. 6. 2. Consecințe ale defcitului de properdină
Sistemul complement este un complex de molecule care face parte din ansamblul
imunităţii nespecifce. De-a lungul timpului, s-au descoperit o serie de afecţiuni corelate cu
defcienţe ale acestor compuşi dintre care şi boli autoimune, dar şi reacţii de
hipersensibilitate.
Un subiect îndelung studiat îl reprezintă defcitul de properdină şi predispoziţia
persoanelor care posedă această carenţă faţă de infecţiile cu specii din genul Neisseria.
Properdina este o glicoproteină reglatoare a căii alterne de activare a complementului,
singura care reglează pozitiv cascada enzimatică prin stabilizarea C3 şi C5 convertazei căii
alterne. Concentraţia serică fziologică de properdină este de 5-15 μg/ml, find un amestec
de monomeri, dimeri, trimeri şi tetrameri în raport de 1:2:1.
În 1982, într-o familie suedeză, a fost descris primul caz de carenţă de properdină în
asociere cu o infecţie meningococică cu debut fulminant. Ulterior, studiindu-se această
problemă, s-a ajuns la concluzia că există 3 tipuri diferite de defcit de properdină
(observate clinic la indivizi diferiţi). Primul tip se caracterizează prin absenţa proteinei în
plasmă. Cel de-al doilea se manifestă printr-un titru foarte scăzut al properdinei, iar cel de-
al treile tip presupune o concentraţie serică normală, dar o variantă nefuncţională a
proteinei.
Detectarea unei astfel de condiţii la un pacient este foarte difcil de făcut. Pe lângă
testele de laborator care sunt foarte laborioase, este necesar un istoric infecţios al
pacientului şi al familiei acestuia. Din pricina diagnosticului greu de stabilit, defcitul de
properdină este rar întâlnit, însă prezent în fază „ocultă” (nediagnosticată) în special în
cadrul rasei caucaziene, nefind reportate cazuri la nici o altă populaţie. Formele de defcit
de properdină sunt maladii genetice transmisibile, X-linkate. Se cunoaşte deja, în toate trei
tipurile bolii, care sunt mutaţiile ce survin şi unde sunt acestea localizate.
Predispoziţia faţă de infecţiile cu Neisseria meningitidis apare ca manifestare clinică în
toate tipurile defcitului de properdină. Serotipurile cel mai des implicate în astfel de infecţii
sunt W-135 şi Y, mai puţin serotipul B, faţă de care s-a constatat că organismul uman şi-a
dezvoltat metode mai efciente de apărare prin mecanisme de fagocitoză. Indivizii cu defcit
de properdină au un risc mai crescut de 250 de ori de a dezvolta o infecţie meningocociă
decât restul populaţiei sănătoase. Dacă la o persoană normală, şansele cele mai mari de a
face infecţie cu meningococ sunt la vârsta de 6 ani, la un individ cu defcit de properdină,
vârful riscului dezvoltării infecţiei este în jurul vârstei de 14 ani. Mortalitatea în astfel de
cazuri este de până la 75%. Infecţiile recurente sunt extrem de rare în condiţiile date, fapt
ce atestă că probabil apărarea umorală devine mai efcientă la aceste persoane.
Pacienţii cu defcit de properdină au un răspuns umoral adecvat la vaccinul tetravalent
antimeningococic (care conţine antigene din serotipurile A, C, Y, W135), organismul
generând anticorpi anticapsulari ce devin efcienţi în combaterea instalării infecţiei. Partea
bună este că nu la toţi pacienţii la care este detectat defcitul de properdină se dezvoltă
infecţii meningococice. Acest lucru a sugerat că există şi alţi factori adiţionali care
200
favorizează predispoziţia către aceste infecţii. S-a constatat astfel că la o parte dintre
indivizii cu defcit de properdină, lipsea alotipul G2m(n) (alotipul reprezentînd o secvenţă
aminoacidică de pe lanţul g al moleculei de IgG2 specifcă fecărui individ). Se speculează
că această combinaţie: defcit de properdină – lipsa alotipului G2m(n) este un temei
relevant care explică de ce indivizii afectaţi prezintă un risc net superior de a se imbolnăvii
de infecţii meningococice.
1. C3 convertaza:
A. este o enzimă proteolitică, cu activitate anaflactoidă
B. se poate constitui pe două căi, rezultând 2 compuşi diferiţi structural, dar cu aceeaşi
funcţie
C. scindează componenta C5 în C5a şi C5b
D. sub acţiunea sa, în membrana celulei atacate se formează MAC (Membrane Attack
Complex)
E. nici un răspuns nu este corect.
201
4. Calea comună de activare a sistemului complement:
A. are ca rezultat formarea C3 convertazei
B. poate f inhibată de către properdină
C. este amplifcată sub acţiunea DAF (Decay Accelerating Factor)
D. debutează prin scindarea componentei C5 sub acţiunea C5 convertazei
E. toate răspunsurile sunt corecte.
16. Antigenele
Antigenul se defneşte drept o substanţă recunoscută specifc de către sistemul imun.
Alţi autori consideră că antigenul este o substanţă capabilă să inducă un răspuns imun
(imunogenicitate) şi să fe recunoscută de către sistemul imun (specifcitate). Răspunsul
imun (RI) tinde să neutralizeze şi să elimine antigenul din cauza căruia s-a declanşat.
Antigenele (Ag) care pot declanşa RI sunt defnite drept substanţe imunogene.
Haptenele reprezintă Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot
declanşa activarea limfocitelor (fără de care nu apare RI). Haptenele devin imunogene
numai dacă se combină cu macromolecule „carrier”. Aşadar, haptena este un antigen
incomplet, are specifcitate dar nu are imunogenicitate. Spre exemplu acidul penicilinoic
rezultat prin degradarea moleculei de penicilină este o haptenă. Pot apărea reacţii de
hipersensibilitate după cel puţin al doilea contact cu această structură şi numai în
condiţiile în care gazda întră în categoria persoanelor „atopice”, având structura genetică
de codifcare pentru o proteină „carrier”, care cuplează acidul penicilinoic stimulând astfel
RI.
Tolerogenele sunt Ag care declanşează activarea limfocitelor, însă RI este inhibat
activ, imediat.
Orice bacterie trebuie văzută ca un ansamblu de antigene, din care nu toate sunt
imunogene (unele pot fhaptene altele tolerogene). Mecanismele de apărare împotriva
microorganismelor sunt diferite dar pot f deduse în funcţie de structura şi caracterele de
patogenitate ale respectivei bacterii. Acesta este un alt exemplu care demonstrează
202
faptul că între capitole diferite există legături importante, iar noțiunile citite și
înțelese ”la timpul lor” pot f foarte utile, ulterior.
Există 4 tipuri principale de perete bacterian (tip gram pozitiv, gram negativ, tip
micobacterian și spirochetal) iar patogenitatea poate varia între 2 ”extreme” (toxicitate
fără invazivitate și invazivitate fără toxicitate). (Figura nr. 1)
Recunoaşterea antigenului depinde de structurile complementare ale sistemului imun,
preexistente introducerii sale. Moleculele CMH clasa I sau II pot prezenta o multitudine de
peptide antigenice diferite şi nu sunt specifce unui antigen în mod particular.
Moleculele simple precum apa, sărurile minerale şi ureea sau comune majorităţii
speciilor (ca acizii graşi, creatinina, mono- şi dizaharidele, fbrina) nu sunt antigene. Pe de
altă parte, moleculele mici de tipul metalelor grele (crom, nichel), responsabile de apariţia
hipersensibilității, sau medicamentele, pot deveni antigene după ce se asociază cu diferite
macromolecule.
Alloantigenele sunt prezente la unii indivizi din aceeaşi specie. Alloanticorpii sunt
obţinuţi prin imunizarea intra-specie sau inter-specii, după absorbţia anticorpilor anti-izotip.
Autoantigenele sunt substanţe recunoscute prin răspunsul imun şi prezente la
animalul imunizat sau la om în contextul unei afecţiuni autoimune. În mod normal, un
individ nu declanşează un răspuns imun împotriva structurilor proprii. Un răspuns autoimun
se poate obţine prin imunizarea animalului cu substanţe proprii împreună cu adjuvanţi sau
prin injectarea unor substanţe self uşor alterate.
Idiotipul se referă la un caracter propriu părţilor variabile ale TCR-ului limfocitului T sau
anticorpilor apăruţi după imunizarea faţă de un antigen dat.
204
Atunci când au o greutate moleculară mai mare de 4.000 Da, polipeptidele sau
proteinele devin antigene şi imunogene. Cel mai mic imunogen cunoscut este vasopresina
(greutate moleculară 1.000, cu doar 9 aminoacizi).
Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ubicuitare; sunt antigene şi imunogene.
Lipidele cuplate cu zaharuri formează lipopolizaharide/lipooligozaharide (LPZ/LOZ), de
ex. în peretele bacteriilor Gram-negative (Neisseria spp., Salmonella spp., Vibrio
spp., Brucella spp. etc).
Obţinerea de anticorpi anti-acizi nucleici după imunizarea unui animal este difcilă. În
unele afecţiuni autoimune, de tipul lupusului eritematos diseminat, se observă diferite tipuri
de anticorpi anti-acizi nucleici.
Compuşii sintetici cu structura cea mai variată pot f antigene dacă greutatea lor
moleculară este sufcient de mare sau dacă sunt legaţi de proteine purtătoare („carrier”).
Compuşii sintetici au importanţă în determinarea imunogenicităţii şi specifcităţii
antigenice. Un posibil tip de antigene este reprezentat de medicamente, responsabile de
reacţia „alergică” din patologia umană (ex. hipersensibilitatea de tip I faţă de beta-
lactamine).
Superantigenele sunt molecule care se leagă în exteriorul moleculelor MHC II şi de o
secvenţă peptidică din familia TCR; aceste molecule, fără a f recunoscute specifc,
acţionează pe numeroase clone celulare T cu structură comună. Această proprietate a fost
observată la enterotoxinele staflococice, la nucleocapsida virusului rabiei etc. Se consideră
că superantigenele pot avea un rol în inducerea bolilor autoimune.
205
dacă sunt lizogenizaţi, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Vibrio cholerae, Shigella
shiga, Bordetella pertussis etc). (vezi și capitolele 2 și 9)
Antigenele virale sunt localizate la nivelul capsidei, fac parte din învelişul extern (ex.
hemaglutinine) sau constituie proteine şi glicoproteine structurale.
Antigenele parazitare au un caracter complex şi un aspect mozaicat, datorat de ex.
marii diversităţi a ciclurilor biologice parazitare. La o singură specie parazitară pot f
evidenţiate mai multe tipuri de antigene (ex. 20 de antigene la Plasmodium falciparum).
Antigenele parazitare pot f somatice şi metabolice.
206
16. 2. 2. Imunogenicitatea
Imunogenicitatea este capacitatea unui Ag de a induce un răspuns imun umoral sau
celular.
O haptenă este o moleculă mică (naturală sau artifcială), incapabilă să inducă singură
un răspuns imun dar care poate f recunoscută de componentele sistemului imun. Termenul
a fost introdus de Landsteiner în 1930. Haptena are specifcitate dar nu are
imunogenicitate. Termenul de haptenă nu este sinonim cu cel de determinant antigenic:
haptena poate f mai mică, egală sau mai mare ca epitopul.
Purtătorul(carrier-ul) este partea Ag cu structură proteică, în general, care prin cuplare
cu haptena face ca aceasta să devină imunogenă.
16. 2. 3. Alergenicitatea
Unele antigene sunt capabile să inducă producţia de anticorpi IgE şi prin aceasta să
provoace o reacţie de hipersensibilitate mediată umoral (tip I). Principalele alergene
cunoscute sunt polenul, veninul de viperă, praful de acarieni şi unele fragmente sau
produse de origine animală.
207
neutrofle și celule dendritice printre fbrele de colagen. nn cazul tuberculozei (TB) centrul
granulomului este reprezentat de cazeum. În cazul persoanelor diabetice, a persoanelor cu
SIDA sau cu alte stări de imunodepresie procesul de formare a granuloamelor poate f
afectat, infecţia nu trece în stadiu latent ci rămâne activă. Un alt argument poate f
reprezentat de următoarea constatare: adminstrarea de anticorpi blocanți ai TNF (de
exemplu, ca tratament simptomatic în artrita reumatoidă) reactivează rapid tuberculoza.
Răspunsul organismului la agresiunea bacteriană se poate solda și cu alte afectări și
chiar distrugeri la nivel tisular, şoc toxico-septic sau reacții de tip Schwartzman. Şocul
toxico septic este provocat de o producere excesivă de citokine în cursul sepsisului, în
special în infecțiile cu germeni Gram negativi și respectiv cu eliminare importantă de LPZ.
Apar febră înaltă, colaps circulator, CID (coagulare intravasculară diseminată), necroză
hemoragică și eventual afectare multiplă de organ (MOF -multiple organ failure). În mod
paradoxal, pacienţii care îşi revin după acest tip de şoc pot dezvolta ”paralizie imună”, find
susceptibili unei infecţii secundare.
Reacția Schwartzman (Sanarelli-Schwartzman) poate să apară experimental atunci
cȃnd, injectând subcutanat o doză mică de endotoxină, rezultă infamaţie uşoară; ulterior,
la injectarea intravenoasă după 24 de ore a endotoxinei, zona anterior infamată devine
hemoragică în cȃteva ore. Această reacție poate apărea după infecții cu bacterii Gram
negative, streptococi, mycobacterii, Corynebaterium diphteriae etc.
O a doua injectare după încă 24 de ore de la prima injectare intravenoasă a
endotoxinei/bacteriei poate determina colaps circulator şi necroză bilaterală a cortexului
renal. Mai pot apărea necroze la nivelul pancreasului, epifzei, corticosuprarenalelor, tubului
digestiv, tromboze și CID. La nivel microscopic apar modifcări endoteliale, depozite de
fbrină, acumulare de neutrofle și degranularea acestora. Titrul interferonului se corelează
cu distrugerile tisulare, iar titrul TNF se corelează cu manifestările sistemice. Aceasta
reacţie Schwartzman ar putea să se afe la originea rash-ul ce apare la copii cu meningita
meningococică sau a şocului septico-toxic.
Organismul uman reușește, de obicei, să mențină o balanţă și nu apar agresiuni (auto-
agresiuni) evidente în cursul infecțiilor bacteriene. Principalele citokine imunoregulatoare
sunt IL-10 si TGFβ. Există și bacterii care proftă tocmai de această balanţă a organismului.
Hemaglutinina şi adenilat ciclaza (factori de virulenţă ai B. pertussis) favorizează secreţia
de Il-10, ceea ce conduce la favorizarea persistenţa bacteriene în organism prin inhibarea
TH1. O perturbare a acestei balanţe o poate determina omul prin tratament antibiotic
(auto-administrat sau nu) soldat cu distrugerea masivă a bacteriilor. Poate rezulta un
răspuns infamator sever cu distrugeri tisulare.
209
imunogen). TLR-urile implicate sunt de data aceasta 1, 2 si 6. nn recunoaşterea
lipoproteinelor mycoplasmelor, mycobacteriilor şi spirochetelor intervin LBP și TLR4. TLR4
se mai numește şi CD14.
Cum se prezintă aceste pattern recognition molecules? Majoritatea sunt exprimate la
suprafaţa celulelor organismului (in special de la nivelul porţilor de intrare) și sunt
îndreptate împotriva patogenilor extracelulari. Dar există și molecule pentru patogenii care
au pătruns în celulă, care se afă nu la nivelul membranei celulare ci la nivelul fagozomilor
(TLR 9) sau solubili în citosol. (Figura nr. 2). Listeria spp., Helicobacter pylori şi Salmonella
spp. generează PAMPs intracelulare. (Film nr. 1)
http://www.youtube.com/watch?v=2LchUweyRx0
NO se formează din L-arginină sub acţiunea NO-sintetazei, care poate f indusă de IFNγ și
TNFα, NO find tot o specie reactivă de oxigen, formată pe altă cale decȃt a anionului
superoxid.
Dar există şi metode oxigen-independente prin care fagocitele pot distruge bacteriile,
de exemplu, prin intermediuil proteinelor cationice. Defensina din granulele neutroflelor
se inseră între lipidele membranei bacteriene şi crează un canal transmembranar care va
duce la liza respectivului microorganism. Microbii sensibili la defensină sunt Staphylococcus
aureus,Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Cryptococcus neoformans. Catepsina
G şi azurocidina sunt active pe bacteriile Gram negative. Fierul este foarte important
pentru dezvoltarea bacteriilor intracelulare, neutroflele îngreunȃnd accesul
microorganismelor la acest element. nnsă, organismul gazdă are nevoie crescută de fer de
vreme ce este co-enzimă pentru generarea NO şi pentru lanţul respirator. E foarte
important de reţinut că neutroflul are o viaţă scurtă dar este foarte agresiv cu bacteriile, în
timp ce macrofagul are o viață mai lungă, însă neactivat, este un ... prieten al
bacteriilor. Cel mai important factor de activare a macrofagelor este IFNγ, iar acesta este
produs în cele mai mari cantităţi de TH1 (CD4+).
Există diferite metode prin care patogenii ”păcălesc” apărarea fagocitară. Listeria
monocytogenes, Shigella spp. şiBurkholderia pseudomallei eliberează enzime care distrug
membrana fagozomilor, împidedicând asfel unirea cu lizozomii şi formarea complexului
fago-lizozom.
M. leprae şi Salmonella spp. se îndreaptă spre celulele Schwann, hepatocite şi celulele
epiteliale, care au o capacitate mai redusă de apărare. Streptococcus pneumoniae şi C.
neoformans au un înveliş protector, care inhibă ataşarea macrofagelor de aceste bacterii.
Staflococii posedă catalază, care scade stresul oxidativ. M. leprae se înconjoară cu un
glicolipid care absoarbe radicalii liberi. Micobacteriile, în general, eliberează
lipoarabinoman, care scade efcienţa IFN în activarea macrofagelor. Celulele gazdei
infectate cu Salmonella enteritidis, M. tuberculosis sau Chlamydia trachomatis nu işi
exercită corespunzător funcţia de prezentare a antigenelor. Yersinia spp. induce apoptoza
celulei gazdă.
După internalizarea anumitor antigene urmează expunerea acestora la suprafaţa APC.
Recunoaşterea de către TCR (T cell receptor) a Ag impune ca acest Ag să fe legat de o
moleculă MHC (major histocompatibility complex). Ag endogene (peptide) vor f prezentate
pe MHC I, iar Ag exogene (peptide derivate din proteine extracelulare, care au ajuns la
212
nivelul APC prin fagocitoză sau endocitoză, aşa cum este cazul antigenelor bacteriene) pe
MHC II. Genotipic, MHC I sunt codifcate de genele HLA-A, HLA-B, iar MHC II, de HLA-DP,
HLA-DQ, HLA-DR. CD1 este o moleculă asemănătoare MHC I care prezintă antigene lipidice
(M. tuberculosis, H. infuenzae). (Film nr. 4)
http://www.youtube.com/watch?v=m0ShUtbPllY
16.4.5. Intervenția LT ...
LTc (CD8+) pot elibera microorganismele care s-au „ascuns” la nivelul celulelor gazdă.
S-a demonstrat că prăbușirea sistemului MHC I la şoareci duce la lipsa de răspuns din
partea LTc şi consecutiv, aceşti şoareci devin susceptibili la infecţia cuM. tuberculosis.
Tendinţele actuale sunt de a găsi un vaccin care să stimuleze formarea LTc (Figura nr. 3). S-
a mai observat că pe lȃngă dependenţa activării LTc de prezentarea MHC I-Ag, mai există şi
o dependență de activitatea litică a fagozomilor.
TCR (fe ei situaţi pe LT CD4+ sau CD8+) sunt de 2 tipuri: cu lanțuri αβ şi cu lanțuri γδ.
Aceste 2 tipuri diferă prea puţin ca structură şi mai mult ca distribuţie. Consecutiv, cele 2
specii de receptori vor avea funcţii diferite. TCR αβ se găsesc la nivelul sȃngelui periferic şi
a timocitelor, iar TCR γδ la nivelul pielii, mucoaselor, aparatului digestiv şi reproducător. De
aceea s-a ridicat ipoteza conform căreia LT în care predomină TCR γδ să nu aibă neaparat
nevoie de prezentare MHC-Ag pentru activare (Unele LT γδ recunosc fosfoliganzi derivaţi
din M. tuberculosis care le determină activarea).
