María Atienza Sierra

Gonzalo Delgado González

Blanca Ruiz Buezas

INTRODUCCIÓN
La función del sistema inmunitario es la de defendernos constantemente frente a
agresiones procedentes del exterior, así como del propio organismo, con el fin de poder
mantener la integridad biológica de nuestro organismo.
Todos los mecanismos de defensa de los cuales nuestro sistema inmunitario dispone y
pone en marcha para proteger a nuestro organismo se agrupan bajo el término
denominado respuesta inmune.
Hay dos tipos de respuesta inmune, aunque ambas sean distintas, actúan de manera
coordinada e integrada.
● La respuesta inmune innata, esta sería la natural y específica.
● La respuesta inmune adaptativa, la cual es adquirida y inespecífica.

Entre ellas es importante saber las diferencias aunque sean semejantes, para entender
mejor el funcionamiento del sistema inmune.
La principal distinción es que el Sistema Inmune Innato es el responsable de detectar el
peligro de forma bastante eficaz y rápida y de la activar el Sistema Inmune Adaptativo,
además, no solo lo activa sino que “integra” todas las informaciones posibles sobre el
agresor y pone a punto un plan de acción indicando al sistema inmune adaptativo que
“armas” movilizar y el lugar exacto del cuerpo donde deberán desplegadas.
Por otro lado el Sistema Inmune Adaptativo no puede reconocer a las moléculas
peligrosas, debido a que para ello depende del Sistema Innato.

En conclusión la principal diferencia es que el primero es capaz de detectar por si

mismo a los agentes patógenos, mientras que el segundo es dependiente del anterior.

Al ser el fármaco inmunosupresor indispensable para esta investigación, tratándose del

estímulo incondicionado, primero debemos conocer el concepto de inmunosupresión
como tal ya que está directamente relacionada con nuestra investigación. Podemos
definir a esta, como la inhibición de uno o más componentes del sistema inmunitario
adaptativo o innato, que pueden producirse como resultado de una enfermedad
subyacente o de forma intencional mediante el uso de fármacos u otros tratamientos,
como la radiación, con el propósito de prevenir o tratar el rechazo de un trasplante o
una enfermedad autoinmune.

También la pregunta de cómo se condiciona el Sistema Inmune es un planteamiento

requerido para el progreso de nuestra investigación, en la cual nos centraremos en
responder a continuación; se presentan investigaciones tempranas y recientes del
condicionamiento clásico del sistema inmunológico, uno de los más contundentes
fenómenos que evidencia la relación entre el sistema nervioso central y el
inmunológico. Los estudios muestran adquisición, extinción y discriminación en,
medidas de inmunosupresión y facilitación condicionada de la inmunidad celular,
generalmente se asocian estímulos condicionados gustativos y olfativos y en menor
cantidad estímulos audiovisuales y contextuales.
Como estímulos incondicionados (EI) se usaron en su mayoría fármacos
inmunosupresores o inmunoactivadores, antígenos, mitógenos o vacunas. Se miden
respuestas condicionales (RC) de la inmunidad humoral y celular, inespecífica y
específica y / o respuestas fisiológicas asociadas. Las RC que aparecen con la
reexposición son semejantes a las RI que provocan los EI aunque también se hallaron RC
compensatorias (opuestas a la RI). Se encontraron disociaciones entre las respuestas
conductuales de condicionamiento y las inmunológicas. Los estudios de animales con
enfermedades autoinmunes, transplantes, cáncer o alergias mostraron la importancia
clínica potencial que puede tener este fenómeno, ya que la exposición a los EC
aumentaron el tiempo de sobrevida y disminuyeron las respuestas de rechazo o la
alergia de estos animales a un nivel similar a los que recibieron siempre la droga
inmunosupresora. Los estudios con humanos son más escasos, aunque se demostró
facilitación condicionada y condicionamiento de respuestas alérgicas. Ya se conocen
algunos mecanismos neurofisiológicos de la inmunorregulación condicionada, aunque
falta determinar la generalidad de los mecanismos encontrados.