Superantigenele activează direct LT, fără a mai f nevoie de prezentarea lor de către un
APC pe un MHC. Staflococcii şi streptococcii posedă 21 de superantigene, probabil cu rol
adaptativ. S-ar putea ca motivul să fe o cât mai rapidă depleţie de LT a gazdei și inhibarea
producerii de anticorpi. Certa e însă toxicitatea determinată de eliberarea masivă de
citokine. TSST-1 (toxic shock syndrom toxin-1) aparţinȃnd staflococcilor este un exemplu
de superantigen. Și proteina M a Streptococcus pyogenes formeză un complex cu
fbrinogenul, complex care se leagă de integrinele de pe neutrofle, determinȃnd eliberarea
în cantităţi mari a mediatorilor infamatori. Dacă un antigen convenţional activează 0,01-
0,1% LT, superantigenele activează 5-30% din populaţia LT.
16.4.6. TSS ... HSP ... utilitatea antigenelor ...
Datele din USA referitoare la TSS (toxic shock syndrome) publicate într-un articol în
2010 relevă o incidenţa a infecţiilor GAS (group A streptococci) de 1,5-5,2o/oooo/an, din care
8-14% au dezvoltat TSS, cu o mortalitate de 30-70%. O epidemie de varicelă creşte riscul
de TSS la 62,74o/oooo. La 50% din pacienţii cu TSS au avut afectări severe de ţesuturi moi,
precum fasciita necrozantă, miozită, celulită. (1)
HSP (Heat shock proteins) sunt proteine comune atȃt organismelor umane, cȃt si
bacteriilor şi au fost denumite astfel datorită faptului că s-a remarcat creşterea expresiei
acestora în condiţii de temperaturi ridicate sau față de alţi factori de stres (ex. un proces
infecţios). HSP au rol în asamblarea, formarea structurii cuaternare a proteinelor şi în
transportul altor molecule. nn timpul unei invazii bacteriene, sistemul imun se îndreaptă şi
împotriva HSP, atȃt a celor autohtone, cȃt şi a celor bacteriene. HSP activează sistemul
imun prin intermediul CD91, CD40, CD14 şi anumiţi TLR. Datorită asemănării structurale
213
între cele 2 tipuri de HSP se presupune că aceste proteine ar avea un rol important în
generarea bolilor autoimune.
Tot timpul ne afăm sub infuenţa antigenelor bacteriene. Unele asigură sau înlesnesc
procese fziologice, aşa cum se întȃmplă la nivelul intestinului gros, altele, prin competiţie
ne protejează de germeni virulenţi, aşa cum se întȃmplă de ex. la nivelul foselor nazale.
Dar există şi ”teoria igieniei”, neconfrmată şi nu neapărat adevarată sau aplicabilă tuturor
microorganismelor, conform căreia şi infecţia uşoară şi tranzitorie (nu boala) cu bacterii
patogene este de folos. ”Alergiile” (stările de hipersensibilitate), bolile infamatorii ale
intestinului subțire şi bolile autoimune ar f generate de un dezechilibru imun generat de
igienă, vaccinuri și antibiotice. Ideea este nu de a elimina aceste 3 modalități clasice de
apărare împotriva infecțiilor, ci de a afa cum, cȃnd și cȃt trebuie folosită fecare ”armă” şi
de a cunoaște cȃt mai bine adversarul împotriva căruia o folosim.
16.4.7. Şoc toxico septic sau alergie? Streptococ sau Staflococ?
Pacienta în vȃrstă de 25 ani, se prezintă la camera de gardă după 2 zile de rash cutanat
şi o durere surdă difuză în cadranul stȃng inferior al toracelui.
nn urmă cu o săptămȃnă a fost diagnosticată cu faringita streptococică şi a primit
amoxicilină. S-a prezentat după 3 zile la serviciul de dermatologie datorită rash-ului, unde i
s-a pus diagnosticul de alergie la amoxicilină. Prin urmare, a fost întrerupt tratamentul cu
amoxicilină şi s-a recomandat prednison.
Este corectă atitudinea dermatologului?
Argumentaţi.
La efectuarea anamnezei pacienta acuză greață, vărsături, febră, fatigabilitate,
dezorientare și durerea surdă menţionată mai sus. Neagă să f avut sȃngerări (melenă,
hemoptizie, hemoroizi). Examen și analize: TA=65/35 mmHg, AV=110-120bpm, FR=20/min,
T:39,7°C, SO2=93%.
La examenul fzic: pacienta este palidă, cu starea generală alterată. Orofaringele clar,
fără exsudate sau eritem, crepitaţii difuze la auscultaţia pulmonară, fără sufuri
supraadăugate sau zgomote patologice cardiace, abdomen suplu, mobil cu respiraţia. În
tabel sunt listate determinările biochimice şi hematologice anormale (comparativ, valorile
normale). (Tabelul nr. 1)
Se efectueaza o radiografe (Rx) cardio-pulmonară, care este în concordanţă cu
explorările paraclinice şi cu examenul clinic, punȃndu-se diagnosticul de etapă, ARDS (adult
respiratory distress syndrome). (Figura nr. 3)
La întoarcerea de la radiologie, pacienta devine iar hipotensivă, tahicardică, tahipneică;
febra se menţine în ciuda adminitrării de acetaminofen. Se decide intubarea pacientei
datorită insufcienţei respiratorii ce se agravează, se recoltează probe de sȃnge, urină,
exsudat faringian şi se face o puncție lombară. Se solicită titrul ASLO și TSST-1. Se iniţiază
tratament cu clindamicină, vancomicină și meropenem iar pacienta este transferată în
serviciul de ATI.
Comentarii explicative
nn 1993 s-a ajuns la un consens privind TSS produs de streptococi, care presupune
stabilirea diagnosticului pozitiv dacă sunt îndeplinite concomitent următoarele condiţii:
214
1) Izolarea streptococcilor de grup A (GAS) dintr-o zonă în mod normal sterilă (sȃnge,
fuid cerebro-spinal, pleural, peritoneal)
2) Hipotensiune
3) 2 sau mai multe dintre următoarele:
· Insufcienţă renală (creatinina>2mg/dL sau valori de 2 ori mai mari decȃt în mod
normal la pacienţii cu boală renală)
· Coagulopatie
· Enzime hepatice crescute
· ARDS (adult respiratory distress syndrome)
· Rash maculo-eritematos
· Necroză de ţesut moale.
Introducerea vaccinurilor antivaricelă a scăzut incidenţa TSS de la 27% în 1993-1995 la
2% 1995-2001. Utilizarea de medicamenteantiinfamatorii nesteroidiene (AINS) se pare că
favorizează TSS. Un articol din 1995 a Chuang șsi colab. arată că 92% din pacienţii cu TSS
folosiseră anterior AINS. Mai mult, AINS pot masca simptomatologia şocului toxico-septic.
Diferenţierea între TSS staflococic şi steptococic este greu de făcut. Pacienţii cu infecție
staflococică pot prezenta diaree, vomă, eritrodermie generalizată, insufcienţa
conjunctivală, mialgie severă. Pacienţii cu infecție streptococă pot prezenta necroză de
ţesut moale (celulită, fasciită, abces, miozită), simptomatologie infuenza-like, varicelă în
antecedente în cazul celor nevaccinaţi.
nn cazul TSS staflococic, se pare că toxina TSST-1 este responsabilă de 75% din cazuri.
Pentru TSS steptococic, proteina M este responsabilă de 75% cazuri iar SPEs A, B, C sunt
responsabile de circa 13% (SPEs = Streptococcus pyogenes exotoxins). Specifcitatea
determinării Ac anti TSST-1 este de 90%, în timp ce pentru determinarea titrului proteinei M
nu există teste fabile. Se poate folosi în schimb titrarea ASLO în dinamică.
nn ciuda ambiguităţii privind etiologia, tratamentul rămȃne acelaşi:
· cristaloizi şi agenţi inotrop pozitiv contra şocului hipovolemic, cu monitorizarea
TA şi a PVC
· antibiotice: penicilină, vancomicină şi clindamicină (penicilină sau alte beta-
lactamine pentru streptococ; vancomicină sau peniciline sintetice pentru staflococ;
clindamicina s-a introdus pentru că are un efect mai îndelungat după administrare,
facilitează fagocitoza bacteriei, inhibă liza celulelor bacteriene cu eliberarea consecutivă
suplimentară de citokine în circulaţie).
· terapii adjuvante (încă în stadiu de cercetare): =imunoglobuline administrate
intravenos, O2 hiperbar, Ac antiTNF.
Evoluţia pacientei: Statusul respirator s-a îmbunătăţit, cu detubare la 48 de ore. Titrul
Ac anti TSST-1 s-a pozitivat după 2 săptămȃni, ASLO a rămas normal. S-a trecut pe
antibiotice orale, funcţia renală şi WBC au revenit uşor la normal, s-au efectuat radiografi
toracice zilnice, care au confrmat şi rezolvarea ARDS. Pacienta a fost externată după 14
zile de spitalizare.
Diagnosticul fnal: Şoc toxico-septic staflococic, probabil post-pneumonic.
215
16. 5. Verifcați-vă cunoștințele
La întrebările următoare, alegeţi răspunsul corect.
1. Care dintre următoarele microorganisme au toxicitate dar nu şi invazivitate?
a) Klebsiella pneumoniae şi Vibrio cholerae
b) Corynebacterium diphteriae şi Vibrio cholerae
c) Escherichia coli şi Salmonella typhi
d) Corynebacterium diphteriae şi Mycobacterium tuberculosis
3. Ce este un granulom?
a) o marcă a RIC împotriva bacteriilor intracelulare
b) un tip de modifcare anatomo-patologică acută
c) o marcă a RIU împotriva bacteriilor extracelulare
d) o marca a RIC împotriva bacteriilor extracelulare.
5.Iată 3 afrmaţii: (1) „cu cât structura chimică antigenică provine de la o specie mai
îndepărtată flogenetic, cu atât RI va f mai slab”; (2) „structura chimică trebuie să fe cât
mai simplă” și (3) „greutatea moleculară trebuie să fe cât mai mare (de regulă peste 4-
5.000 Da)”. Alegeţi varianta corectă dintre urmatoarele:
a) (1) și (3) sunt false
b) (1) și (2) sunt adevărate
c) doar (3) este adevărată
216
d) doar (2) este falsă
217
dezvoltă un răspuns imun celular specifc prin LT citotoxice şi unul umoral specifc prin
anticorpi. Diferite citokine pot activa sau inhiba, în mod preferenţial, unul sau ambele tipuri
de răspuns. În cazul antigenelor timoindependente, răspunsul imun este umoral. În
continuare vor f prezentate în mod schematic aceste două tipuri de răspuns imun umoral şi
celular.
218
imunoblaştii şi plasmocitele, cât şi limfocitele de memorie; după 3-4 zile se pot detecta
limfocite cu anticorpi membranari, apoi celule care sintetizează anticorpi serici.
17. 2. 1. Răspunsul imun primar (RIP)
Înaintea primului contact cu un anumit antigen, nu există anticorpi „potriviţi” față de
acesta. Stimulul antigenic primar „selectează” LB care au receptori pentru respectivul Ag.
După primul contact cu Ag se dezvoltă RIP, cu următoarele caracteristici:
· Latenţa: reprezintă perioada de la contactul cu Ag până la prezentarea structurilor
Ag către LB (în conjuncţie cu moleculele MHC); variază în funcţie de natura antigenului,
calea de administrare şi doza administrată; durează între 2 şi 3 zile;
· Creşterea logaritmică: (sinteză activă de Ac, de către plasmocite) durează circa 3
zile; în timpul acestei perioade, Ac devin decelabili prin reacţii Ag-Ac; urmează o fază de
stagnare (câteva zile), timp în care titrul anticorpilor serici se menţine relativ constant;
· Ulterior are loc scăderea progresivă a titrului anticorpilor serici.
De regulă, tehnicile imunologice uzuale permit identifcarea Ac după 5-14 zile de la
stimulul antigenic primar.
Natura anticorpilor:
· examinarea claselor de anticorpi produşi arată că primii anticorpi care apar sunt
de tip IgM (cei din clasa IgG apar câteva zile mai târziu iar nivelul lor creşte pe măsură ce
nivelul IgM scade);
· în următoarele 2-3 săptămâni, în ser predomină anticorpii de tip IgG;
· în următoarele luni, eventualii anticorpi care persistă sunt de tip IgG.
17. 2. 2. Răspunsul imun secundar (RIS)
Răspunsul imun secundar apare după al doilea contact cu acelaşi antigen (sau după
contacte ulterioare). RIS are următoarele caracteristici:
· poate apărea chiar şi după administrarea unor doze destul de mici de antigen;
· latenţa este redusă la circa 24 ore; se ajunge repede, abrupt la faza de creştere
logaritmică;
· anticorpii sunt de tip IgG;
· titrul Ac produşi este mult mai înalt;
· persistenţa acestora este mai lungă (Ac produşi se menţin timp mai îndelungat,
luni de zile).
Diferenţa dintre RIP şi RIS este datorată în primul rând existenţei limfocitelor cu
memorie. După eliminarea Ag, în organism continuă să „circule” celule cu memorie,
reacţia imună la al doilea contact cu acelaşi Ag având caracteristicile de mai sus. Memoria
imună se stabileşte din timpul RIP şi este specifcă.
Determinarea claselor IgM şi IgG are o dublă importanţă practică:
· face posibilă distincţia între o afecţiune recentă şi una mai veche şi
· permite recunoaşterea unei infecţii congenitale (cu anumite excepţii).
Cunoașterea caracteristicile RIP şi RIS are importanță practică. Ne permite să înţelegem
şi motivul pentru care reacţiile Ag-Ac trebuie făcute, de regulă, „în dinamică”.
17. 2. 3. Succesiunea de evenimente în producerea anticorpilor
219
După pătrunderea antigenului şi recunoaşterea acestuia ca non-self urmează
fagocitarea şi prelucrarea de către celulele prezentatoare de antigen care sunt
reprezentate în principal de celulele dendritice foliculare, macrofage și limfocitele B.
APC, prin IgM şi IgD membranar, posedă tot ce este necesar pentru recunoaşterea
epitopilor antigenici (diversitatea rearanjării genice demonstrează un repertoriu bogat de
limfocite B, estimat la 107 posibilităţi; mutaţia somatică conduce la posibilităţi mult mai
mari de diversifcare).
Pentru majoritatea antigenelor (în special cele de natură proteică), activarea şi etapele
următoare ale RIU necesită prezenţa limfocitelor Th CD4+ (cu intervenţia TCR, APC cu
expunerea pe MHC II de peptide antigenice, molecula CD4 şi moleculele de aderenţă).
După contactul cu antigenul și activarea completă, LTh se vor numi LThp (primitive),
care ulterior vor începe proliferarea și sinteza de IL2. Prin stimulări autocrine repetate LThp
se vor diferenția în LTh0 și apoi în LTh1 sau LTh2 în funcție de mediul citokinic din jur și de
citokinele produse (vezi și 11.3.1.).
Limfocitele Th2 sunt reprezentative pentru RIU (Figura nr. 1). LTh2 secretă IL-2, IL-4, IL-
5 şi IL-6, care activează LB și stimuleaza mecanismul de „switch” izotipic în genomul LB.
Acest „switch” se realizează prin rearanjarea ADN-ului, pentru sinteza Ac diferiți structural,
dar cu aceeași specifcitate pentru antigen.
Limfocitele B pot f activate şi direct, în cazul antigenelor timoindependente de origine
polizaharidică, cu epitopi repetitivi. Aceasta se realizează prin formarea unor punţi între
receptorii de suprafaţă şi determină redistribuţia Ig pe suprafaţa membranei celulare. În
lipsa interleukinelor produse de LT, activarea LB este limitată la sinteza de IgM, fără
„comutarea” spre IgG.
Prima etapă constă în activarea limfocitelor B din stadiul G0 al ciclului celular spre
stadiul G1 (celula sintetizează ARN şi creşte în volum); stimulul este reprezentat de
contactul cu antigenul.
IL-4, secretată de limfocitele Th, poate transforma limfocitele B din stadiul G 0 şi G1 şi
creşte expresia moleculelor MHC. În acest stadiu LB activat exprimă molecule noi: CD23,
CD34 şi CD40.
Al doilea timp corespunde proliferării policlonale a celulelor B activate, care trec din
stadiul G1 în fazele S şi M. Această fază necesită prezenţa IL-2 şi IL-5.
Ultima fază constă în diferenţierea în celule producătoare de anticorpi - plasmocite;
secreţia de IL-6 ajută procesului de maturizare iar diferitele interleukine permit orientarea
izotipică spre sinteza unei clase particulare de imunoglobuline.
Așadar, există o intensă colaborare între LB, LTh și APC atât prin contact direct cu
ajutorul unor molecule de adeziune, cât mai ales prin intermediul citokinelor, adevărați
mesageri (”hormoni”) ai imunității.
17. 2. 4. Teoria selecţiei clonale
Teoria selecţiei clonale a fost propusă în jurul anului 1950 de către McFarlane Burnet.
Această teorie afrmă că la nivelul sistemului imun există un număr imens de „capi” de
clone de limfocite, fecare dintre aceşti „capi de serie” corespunzând unei structuri
antigenice (unui anume epitop); în cadrul aceleaşi teorii, Burnet a făcut estimarea că în
220
lume ar exista circa 100 de milioane de tipuri de epitopi diferiţi. Clona, aşa cum se
cunoaşte, este o populaţie de celule identice din punct de vedere genetic, descendente ale
unei singure celule „mamă”.
Toate celulele unei anumite clone au la suprafaţă, molecule identice cu structură
imunoglobulinică; aceste imunoglobuline au rol de receptori pentru structurile antigenice
(pentru fecare antigen diferit există un receptor diferit).
Structurile antigenice „selectează” din acest număr imens de limfocite „cap de serie”
pe acelea care au receptori complementari (confguraţie spaţială etc) şi astfel determină
proliferarea şi diferenţierea lor în celule producătoare de anticorpi. Celulele unei clone au
aceeaşi specifcitate pentru structura antigenică datorită căreia au proliferat.
Clonele de limfocite care ar putea să producă anticorpi faţă de structurile proprii („self”)
sunt reprimate în timpul vieţii intra-uterine şi numai celelalte clone pot ajunge la
maturitate. În lipsa acestei represii apar boli autoimune grave, potenţial fatale.
221
Recunoaşterea peptidelor antigenice de către LT helper şi activarea
lor necesită contactul direct între APC şi limfocitele Th, interacţiunea find trimoleculară:
TCR, peptide antigenice şi MHC clasa II. moleculele CD4 şi moleculele de adeziune
consolidează această interacţiune. Toate aceste contacte duc la activarea şi multiplicarea
limfocitelor T CD4+. Drept rezultat, LT CD4+ activate sintetizează IL-2 şi lanţul a cu rol de
receptor pentru IL-2 (IL-2R), ceea ce permite o acţiune autocrină şi exocrină; multiplicarea
limfocitelor T antigen-specifce duce la formarea de clone celulare specifce antigenului.
Generarea limfocitelor T citotoxice
LT CD8+ sunt selecţionate după specifcitatea lor faţă de antigen şi activate de
diferitele citokine (IL-2, IFN-g) secretate de limfocitele Th1 activate în prealabil.
Recrutarea altor celule pentru cooperare
Prin citokinele secretate, imunitatea celulară permite recrutarea şi activarea unor celule
care nu sunt specifce antigenului:
¨ IL-2 - produsă numai de LT (în principal CD4+ şi numai într-o mică măsură de
către CD8+), are o acţiune autocrină asupra LT dar şi asupra monocitelor, macrofagelor, LT
CD8+ şi a celulelor NK;
¨ IFN-g - produs în principal de LT (CD8+ şi mai puţin din CD4+) dar şi de
celulele NK, activează macrofagul, creşte sinteza de molecule MHC II, recrutează celule NK
şi le activează funcţia citotoxică sub efectul TNF-a şi împiedică infectarea celulelor cu
virusuri (acţiune antivirală).
222
Paradoxal, stresul este învinuit pentru exacerbarea astmului și a bolilor infamatorii și
autoimune, deși astfel de boli ar trebui să fe ameliorate de un anumit grad de
imunosupresie. Mai mult, răspunsul de tip „fght-or-fight” este unul dintre mecanismele
naturale de apărare care prin activarea aparatelor cardiovascular si musculoscheletal
promovează supraviețuirea, și de aceea este puțin probabil ca acest răspuns la stres să
suprime funcția imună, în momentul în care este esențială pentru supraviețuire. Fără acest
răspuns un tigru nu poate prinde o căprioară, în timp ce căprioara nu ar avea nici o șansă
de supraviețuire. Aceste observații sugerează că stresul poate suprima funcția imună în
anumite condiții și o poate întări în altele. Așadar, efectele stresului pot f atât benefce cât
și dăunătoare.
Studiile au demonstrat că o serie de factori infuențează direcția efectelor stresului:
1. durata stresului (acut vs. cronic): stresul acut exprimat în timpul activării
imune stimulează atât imunitatatea înnăscută cât și pe cea adaptativa; stresul cronic
suprimă răspunsul imun scăzând numărul celulelor și/sau potențând mecanismele
imunosupresoare (limocitele T reglatorii). Stresul cronic poate perturba RI și prin
promovarea răspunsului proinfamator.
2. distribuția leucocitelor: compartimentele cu un număr crescut de leucocite în
timpul stresului acut determină imunostimulare;
3. concentrația fziologică vs. farmacologică a glucocorticoizilor și structura
endogenă vs. sintetică a acestora: hormonii endogeni în concentrație fziologică au
efect imunostimulant, în timp ce hormonii endogeni în concentrații farmacologice și
hormonii sintetici au efect imunosupresor.
4. corelația timp de acțiune al agentului stresor – timp de activare a
răspunsului imun: imunostimularea se observă când agentul stresor acționează în stadii
incipiente ale activării imune, iar imunosupresia este asociată cu stadiile tardive ale RI.
Se consideră că stresul pe termen scurt induce o redistribuție a celulelor imune în
organism, funcția imună find semnifcativ stimulată în organe pe unde leucocitele trec în
timpul stresului acut.
Un exemplu interesant este cel al unor parașutiști cărora li s-au măsurat nivelul
plasmatic al cortizolului și al celulelor LT și NK cu 2 ore înainte, și la 1 oră după săritură.
Rezultatele arată o creștere semnifcativă în numărul celulelor imune înainte de săritură,
urmată de o scădere dramatică la 1 oră după, modifcări concomitente cu creșterea
catecolaminelor, respectiv creșterea cortizolului plasmatic. (2)
Așadar, imediat după debutul unui stres (minute) sau în timpul unui stres de intensitate
ușoară, sau efort fzic catecolaminele determină ieșirea „soldaților” (leucocite) din tranșee
(splină, plămâni) și intrarea pe” bulevarde” (vase sangvine și limfatice). Ulterior, cortizolul
induce trecerea leucocitelor din sânge la „locurile de luptă” (piele, plămâni, tract
gastrointestinal, mucoase, ganglioni limfatici).
Stresul cronic, numit și distres are drept mecanism fziopatologic persistența RI după
încetarea acțiunii agentului stresor sau activarea repetată.
Răspunsul la stresul acut are rol critic în adaptarea organismului, hormonii de stres
pregătind sistemul imun pentru eventuale provocări (ex. rănire, infecție).
223
17.4.3. Interacțiunea somn – răspuns imun
Deși deprivarea de somn este considerată un factor de risc pentru sănătate, asocierea
consecințelor a fost difcilă, întrucât semnele clinice măsurabile, specifce acesteia, lipsesc.
S-a constatat însă că peste 64 de ore fără somn la persoane sănătoase au consecințe
cognitive marcate, dar numai câteva semne fziologice și neurologice minore. Similar, 9 zile
de deprivare de somn au ca rezultat colapsul iarspitalizarea devine obligatorie.
Se știe că există o relație între somn și sistemul imun, însă natura acesteia nu
este foarte clară. Unele studii au sugerat că deprivarea de somn determină un dezechilibru
cronic energetic, deteriorarea graduală a sănătății, cu scăderea activității răspunsului imun,
accelerarea catabolismului, malnutriție putând conduce la deces, în cele din urmă. Cauza
morții șobolanilor deprivați de somn (3 săptămâni) a fost sepsisul cu bacterii facultativ
anaerobe, prin multiplicare excesivă (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella
pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae și Corynebacterium
jejikum). Translocarea bacteriilor și a toxinelor extraintestinal, sangvin, reprezintă trigger-ul
unei stări hipermetabolice și infamatorie sistemice având ca rezultat sepsisul fără a se
putea pune în evidență un focar septic.
Semnele care certifcă prezența unui status de imunosupresie includ absența abceselor
în ciuda colonizării cu S. aureus, absența febrei și bacteriemia primară indusă de
microorganisme oportuniste, similar cu patogenia sepsisului la pacienții imunocompromiși.
224
Mult timp s-a considerat că cele 2 tipuri de imunitate acționează independent,
imunitatea înnăscută oferind prima linie de apărare împotriva microbilor invadatori, iar
imunitatea dobândită intervenind mai târziu, pentru a elimina infecția. Însă,interacțiunea
dintre cele 2 tipuri de imunitate este evidentă: imunitatea adaptativă proftă de
abilitatea imunității înnăscute de a distinge între agenții patogeni, microbii benefci și
factorii de mediu.
Cele 2 tipuri de imunitate sunt complementare, în strânsă colaborare (un adevărat
exemplu pentru studenți, medici sau orice membru al sistemului sanitar).
Existența celulelor NK întărește aceste considerente. Conform unor descoperiri recente,
celulele NK au o proprietate esențială, atribuită numai celulelor imunității – memoria; în
plus, au fost identifcate celule NK în locuri atribuite în mod clasic imunității adaptative:
timus și ganglionii limfatici. (4)
226
vaccinării copiilor sunt o nou-descoperită libertate, în cadrul democraţiei instaurate odată
cu dizolvarea URSS.
Epidemia apărută în anii ’90 a îngrijorat comunitatea medicala internaţională în
legătură cu vaccinul produs în Rusia. Contrar opiniilor anecdotice, studiile realizate au
demonstrat că vaccinul era efcient [este totuşi posibil ca vaccinul să f fost transportat în
condiţii improprii şi astfel să f avut, în mod real, o efcacitate mai mică (presupunere care
nu a fost demonstrată)].
Este adevărat că şi schemele de vaccinare din URSS au suferit în anii '80 unele
modifcări, diferind de schemele recomandate de OMS (ex. conţinut mai mic de antigen,
creşterea intervalului între vaccinări, renunţarea la administrarea DT la intrarea în şcoală)
iar preocuparea pentru sănătatea publică a scăzut, din diverse motive. Rata vaccinării la
copii a scăzut în anii ’80, la mai puţin de 70% (mult sub recomandările OMS).
Reacţia faţă de această epidemie s-a concentrat iniţial asupra vaccinării a cât mai
multor copii dar şi a adulţilor din grupele de risc. Vaccinarea tuturor adulţilor a fost
aprobată abia în 1993. S-au făcut vaccinări la locul de muncă dar şi vizite la domiciliu
pentru vaccinarea şomerilor. Pentru a creşte rata imunizării la copii s-a diminuat lista
contraindicaţiilor şi a început să se folosească schema completă de vaccinare. În octombrie
1994, s-a reintrodus vaccinarea copiilor la intrarea în clasa I. În 1995 - 1996, epidemia a
început să fe controlată. Dar care au fost pierderile umane şi materiale, reale, probabil că
nu vom cunoaşte, vreodată.
În timp ce apariţia epidemiei a fost unul dintre cele mai spectaculoase exemple ale
intervenţiei negative a mass-media în problemele de sănătate publică, controlul epidemiei
de difterie a fost unul dintre cele mai spectaculoase succese ale intervenţiei de sănătate
publică în secolul 20.
227
antigenice (sau haptene). Cuvȃntul alergen a fost pentru prima oară utilizat de Riquet;
desemnează un antigen care dă naştere unei reacţii de hipersensibilitate.
HS este specifcă şi include
· un contact sensibilizant,
· o perioadă de latenţă şi
· un nou contact, contactul declanşator, cu acelaşi antigen care a fost implicat în
contactul sensibilizant.
HS se poate clasifca în funcţie de tipul de răspuns imun în:
· HS mediată prin mecanism imun umoral (rol primordial LB şi anticorpii)
-HS de tip I (anaflactică, atopică), aşa cum se înregistrează în cazul şocului
anaflactic, edemului Quincke, conjunctivitelor sau rinitelor alergice, astmului alergic,
urticariei, eczemei atopice etc;
-HS de tip II (citotoxică), aşa cum se întâmplă în liza celulară prin anticorpi,
complement dependentă sau în citotoxicitatea anticorp dependentă, complement
independentă (mecanisme ce pot f implicate de ex. în patogenia reumatismului articular
acut, în anemii hemolitice inclusiv după infecţii cu Mycoplasma pneumoniae, reacţii
posttransfuzionale, sindromul Goodpasture etc);
-HS de tip III (prin complexe antigen-anticorp), aşa cum se înregistrează în
reacţia Arthus, boala serului, boala plămânului de fermier, glomerulonefrita
extramembranară, lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixtă, glomerulonefrita
şi periarterita poststreptococică etc.
· HS de tip IV mediată prin mecanism imun celular (rol primordial LT şi
citokinele), spre exemplu în
-HS tuberculinică sau
-HS în testările intradermice care utilizează lepromină, candidină, histoplasmină,
tricoftină etc şi
-HS în multe dintre infecţiile virale.
IgE au un timp de viaţă mai scurt (<2 zile) comparativ cu 21-23 zile pentru IgG, iar
concentraţia acestora este foarte scăzută în serul individului normal.
Ataşarea IgE de mastocite şi bazofle (ca dimeri cuplaţi cu alergenul) duce la creşterea
duratei de viaţă a IgE de la mai puțin de 2 zile la 10 zile.
IgE nu trec de bariera feto-placentară datorită faptului că placenta nu conține FcεR. nn
sângele fetal se pot găsi IgE în cantităţi sub 1UI/ml prin ataşare de FcγRI de pe macrofagele
fetale. FcγRI pot semnaliza pentru degranulare şi după cuplarea cu alte molecule (ex.
lectine, Ac anti lanțt α FcγRI).
Bazoflele şi mastocitele se caracterizează prin prezenţa unor granule
metacromatice, roşii după coloraţia cu albastru alcyan, datorită histaminei şi heparinei.
Mediatorii mastocitari sunt reprezentaţi de histamină, leucotriene, prostaglandine,
factorul activator plachetar (PAF), adenozină, factori chemotactici pentru eozinofle (ECF) şi
neutrofle (NCF) şi o serie de citokine proinfamatorii (IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, GM-CSF, TNF-
a, TGF-β1, IFN-g). La suprafaţa bazoflelor şi mastocitelor sunt exprimaţi diverşi receptori,
dintre care cei mai importanţi sunt FceRI, FceRII (CD23) şi C3aR şi C5aR (CD88).
Legarea reaginelor de receptorii FceRI, FceRII iniţializează semnalizarea spre interiorul
celulei, ducând la activarea celulară.
Activarea bazoflelor şi mastocitelor se realizează prin mecanisme mediate imun şi
necesită prezenţa unui mesager secund intracelular (Ca 2+ sau AMPc). Procesul de activare
constă dintr-o serie de reacţii biochimice în trepte, cu participarea fosfolipidelor
membranare, activarea PKC, fosforilarea tirozinei, toate ducând la creşterea infuxului de
Ca2+ extracelular alături de mobilizarea rezervelor de Ca 2+ intracelular. Rolul Ca2+ este de a
iniţia eliberarea mediatorilor preformaţi şi sinteza de novoa mediatorilor lipidici.
Exemplifcăm efectele acestor mediatori prin histamină care produce:
· bronhoconstricţie prin acţiune directă pe receptorii H1 ai musculaturii netede
traheo-bronşice,
· vasodilataţie arterio-capilară prin contracţia fbrelor musculare netede din
peretele venulelor postcapilare,
229
· creşterea permeabilităţii capilare,
· creşterea motilităţii intestinale şi
· reacţie urticariană la nivel cutanat.
Dintre manifestările clinice sistemice care pot apărea în cazul unei stări de HS de tip I,
sunt de reţinut:
- şocul anaflactic, care la om se manifestă prin colaps cardio-vascular şi bronhospasm;
în lipsa tratamentului poate evolua către deces. Principalele antigene care pot declanşa
şocul anaflactic sunt înţepăturile de himenoptere (albine, viespii), injectarea unor
medicamente (penicilina, miorelaxante, ACTH etc), latexul (la infrmiere, chirurgi) şi
- edemul Quincke care cuprinde faţa, gura şi uneori faringele şi laringele, ducând la
asfxie şi deces.
Dintre manifestările clinice localizate ar f de amintit:
- manifestările localizate la nivelul mucoasei oculare sau respiratorii, având drept
principali agenţi declanşatori polenul, acarienii, praful de casă, sporii de ciuperci
(conjunctivite alergice, rinite alergice inclusiv febra de fân, traheita spasmodică şi astmul
alergic);
- manifestările cutanate (urticarie, dermatite sau eczema atopică) şi
- manifestările digestive (diaree, vomismente în caz de alergie la laptele de vacă, ouă,
peşte, fructe, ţelină etc).
230
18. 3. 1. Anaflaxie sau atac astmatic sever?
18. 3. 2. Dar cum s-ar putea modula secreția IgG4/IgE?
18. 3. 3. Testarea HS de tip I
O tânără de 19 ani ajunge la camera de urgenţă din cauza unui atac acut de dispnee, respiraţii
şuierătoare (wheezing), înroşire (erupţie eritematoasă) generalizată la nivelul tegumentelor şi
vărsături. Era cunoscută ca suferindă de astm bronşic, ţinut sub control cu tratament
medicamentos. Din antecedentele din copilărie, avea notat în carnetul de sănătate o reacţie
„alergică” (dermatită atopică şi urticarie) după ingerarea de unt de arahide.
După spusele colegilor care au însoţit-o la spital, înainte de a-i apărea simptomele, a mâncat o
ciocolată de la un tonomat din cămin. Pe ambalaj nu apăreau notate alunele ca ingredient.
Totuşi ...
La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, în absenţa unor semne recente de
astm, trebuie să ridice întotdeauna suspiciunea anafilaxiei. Anafilaxia indusă de produse
alimentare poate fi confundată de ex. cu un atac astmatic sever. Cu alte cuvinte, anamneza şi
examenul clinic pot contribui la orientarea diagnosticului.
În primul rând şi cel mai important este ca reacţia de hipersensibilitate (HS) de tip I să fie
prevenită şi măsurile includ educarea pacienţilor şi a familiilor acestora cu privire la modul în care
231
să evite ingestia accidentală de alune, cum să recunoască primele semne şi simptome ale unei reacţii
„alergice” şi cum să reacţioneze în primele stadii ale unei reacţii anafilactice.
Pentru a bloca interacţiunea Th2 - IL-4 se pot folosi Ac anti IL-4 sau receptori solubili pentru
IL-4. Utilizarea receptorilor solubili IL-4 s-a încercat terapeutic, cu rezultate bune in
vitro (administrare inhalatorie), dar nu și in vivo (probabil datorită contracarării acțiunii acestora
prin intervenția altor citokine implicate în sinteza de IgE).
Sinteza de IgG4 și sinteza de IgE se află sub controlul aceloraşi citokine şi se realizează de
aceeaşi populaţie celulară. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulină sunt situate foarte
apropiat una de cealaltă, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4 devine
independentă de cea de IgE nu este clar elucidat, dar se pare că un rol l-ar putea juca Il-10.
232
va scădea sinteza de IgE.
Testele cutanate, prick-test, reprezintă metoda cel mai des utilizată în diagnosticul HS de tip I.
Se introduc cȃte 0,1μl din fiecare preparat antigenic de testat intradermic (de obicei se testează
25 de astfel de preparate), un martor pozitiv (histamina), şi unul negativ (soluție salină fiziologică).
Modificările cutanate apar în 5-15 min şi durează 30 minute sau mai mult. Vor fi 2 tipuri de
răspuns:
papulă, cu aspect eritematos şi dimensiuni mai mari şi care are ca mecanism refexul
de axon.
(Figurile nr. 5 și 6)
Altă tehnică ar include dozarea IgE, însă testul este mai puţin sensibil decȃt testele cutanate.
233
Un test cutanat pozitiv nu inseamnă neapărat că persoana prezintă HS de tip I, ci că există o
mare probabilitate să fie aşa. Numai un test cutanat pozitiv de mari dimensiuni (>10mm diametru)
este urmat şi de un răspuns tardiv, caracterizat prin eritem şi induratie. Răspunsul tardiv apare la
2-3 ore după injectarea intradermica a antigenului, ţine pȃnă la 24 ore şi este sugestiv pentru
inflamaţie cronică la nivelul foselor nazale, plămȃnului, pielii, datorându-se:
Testele ”patch” reprezintă aplicarea cutanată a 10μg alergen şi realizarea unei biopsii din zona
respectivă după 24 sau 48 ore. Există 3 moduri de aplicare a antigenului în cazul patch-test: injecţii
intradermice locale, plasture sau godeu. Ultima metodă are avantajul că se pot lua probe repetate
fără traumatizarea suplimentară a pielii la fiecare prelevare.
(Figurile nr. 7 și 8)
(Figura nr. 9)
Un alt test care se poate folosi este testul de provocare prin nebulizarea antigenului, cu răspuns
rapid în 20 minute constȃnd în bronhospasm şi cu un raspuns tardiv în 4-8 ore, constȃnd în
234
eliberare de mediatori de novo şi infiltrat celular. Răspunsul tardiv pozitiv se poate pune în
evidenţă prin LBA (lavaj bronho-alveolar), cȃnd se identifică nu celulele, ci produşi ai acestora
(histamina, prostaglandine, leucotriene, MBP, ECP) sau prin biposie, cȃnd se pot identifica toate
modificările patologice care pot să apară în astm (celule inflamatorii, depunere de colagen,
subţierea peretelui bronşiolelor), reunite sub denumirea de remodelare bronşică. Pentru
demonstrarea hiperreactivităţii bronşice nespecifice se fac teste de provocare cu histamină,
metacolină sau aer rece. Teoriile spun că evaporarea crescută de apă, care va răci epitelilul, ori
stimulează direct terminaţiile nervoase, ori stimulează eliberarea de mediatori din celulele locale
(histamină din mastocite).
Pe frotiul de sânge periferic se remarcă eozinofilie, iar în secreţiile nazale ale unui astmatic,
titrurile de ECP şi CXCL8 (IL-8) vor fi crecute. pH-ul vaporilor de apă în criză va fi acid.
Examenul CT al sinusurilor nazale poate arăta opacifierea acestora, situaţie întȃlnită la o treime
din astmatici.
Ca și în cazul oricărei alte patologii nu se poate rămȃne doar la stadiul de observare, nici la cel
de diagnostic, ci trebuie să se meargă la următorul nivel, identificarea unui tratament.
nntrebarea 2
Alegeți afrmațiile care sunt amândouă corecte și se afă în relație de cauză-efect.
a). Activarea bazoflelor şi mastocitelor se realizează prin mecanisme mediate imun
pentru că necesită prezenţa unui mesager secund intracelular (Ca 2+ sau AMPc).
b). Histamina determină bronhoconstricţie la nivelul plămȃnului pentru că acţionează pe
receptorii H1 ai musculaturii netede traheo-bronşice
c). Şocul anaflactic la om se manifestă prin colaps cardio-vascular şi bronhospasm
pentru că în lipsa tratamentului poate evolua către deces
d). Polenul, acarienii, praful de casă, sporii de ciuperci nu pot determina leziuni la
nivelul mucoasei oculare sau respiratorii deoarece ei nu pot declanșa un raspuns imun.
Intrebarea 3
Care dintre următoarele nu reprezintă un test diagnostic al hipersenibilității tip I
a). prick-test
b). dozarea IgE
c). patch test
d). dozarea IgG
Intrebarea 4
Nu se folosește ca tratament al hipersensibilității tip I
a). hiposensiblizarea prin injectarea alergenului în cantităţi mici pentru o perioadă de
cȃteva luni
b). un fragment antigenic conţinȃnd numai primii 20 aminoacizi din structura primară a
alergenului caruia i s-a crescut şi capacitatea de legare de IgE
c). introducerea genomului alergenului bacterian cu ajutorul unui vector în celulele
gazdei, cu modifcarea răspunsului imun al acesteia
d). anticorpii monoclonali anti-IgE umanizaţi
236
Intrebarea 5
Pentru a găsi afrmaţia corectă ajutaţi-vă de povestirea adevărată
a).La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, în absenţa unor semne
recente de astm, nu ar trebui să ridice niciodată suspiciunea anaflaxiei.
b). Cel mai important este ca reacţia de hipersensibilitate (HS) de tip I să fe prevenită
c). nn cazul HS tip I se evită adrenalina, antagoniştii receptorilor histaminici H1 şi H2,
oxigenul, albuterolul şi corticosteroizii
d). Pentru că aproximativ 90% din răspunsurile bifazice apar în primele 4 ore de la
reacţia anaflactică iniţială, pacienţii pot f externaţi din camera de urgenţă înainte de
atingerea a 4 ore de la prezentare.
nntrebarea 1
Printre rolurile hipersensibilităţii de tip II se numără:
a). distrugerea bacteriilor extracelulare şi intracelulare
b). eliminarea celulelor infectate cu virusuri
c). distrugerea unor paraziţi sau fungi
d). toate cele de mai sus
nntrebarea 2
Care dintre următoarele afrmaţii este incorectă?
a). nn HS de tip II limfocitele Tc cu efect litic faţă de celulele infectate viral.
b). nn HS de tip II sunt utilizate atȃt mecanismele „imunităţii naturale” (implicând PMN,
macrofage, celule NK) cȃt și ale imunităţii specifce.
c). Imunitatea specifcă presupune, printre altele, formarea de Ac care vor forma
ulterior complexe imune circulante.