El concepto de una comunicación bidireccional entre el sistema nervioso central (SNC) y

el sistema inmune en humanos y roedores se conoce desde hace décadas y constituye
la base de los procesos de aprendizaje asociativo, como el condicionamiento conductual
de las respuestas inmunológicas [ M. Schedlowski, et al(2010)]. Aunque los mecanismos
detallados más allá de la inmunosupresión aprendida asociada a CsA aún no se han
aclarado por completo, los estudios previos demostraron que el condicionamiento de
las funciones inmunes con CsA depende de la adrenalina y el adrenoceptor β, mediada
centralmente por la corteza insular (CI) y la amígdala ( AM) e inducida por inervación
directa del bazo (M.S. Exton, C. et al (2002)

El objetivo principal es conocer a través del uso de animales en la investigación, en este

caso roedores, de qué manera las respuestas conductuales e inmunológicas
condicionadas pueden evocarse después de intervalos de retención prolongada en
ratas.
La Hipótesis planteada en esta investigación se trata de en encontrar en qué medida los
largos intervalos de producción de 14 y 30 días entre la adquisición y la recuperación,
afectan las respuestas conductuales y en particular las inmunosupresoras en un
paradigma de CTA(conditioned taste avoidance, el cual le podemos dar una definición
como; paradigma establecido para el condicionamiento conductual de las funciones
inmunes periféricas) establecido en ratas que emplean el fármaco inmunosupresor,
ciclosporina A como estímulo incondicionado y sacarina como estímulo condicionado.
Por lo tanto, las ratas aprenderán a asociar un sabor novedoso, como es la sacarina
(estímulo condicionado) con un fármaco inmunosupresor (estímulo incondicionado), el
cual será la ciclosporina A (CsA).
MÉTODO
Como la inmunosupresión aprendida no se limita a un solo evento de recuperación, sino
que se puede recuperar varias veces, y para una posible aplicación clínica de
inmunosupresión condicionada por el comportamiento, es importante saber si, y en qué
medida, los intervalos de retención prolongados están afectando la eficacia de las
respuestas inmunes aprendidas. Por ejemplo, en los modelos de roedores de
enfermedades autoinmunes inflamatorias, los animales se acondicionan antes de aplicar
el agente inductor de la enfermedad, sin embargo, se vuelven a exponer al EC durante la
recuperación cuando aparecen los primeros síntomas. Esta re-exposición al EC provoca
cambios en la respuesta inmune por aquellos inducidos formalmente por el fármaco
inmunocompetente (EI). (W. Klosterhalfen, et al (2008) 538–543)
Además, investigaciones establecidas anteriormente, nos ofrecen una prueba más de
que las respuestas inmunes condicionadas informadas, definitivamente no se deben a
los efectos residuales del medicamento CsA, sino que se inducen a través de procesos
de aprendizaje asociativo. Por lo tanto, la CsA debe eliminarse por completo y ya no es
detectable en el organismo 14 y 30 días después de la última administración de CsA
(M.Stalder, et al(2003)). Gracias a esta investigación nos evidenciará lo fundamental que
es para futuros análisis sobre el condicionamiento conductual de la inmunosupresión
para dilucidar los posibles mecanismos neuropsicológicos de las respuestas inmunes
aprendidas que forman la base para los respectivos futuros estudios traslacionales en
humanos.(G Pacheco-Lopez, et al(2005).
ADQUISICIÓN RECUPERACIÓN

GRUPOS MAÑANA NOCHE MAÑANA NOCHE

C. no evocado EC0 Sac/ Agua Agua Agua

Ciclosporina
A

CsA tratado EI Sac/ Agua Agua/ Agua

(ciclosporina Ciclosporina Ciclosporina
A) A A

Condicionado EC Sac/ Agua Sac Agua

Ciclosporina
A

*Paradigma de condicionamiento conductual y asignación grupal. Durante la

adquisición, las ratas recibieron tres ensayos de entrenamiento CS-US con CsA y
sacarina. La recuperación comenzó después de intervalos de retención de 14 y 30 días,
donde las ratas fueron expuestas a los estímulos correspondientes (A). Los animales en el
grupo de control no evocado condicionado (CS0), el grupo de control farmacológico (EI),
Así como el grupo condicionado (CS) recibieron sacarina combinada con inyecciones de
CsA (20 mg / kg, i.p.) durante la adquisición.*

Para la adquisición, se realizaron tres ensayos de aprendizaje con un descanso de dos

días (72 h) entre cada ensayo. En la sesión de la tarde, los animales de todos los grupos
recibieron agua. Ya sea 14 o 30 días después del último juicio de adquisición, comenzó la
fase de recuperación. Aquí, las ratas condicionadas (EC) fueron sometidas a la sacarina
(EC) en la mañana y al agua en las sesiones de la tarde. Los animales del grupo CS0
obtuvieron agua en ambas sesiones y, por lo tanto, sirvieron como control para excluir
los efectos residuales asociados a CsA. Durante la recuperación, los animales del grupo
de control farmacológico (EI) Recibieron agua seguida de la administración de CsA en la
sesión de la mañana mientras obtenían agua por la noche. El grupo de EI Permite la
comparación entre las respuestas inmunes condicionadas y la acción farmacológica del
fármaco en sí (Fig. 2A, B).