240
d). Complexele imune circulante sunt rapid epurate din organism, ele neavȃnd
posibilitatea de a se depune la nivelul ţesuturilor.
- unei infecţii persistente (ex. lepră, malarie, hepatită virală, endocardită staflococică);
- unei boli autoimune (ex. artrită reumatoidă, lupus eritematos sistemic, polimiozită);
- inhalării de material antigenic (ex. actinomicete în cazul plămȃnului de fermier,
antigene aviare în cazul plămȃnul crescătorilor de păsări).
Complexele imune activează o serie de căi ale răspunsului imun. Aminele vasoactive
eliberate în cadrul activării acestor căi determină retracţia celulelor endoteliale, ceea ce are
ca efect creşterea permeabilităţii vasculare, depunerea complexelor imune, dar şi
expunerea colagenului, care va stimula agregarea trombocitelor şi formarea de
microtrombi.
Se intră într-un cerc vicios deoarece complexele imune depuse pe membrana bazală
continuă să genereze C3a şi C5a (anaflatoxine). Astfel, complementul, iniţial cu rol
protectiv, determină ulterior creşterea suplimentară a permeabilităţii capilare.
Polimorfonuclearele sunt atrase şi îşi exocitează conţinutul în loc să endociteze complexele
imune (acestea nu pot f desprinse de pe membrana bazală vasculară). Enzimele inhibitoare
serice împiedică enzimele lizozomale să acţioneze la nivel sistemic, însă nu şi local, de
aceea se vor genera leziuni tisulare locale. Eritrocitele primatelor conţin receptori pentru
C3b, importanţi pentru preluarea complexelor imune şi transportul lor către splina şi fcat,
unde vor f fagocitate. nn HS de tip III, sistemul este suprasaturat, ceea ce îi scade efcienţa.
Complementul menţine complexele Ag-Ac solubile pe calea clasică şi resolubilizează
complexele Ag-Ac agregate pe calea alternă, de aici putȃndu-se deduce rolul depleţiei de
componente ale complementului sau a unor boli ereditare (defcit C2) în patologia HS de tip
III. Este importantă şi dimensiunea complexelor imune. Cele mari sunt repede preluate de
fcat şi eliminate, în timp ce complexele mici rămȃn în circulaţie o perioadă mai lungă de
timp. Un defect genetic ce determină sinteza de Ac cu afnitate joasă, va favoriza
producerea de complexe Ag-Ac mici şi deci, leziunile caracteristice HS de tip III.
Depunerea complexelor imune
Administrarea de metilsergida sau clorfenilamina (antagonişti ai aminelor vasoactive)
reduce considerabil depunerea complexelor imune prin scăderea permeabilităţii vasculare.
241
Depunerea complexelor mai este dependentă de regimul presional crescut şi de
prezenţa turbulenţelor. nn capilarele glomerulare presiunea sȃngelui este de 4 ori mai mare
decȃt în restul capilarelor. Turbulenţe se întȃlnesc în zonele de bifurcaţie a arterelor şi în
zonele de fltru vascular (plexurile coroide şi corpii ciliari). Preferinţa pentru un ţesut sau
altul poate f dependent de sarcina electrică a complexului imun, de gradul de glicozilare a
Ac.
Fenomene experimentale
Reacţia Arthus a fost descrisă în 1903 de Maurice Arthus şi Nicholas Breton, după
injectarea subcutanată de ser de cal la un iepure hiperimunizat. Leziunile au fost maxime
după aproximativ 6 ore. Boala serică acută, descrisă în 1911 de von Pirquet, a fost studiată
din nou în anii 1960, descriindu-se zece modele de glomerulonefrite experimentale (Dixon).
Deoarece complexele imune circulante (CIC) se depozitează în ţesuturi, apare conceptul de
antigen in situ. După ce complexul imun se formează în locul respectiv sau este fxat
secundar, se iniţiază (așa cum am menționat anterior) o cascadă de evenimente:
· activarea complementului şi a factorilor anaflactoizi chimiotactici C3a şi C5a;
· afuxul de neutrofle, care produc leziuni prin enzimele lizozomale şi
· afuxul de trombocite, cu generarea fenomenelor de tromboză.
Fenomenul Arthus a fost observat la iepure, cobai, şoarece etc, dar şi la om.
Experimentul a fost efectuat pe iepure prin injectarea de antigen netoxic (ex. albumină) de
la altă specie, asociat cu un adjuvant imun. După unele rapeluri, necesare uneori pentru
obţinerea de anticorpi circulanţi IgG precipitanţi, reacţia Arthus poate f obţinută prin
injectarea subcutanată a antigenului. Manifestările apar după 2 ore, atingând maximum la
6 ore şi dispar după 24-48 ore. Constau în edem, eritem indurat, peteşii şi uneori purpură
necrotică sau chiar necroză. Leziunile de la locul injectării antigenului duc la fxarea de igG
şi C3b cu sediul perivascular sau în peretele vascular.
Boala serului
a) Boala serului acută. Înaintea erei antibioticelor, multe boli infecţioase erau tratate
prin injectarea de ser de cal hiperimunizat. În 1911, von Pirquet descrie complicaţiile
acestei terapii sub termenul de boală serică (febră, artralgii, vasculită cutanată), survenită
la unii bolnavi după 8-12 zile de la prima injecţie.
Injectarea unică, pe cale intravenoasă, a unei substanţe netoxice, ca serumalbumina
bovină (BSA), în cantitate mare, la animalul neimunizat (iepure), este urmată de apariţia
bolii serice acute (experimentală) cu 3 faze: 1. faza anterioară imunizării (durează 5-8 zile.
BSA marcată radioactiv, scade, iniţial brutal prin difuziune în spaţiile extravasculare, apoi
după 24 de ore, lent, corespunzător propriului catabolism); 2. faza complexelor imune
(corespunde prezenţei concomitente de BSA şi a anticorpilor anti-BSA); este boala serică cu
glomerulonefrită. În jurul zilei a 5-a, concentraţia sangvină de BSA scade rapid. Anticorpii
anti-BSA liberi nu sunt decelabili decât după dispariţia BSA liberă. Detectarea complexelor
imune corespunde acestei perioade, ca şi scăderea complementului seric. Manifestările
patologice nu sunt datorate anticorpilor anti-BSA liberi şi nici complexelor imune circulante.
Ca şi în reacţia Arthus, leziunile sunt datorate acţiunii complementului, care este urmată de
un afux de neutrofle. La animalul fără complement apare o simplă albuminurie fără
242
glomerulonefrită); 3. faza de restitutio ad integrum (nu mai există antigen liber sau
conjugat decelabil; anticorpii anti-BSA sunt crescuţi; manifestările clinice, în special
glomerulonefrita, regresează rapid).
b) Boala serică cronică. Este difcil de reprodus la animal. Totuşi administrarea
repetată a antigenului (din 2 în 2 zile), permite producerea unei glomerulonefrite cronice
extramembranare proliferante.
Patologia umană
Principalele afecţiuni umane sunt:
· bolile comparabile cu reacţia Arthus (în care antigenul induce o reacţie locală prin
difuziunea anticorpilor IgG precipitanţi); un exemplu este boala plămânului de fermier
[după contactul în timpul zilei cu fânul mucegăit (Actinomyces thermophylus), apare la
începutul nopţii (după 6 ore) o stare de asfxie care dispare în următoarele ore];
· manifestări mai generale, cu atingerea rinichiului, articulaţiilor, pielii şi uneori a
creierului; apar leziuni de tipul glomerulonefritei extramembranare, uneori proliferative.
Afecţiunile mai frecvente sunt lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixtă,
glomerulonefritele şi periarteritele poststreptococice etc. În 2/3 din cazurile de anemie
hemolitică imuno-alergică medicamentoasă se formează anticorpi IgM anti-medicament. În
aceste cazuri apar adesea manifestări generale: febră, frison, mialgii cu dureri lombare şi
uneori anurie tranzitorie, prin necroză tubulară acută.
244
Examenul clinic la internare a relevat o stare generală bună, absenţa temperaturii,
greutate = 63 kg, înălţime = 147 cm, TA = 140/80 mmHg, 80 bătăi cardiace / minut, 20
respiraţii / minut, jugulare turgescente, raluri ronfante la nivelul bazelor pulmonare, fcat
palpabil la 5cm sub rebordul costal.
Au fost înregistrate următoarele valori pentru analizele de laborator efectuate:
hematocrit 40,2%, hemoglobină 13,5 g/dl, număr leucocite = 15.600/mm 3. Examenul de
urină a arătat o densitate de 1025, pH = 5, proteinurie = 4+, fără glicozurie, hematurie =
3+, hemoglobinurie = 3+, leucocite, hematii şi cilindri numeroşi în sedimentul urinar iar
urocultura a fost negativă.
După 12 ore de la internare, proteinuria a crescut. Iar celelalte analize de laborator au
avut următoarele rezultate: proteine totale = 6,4 g%, albumină = 3,6 g%, globuline = 2,8 g
%, glicemie = 156 mg%, Na = 136 mEq/l, K = 4 mEq/l, Ca = 10 mg%, P = 8,2 mg%, acid
uric = 10,6 mg%, uree = 174 mg%, creatinină = 1,84 mg%, proteina C reactivă = 100
mg%, C3 = 8,3 mg% (Normal = 0,5 - 1,5 mg%), C4 = 42,9 mg% (Normal = 400-
500 µg/ml), ASLO = 833 UI/ml. Factorul anti-nuclear a fost absent.
Examenul ecografc renal a fost în limite normale.
Funcţia renală s-a deteriorat progresiv, şi în aceste condiţii, la 20 de zile de la internare,
ureea a ajuns la valoarea de 223 mg%, creatinina la valoarea de 8,3 mg%, clearance-ul
creatininei la 5,34 ml/min, iar proteinuria la 3,9 g/24 h.
S-a efectuat o biopsie renală care a evidenţiat o glomerulonefrită proliferativă difuză
endocapilar exsudativă, cu necroză tubulară acută (25% proliferări celulare). La
imunofuorescenţă s-au observat depozite granulare difuze de C 3 în capilare şi mezangiul
arteriolelor. Prin ME s-au observat depozite voluminoase mezangiale şi subepiteliale.
În acest context s-a pus diagnosticul de glomerulonefrită acută post-infecţioasă.
Pacienta a primit un tratament în urma căruia funcţia renală s-a ameliorat progresiv, iar
la 6 zile ureea a ajuns la valoarea de 122 mg%, creatinina = 2,85 mg% şi clearance-ul
creatininei = 14 ml/min, moment în care a fost externată (la cerere).
După aproximativ două săptămâni, pacienta a revenit, iar la acel moment valoarea
diurezei era scăzută, prezenta proteinurie = 9,2 g/24 h, uree = 180 mg%, creatinină = 3,17
mg, clearance-ul creatininei = 9 ml/min; din punct de vedere clinic pacienta era dispneică şi
prezenta fatigabilitate intensă.
A doua biopsie a demonstrat înrăutăţirea tabloului anterior, cu 80% proliferări celulare
şi 42% scleroză glomerulară şi necroză fbrinoidă pe arterele mici, cu depozite de C 1q, C3,
IgG şi fbrină.
Pacienta a evoluat foarte rapid către IRA. După 3 săptămâni s-a început dializa. După 9
săptămâni, a prezentat erizipel la membrul inferior drept şi şoc septic, urmat de deces.
nntrebarea 1
245
Este corectă afrmaţia:
a). Pentru HS de tip III apare conceptul de Ac „in situ”
b). Complexul imun se formează în ţesuturi sau este fxat secundar
c). Reacţia Arthus a fost descrisă după injectarea subcutanată de ser de iepure la un cal
hiperimunizat.
d). Boala serică se caracterizează prin febră, artralgii, vasculită cutanată survenită
imediat după injectarea de ser de cal hiperimunizat
nntrebarea 2
Care dintre următoarele nu este fază a bolii serice acute?
a). faza leziunilor vasculare
b). faza anterioară imunizării
c). faza de restitutio ad integrum
d). faza complexelor imune
nntrebarea 3
Următoarea afrmaţie „leziunile sunt datorate acţiunii complementului, care este
urmată de un afux de neutrofle” este valabilă:
a). pentru reacţia Arthus
b). pentru boala serului
c). atȃt pentru reacţia Arthus cȃt şi pentru boala serului
d). pentru nici una dintre ele.
nntrebarea 4
Printre principalele afecţiuni umane datorate HS de tip III nu se numără:
a). boala plămânului de fermier
b). lupusul eritematos diseminat
c). cardita reumatismală
d). glomerulonefritele şi periarteritele poststreptococice.
nntrebarea 5
Depunerea complexelor imune este dependentă de:
a). permeabilitatea presională
b). regimul presional crescut
c). prezenţa turbulenţelor
d). nici una dintre mențiunile de mai sus
e). primele 3 afrmații sunt corecte.
248
Elementul distinctiv al hipersensibilităţii granulomatoase este formarea de celule
epiteloide, celulele derivate din macrofage, de dimensiuni mari pe seama dezvoltarii
reticulului endoplasmatic, cu rolul lor de a întreţine infamaţia prin secreţia continuă de
TNF. Persoanele cu defcit de IFN nu dezvoltă granuloame, însă nici nu se apără efcient
împotriva tuberculozei, leprei, leishmaniozei, schistosomiazei etc. Prin fuziunea celulelor
epiteloide rezultă celule gigante. Mai sunt denumite şi celule Langhans. Atenţie, sunt
diferite de celulele Langerhans! Aceste celule gigante au mai mulţi nuclei, însă periferici,
reticulul endoplasmic este puţin dezvoltat, iar mitocondriile şi lizozomii sunt în degradare.
Se pare ca aceste celule Langhans ar reprezenta etapa fnală din diferenţierea
macrofagelor.
Reacţiile de hipersensibilitate de tip IV observate în patologia umană pot f observate în
trei grupe principale de afecţiuni:
1. Eczema de contact care poate apărea datorită bijuteriilor care conţin nichel,
produselor din piele de animal, produselor cu săruri de crom, cremelor „solare”, compuşilor
chimici de cauciuc, produselor farmaceutice (penicilină, streptomicină, neomicină) etc;
2. Maladii infecţioase în care agenţii patogeni se dezvoltă intracelular (tuberculoză,
lepră, leishmanioză, listerioză, micoze profunde etc);
nn cazul M. tuberculosis, leziunea granulomatoasă conţine pe lȃngă macrofage, celule
epiteloide, celule gigante şi LT dispuse centrifug, şi o zonă de necroză centrală, un fel de
puroi numit cazeum. nn jurul întregului ansamblu se afă o zonă de fbroză şi o cantitate
crescută de colagen.
nn cazul M. leprae, reacţia granulomatoasă se numeşte reacţia Mitsuda.
Apariţia de leziuni la injectarea de antigene splenice de la un alt pacient cu sarcoidoză
unei alte persoane cu sarcoidoză, constituie pozitivarea testului Kweim.
3. Alte maladii (sarcoidoză ciroză biliară primitivă, hepatitele cronice virale B şi C, SIDA,
infecţia HIV, poliartrita reumatoidă, reumatismul articular acut, b. Crohn etc).
249
Datorită simptomatologiei şi valorilor crescute ale reactanţilor de fază acută, s-a început
terapia cu corticosteroizi, pacientul prezentând o remisie a simptomelor. S-a efectuat
biopsie din zona afectată, histologic descoperindu-se leziuni foliculare cu celule epitelioide
dar fără necroză. S-au realizat frotiuri colorate Gram, Ziehl-Neelsen şi PAS; nu au fost
evidenţiate microorganisme iar decizia a fost de a nu se trimite produsele recoltate spre
laboratorul de bacteriologie.
Pentru a se elucida motivul apariţiei acestei leziuni, au fost realizate şi o serie de
investigaţii extracerebrale (CT toraco-abdominal, lavaj bronhoalveolar şi bronhoscopie) fără
a se obţine date suplimentare pentru un diagnostic pozitiv.
În aceste condiţii, medicul curant a pus diagnosticul de sarcoidoză localizată la nivelul
SNC iar pacientul a fost externat, continuând la domiciliu tratamentul cu corticosteroizi,
conform scrisorii medicale eliberată în spital.
După 2 luni bărbatul a fost reinternat cu defcienţe motorii şi febră (38,2CC). S-a indicat
din nou examen CT; rezultatul nu a permis explicarea simptomatologiei. Recoltându-se
produse din mai multe zone, examenul bacteriologic, complet, a permis punerea
diagnosticului de tuberculoză diseminată.
S-a continuat tratamentul cortizonic, dar s-a început tratamentul anti-tuberculos cu o
asociere de 4 medicamente (izoniazidă, rifampicină, pirazinamidă şi etambutol).
După 4 luni simptomele au reapărut şi s-a luat decizia intervenţiei chirurgicale, pentru
excizia formaţiunii. Analiza anatomo-patologică a pus în evidenţă structura tipică pentru
granulomul tuberculos (ceea ce prin biopsia „oarbă” efectuată cu câteva luni înainte, nu s-a
reuşit). Tratamentul a continuat, dar a fost adăugată amikacina, penta-terapia anti-TB
realizându-se pentru o durată de 6 luni. Pacientul nu a prezentat reacţii adverse. După un
an, au fost scoase din asocierea medicamentoasă 3 medicamente iar pacientul a primit
pentru încă 6 luni (durata totală a tratamentului anti-TB a fost de 18 luni) numai izoniazidă
şi rifampicină.
Discuţii
Tuberculoza cerebrală are o rată de mortalitate care variază între 5 şi 60%. Tratamentul
de elecţie este cel medicamentos, cu o durată de circa 18 luni, până la dispariţia leziunilor
sau până la calcifcarea acestora. O creştere paradoxală în dimensiuni a leziunii, sub
tratament, poate duce la recomandarea intervenţiei chirurgicale de excizie a
tuberculomului, aşa cum s-a întâmplat şi în această situaţie.
250
nntrebarea 2
Alegeti dintre următoarele afrmaţii adevărate pe cea care nu se potriveşte în context
(ca sens de desfăşurare a reacţiilor imune):
a). Ultravioletele inhibă direct celulele Langerhans, care au un rol important în
sensibilizare
b). Persoanele cu defcit de IFN nu dezvoltă granuloame
c). Absenţa reacţiei epidermice la contactul tegumentului cu DCNB se datorează unui
defcit imun celular
d). Keratinocitele exprimă la suprafaţa lor molecule HLA DR la 48-96 de ore după
apariţia infltratului limfocitar, fapt care va amplifca răspunsul imun al gazdei
nntrebarea 3
Alegeţi varianta care se potriveşte pentru spaţiile libere din următoarea afrmaţie:
”Intradermoreacţia la .................... presupune apariţia unei eventuale arii
intens..................., circumscriind urma înţepăturii dermice, ...................... si reliefate, care
corespunde histopatologic infltraţiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN),
reprezentând răspunsul imun faţă de antigenul injectat”
a). tuberculină; eritemato-violacee, indurate
b). bacil Koch; eritemato-violacee; indurate
c). tuberculină; cianotice; retractile
d). bacil Koch; cianotice; indurate
nntrebarea 5
Care dintre următoarele tipuri de HS de tip IV nu are echivalent la om?
a). Hipersensibilitatea tuberculinică
b).Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote;
c). Hipersensibilitatea de contact
251
d). Hipersensibilitatea granulomatoasă
252
Specifcitatea se referă la faptul că un antigen nu este recunoscut decât de anticorpii
care au fost produşi în urma inoculării respectivului antigen, iar anticorpii nu recunosc
decât antigenul faţă de care au apărut. Trebuie menţionat că specifcitatea nu este
absolută, întrucât un Ag cu reactivitate încrucişată, poate reacţiona cu un Ac format faţă de
un alt antigen (reacţia încrucişată se explică prin aceea că anumite Ag posedă anumite
grupări determinante comune).
Reversibilitatea complexului Ag-Ac se datorează faptului că legăturile necovalente
sunt reversibile la cald sau pH acid (<3).
Legarea antigenului cu anticorpul este determinată de complementaritatea reciprocă
dintre conturul suprafeţei epitopului şi paratopului, care apropie la câţiva Angstromi
grupările chimice care le alcătuiesc, permiţând stabilirea unor forţe intermoleculare între
epitop şi paratop (hidrofobe între grupările nepolare, de atracţie electrostatică între
grupările ionizate de semn contrar).
Iniţial are loc cuplarea între Ag şi Ac rezultând complexe Ag-Ac mici, solubile, care se
pot desface relativ uşor. În continuare, datorită existenţei mai multor situsuri de legare,
complexele Ag-Ac mici se reunesc formând structuri de dimensiuni mai mari, adevărate
reţele Ag-Ac, care pot f evidenţiate fe direct, fe după utilizarea unor artifcii tehnice (19.4.,
19.5).
Anticorpii din clasa IgG, care apar în RIS au afnitate mică, dar aviditate mare pentru Ag
(şi legăturile sunt mult mai stabile).
256
Utilizarea ASLO în diagnosticul infecţiilor aparatului locomotor
257
1. Ce presupune o reacţie antigen-anticorp?
A. activarea sistemului complement
B. interacţiunea dintre determinantul antigenic (epitop) şi fragmentul corespunzător din
molecula anticorpului (paratop)
C. pH şi temperaturi extreme
D. neapărat prezenţa unei bacterii în sânge
E. opsonizarea particulei patogene
258
20. Reacţii de precipitare şi
reacţii de aglutinare
20. 1. Reacţia de precipitare
Reacţia de precipitare între Ag şi Ac poate avea loc în mediu lichid sau solid şi constă în
unirea Ag solubile cu Ac specifci, rezultând complexe antigen-anticorp, care nu devin
insolubile şi stabile decât în cazul formării unei reţele tridimensionale între antigen şi
anticorp, conform teoriei reţelei care presupune: un antigen cel puţin trivalent pentru
amplasarea anticorpilor, anticorp bivalent şi condiţii fzice favorabile precipitării (ex. Ac
puţin glicozilaţi / de tip IgG cu 3% glucide superiori celor IgM cu 10% glucide).
Reacţia de precipitare este sensibilă şi specifcă în evidenţierea prezenţei Ag (pentru
realizarea reţelei Ag-Ac este necesar ca în reacţie să intre o anumită „cantitate” de Ag şi
Ac, care să se găsească într-un anumit raport / proporţie, iar Ag care participă la formarea
agregatelor sunt într-o cantitate proporţional mai mică, în raport cu Ac). În cadrul cursului
se discută diferitele situaţii legate de prezonă (exces de Ac), exces relativ de Ac, zona de
echivalenţă (Ag şi Ac se găsesc „în totalitate” în precipitat), exces relativ de Ag şi respectiv
postzonă (exces de Ag). Pentru anumite sisteme Ag-Ac va f defnită şi noţiunea de
proporţie optimă.
259
C. Reacţii de precipitare în care difuzia în gel este combinată cu migrarea în câmp
electric
· Imunoelectroforeza
· Contraimunoelectroforeza
· Electroforeza urmată de imunofxare
· Electroimunodifuzia.
20. 2. 1. Reacţii de precipitare în mediu lichid
Au la bază unirea Ag cu Ac în mediul lichid, formându-se complexe Ag-Ac, care vor
precipita atunci când Ag şi Ac se găsesc în anumite proporţii.
20. 2. 1. 1. Reacţii de precipitare în amestec
Reacţia de precipitare între Ag şi Ac se poate cuantifca şi este foarte utilă pentru a
demonstra prezenţa şi respectiv absenţa precipitatului în funcţie de concentraţiile relative
de Ag şi Ac. Spre exemplu, pentru titrarea toxinei difterice (metodaRamon) se pun în
contact, în amestec în tuburi, cantităţi egale din componenta care trebuie titrată (toxina
difterică, Ag) cu cantităţi variabile de Ac la care titrul este cunoscut. Cantitatea maximă de
precipitat se găseşte în tubul unde există raportul de echivalenţă. Pentru sistemul toxină
difterică - anticorpi anti-toxină difterică (ca şi în cazul sistemului toxină tetanică - anticorpi
anti-toxină tetanică), raportul de echivalenţă se „suprapune” peste proporţia optimă, astfel
încât se poate observa relativ uşor tubul în care apare cantitatea cea mai importantă de
precipitat. Cunoscând titrul anticorpilor, se afă imediat titrul toxinei (1 Lf = 1 limes
foculans = cantitatea de toxină care se combină cu o unitate de antitoxină = 1 UA = 1
unitate antitoxică). Dacă spre exemplu precipitarea maximă apare în tubul în care titrul
anticorpilor este de 10 UA, titrul toxinei este de 10 Lf.
În mod asemănător, prin metoda Dean şi Web se poate determina titrul
anticorpilor anti-toxici, cunoscând titrul toxinei.
20. 2. 1. 2. Reacţii de precipitare în inel
Reacţia de precipitare în inel, constă în punerea în contact a Ag şi Ac astfel încât să nu
se amestece; reacţia care apare la interfaţa dintre Ag şi Ac se concretizează printr-un inel
de precipitare albicios. Se utilizează pentru identifcarea originii petelor de sânge (reacţia
Uhlenhut, în medicina legală) şi pentru identifcarea provenienţei unor preparate pe bază
de carne (în industria alimentară).
Demonstrativ, în cursul lucrărilor practice, reacţia de precipitare în inel (reacţia Ascoli)
se poate utiliza pentru identifcarea prezenţei antigenului cărbunos (Ag obţinut de
la Bacillus anthracis). Istoric, soluţia de antigen se prepara pornind de la organe (de ex.
splină) recoltate de la un animal care a decedat şi pentru care se suspecta că decesul a fost
produs de o infecţie generalizată cu Bacillus anthracis. Fragmentul de organ se mojarează
în soluţie de clorură de sodiu sterilă, adăugându-se ulterior câteva picături de acid acetic,
apoi se menţinea la temperatura de ferbere timp de 5-10 minute. După decantarea şi
alcalinizarea cu NaOH, urma fltrarea şi rezulta soluţia antigenică. Din punct de vedere
tehnic vom utiliza 3 tuburi, 1 pentru reacţie şi 2 tuburi martor. În primul tub martor vom
pipeta 0,5 ml ser anticărbunos şi 0,5 ml soluţie salină fziologică iar în al doilea tub martor
vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal şi 0,5 ml soluţie de antigen. În ceea ce priveşte tubul
260
de reacţie trebuie să pipetăm întâi 0,5 ml din serul anticărbunos, urmând ca soluţia de
antigen (în cantitate de 0,5 ml) să fe pipetată foarte lent, eventual prin „scurgere picătură
cu picătură” pe peretele interior al tubului, în aşa fel încât cele 2 soluţii să nu se amestece.
În cazul reacţiei pozitive (prezenţa Ag cărbunos în soluţia antigenică), după circa 5 minute,
la interfaţa dintre cei 2 reactivi apare un „inel” de precipitare.
20. 2. 1. 3. Reacţia de precipitare în tub capilar a fost utilizată pentru evidenţierea
prezenţei proteinei C reactive (CRP).
20. 2. 1. 4. Dozajul nefelometric: în prezenţa unei cantităţi constante de Ag sau Ac, se
formează complexe Ag-Ac care modifcă intensitatea şi dispersia luminii direct proporţional
cu concentraţia de Ag sau Ac (principiul de măsurare este proporţionalitatea dintre
cantitatea de complex antigen-anticorp formată şi lumina „împrăştiată”). Cu ajutorul unui
nefelometru, care utilizează fascicule luminoase monocromatice intense şi a unei măsurări
a precipitatului în mediu lichid prin difracţie de raze luminoase, este posibilă dozarea
uşoară, reproductibilă a antigenului sau a anticorpilor, folosind o curbă de etalonare.
Nefelometria se utilizează curent şi determină cantitativ proteine specifce din ser şi urină
(IgG, IgA, IgM, CRP, haptoglobină, orosomucoid, fbrinogen, C3, C4, prealbumină, alfa1-
antitripsină etc).
20. 2. 2. Reacţii de precipitare în mediu gelifat
Utilizarea gelozei, în care pot să migreze cei doi reactivi (se va utiliza o anumită
concentraţie de agar în soluţie de tampon veronal, în aşa fel încât porii gelului să permită
migrarea), va duce la vizualizarea reacţiei Ag-Ac printr-un arc / linie de precipitare.
20. 2. 2. 1. Imunodifuzia radială simplă (IDRS Mancini)
Imunodifuzia radială simplă (Mancini) se bazează pe difuzia spontană şi radială a Ag din
proba de cercetat, într-un gel care conţine o cantitate constantă de anticorpi, determinând
apariţia unui cerc de precipitare al cărui diametru este direct proporţional cu concentraţia
de antigen din probă. Pentru a obţine un cerc de precipitare de mărime convenabilă,
concentraţia Ac înglobaţi în gel trebuie să fe aleasă în funcţie de titrul acestora şi de
concentraţia Ag care urmează a f testat. Metoda permite determinareacantitativă a
imunoglobulinelor (IgG, IgM, IgA), fracţiunii C3 a complementului, alfa1-antitripsinei,
sideroflinei etc.
Sunt necesare plăcuţe (de ex. cu diametrul de 5 cm) în care se toarnă un gel care
include Ac faţă de structura a cărei concentraţie dorim să o determinăm. Există un cod al
culorilor şi spre exemplu, plăcuţele care vor f utilizate pentru determinarea concentraţiei
de IgG au culoare roşie, pentru IgA culoarea este albastră, pentru sideroflină culoarea este
portocalie etc. În gel sunt perforate mici godeuri (3 mm diametru). Sunt necesare seruri de
cercetat şi un ser de referinţă în care se cunoaşte concentraţia diferitelor componente (spre
ex. câte 100 UI / ml pentru fecare dintre cele 3 imunoglobuline). Înainte de pipetarea
serurilor în godeuri se realizează diluarea acestora, diluţia find ¼ pentru IgG, IgA şi
sideroflină şi respectiv ½ pentru IgM, complement C3 şi alfa1-antitripsină. Diluţia serului de
referinţă se face în funcţie de proteina care urmează a f determinată. Cantitatea de ser
introdusă în fecare godeu este de 5 ml (un godeu pentru serul de referinţă şi restul pentru
serurile de cercetat).
261
După 10 minute de menţinere a plăcuţei pe masa de lucru aceasta se incubează la
37°C, cu stratul de gel poziţionat în sus, timp de 48 ore pentru IgA şi IgM şi respectiv 24 de
ore pentru celelalte componente. Citirea se realizează cu ajutorul unei rigle gradate, din
plastic, o riglă specială pentru această analiză (demonstrat în cursul lucrărilor practice). Se
va măsura iniţial diametrul cercului de precipitare din jurul godeului în care se afă serul de
referinţă iar rezultatul obţinut trebuie să corespundă aşteptărilor (de ex. 6 mm pentru IgG
care a fost diluat ¼ şi astfel are concentraţia de 25 UI / ml). În cazul că rezultatul este cel
aşteptat, se poate face direct citirea diametrelor cercurilor de precipitare pentru serurile de
cercetat; în caz contrar este necesară o „corecţie” (dacă spre exemplu diametrul este 6,5
mm în loc de 6 mm, din valoarea obţinută pentru serurile de cercetat se scad 0,5 mm).
După citirea diametrelor, se compară rezultatele cu cele puse la dispoziţie în tabele iar cifra
obţinută se înmulţeşte cu diluţia probei (spre ex. dacă obţinem o valoare de 50 UI / ml
pentru IgG, vom înmulţi cu 4 pentru a obţine rezultatul real).
20. 2. 2. 2. Imunodifuzia dublă radială (Ouchterlony)
Imunodifuzia dublă se bazează pe difuzia Ag şi Ac (unul spre celălalt) într-un gel.
Deoarece mărimea moleculelor de Ag şi Ac este mai mică decât diametrul porilor gelului,
iar distanţa parcursă de reactant într-un anumit timp este direct proporţională cu gradientul
concentraţiei sale şi invers proporţională cu greutatea sa moleculară, migrarea reactanţilor
unul spre celălalt determină formarea unor linii de precipitare la locul de întâlnire Ag-Ac. În
gelul transparent vor apărea linii opace, numărul lor corespunzând numărului sistemelor
Ag-Ac studiate.
Metoda certifcă prezenţa sau absenţa proteinei cercetate. Se pot evidenţia alfa-
fetoproteina, proteina C reactivă, beta-2 microglobulina, proteine Bence-Jones tip kappa şi
lambda, produşi de degradare ai fbrinogenului (PDF) etc. În micologie, prin imunodifuzie se
poate identifca prezenţa exoantigenelor fungice (Histoplasma capsulatum, Blastomyces
dermatidis, Coccidioides immitis etc) sau prezenţa Ac faţă de Ag fungice, spre exemplu în
diagnosticul serologic al unei aspergiloze invazive. Această metodă este încă frecvent
utilizată pentru determinarea specifcităţii anticorpilor antinucleari sau a altor anticorpi în
patologia umană.
Sunt necesare lame de microscop pe care se toarnă un gel de agar 1%, lama putând f
folosită pe parcursul unei zile (dacă acest lucru nu se poate îndeplini, lama trebuie păstrată
în cameră umedă, la temperatura frigiderului, pentru maxim o săptămână). În gelul de pe
lamă se perforează 3 grupe de godeuri, câte 7 godeuri în fecare grup (1 godeu central şi 6
godeuri periferice, fecare cu diametrul de 3 mm). Dacă spre exemplu dorim să determinăm
prezenţa proteinei C reactivă (CRP) în seruri de cercetat, avem nevoie de un ser cu Ac anti-
CRP, seruri de cercetat şi un ser de referinţă care conţine CRP. Numerotând godeurile
periferice, pipetăm Ac anti-CRP în godeul central şi ser de referinţă cu CRP în godeurile 1 şi
4. În celelalte godeuri pipetăm serurile de cercetat. Incubăm la 37°C, timp de 24 de ore, în
cameră umedă (într-o cutie Petri putem pune o bucată de vată îmbibată în soluţie salină
fziologică, alături de lama respectivă). Liniile de precipitare pot deveni vizibile după 2-4 ore
dar sunt mult mai clare după 24 de ore.
262
Pentru citire pot f necesare o lupă şi o sursă de lumină. Între godeul central şi godeurile
1 şi 4 (martori pozitivi) vor apărea linii (arcuri) de precipitare. În cazul în care de ex. în
godeul 2 există CRP, va apărea un arc de precipitare şi între godeul central şi godeul nr. 2.
Este certifcată prezenţa CRP în cazul în care cele 2 linii de precipitare (dintre godeul
central şi godeurile 1 şi 2) sunt una în continuarea celeilalte (imagine de „genunchi îndoit”).
20. 2. 2. 3. Dubla difuzie Elek
Această metodă permite depistarea capacităţii toxigene a unei tulpini
de Corynebacterium diphteriae. În cazul în care tulpina este toxigenă, toxina va difuza în
mediu iar după unirea cu Ac anti-toxină, complexele Ag-Ac vor da naştere unor linii de
precipitare.
Într-o cutie Petri turnăm mediul Elek şi după ce mediul s-a întărit, decupăm un şanţ pe
unul din diametre. În şanţul respectiv pipetăm 0,5 ml ser antidifteric, ser care conţine Ac
anti-toxină difterică în concentraţie de 1.000 UI / ml. Ac anti-toxină difterică vor difuza în
mediu. După circa 2 ore însămânţăm perpendicular pe şanţul cu Ac anti-toxină, de fecare
parte a şanţului, o tulpină de Corynebacterium diphteriae toxigenă (martor pozitiv), o
tulpină de Corynebacterium diphteriae ne-toxigenă (martor negativ) şi tulpini de cercetat,
câte un striu (de fecare parte a şanţului) pentru fecare tulpină. Incubăm la 37°C pentru 48
ore, dar urmărim zilnic apariţia culturii şi precipitatului (liniilor de precipitare). De-a lungul
liniilor de însămânţare apare cultură bacteriană. Din cultura
de Corynebacterium diphteriae toxigen, toxina (Ag) difuzează în mediu. Unirea dintre Ag şi
Ac duce la formarea unor complexe Ag-Ac care precipită, iar în mediu vor apărea linii de
precipitare în unghiurile dintre cultură şi şanţul cu Ac anti-toxină. În cazul în care apar linii
de precipitare în unghiul dintre una dintre tulpinile de cercetat şi şanţul cu Ac anti-toxină,
respectiva tulpină este toxigenă. Reacţia va f negativă pentru martorul negativ şi pentru
tulpinile de cercetat ne-toxigene.
20. 2. 3. Reacţii de precipitare în care difuzia în gel este
combinată cu migrarea în câmp electric
20. 2. 3. 1. Electroforeza proteică în gel
Electroforeza proteică în gel este folosită în laboratorul de imunochimie pentru
decelarea unor proteine patologice. Deplasarea proteinelor într-un strat de gel care este
supus acţiunii unui câmp electric se va realiza diferenţiat, pentru fecare structură proteică
în parte, în funcţie de greutatea moleculară şi încărcătura electrică a proteinelor. Pentru
vizualizare este necesară fxarea, uscarea şi colorarea liniilor de precipitare care corespund
fracţiunilor proteice din serul normal sau unor eventuale proteine patologice (ex. o
componentă monoclonală).
20. 2. 3. 2. Imunoelectroforeza
Se asociază electroforeza în gel cu imunodifuzia dublă (realizându-se separarea prin
electroforeză a proteinelor în mediu gelozat, urmată de o imunodifuzie dublă utilizând un
antiser corespunzător). Reacţia Ag-Ac se va vizualiza prin apariţia unor arcuri de
precipitare. Este o metodă foarte utilă în studierea purităţii unui Ag (sau Ac), însă în mod
curent are indicaţii didactice. Datorită faptului că în boala pneumococică prin urină se
263
elimină cantităţi destul de importante de Ag K, prezenţa acestuia poate f evidenţiată de ex.
prin imunoelectroforeză.
20. 2. 3. 3. Contraimunoelectroforeza
Contraimunoelectroforeza reprezintă o dublă difuzie în care deplasarea unul faţă de
celălalt a Ag şi Ac este accelerată de un câmp electric. Pe o lamă de microscop se toarnă un
gel de agar 1% şi se perforează 3 grupe de perechi de godeuri, faţă în faţă. Metoda poate f
utilizată pentru acele structuri antigenice care în câmp electric migrează către anod. Luând
în discuţie spre exemplu doar una dintre cele 3 grupe de perechi de godeuri, în godeurile
care vor f poziţionate spre catod (polul negativ) pipetăm Ag iar în godeurile care vor f
poziţionate spre anod (polul pozitiv) pipetăm Ac cunoscuţi, specifci Ag pe care dorim să-l
identifcăm. Reacţia este mai rapidă şi mai sensibilă decât dubla difuzie deoarece migrarea
celor doi reactanţi unul către celălalt este amplifcată de câmpul electric. Reacţia (apariţia
unei linii de precipitare între godeuri, în cazul în care în godeul catodic se găseşte Ag
presupus) poate f citită după numai 30-90 minute în loc de 24 de ore aşa cum se întâmplă
în dubla difuzie Ouchterlony. Metoda a fost utilizată din punct de vedere istoric pentru
identifcarea prezenţei Ag HBs. Se poate utiliza pentru identifcarea antigenelor capsulare în
lichidul cefalorahidian la pacienţi cu meningită acută (Haemophilus infuenzae, Neisseria
meningitidis, Streptococcus pneumoniae).
20. 2. 3. 4. Electroimunodifuzia
Electroimunodifuzia are la bază electroforeza probelor care conţin proteina-antigen,
într-un strat de gel, care conţine o cantitate constantă de anticorpi monospecifci (anti-
proteină antigen), rezultând zone de precipitare în formă de rachetă sau conuri, a căror arie
este direct proporţională cu concentraţia antigenului. Metoda are o sensibilitate mai mare
decât IDRS.
265
20. 5. 1. Reacţii de aglutinare
utilizate în diagnosticul de
laborator microbiologic direct
Tehnica de aglutinare se execută în a patra etapă a diagnosticului de laborator,
respectiv în etapa de identifcare, pe baza caracterelor antigenice. În momentul aplicării
acestei reacţii avem o serie de date pornind de la informaţiile clinice, paraclinice,
epidemiologice, s-a prelevat un anumit p.p., care s-a examinat din punct de vedere
microscopic şi a fost cultivat. Aşa cum am menţionat anterior, în vederea identifcării este
necesar să avem colonii izolate, cultură pură.
20. 5. 1. 1. Aglutinarea pe lamă
Spre exemplu, în cursul identifcării unei tulpini enterobacteriene (Shigella
spp., Salmonella spp., E. coli etc), după cultivarea p.p. pe medii selectivo-diferenţiale se
obţin colonii izolate şi din porţiunea superioară (bombată) a coloniilor izolate facem treceri
pe medii multitest (ex. TSI, MIU). În ziua următoare, avem deja mai multe elemente pentru
încadrarea tulpinii izolate într-o specie, dar, folosind spre exemplu cultura bacteriană
dezvoltată pe mediul TSI, putem face reacţia de aglutinare. În nici un caz nu se vor utiliza
pentru identifcarea pe bază de caractere antigenice tulpini mai „vechi” de 18-24 ore.