FIG 2A

*Inmunosupresión condicionada después

de 14 y 30 días de IR en ratas. La
producción de citocinas de IFN-γ se
evaluó en los sobrenadantes de
esplenocitos por ELISA a 14- (A) y 30 días
(B) RI después de tres reexposiciones de EC*

FIG 2B

RESULTADOS

Mediante el uso de un grupo de vehículos no descondicionados que recibió sacarina

junto con una inyección de solución salina durante la adquisición, seguida de una nueva
exposición a la sacarina durante la recuperación, se ha demostrado repetidamente que
ni la manipulación, el régimen de privación de agua en sí mismo, ni el estrés mediado o
interferido con el condicionado respuestas Además, los efectos observados en los
niveles de comportamiento e inmunológicos no diferían entre el vehículo y los controles
CS0(M. Hadamitzky, et al (2016).

Debido a esto, y para minimizar la cantidad de animales necesarios para obtener

resultados válidos, no incluimos un grupo de vehículos en el presente estudio. Para el
aislamiento de esplenocitos de rata, los bazos se interrumpieron con émbolos de jeringa
en solución salina equilibrada fría de Hanks (Invitrogen, Basilea, Suiza). La suspensión
celular se trató con PharM Lyse (BD Pharmingen, Allschwil, Suiza) para eliminar los
eritrocitos. Los esplenocitos se lavaron en medio de cultivo celular (RPMI 1640
suplementado con GlutaMAX I, HEPES 25 mM, FBS al 10% y gentamicina 50 μg / ml;
Invitrogen, Basilea, Suiza), se filtraron a través de un filtro de nylon de 70 μm, y la
densidad celular fue evaluado con un contador automático de células animales (Vet abc;
Medical Solution, Steinhausen, Suiza). Se incubaron esplenocitos aislados (5 x 106
células / ml) con 1 μg / ml de anticuerpo monoclonal anti-rata CD3 de ratón (clon:
G4.18; BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania) durante 48 h en placas de microtitulación
de fondo plano de 96 pocillos. en una incubadora humidificada (37 ° C, 5% de CO2)
como se describió anteriormente(M. Hadamitzky,et al (2016)). Los niveles de producción
de citocinas de IFN-γ se evaluaron en sobrenadantes de esplenocitos cultivados y
estimulados con anti-CD3 de 48 h aislados de animales de todos los grupos usando la
técnica ELISA (Invitrogen, Basilea, Suiza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism versión 7.0 (GraphPad
Software, La Jolla, CA, EI) Y los valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente
significativos. Para la comparación de los datos conductuales de CTA (adquisición y
recuperación), se utilizaron análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con medidas
repetidas con el grupo (tratamiento) como un factor y el tiempo (días) como un factor
dentro de los sujetos. Los datos de producción de citoquinas se analizaron mediante
ANOVA de una vía. Las comparaciones post hoc se realizaron utilizando las correcciones
de Bonferroni.

En la fase de adquisición, los animales fueron sometidos a tres ensayos de

acondicionamiento. Durante la primera prueba de adquisición, las ratas de todos los
grupos mostraron una respuesta neofóbica hacia el EC reflejada por un menor consumo
de líquido en comparación con los niveles de referencia. En la adquisición, ANOVA
mostró un CTA pronunciado después de tres ensayos de adquisición EC-EI (efecto de
tiempo; F (2, 106) = 37.22, p <0.001) (Fig. 1C) y las pruebas post-hoc revelaron una
ingesta de líquidos significativamente reducida en el día 3 en comparación con el día 1
en todos los grupos (p = 0.01 EI; p <0.001 CS0; p <0.001 EC)