Pentru realizarea reacţiei de aglutinare sunt necesare următoarele: cultura de
identifcat (colonii de tip S, de 18-24 ore), soluţie salină fziologică, Ac cunoscuţi faţă de Ag
pe care dorim să le identifcăm (Ac polivalenţi, Ac monovalenţi de grup, Ac monovalenţi de
tip, după caz), lame de microscop curate, pahar Berzelius cu amestec dezinfectant etc.
Iniţial, pe o lamă de microscop curată şi degresată punem la una dintre extremităţile
lamei o picătură de soluţie salină fziologică, în care suspendăm un fragment din colonia de
identifcat în aşa fel încât să obţinem o suspensie omogenă, opalescentă. În cazul în care
suspensia rămâne omogenă, putem trece la etapele următoare; în cazul în care picătura
„se limpezeşte” şi apar grunji, tulpina este ne-tipabilă prin această metodă (apare
„aglutinarea nespecifcă”), ar putea f vorba de o tulpină care provine dintr-o colonie de tip
R. În următoarea etapă, la cealaltă extremitate a lamei, punem o picătură de ser cu Ac
cunoscuţi, de ex. polivalenţi şi realizăm o suspensie omogenă, opalescentă, a coloniei de
identifcat. Înclinăm lama de câteva ori, uşor, în toate direcţiile, pentru a favoriza contactul
dintre cei 2 reactanţi şi unirea complexelor Ag-Ac mici, solubile, pentru a forma reţele de
complexe Ag-Ac. În cazul reacţiei pozitive (corespondenţă între Ac cunoscuţi şi Ag pe care
dorim să îl identifcăm) picătura „se limpezeşte” şi apar grunji de aglutinare. Este indicat să
citim reacţia pe fond negru. De cele mai multe ori citirea se face cu ochiul liber însă în cazul
unor aglutinate de dimensiuni foarte mici poate f necesar să folosim o lupă, un microscop
sau un aglutinoscop. Pentru identifcarea diferitelor microorganisme există scheme care
orientează etapele de urmat (tabelele şi schemele respective se livrează de către
producători împreună cu serurile cu Ac specifci). Lamele pe care se fac reacţiile de
aglutinare, după terminarea reacţiilor se introduc în amestecul dezinfectant.
266
În cadrul lucrărilor practice vor f discutate aglutinările pentru identifcarea E.
coli, Salmonella spp. până la nivel de specie (conform clasifcării Kaufmann-White) şi
respectiv a grupurilor de Shigella spp. Tot prin aglutinare directă se mai pot identifca
tulpini de Vibrio cholerae, Haemophilus infuenzae tip b, tulpini de Brucella spp., tulpini
de E. coli entero-patogen, iar în cazul leptospirelor şi unor rickettsii apariţia aglutinării
trebuie verifcată cu ajutorul microscopului.
Reacţii de aglutinare indirectă se pot utiliza pentru detectarea în p.p. a streptococilor de
grup A sau B, pneumococilor, meningococilor, E. coli tip capsular K1, H. infuenzae tip
capsular b, pentru detectarea unor enterotoxine (staflococice, clostridiene etc), pentru
detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) sau a
unor virusuri. Tot prin tehnica de aglutinare indirectă se pot identifca exotoxine în fltratul
de cultură, streptococii de grup A-D, E. coliO:157, Legionella pneumophila, Listeria
monocytogenes etc.
20. 5. 1. 2. Aglutinarea în tuburi
Tehnica de aglutinare în tuburi se poate folosi pentru confrmarea unui rezultat pozitiv
la aglutinarea pe lamă sau atunci când rezultatul unei aglutinări pe lamă nu este sufcient
de clar. Vom avea la dispoziţie cultura pură de identifcat care se va prepara diferenţiat în
funcţie de tipul de Ag pe care dorim să-l identifcăm. Spre exemplu, dacă încercăm să
identifcăm Ag de tip O iar bacteria ar putea să prezinte şi Ag H sau Ag K (care ar putea
inhiba aglutinarea cu Ag O) cultura se va menţine 1-2 ore la 100°C pentru inactivarea Ag de
înveliş, după care se va trece la realizarea aglutinării în tuburi (o procedură asemănătoare
poate f necesară şi în cazul tehnicii de aglutinare pe lamă). Vom utiliza un şir de eprubete
în care vom introduce Ac cunoscuţi, care se vor dilua succesiv, binar, cu soluţie salină
fziologică. În tuburile respective vom adăuga o cantitate echivalentă de suspensie Ag (spre
ex., la 0,5 ml Ac vom adăuga 0,5 ml suspensie Ag). Incubarea se va face diferenţiat, în
funcţie de tipul de Ag pe care dorim să-l identifcăm (ex. 20 ore la 52°C pentru identifcarea
Ag O).
Reacţia este pozitivă în cazul apariţiei aglutinatelor (grunjoase - în cazul prezenţei Ag O,
foconoase - în cazul prezenţei Ag H etc). Reacţia de aglutinare în tuburi permite şi
verifcarea titrului la care are loc formarea complexelor Ag-Ac.
268
21. Reacţii care utilizează
sistemul complement
21. 1. Reacţia de fxare a
complementului (RFC)
Face parte dintre reacţiile al căror rezultat nu poate f vizualizat fără un artifciu tehnic,
în acest caz utilizarea unui sistem hemolitic indicator. Motivul pentru care este necesar
acest sistem indicator se datorează faptului că Ag este fe sub formă macromoleculară fe
este reprezentat de corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar complexul Ag-Ac format
nu devine vizibil cu ochiul liber. RFC a fost imaginată încă din anul 1901 de către Jules
Bordet şi s-a perfecţionat destul de mult de-a lungul timpului. Această reacţie este utilizată
în peste 100 de sisteme Ag-Ac, prin tehnici clasice sau tehnici care au suferit modifcări,
inclusiv introducerea micrometodelor RFC.
Se utilizează de ex. Ag cunoscute, puse în contact cu serul testat (în care căutăm Ac)
care este decomplementat (prin încălzire la 56°C timp de 30 minute) şi cu o cantitate
de C' de cobai (alexină); dacă în serul cercetat există Ac, ei se vor cupla cu Ag formându-se
complexe Ag-Ac, pe care se ataşează C', care se va consuma şi nu va mai acţiona în timpul
doi (nu va mai produce hemoliza). Într-un al doilea timp este adăugat un sistem hemolitic
(substrat indicator) compus din globule roşii de oaie (acoperite cu anticorpi IgG de iepure).
Dacă globulele roşii nu sunt hemolizate, înseamnă că a fost utilizat C' în cursul primului
timp şi reacţia este pozitivă (Ac prezenţi în serul de cercetat); dacă globulele roşii sunt
hemolizate, înseamnă că nu s-a utilizatC' care a rămas disponibil pentru a se ataşa de
sistemul hemolitic, reacţia este negativă (nu sunt prezenţi Ac în serul de cercetat).
Reacţia de fxare a complementului se poate folosi atât pentru identifcarea Ag cât şi în
diagnosticul serologic. Pentru că nu urmează să discutăm pe larg prima variantă, vom
enumera doar câteva dintre exemple, RFC permiţând identifcarea unor Ag rickettsiene,
chlamydiene, virale etc. În diagnosticul serologic, cea mai cunoscută metodă rămâne încă
RFC Bordet-Wasserman, utilizată încă în diagnosticul serologic al siflisului.
Subliniem faptul că RFC este o metodă laborioasă, în care nu se admit erori tehnice, dar
find executată corect este foarte exactă, are o mare sensibilitate şi specifcitate. Este de
asemenea una dintre metodele cu un mare grad de reproductibilitate.
Principiul RFC:
RFC se bazează pe proprietatea sistemului C' de a se fxa pe complexul imun Ag-Ac.
În prima fază a reacţiei se introduce serul de cercetat iar dacă acest ser conţine Ac
specifci faţă de Ag cunoscut se va forma un complex Ag-Ac, urmat de fxarea C', care se va
activa pe calea clasică şi nu va mai f „disponibil” pentru a se fxa pe sistemul hemolitic
indicator (hematii + Ac-antihematie). În cazul în care serul de cercetat nu conţine Ac
specifci faţă de Ag cunoscut, nu va avea loc formarea unui complex Ag-Ac în prima etapă a
RFC.
269
După introducerea în reacţie a sistemului hemolitic indicator, hematiile şi Ac-
antihematie se vor cupla, vor forma un complex imun iar C' „liber” se va fxa pe acesta.
După fxare va urma activarea C' şi respectiv liza hematiilor, hemoliza putând f examinată
cu ochiul liber.
Materiale şi reactivi necesari:
- serul de cercetat recoltat de la pacientul suspect sau o pereche de seruri, obţinute „în
dinamică”;
- seruri de referinţă (martor pozitiv şi negativ);
- Ag cunoscut (suspensie corpusculară sau soluţie coloidală, după caz);
- sistemul C' obţinut din ser proaspăt sau conservat recoltat de la cobai;
- sistemul hemolitic indicator format din
o hematii de berbec, soluţie 4%, valabil timp de o săptămână la 4°C şi
o ser hemolitic anti-hematii de berbec (obţinut prin injectări repetate de hematii de
oaie la iepurele de laborator, spălate cu soluţie salină fziologică) titrat şi conservat la 4°C;
- baie de apă cu temperatură reglabilă;
- plăci cu godeuri, tuburi de hemoliză, pipete diferite etc.
Tehnica de lucru:
Aşa cum am menţionat, tehnica de lucru este laborioasă şi nu va f prezentată în
totalitate, în cele ce urmează.
Serul de cercetat se va menţine 30 minute la 56°C, în baia de apă, pentru
inactivarea C' propriu.
Aşa cum am menţionat anterior, principial, RFC are loc în 2 etape (Figura nr. 1):
o în prima etapă se pun în reacţie C', serul de cercetat şi Ag cunoscut; există 2
posibilităţi: a. în serul de cercetat există Ac specifci, rezultând un complex Ag-Ac pe care
se va fxa C'; b. în serul de cercetat nu există Ac specifci, nu se formează complex Ag-
Ac, C' rămâne liber;
o în a doua etapă se introduce în reacţie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac
anti-hematie); există 2 posibilităţi: a. C'nu este liber, nu are loc hemoliza, b. C' se fxează
pe sistemul hemolitic, lizează hematiile şi observăm apariţia hemolizei.
Toţi reactivii utilizaţi trebuie standardizaţi, respectiv se vor realiza:
o omogenizarea suspensiei de hematii cu eventuală etalonare prin spectrofotometrie;
o titrarea serului hemolitic;
o titrarea C' în prezenţa Ag;
o titrarea „bidimensională” a Ag şi a serului de referinţă.
În RFC „fnală” se va proceda astfel:
o se diluează conform indicaţiilor din protocolul de lucru reactivii utilizaţi (serul
hemolitic, serurile de cercetat, Ag, serurile de referinţă, C');
o se repartizează în godeurile corespunzătoare serurile de cercetat, Ag şi C';
o pe o placă separată se prepară martorii (martor pentru sistemul hemolitic, martor
pentru C', martor pentru Ag, 2 martori pentru serul de referinţă, martor sigur negativ);
o plăcile se introduc până a doua zi la 4°C;
o a doua zi, plăcile se menţin la 37°C timp de 30 minute;
270
o se adaugă în toate godeurile sistem hemolitic;
o plăcile se menţin la 37°C timp de 30 minute;
o se pun plăcile la 4°C, până la sedimentarea hematiilor.
Există anumite diferenţe între tehnicile cantitative şi cele calitative, dar principiile sunt
aceleaşi.
Interpretare:
Iniţial se verifcă rezultatele apărute pentru martori (fe că este vorba de o metodă
cantitativă sau calitativă); spre ex. în cazul metodei calitative, în tubul martor pentru serul
de cercetat trebuie să fe hemoliză, la fel ca şi în tuburile martor pentru Ag,C' şi ser sigur
negativ. În tuburile martor sigur pozitiv şi martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie să
fe hemoliză.
În tuburile cu serul de cercetat, dacă apare hemoliza, înseamnă că nu există Ac iar
testul este negativ (lichidul din tub va avea un aspect roşu, limpede).
Testul este pozitiv atunci când în tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliză,
hematiile se depun formând un „buton” în partea inferioară a tubului (în serul de
cercetat există Ac). Pentru a stabili diagnosticul fnal, este necesar ca RBW să fe
confrmată prin reacţii specifce (vezi capitolul dedicat genului Treponema).
Control de calitate:
Cu privire la controlul de calitate am menţionat utilizarea martorilor, pentru fecare
reacţie.
În RFC utilizată în diagnosticul serologic, Ag cunoscut va f ales în funcţie de suspiciunea
de diagnostic. RFC cantitativă se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infecţiilor
produse de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia spp.,Treponema
pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp., diferite virusuri etc.
În scopul creşterii sensibilităţii şi specifcităţii se aleg proprietăţile Ag cunoscut, o
anumită temperatură „de incubare” (de ex. 4°C în loc de 37°C în RFC Kolmer) etc. Ac
fxatori de C' apar precoce în cursul bolii astfel încât identifcarea prezenţei lor poate
semnifca o infecţie acută sau recentă.
271
care determinantul pentru toxicitate sau pentru activitatea enzimatică respectivă este
acelaşi cu determinantul antigenic (epitop).
Reacţiile de seroneutralizare ar putea f utilizate în mai multe împrejurări, spre exemplu
în:
· diagnosticul microbiologic direct
o identifcarea Clostridium perfringens prin metoda plăcilor semineutralizate (vezi
anexa nr. 2 şi capitolul 51);
o testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test de
seroprotecţie, vezi anexa nr. 2);
o toxinotipia în cazul suspicionării unei toxi-infecţii alimentare cu Clostridium
botulinum (vezi anexa nr. 2 şi capitolul 50);
· diagnosticul serologic
o reacţia ASLO (vezi şi capitolul 28);
· prevenirea unor boli infecţioase prevenibile prin vaccinare şi evaluarea efcacităţii
vaccinale
o vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, dT, ATPA, ADPA; vezi şi anexa nr. 4);
o titrarea prezenţei Ac anti-toxine (difterică, tetanică etc);
o testarea prin IDR (intra-dermo-reacţie) a susceptibilităţii faţă de o anumită boală
infecţioasă care are la bază drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine.
Intradermoreacţiile Schick sau Dick, pentru a dovedi susceptibilitatea persoanei testate faţă
de o infecţie difterică sau scarlatinoasă au intrat în istoria medicinii.
· tratamentul / proflaxia unor boli infecţioase prin utilizarea de imunoglobuline
specifce omologe sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe.
274
23. Reacţii Ag-Ac cu reactivi
marcaţi
Reamintim că, în funcţie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare,
scopul urmărit există mai multe tipuri de reacţii Ag-Ac, şi anume:
· reacţii de precipitare
· reacţii de aglutinare
· reacţia de fxare a complementului (RFC)
· reacţii de seroneutralizare.
Dacă în cazul primelor 2 tipuri de reacţii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul
liber, cu ajutorul unei lupe etc) în cazul RFC şi RSN este necesară utilizarea unor „sisteme
indicator”. În continuare vom discuta despre reacţiile Ag-Ac în care pentru interpretare este
necesară marcarea reactanţilor, ceea ce se poate face:
- izotopic (radio immunoassay, RIA);
- enzimatic (enzyme-linked immunoassay, ELISA);
- fuorescent (fuorescent immunoassay, FIA);
- chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA) etc.
În prezent aceste metode sunt extrem de folosite având avantajul unei mari
sensibilităţi, sunt automatizate şi adaptabile la testări utile în toate disciplinele bio-
medicale.
277
suprafaţă pentru componenta C5a a sistemului complement, pentru CCF (crystal-induced
chemotactic factor) şi LTB4 (leucotriena B4), precum şi pentru peptidele din factorii
chemotactici. Aceste peptide servesc cuplării PMN-factor chemotactic şi astfel fagocitele se
îndreaptă spre locul unde acesta a fost produs. Ajungând la nivelul respectiv, PMN sau
macrofagele îşi pierd confguraţia rotundă, devin oarecum triunghiulare, cu baza spre
factorul chemotactic. Pentru ca modifcarea de formă să fe posibilă, are loc o rearanjare a
elementelor din citoschelet, microtubulii generează o polarizare „faţă-spate”, flamentele
de actină se acumulează în faţa şi în spatele celulei. Se asigură astfel forţele necesare
deplasării (motilitatea celulară depinde de polimerizarea monomerilor de actină în
flamente de actină). (Figura nr. 2)
Fagocitarea „agentului determinant” al procesului infamator (de ex. o structură bacteriană)
este favorizată de opsonizare. Materialul fagocitat este inactivat la nivelul fagolizozomilor
(atunci când acest lucru este posibil) şi / sau transformat în superantigen cu rol în
declanşarea unor cascade de reacţii imune. Până în acest moment, sistemul complement a
reprezentat elementul esenţial, fe că a fost activat pe cale directă sau pe cale alternă.
Fragmentele rezultate în cascada complementului participă la stimularea secreţiei
macrofagice (mediatori ai răspunsului infamator acut).
Activitatea leucocitelor PMN este facilitată şi de prezenţa unei întregi game de proteine
active de tipul moleculelor de adeziune celulară (selectine, integrine, ICAM-1 (intercellular
adhesion molecule), ELAM-1 (endothelial cell leucocyte adhesion molecule), GMP-140,
adezine, LECAM-1 (leucocyte endothelial cell adhesion molecule), ISCOM
(immunostimulating complex), PAF, MAC (membrane atack complex), MACIF (MAC
inhibitory factor), precum şi o serie de proteine sintetizate şi eliberate de fcat drept
reactanţi de fază acută (RFA). Dintre RFA am putea menţiona: proteina C reactivă (PCR
este secretată în mod predominant de fcat şi ţesuturile adipoase ca răspuns la stresul
infamator şi este reglat, în mare parte, de interleukina-6. Valoarea semnifcativă pentru
prezenţa infamaţiei este de 1mg/dl sau mai mult. Fiind de încredere şi uşor de dozat, este
foarte utilizată în practica medicală ca metodă de screening şi monitorizare a infamaţiei,
însă nu trebuie să uităm ca PCR poate f crescută şi în sarcină sau în arsuri etc). (1)
Alți RFA sunt:a2-macroglobulina, a1-antitripsina, a1-antichimotripsina, fbrinogenul,
haptoglobina, hemopexina, ceruloplasmina, componenta C3 şi amiloidul P seric. Am
subliniat cu caractere speciale RFA care se testează mai frecvent în practică, în ţara
noastră.
Aceste proteine de fază acută mediază procesul infamator, în cursul căruia se şi consumă.
Majoritatea sunt glicoproteine sintetizate de fcat (mici cantităţi sunt sintetizate şi de către
macrofage). Rolul RFA nu este pe deplin elucidat. Se cunoaşte, totuşi, că o serie de RFA
sunt implicaţi atât în procesele de necrobioză cât şi în cele de remaniere tisulară.
Informaţii cu privire la existenţa unui proces infamator putem obţine şi verifcând
valoarea VSH.
278
agresivitatea acestuia şi momentul declanşării „confictului imun”. Acesta din urmă
corespunde de regulă apariţiei semnelor clinice (de ex. febră).
279
care duce la apariţia leucotrienelor, de exemplu LTD 4, LTG4(care determină
bronhoconstricţie, vasoconstricţie sistemică, vasodilataţie la nivelul microcirculaţiei)
şic)calea epooxigenazei;
(Figura nr. 7, Căile ciclooxigenazei si liopooxigenazei)
- sistemul kinină-bradikinină;
- familia citokinelor;
- superfamilia interferonilor;
- sistemul extracelular „gunoier” al actinei. Actina este o proteină care se găseşte în
cantităţi mari şi este responsabilă pentru motilitatea celulară, schimbarea formei şi mărimii
celulelor (care depinde de proprietatea monomerilor de a polimeriza). După apoptoză,
actina eliberată are tendinţa de a polimeriza, ducând la apariţia de flamente de actină în
vase, cu un rezultat catastrofal (de exemplu în şocul septic, necroza hepatică etc). Există
însă şi un mecanism homeostatic ce are la bază două proteine plasmatice, gelsolina şi
proteina Gc (care sunt depăşite însă din punct de vedere funcţional în distrugerile masive).
B) Subetapa vasculară, în care au loc modifcări ale calibrului vaselor mici, ale vitezei de
circulaţie a sângelui, ale permeabilităţii vaselor mici din aria tisulară lezată. Iniţial se
produce vasoconstricţie, în decurs de secunde / minute (are loc un afux masiv de celule
sanguine proinfamatorii - neutrofle, monocite, eozinofle - sub acţiunea unor mediatori
solubili eliberaţi din zona tisulară afectată, care produc două categorii de efecte:
a) vasculare (dilataţie arteriolocapilară cu creşterea numărului de capilare active,
hiperemie, stimularea expresiei pe celulele endoteliale din zonă a unor receptori de
adeziune intercelulară astfel încât celulele sangiune recrutate vor adera la endoteliul
vascular prin cuplaj receptorial şi în fnal o fază de stază vasculară pasivă, cu hipoxie şi
creşterea permeabilităţii vaselor mici) şi
b) chemotactice (celulele proinfamatorii sunt atrase către ţesutul lezionat şi activate
metabolic)..
C) Subetapa exsudativă, în care se formează exsudatul infamator (plasma exsudată,
bogată în proteine şi LDH) la care se adaugă elementele fgurate extravazate, elementele
celulare mobilizate local şi produşi rezultaţi din diferite modifcări locale. Prin constituenţii
săi celulari şi moleculari, exsudatul asanează focarul infamator şi tinde să blocheze
procesul infecţios la poarta de intrare, constituind bariera fbrino-imuno-leucocitară.
24. 1. 4.Consecinţele activării mecanismelor implicate în procesul infamator
În funcţie de cascadele activate poate rezulta un anumit tip de infamaţie. Putem lua în
discuţie diferitele forme clinice evolutive (acută, subacută, cronică) precum şi formele
anatomoclinice.
24. 1. 4. 1.Evoluţia spre cronicizare se datorează agenţilor infamatori care au proprietatea
de a stimula în special sistemul efector timodependent, autoantigenelor sau persistenţei
stimulului infamator.
Infamaţia cronică este din ce în ce mai mult privită nu numai ca o consecinţă a unui risc
infecţios continuu, dar şi ca o parte integrantă a multor boli neinfecţioase, cum ar f
disfuncţiile autoimune, diabetul sau bolile cardiovasculare etc.
Astfel, nu este surprinzător că unele sisteme hormonale, cum ar f sistemul renină-
280
angiotensină (SRA), care a fost descris prima dată în contextul bolilor cardiovasculare, s-a
dovedit a f factorul major de reglare a răspunsului infamator. (4) (Figura nr. 8)
24. 1. 4. 2.Evoluţia spre vindecare presupune:
- asanarea focarului infamator (începe concomitent cu constituirea barierei fbrino-
leucocitare şi cu îndepărtarea resturilor celulare şi a eventualelor microorganisme care sunt
„agenţi determinanţi”); devine maximă după acumularea de leucocite PMN şi macrofage.
- vindecarea propriu-zisă începe relativ rapid în cursul procesului infamator; vindecarea
începe aproape concomitent cu fenomenele distructive, pe care tinde să le înlocuiască
pentru a conduce la una dintre variantele evolutive menţionate anterior.
Varianta cea mai favorabilă este reprezentată de vindecarea completă, anatomică (numită
şi „restitutio ad integrum”). Cealaltă posibilitate este reprezentată de evoluţia spre apariţia
unei cicatrici (cicatrizarea). Cicatrizarea apare în cazul unor infamaţii însoţite de fenomene
lezionale întinse, pierderi de ţesut şi eventual de infecţii şi cronicizarea infecţiei.
24. 1. 4. 3.Aspecte anatomo-clinice:
- infamaţii alterative în care predomină procesele distrofce şi necrobiotice (de exemplu în
miocardita difterică sau în miozita produsă de Clostridium spp.);
- infamaţii exsudative în care predomină procesele exsudative şi care se pot subîmpărţi în
infamaţii:
a) seroase (3-5% proteine, număr scăzut de leucocite, cu eozinofle), de exemplu în
pleurezia sau meningita produse deMycobacterium tuberculosis;
b) fbroase, destul de frecvent rezultate în urma unui proces infecţios, cu acumulare de
fbrinogen care determină apariţia fbrinei şi formarea de depozite care se organizează şi
duc la apariţia „aderenţelor”, care se organizează (de ex. în pneumonia cu Streptococcus
pneumoniae, în dizenteria bacteriană, în miocardita difterică etc.);
c) purulente, produse de exemplu de coci piogeni, precum Streptococcus
pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis etc., de ex. cu formarea de
abcese;
d) hemoragice, de exemplu în ciumă (produsă de Yersinia pestis) sau în pneumonia
hemoragică produsă de Bacillus anthracis(extrem de gravă, însoţită de hemoptizie şi
asociată frecvent cu pleurezie hemoragică şi adenopatie mediastinală importantă).
- infamaţii proliferative, având ca formă particulară granulomul, de aspect nodular (de
ex. apărute după infecţii cuMycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, diferite specii
de Brucella sau datorate prezenţei unui corp străin). (Video nr. 1, Infamaţia acută
http://www.youtube.com/watch?v=yQwxHmn6tvw); (Video nr. 2, Răspunsul
infamatorhttp://www.youtube.com/watch?v=aIzE-XsBrcg-)
Febra
Febra (pyrexia) este un semn şi simptom medical caracterizat de creşterea
temperaturii corpului o anumită valoare (ex. peste 37,8°C; însă este important de cunoscut
281
valoarea temperaturii bazale, pentru fecare subiect) datorită stabilirii unui alt punct de
echilibru la nivelul centrului reglator din hipotalamus. Se acompaniază de creşterea
tonusului muscular, tremurat (frison) şi paradoxal, de senzaţia de frig. Senzaţia de cald
apare odată ce noua temperatură de echilibru este atinsă. Etimologia termenului este
dublă: din grecescul pyretos (foc)şi din latinesculfevris (febră).
Febra este o dovadăa funcţionării sistemului imun, deoarece prin această modifcare de
temperatură, organismul încearcă să distrugă” bacteriile şi virusurile. Dar infecţiile nu sunt
singurul mecanism declanșator al febrei.
De obicei nu este nevoie de tratament antipiretic. Acesta se administrează doar în cazurile
în care temperatura crește foate mult sau pentru confortul pacientului.
Hipertermia, spre deosebire de febră, nu presupune un nou punct de echilibru, ci depăşirea
capacităţii de termoreglare (ex. o zi în soare înnăbuşitor fără consum adecvat de lichide)
sau supraîncălzirea (ex. după un efort fzic foarte intens).
Temperatura se măsoară clasic la nivel anal, la nivel axilar, în cavitatea bucală, sau la nivel
auricular. Vorbim despre febră dacă temperatura intrarectală depăşeşte 37,5-38,3°C și/sau
cea din cavitatea bucalădepășește 37,7 °C (”în mare” vorbim de subfebră între 37-38°C şi
de febrăpeste 38°C).
Persoanele maiîn vȃrsta au o abilitate scăzută de a genera caldură, astfel că și o
temperatură nu foarte crescută poate f expresia unei afecțiuni grave.
Cauze posibile de febră ar f: hemoragia intracraniană, administrarea anumitor
medicamente, boli ale țesutului colagen, distrucţii tisulare de diverse cauze (traumatisme,
intervenţii chirurgicale, iradieri, arsuri, infarcte), neoplazii, hemopatii maligne,reacţii
”alergice”, conficte de ordin psihologic, probleme neurologice, endocrine, metabolice sau
pot f de cauză iatrogenă (de cauză medicală).
Infecţia este ce mai comună cauză de febră.
Febra infecţioasăse instalează în: infecţii generalizate acute şi cronice fără semne de
localizare (în viroze, bacteriemii, rikettsioze, spirochetoze etc.); infecții generale cu
semne de localizare (tuberculoza pulmonară ganglionară, endocardita septică
etc.);infecţii localizate superfciale (celulite, plăgi infectate) sau profunde (fegmon,
abces subfrenic, abces apendicular, salpingite, pielonefrite, colecistite) etc.
Un trigger al febrei se numeşte pirogen. Pirogenul determină secreţia de PGE2, care
acționează la nivelul hipotalamusului (aria preoptică), determină un răspuns sistemic
(simpatic) de creştere a temperaturii (prin vasoconstricție, secuse ale muşchilor, catabolism
crescut şi creşterea activităţii diferitelor organe endocrine. Aceste modifcări duc şi la
creşterea TA. nn cazul nou-născuţilor, se mai obţine căldură în principal prin consumarea
grăsimii brune perirenale. Reversul presupune vasodilataţie şi transpiraţie. PGE2 provine
din acidul arahidonic, sub acţiunea PLA2, COX-2 şi PGE2-sintetaza.
Pirogenii pot f endogeni sau exogeni. LPZ-ul din peretele bacteriilor Gram -
(precum şi alte superantigene) reprezintă exemplul clasic de antipiretic exogen.
Pirogenii endogeni sunt citokinele. Il-1; Il-6; TNF-αsunt pirogeni majori. Alţi pirogeni: Il-8,
macrophage infammatory protein-α, IFN α, βsi γ.
Febra evoluează în 3 stadii:
282
a) stadium incrementi: stadiul de creştere a temperaturii, de la cȃteva minute la cȃteva
ore, zile sau săptămȃni.
b) stadium fastigium: stadiul de temperatura maximă reprezintă perioada de apogeu a
temperaturii.
c) stadium decrementi stadiul de scădere a temperaturii, de declin sau defervescenţă se
caracterizează prin creşterea termolizei.
Iată tipurile de febră, fecare patologie caracterizȃndu-se prin una din urmatoarele:
Febra prelungită. Orice stare febrilă care persistă mai mult de trei săptămȃni reprezintă o
febră prelungită.
Febra continuăeste o febră ridicată în care diferenţa dintre temperatura matinală şi cea
vesperală timp de mai multe zile nu depăşeşte 1 grad C. Ea este întȃlnită în pneumonia
francă lobară, febra tifoidă (în perioada de stare a bolii), tifosul exantematic, osteomielită
etc.
Febra remitentăeste febra ce se caracterizează prin aceea că diferenţa dintre
temperatura matinală şi cea vesperală depăşeşte 1 grad C. Ea apare în septicemii, supuraţii
pulmonare, tuberculoza pulmonara gravă, în perioada a doua a febrei tifoide.
Febra intermitentăse caracterizează printr-o alternanţă în timp de 24 de ore a
temperaturii normale cu febră mult ridicată. Cȃnd oscilaţiile devin foarte mari (ex. 3-5
grade C pe parcursul a 24 de ore) febra foarte ridicată oscilȃnd cu temperatura normală
sau chiar subnormală vorbim de febră hectică. Ea apare în supuraţiile pulmonare, infecţii
urinare şi unele septicemii etc.
Febra recurentăevoluează cu febră ridicată şi continuă timp de 5-8 zile alternȃnd cu
perioade afebrile. Ea apare în limfogranulomatoza malignă, tuberculoza pulmonară, infecţii
urinare sau biliare, leptospiroze etc.
Febra recidivantăeste o variantă de febră recurentă caracterizată prin faptul că
ascensiunile termice survin la intervale foarte variate şi îmbracă caracter de puseuri (o
întȃlnim în colangite, pielite, carcinom şi unele forme de tuberculoză etc.).
Febra ondulantăeste caracterizată prin ascensiuni termice ce se repetă periodic.
Ridicarea temperaturii este progresivă, iar defervescenţa este lentă pȃnă la afebrilitate sau
subfebrilitate urmată de cicluri repetate.
Febra de tip inverseste febra în care temperatura matinală este mai ridicată decȃt cea
vesperală. Apare în tuberculoza pulmonară gravă, supuraţii profunde şi infamaţii cavitare
etc.
Febra neregulatăse referă la febra care nu poate f încadrată în nici unul din tipurile
descrise şi care nu poate f descrisă așa cum s-a menționat mai sus. (3)
Febra de origine necunoscutăeste luată în considerație atunci când, după 1 săptămână
de încercări în a pune diagnosticul și a stabili etiologia febrei (clinic, paraclinic, alte metode
de laborator), nu am reușit să identifcă o cauză pentru creșterea temperaturii.
VSH-ul
283
VSH reprezintă rata la care sedimentează hematiile dintr-o probă de sȃnge cu
anticoagulant, într-o oră. nn mod normal hematiile dintr-o probă de sȃnge sedimentează
lent datorită încărcăturii de suprafaţă negative a acestora, care face ca celulele adiacente
să se respingă cȃnd distanţa intercelulară scade sub un nivel minim. nn anumite afecţiuni
care determină creşterea proteinelor de fază acută (alfa-globuline, fbrinogen) sau
creșterea valorii imunoglobulinelor, proteinele plasmatice se ataşează pe suprafaţa
hematiilor şi reduc potenţialul de suprafaţă determinȃnd agregarea hematiilor şi creşterea
sedimentării acestora.
Care sunt recomandările efectuării acestui test?
VSH poate f folosit ca test screening în suspiciunea unor reacţii infamatorii, infecţii, boli
autoimune, discrazii plasmocitare, dar şi pentru monitorizarea evoluţiei şi tratamentului în
anumite boli (ex. arterită temporală, polimialgie reumatică, artrita reumatoidă, reumatism
articular acut, lupus eritematos sistemic, boală Hodgkin, tuberculoză, endocardită
bacteriană). De reţinut: VSH nu este un test diagnostic pentru o anumită boală şi nu
trebuie utilizat pentru screening-ul pacienților asimptomatici.
1. Variații fziologice:
a. În menstruație: VSH creşte în timpul ciclului menstrual, atingȃnd nivelul maxim în faza
premenstruală şi scăzȃnd în timpul menstruaţiei.
b. În sarcină: VSH-ul creşte continuu începȃnd cu a 4-a săptămȃnă de sarcină pȃnă în a 3-a
săptămȃnă postpartum şi atinge un nivel maxim de pȃnă la 45 mm/h în prima săptămȃnă
postpartum.
c. la nou-născuţi: VSH-ul este scăzut datorită hematocritului crescut şi nivelului scăzut de
fbrinogen.
d. la femei vȃrstnice (70-89 ani) aparent sănătoase VSH poate atinge valori de pȃnă la 60
284
mm/h.
2. Factori care determină creșterea VSH:
a. Refrigerarea sângelui;
b. Anemia: datorita numărului scăzut de eritrocite; în anemia feriprivă creşterea VSH nu
corespunde numărului de eritrocite deoarece microcitoza concomitentă încetineşte
sedimentarea hematiilor;
c. Macrocitoza.;
d. Medicamentele: contraceptive orale, dextrani (datorită absorbţiei pe suprafaţa
eritrocitelor), anticonvulsivante, carbamazepină, cefalotină, ciclosporină A, dexametazonă,
etretinat, fuvastatin, hidralazină, indometacin, isotretinoin, sulfametoxazol, ofoxacină,
lomefoxacină, metisergid, misoprostol, procainamidă, propafenonă, quinină, zolpidem etc.
3. Factori care determină scăderea VSH:
a. Temperaturi >20-24o C;
b. Hiperglicemia;
c. Hiperlipoproteinemia (în special chilomicronii);
d. Hipofbrinogenemia;
e. Policitemia;
f. Leucocitoza;
g. Prezenţa de eritrocite anormale: microcite, drepanocite, echinocite, poichilocite,
stomatocite, acantocite, sferocite (prin scăderea suprafeţei necesare pentru agregarea
hematiilor);
h. Caşexia;
i. Medicamentele: aspirină, aur, corticotropină, ciclofosfamidă, glucocorticoizi,
hidroxiclorochină, metotrexat, antiinfamatorii nesteroidiene, penicilamină, sulfasalazină,
tamoxifen, trimetoprim etc.
Concomitent, macrofagele dezvoltă o serie de activităţi şi anume: pregătesc
superantigenul, eliberează în circulaţie monokine şi îşi expun (la suprafaţa membranei) Ag
HLA de clasa a II-a (vezi și capitolul 11). (Figurile nr. 4 și 5)
285
Starea de boală (manifestă clinic sau fără ca modifcările apărute să fe exteriorizate şi
constatabile de către medicul clinician) se datoreşte interacţiunii dintre microorganism
(bacterie, parazit, virus, fung, prion) - gazdă şi este urmată de apariţia unor simptome (de
ex. temperatură peste 39CC, cefalee, eliminarea unor scaune diareice etc.) şi de reacţii
funcţionale din partea gazdei (de ex. stare generală modifcată, senzaţie de febră, frisoane,
creşterea numărului de respiraţii pe minut, creşterea numărului de bătăi cardiace pe minut
etc). Infecţia nu este urmată obligatoriu de starea de boală, putând f inaparentă, subclinică
sau latentă. Poate apărea şi starea de purtător şi / sau eliminator de germeni.
Datorită infecţiei pot apărea, sau nu, manifestări foarte variate în funcţie de:
- agentul infecţios (factori de patogenitate, gradul de virulenţă);
- organismul gazdă (rezistenţa specifcă şi nespecifcă);
- mediul extern (factori geografci, climatici, sociali, economici etc).
Manifestări subclinice
a) Infecţia inaparentă nu se asociază cu semne sau simptome şi ar putea f decelată numai
prin examene de laborator. Spre deosebire de infecţia latentă, infecţia inaparentă este
limitată în timp şi poate contribui la crearea unei stări de imunitate (ex. infecţia
cu Neisseria meningitidis, infecţii cu Haemophilus infuenzae etc).
b) Boala subclinică se deosebeşte de infecţia inaparentă prin apariţia unor tulburări
funcţionale (febră, transpiraţii, dureri etc) şi chiar a unor leziuni organice (de multe ori fără
o simptomatologie distinctă / specifcă, dar există şi situaţii în care nu este decelat nici un
simptom, de exemplu în formele subclinice de hepatită virală acută).
c) Infecţia latentă este asimptomatică, agenţii patogeni putând persista timp îndelungat în
ţesuturile gazdei. După un timp variabil, infecţia latentă poate deveni evidentă clinic, de
obicei în urma acţiunii unor factori favorizanţi externi sau interni, proprii organismului (de
exemplu infecţia cu Mycobacterium tuberculosis care este un microorganism condiţionat
patogen, infectează circa o treime din populaţia globului dar produce tuberculoză la circa 8
milioane de persoane, pe an).
d) Starea de purtător de germeni se referă la bolnavul cu o stare infecţioasă, la persoana
afată în convalescenţă, înainte de „eradicarea” infecţiei suferite dar şi la persoanele
aparent sănătoase care adăpostesc germeni patogeni (de exemplu Salmonella typhi la
nivelul veziculei biliare, microorganismul putându-se „cantona” la acest nivel după o febră
tifoidă). Starea de purtător reprezintă atingerea unui echilibru relativ între cele două verigi,
de multe ori find însoţită de eliminarea în mediu a germenilor care au produs infecţia şi se
afă în diferite focare latente (precum în exemplul de mai sus, situaţie în care starea de
purtător se elimină doar prin extirparea veziculei biliare). De exemplu, în ţara noastră apar
din când în când izbucniri epidemice („outbreak”) de febră tifoidă, după inundaţii, dacă în
zona respectivă există un purtător de S. typhi, iar condiţiile igienico-sanitare pentru
prevenirea transmiterii pe calea fecal-orală nu sunt respectate. În cursul stării de purtător
există teste biologice şi imunologice care pot certifca prezenţa microorganismelor (direct,
de ex. după cultivare sau amplifcare genică şi / sau indirect).
Manifestări clinice
a) Infecţia locală, în care agenţii patogeni rămân cantonaţi la poarta de intrare şi în
286
vecinătatea acesteia, unde se multiplică (de exemplu în furunculul staflococic, infecţia
amigdaliană produsă de streptococul piogen).
b) Infecţia de focar este o formă particulară a infecţiei locale. Evoluează cronic, cu
manifestări locale minime (acestea putând chiar lipsi), adesea însă cu tulburări la distanţă
(subfebrilitate, mialgii, artralgii etc.) a căror apariţie încă nu a fost complet explicată.
c) Infecţia regională cuprinde un teritoriu mai extins, de obicei aferent porţii de intrare, prin
afectarea vaselor limfatice şi a ganglionilor limfatici regionali (de exemplu, infecţia
tuberculoasă, cu producerea de manifestări anatomo-clinice şi paraclinice relativ
caracteristice).
d) Boala infecţioasă cu manifestări clinice la nivelul întregului organism (sistemice), în care
germenii patogeni diseminează pe cale circulatorie (bacteriemie) în diferite ţesuturi şi
organe, la distanţă de poarta de intrare sau de focarul infecţios primar. Se descriu două
forme:
- boala infecţioasă ciclică, cu evoluţie regulată, în mai multe etape care se succed într-un
timp limitat, de exemplu febra tifoidă produsă de S. typhi.
- septicemia (conform nomenclaturii mai vechi) are evoluţie clinică neregulată, de obicei
foarte gravă, find defnită prin existenţa unei porţi de intrare, a unui focar septic (detectat
sau suspectat), bacteriemiei şi a unor „metastaze” septice care pot deveni focare
secundare; din focarele secundare au loc descărcări secundate de germeni în circulaţie.