DISCUSIÓN
La prueba post-hoc corregida de Bonferroni demostró una reducción significativa de la
ingesta de líquidos en animales con EC el día 1 y 2 de recuperación en el grupo de RI de
30 días en comparación con el grupo de RI de 14 días (p = 0,013 día 1; p = 0,017 día 2.
Para examinar si una inmunosupresión condicionada es evocable después de un IR de 14
y 30 días, se aislaron esplenocitos de rata en el día tres de recuperación, estimulados ex
vivo con anti-CD3 seguido de evaluación de la producción de citocinas interferón (IFN)
-γ en sobrenadantes de cultivos celulares. . La nueva presentación de la CS dio como
resultado una supresión significativa de la producción de IFN-γ en esplenocitos
estimulados con anti-CD3 de ratas condicionadas del grupo IR de 14 y 30 días,
respectivamente, en comparación con los controles (CS0) (unidireccional ANOVA; F (2,
23) = 7.61, p <0.01; ANOVA unidireccional; F (2, 25) = 8.09, p <0.01) (Fig. 2A – B).

Aplicando un paradigma de sabor inmune establecido, el presente estudio investigó si

las respuestas conductuales e inmunológicas condicionadas pueden evocarse después
de intervalos de retención prolongados en ratas. Los resultados mostraron que la
aversión aprendida contra la sacarina EC y, lo que es más importante, una
inmunosupresión condicionada aún era recuperable después de intervalos de retención
de 14 y 30 días. Estos hallazgos sugieren que las respuestas inmunes y conductuales
aprendidas inducidas durante el acondicionamiento conductual con CsA como EI.
Forman un rastro de memoria duradero en ratas.

Se ha demostrado que la fuerza de la CTA y las respuestas inmunes aprendidas se ven

afectadas por varios parámetros temporales, incluido el intervalo de tiempo de la
asociación EC-EI, la recuperación no reforzada de EC entre la adquisición y la evocación,
y depende en gran medida de la naturaleza de los estímulos aplicados. (A. Husband et al
, A conditioning model for im- munostimulation: enhancement of the antibody
responses to ovalbumin by behavioral conditioning in rats, et al,(1993))

Los datos experimentales en ratas que usaron ovoalbúmina o lisozima de huevo de

gallina como EI y sacarina como EC demostraron que la producción de anticuerpos
anti-ovoalbúmina o anti-HEL todavía se incrementó 15-39 días después de la
reexposición a la EC en animales condicionados (G. Chaouat et al. A conditioning model
for im- munostimulation: enhancement of the antibody responses to ovalbumin by
behavioral conditioning in rats,et al (2004) Los estudios de acondicionamiento centrados
en las respuestas conductuales utilizando cloruro de litio (LiCl) o ciclofosfamida como
solución de EI Y sacarina o ácido clorhídrico (HCl) como EC, informaron que la CTA
puede recuperarse después de intervalos de retención de 60 o incluso 90 días en
paradigmas de aprendizaje (W. Dragoin, et al(1973))

Sin embargo, si y en qué medida los largos intervalos de retención están afectando la
inmunosupresión condicionada son mucho menos claros. Demostramos a fondo en
estudios previos que aprendimos a evitar el sabor y, en particular, la supresión de las
citocinas específicas de células T esplénicas en regímenes de acondicionamiento
asociados a CsA podría recuperarse después de un corto intervalo de retención de 2 días
(M. Hadamitzky, et al (2016)). Primera evidencia indirecta, que indica que el rastro de
memoria de una CsA asociaron la CTA y la inmunosupresión condicionada duran más
tiempo por Wirth et al. 2011. Los autores demostraron que la inmunosupresión
condicionada podría recordarse sin un refuerzo segunda vez, 6 días después de la
primera recuperación. Por lo tanto, la inmunosupresión aprendida no se limita a un solo
evento de recuperación, sino que se puede recuperar varias veces (T. Wirth, et al
(2011)). Observamos una marcada inmunosupresión aprendida en animales
condicionados de ambos, los grupos RI de 14 y 30 días, y una CTA más pronunciada
después de un RI de 30 días en comparación con 14 días. En conclusión, nuestros datos
demuestran que las respuestas condicionadas a nivel conductual e inmunológico son
recuperables después de intervalos de retención a largo plazo de 14 y 30 días en un
paradigma que emplea CsA como EI. Y sacarina como EC en ratas. Los hallazgos
presentados son fundamentales para futuros análisis sobre el condicionamiento
conductual de la inmunosupresión para dilucidar los posibles mecanismos
neuropsicológicos de las respuestas inmunes aprendidas que forman la base para los
respectivos estudios traslacionales futuros en humanos.