Drept bacteriemie defnim prezenţa pasageră de germeni viabili în sânge. Bacteriemia nu
duce, de regulă, la apariţia de metastaze septice şi nici la apariţia unui tablou clinic
manifest. Bacteriemii pot apare de ex. după extracţii dentare sau intervenţii chirurgicale pe
focare septice, ca şi în multe dintre bolile infecţioase (exemplu în pneumonia cu
pneumococ, meningita cu meningococ etc; se explică astfel utilitatea recoltării de sânge
pentru hemocultură, cu toate că produsul patologic „principal” este reprezentat de spută în
primul caz şi lichid cefalorahidian în al doilea caz).
În momentul de faţă, s-a decis utilizarea noţiunii de sepsis, entitate care reuneşte
existenţa unui proces infecţios şi respectiv existenţa răspunsului infamator sistemic. Starea
de sepsis include prin defniţie două sau mai multe din următoarele elemente:
287
Sindromul de disfuncţie multiorganică (MODS, Multiorgan Dysfunction Syndrome)
reprezintă ultimul şi cel mai grav stadiu evolutiv, cu letalitate mai mare de 80%; este un
sindrom clinic, cu apariţia insufcienţei la 2 sau mai multe organe sau sisteme. Agresiunea
microbiană declanşează un răspuns infamator sistemic, care aşa cum a fost prezentat
anterior, din mecanism de apărare poate deveni un fenomen de autodistrugere.
După aspectul evolutiv, bolile infecţioase pot f:
- acute şi
- cronice (persistente), atunci când agentul patogen persistă şi acţionează vreme
îndelungată în ţesuturile gazdei, de exemplu în bruceloză.
Poarta de intrare
Pentru a produce infecţia (după parcurgerea etapelor menţionate anterior privind
„defniţia” infecţiei) şi a invada organismul gazdă după multiplicare sau prin intermediul
unor produse toxice specifce (ex. exotoxine), fecare microorganism patogen utilizează una
sau mai multe căi de pătrundere. Spre exemplu, vibrionul holeric (Vibrio cholerae) pătrunde
pe cale digestivă (ex. consum de apă contaminată), se multiplică şi produce manifestările
caracteristice la nivel intestinal (rolul esenţial revenind toxinei holerice) etc.
Difuzarea în organism a microorganismului patogen de la poarta de intrare se realizează în
diferite moduri şi pe mai multe căi:
- extindere locală în suprafaţă, ex. în cazul erizipelului produs de streptococul beta-
hemolitic de grup A;
- extindere în profunzime, ex. în miozita produsă de Clostridium spp. (C. septicum,
sporogenes, histolyticum etc.);
- extindere regională;
- diseminare sanguină, de exemplu în febra tifoidă (produsă de Salmonella typhi);
- diseminare pe cale nervoasă, de exemplu în infecţia cu virusul rabic.
Perioadele bolii infecţioase:
- Incubaţia reprezintă intervalul de timp din momentul infectării până la apariţia primelor
semne şi simptome ale bolii; durata incubaţiei variază în limite relativ stabile (ex. 1-5 zile în
dizenterie, circa 14 zile în febra tifoidă);
- Invazia este de obicei concomitentă cu debutul bolii, care poate f brusc (în plină stare de
sănătate) sau lent progresiv; în momentul invaziei este posibil să „surprindem” prezenţa
bacteriemiei (recoltăm sânge pentru hemocultură);
- Perioada de stare se caracterizează prin manifestările esenţiale şi deseori caracteristice
ale bolii;
- Încheierea evoluţiei bolii, care se poate face prin:
1. convalescenţă, în care boala clinică a încetat şi organismul îşi recapătă treptat
capacitatea de apărare şi revine la starea anterioară bolii infecţioase respective;
2. vindecare, urmată de stabilirea unui grad de imunitate; în unele cazuri imunitatea este
de durată, chiar şi pentru tot restul vieţii; instalarea răspunsului imun, precum şi statusul
imun în relaţie cu un anumit microorganism / produs al acestuia, pot f dovedite prin teste
de laborator (reacţii antigen-anticorp); pentru unele entităţi este stabilit nivelul de protecţie
(de ex. prezenţa anticorpilor în valoare de 0.01 UAI/mLasigură protecţie faţă de apariţia
288
tetanosului);
3. cronicizare (uneori prin atingerea unui echilibru microorganism şi gazdă; în alte situaţii
cronicizarea poate crea probleme importante) sau
4. exitus, fe datorită agresivităţii (virulenţei) particulare a tulpinii bacteriene implicate, fe
datorită incapacităţii organismului de a reacţiona în mod efcient.
289
Pacientei i s-a recomandat o internare de scurtă durată, ceea ce a acceptat.
După 36 ore, medicul de gardă din laboratorul de microbiologie clinică, examinând cultura
din secreţia vaginală a realizat frotiuri, a executat textul oxidazei şi testul superoxol şi a
început testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice.
Diagnosticul microbiologic a fost infecţie cu Neisseria gonorrhoeae, iar diagnosticul fnal a
fost cel de artrită gonococică.
Rezultatul testării sensibilităţii la antibiotice (antibiograma difuzimetrică standardizată) a
demonstrat o tulpină cu sensibilitate la majoritate antibioticelor şi chimioterapicelor testate,
inclusiv la penicilină. Pentru mai multă siguranţă, deşi în literatură a fost descris faptul că
„tratamentul minut” este efcient, s-a prescris penicilină G, 1 doză la 12 ore, timp de 10
zile. În a treia zi de la internare, starea generală a pacientei era bună, durerea articulară
diminuase semnifcativ, edemul şi erupţia erau abia perceptibile, curba febrilă a înregistrat
valori normale iar pofta de mâncare a revenit.
Comentarii cu privire la caz
Există statistici în literatura de specialitate internaţională care consideră că artrita
gonococică reprezintă una dintre cele mai frecvente cauze de artrită infamatorie localizată
la o singură articulaţie, la tineri. Nu există date statistice relevante la nivel naţional. În
aceste condiţii, trebuie să luăm în seamă datele puse la dispoziţie cu generozitate de CDC
(Center for Diseases Control and Prevention); pe site-ul CDC se discută că 3% dintre
cazurile de infecţie gonococică sunt însoţite de diseminarea N. gonorrhoeae, mai frecvent la
femei decât la bărbaţi. Infecţia gonococică se poate însoţi de diseminare, indiferent de
calea de pătrundere. Ca şi în cazul meningitei produsă de meningococ, un factor de risc
este reprezentat de defcienţe ale sistemului complement. Sindromul infecţiei gonococice
diseminate include în mod clasic: dermatită, sinovită, artrită migratorie („prinzând”
eventual mai multe articulaţii).
În funcţie de localizare, diagnosticul microbiologic se poate pozitiva după cultivarea unor
produse recoltate de la nivel genital, de la nivel articular sau poate f vorba de sânge.
O problemă care poate apărea este legată de tulpinile de gonococ rezistente la antibiotice
şi chimioterapice, ceea ce nu a fost constatat în această situaţie.
290
medicamentele antimicrobiene. În prezent, cea mai frecventă indicaţie pentru prescrierea
unui antibiotic într-o afecţiune oculară acută este reprezentată de către secreţia
mucopurulentă la acest nivel, cu recomandarea recoltării secreţiei respective şi realizarea
diagnosticului microbiologic direct, înainte de administrarea oricărui alt medicament.
Trebuie menţionat faptul că marea majoritate a presupuselor ulceraţii corneene nu sunt
altceva decât infltrate leucocitare sterile, care în nici un caz nu justifcă administrarea de
medicamente antimicrobiene. Este uimitor însă faptul că „tratamentul” cel mai frecvent al
acestora se face cu antibiotice locale!
291
amikacină, ciprofoxacină, carbenicilină şi asocierea piperacilină-tazobactam. S-a decis
instituirea unui tratament cu ampicilină plus gentamicină, pentru o durată de 3 săptămâni.
Nu a fost utilizată ampicilina în monoterapie, find cunoscut faptul că într-o astfel de
eventualitate ar f fost posibilă dezvoltarea rezistenţei nu numai faţă de acest antibiotic dar
şi faţă de alte antibiotice (ex. piperacilină).
Temperatura a rămas ridicată, iar pacienta a menţionat că simptomele nu se ameliorează,
în cursul primelor două săptămâni de terapie. Reactanţii de fază acută au diminuat ca
valoare, menţinându-se însă peste valorile normale. Examenul clinic realizat (repetat) de
către medicul stomatolog al unităţii nu a revelat o afecţiune care să pară a f în legătură cu
evoluţia insufcient de favorabilă, sub tratament. Totuşi, după ce mandibula a fost
examinată radiologic, cu foarte multă atenţie, a fost remarcată o situaţie patologică şi s-a
presupus existenţa unui granulom care nu era cunoscut anterior.
Luând în calcul aceste noi informaţii şi solicitând un examen de specialitate la o clinică
universitară cu profl stomatologic, s-a decis extracţia dintelui situat în vecinătatea
granulomului respectiv, chiuretarea zonei şi asanarea presupusului focar de infecţie.
Intervenţia stomatologică a avut rezultate foarte bune, după 14 ore de la aceasta
constatându-se diminuarea temperaturii. În următoarele 2-3 zile simptomele s-au ameliorat
semnifcativ. S-a decis continuarea tratamentului antibiotic în aşa fel încât durata totală să
fe de 4 săptămâni. După a treia săptămână de tratament probele biologice au revenit la
valori normale, starea generală a fost considerată ca find bună iar după patru săptămâni
de tratament pacienta a fost externată, vindecată.
292
infamatorii cronice (6). De asemenea Factorul de creştere a hepatocitului (HGFA) este
cunoscut a avea importanţă majoră în morfogeneza ţesuturilor, în regenerare şi în
progresul tumorilor, prin receptorii săi, MET. În vivo, HGFA activează, de asemenea,
proteina stimulatoare de macrofage, care prin receptorii săi RON, are roluri în recrutarea
macrofagelor, declanşarea procesului infecţios, supravieţuirea celulelor şi vindecarea
rănilor. Prin urmare, activitatea pericelulară a HGFA poate constitui un factor important de
reglare a activităţilor citokinelor multifunctionale în vivo. (7)
24. 3. 6. Farmacogenomică?
Aţi mai auzit termenul acesta? Dar farmacogenetică?
Credeţi că există vreo diferenţă? Si dacă da, ce legătură au ele cu infamaţia?
Să vedem.
S-a estimat că genele sunt responsabile de 20-95% din variabilitatea interpersonală cu
293
privire la răspunsul la medicamente. Primele investigaţii pe această latură au fost făcute în
1950, constituind baza farmacogeneticii, iar mai apoi, a farmacogenomicii. Termenii sunt
parţial sinonimi. Farmagenomica studiază efectul unui medicament în relaţie cu întregul
genom, în timp ce farmacogenetica, în relaţie cu o singură genă sau cu un anume set de
gene.
Principala ocupaţie actuală a farmacogenomicii şi a farmacogeneticii este detecţia unui
„profl de risc”, ce va permite probabil, 2 eventualități:
Să luăm un caz ... alegem... boala Alzheimer. Bine, bine....dar ”Alzheimer-ul acesta” nu
e o boală neurologică? Da, foarte bine. nnsă, ca și în situația multor altor boli, astăzi i se
recunoaşte şi o componentă infamatorie.
Iată cȃteva argumente pentru a susţine componenta de infamaţie cronică a bolii
degenerative Alzheimer:
Unii se bazează pe dovezi terapeutice, respectiv pe faptul că AINS ameliorează evoluţia (în
special AINS de tipul ibuprofen, indometacin, sulindac)
Alţii se bazează pe markeri biologici, arătând că PCR este crescută, cu valori în cele 3
quartile superioare ale valorilor, cu 25 ani înaintea diagnosticului bolii.
Sunt luate în discuție și teste genetice, spre exemplu mutaţia genei M694 pentru gena
Pyrin, care reprezintă un factor de risc pentru boala Alzheimer pentru populaţia
reprezentativă >65 ani din Italia. Şi se pare că este factor de risc şi pentru alte boli, cum ar
f infarctul miocardic.
Iată şi cȃteva exemple concrete ale farmacogeneticii/farmacogenomicii în cadrul bolii
Alzheimer, luate ca exemplu (nu poate f o abordare exhaustivă).
Asocierea dintre genotipul ApoE şi boala Alzheimer reprezintă una din întrebările ştiintifce
ridicate de dezvoltarea farmacogenomicii. Dar genotipul nu este numai „profl de risc”, ci şi
indiciu terapeutic. Tacrina (inhibitor de acetilcolinesteraza) se pare că încetineşte progresia
bolii pentru cei care nu sunt homozigoţi pentru ApoE4. Pe de altă parte, există şi studii cu
rezultate negative privind valoarea predictivă a genotipului ApoE. Un al doilea exemplu
relevant este cel al promotorului sintezei 5-LO. nn urmă cu câţiva ani s-a observat că
inhibitorii căii lipooxigenazei aveau efect numai pentru unii pacienţi, variabilitate în strȃnsă
legatură cu polimorfsmul 5-LO. S-a tras concluzia că putem stabili un tratament diferenţial,
în funcţie de genotipul pacientului, concluzie extrapolată de la astm la boala Alzheimer.
Un alt exemplu se referă la polimorfsmul TLR4, receptor ce se pare că este implicat in
fziopatologia bolii Alzheimer şi care ar putea f folosit pentru înţelegerea rolului proflaxiei
cu antibiotice în acest caz. (9)
294
24. 4. Verifcaţi-vă cunoştinţele
Alegeți A dacă 1, 2, 3 sunt adevărate; B dacă 1, 3 sunt adevărate; C dacă 2, 4 sunt
adevărate; D dacă 4 este adevărat, E dacă toate sunt adevărate (mențiunea este
valabilă pentru primele 2 întrebări)
nntrebarea 1:
Următoarele evenimente au loc în cazul declanşării unui răspuns infamator:
1).Modifcări la nivelul microcirculaţiei, cu creşterea calibrului vascular.
2).Creşterea permeabilităţii vaselor mici şi scăderea vitezei de circulaţie (stază).
3).Modifcări ale hemostazei şi respectiv marginaţia, diapedeza, migrarea leucocitelor.
4).Creşterea vitezei de circulaţie şi scăderea riscului trombotic.
nntrebarea 2:
Sunt false următoarele afrmaţii:
1).Febra este o dovadă a alterării sistemului imun.
2).Diferitele particularităţi structurale ale organismului gazdă sau ale unui anumit ţesut ar
putea explica (parţial) diversitatea fenomenelor infamatorii identifcate ca find produse de
către acelaşi agent etiologic.
3).Rezultatul detectabil prin metode de laborator al etapei de vindecare este eliberarea
unor factori chemotactici, a unor proteaze şi kinaze.
4).Modifcările fziopatologice apar independent de cauza infamaţiei sau, cu alte cuvinte,
indiferent de „agentul determinant”.
nntrebarea 4:
A).Fibrinogenul va f mereu normal într-o infamaţie de orice etiologie.
B).PCR este secretată de către adipocite și fcat în mod fziologic, însă valori mai mari de
1mg/dL indică existenţa unui proces infamator.
C).VSH-ul este un test diagnostic pentru infecţie localizată sau generalizată.
D).VSH-ul reprezintă rata la care sedimentează hematiile dintr-o probă de sȃnge coagulat,
295
într-o oră.
E).Ceruloplasmina şi amiloidul P seric nu sunt RFA (reactanţi de faza acută).
nntrebarea 5:
A).Coccii piogeni, precum Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria
meningitidis nu pot provoca infamaţii exsudative purulente.
B).Infamaţiile fbroase, care reprezintă acumularea de fbrinogen, cu apariţia fbrinei şi
formarea de depozite care se organizează şi duc la apariţia „aderenţelor”, nu apar în
pneumonia cu Streptococcus pneumoniae, în dizenteria bacteriană, în miocardita difterică.
C).Vindecarea propriu-zisă începe tardiv în cursul procesului infamator.
D).Infamaţii proliferative, având ca formă particulară granulomul, de aspect nodular, apar
în infecţia cu Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, infecția cu diferite specii
de Brucella sau datorate prezenţei unui corp străin.
E).nn miocardita difterică sau în miozita produsă de Clostridium spp predomină procesele
distrofce şi necrobiotice, care corespund infamației seroase.
296
Figura 1. Schemă generală reprezentând posibilile mecanisme de inactivare a limfocitelor
autoreactive, la nivelul organelor limfocitare centrale cât şi în periferie. Celulele sistemului limfocitar
provin dintr-o populaţie suşă (stem), comună limfocitelor T şi B, ce îşi are sediul în măduva
297
hematogenă. Limfocitele T migrează în timus pentru a continua dezvoltarea. Ambele seturi
limfocitare sunt expuse la antigene self, pentru care unele din aceste celule prezintă receptori.
Acestea au potenţial auto-reactiv, astfel încât, fără mecanisme de reglare, ar putea duce la apariţia
unor boli autoimune. Mecanismele implicate în reglarea răspunsului limfocitar sunt: apoptoza,
anergia, editarea de receptori, generarea de limfocite reglatorii şi supresia de către acestea a
răspunsului imunitar.
Toţi indivizii moştenesc, în mare, aceleaşi gene care codifcă receptorii antigenici.
Rearanjarea acestor gene duce la generarea unui imens repertoriu imunologic ce permite
organismului să răspundă faţă de o paletă foarte largă de antigene. Pentru a ajunge la
acest nivel de variabilitate, rearanjarea genelor codante are loc la întâmplare. (NB: Doar
genele codante pentru receptorii antigenici suferă procesul de rearanjare, nu întreg
genomul limfocitar.)
Calităţile antigenice care dictează statul tolerogen sau imunogen sunt rezumate în
Tabelul 1:
298
25. 2. Mecanisme generale ale
toleranţei
Toleranţa rezultă din recunoaşterea antigenelor de către subseturi limfocitare
specifce. Aceste limfocite, prezente şi la indivizii sănătoşi, recunosc antigene proprii de pe
APC, dar reacţionează într-o manieră care induce toleranţa şi nu un răspuns imun.
Toleranţa poate f indusă în limfocite imature în organe limfoide centrale (toleranţă
centrală), sau în limfocite mature în organe periferice (toleranţă periferică).
Toleranţa centrală reprezintă un proces intricat cu maturarea limfocitară. În cadrul
acestuia, limfocitele imature din organele limfoide centrale devin incapabile sa răspundă la
auto-antigene prezentate. Aceasta se referă la:
- antigene exprimate ubicuitar
- antigene circulante
prin expunerea acestora pe celule specializate în timus (antigenele poartă numele de timo-
dependente) sau captate direct de LB în măduva hematogenă (antigene timo-
independente). Toleranţa centrală nu este un mecanism perfect şi necesită consolidare prin
mecanismele toleranţei periferice (unele antigene sunt exprimate numai în ţesuturile
periferice).
299
25. 3. 1. Toleranţa LT Centrală
Pe parcursul maturării în timus, limfocitele T trebuie să posede două caracteristici
esenţiale, care stau la baza funcţionării sistemului imun. Astfel, reamintim conceptul
de dublă selecţie necesar pentru maturarea LT şi migrarea lor din timus:
- selecţie pozitivă – trebuie să recunoască receptorul MHC II, prezentat pe timocite
- selecţie negativă – nu trebuie să recunoască antigene expuse în timus
Pentru a asigura o selecţie cât mai bună a limfocitelor, este necesar ca în această etapă
limfocitele să întâlnească cât mai multe antigene self. Pentru a facilita acest deziderat,
timocitele exprimă antigene "periferice" după inducţia factorului de
transcripţie AIRE – AutoImmune REgulator. Trebuie reţinut că (aproape) toate celulele din
organism conţin molecule identice de ADN. Astfel, sub acţiunea promoterilor corecţi,
celulele pot exprima orice antigen prezent în organism.
300
semnalul transmis de TCR nu este sufcient pentru a induce răspunsul imun şi induce
toleranţa prin anergie sau apoptoză (Figura 2).
301
Anergia reprezintă o stare caracterizată de incapacitatea limfocitelor de a nu răspunde
la stimuli. Aceasta este indusă în urma interacţiunii cu un auto-antigen şi inducerea
toleranţei. S-au descris o serie de factori epigenetici şi morfologici (markeri de suprafaţă)
caracteristici limfocitelor anergice, dar ne vom opri asupra caracterelor funcţionale:
- scăderea expresiei de molecule TCR, creşterea turn over-ului acestor molecule
- recrutarea tirozin fosfatazelor cu rolul de a diminua semnalizarea TCR
- semnale inhibitorii de la molecule de tip CTLA4 care competiţionează cu CD28 pentru
legarea moleculelor stimulatoare B7.
Este posibil ca celulele dendritice rezidente în organe limfoide sau organe periferice să se
afe într-un stadiu imatur, exprimând puţine molecule B7. În lipsa semnalului costimulator,
LT devin anergice.