TECNOLOGÍA MÉ DICA

MICROBIOLOGIA I

Antimicrobianos

Estudiante: Begoña Pizarro R.

Profesores: Ximena Lazcano
Roberto Flores.
Introducción
Los antimicrobianos son sustancias químicas producidas por microorganismos o
derivados sintéticos de estas capaces de actuar sobre los microorganismos (MO),
inhibiendo su crecimiento o destruyéndolos. Para que esto sea efectivo deben
cumplir con ciertos requerimientos como especificidad, eficacia “in vivo” y toxicidad
selectiva.

Los antimicrobianos se clasifican según origen, actividad sobre microorganismos,

espectro de acción, mecanismo de acción y estructura química.

Clasificación de antimicrobianos.

- Según su origen:

a) Biológico: sintetizados por un microorganismo

b) Sintéticos: compuestos cuyos núcleos naturales son sintetizados en un
laboratorio.
c) Semi-sintéticos: producto biológico mejorado en el laboratorio.

- Actividad sobre microorganismos:

a) Bacteriostáticos: Inhiben crecimiento del MO, deteniendo su ciclo

metabólico.
b) Bactericida: Matan al MO sin necesidad de destruirlos o lisarlos
c) Bacteriolíticos: Matan al MO lisándolo.

- Espectro de acción

a) Reducido: Antimicrobianos activos selectivamente frente a un grupo

determinado de bacterias
b) Amplio: presentan actividad frente a la mayoría de los grupos
bacterianos de importancia clínica.

- Estructura química

a) Son diferentes sustancias químicas con diferentes estructuras.

- Mecanismo de acción

a) Inhiben síntesis de la pared bacteriana o simplemente la destruyen.

b) Afectan la síntesis o destruyen la membrana celular
c) Alteran o inhiben la síntesis de proteínas
d) Inhiben síntesis de ácidos nucleicos

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 e) Alteran el metabolismo energético.

Tipos de antimicrobianos.

- Β-lactámicos: Comparten un anillo central de 4 B-lactam y su principal

modo de acción es la inhibición de la síntesis de la pared celular. Anillos
adicionales a la estructura o grupos agregados al anillo ß-Lactam determina
si el agente es penicilina, cefem, carbapenem, o monobactam.

- Penicilinas: El espectro de actividad de la penicilina primaria incluye no

productores de ß-lactamasa, gram positivos y algunos fastidiosos, y
bacterias gram negativas. Las acilamina penicilinas (ampicilina y
amoxicilina) tienen actividad específica contra más especies de
gramnegativos, incluyendo miembros de la familia Enterobacteriaceae no
productoras de ß-Lactamasa. Carboxi-penicilinas (carbenicilina y ticarcilina)
y ureido-penicilinas (mezlocilina y piperacilina) tienen un amplio y
considerable espectro contra gramnegativos, incluyendo actividad contra
Pseudomonas spp. Penicilinas penicilinasa resistentes (cloxacilina,
dicloxacilina, meticilina, nafcilina y oxacilina) que tienen un espectro
predominantemente gram positivo, incluyendo Staphylococcus spp
productor de penicilinasa.

- Cefemes: Incluyen cefalospirinas. Estos agentes a menudo son llamados

como "primera", "segunda", o "tercera" generación de cefalosporinas,
basado en la extensión de su actividad contra la mayoría de bacterias Gram
negativas resistentes a antibióticos.

- Carbapenemes: Difieren ligeramente en estructura de las penicilinas y son

mucho más resistentes a la hidrólisis por ß-Lactamasa, lo que da a ellos un
amplio espectro de actividad contra muchas bacterias gram positivas y
gram negativas.

- Monobactams: Estos antibióticos son los únicos que estructuralmente

muestran una significativa actividad sólo contra bacterias gram negativas
aeróbicas. Aztreonam es el único monobactam aprobado para uso por la
FDA.

- Glicopeptidos: comparten una compleja estructura química y el modo de

acción es la inhibición de síntesis de la pared celular en sitios diferentes a
los sitios de acción de los ß-Lactámicos. La actividad de este grupo es
dirigida primeramente a bacterias gram positivas. La vancomicina es un

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 agente aceptado para tratamiento de infecciones por bacterias gram
positivo en pacientes alérgicos a la penicilina y es útil para terapia en
infecciones causadas por bacteria gram positivas ß-lactamasa resistentes,
por ej. Staphylococcus aureus (MRSA) y algún Enterococcus spp

- Aminoglicosidos: Inhiben la síntesis de proteínas bacterianas a nivel del

ribosoma. Son usados primeramente para tratar infecciones por bacterias
aeróbicas gram negativas o en combinación sinérgica con antibióticos
activos en la pared celular contra algunos Gram positivo resistentes, por ej.:
Enterococcus spp.

- Macrolidos: estructuralmente relacionados a antibióticos que inhiben la

síntesis proteica a nivel del ribosoma. Hay varios miembros que pueden ser
considerados para pruebas contra fastidiosos Gram positivo o
gramnegativo. Drogas de este grupo están estrechamente relacionadas
entre sí, con pocas excepciones, solo es necesario probar de rutina la
tetraciclina

- Tetraciclinas: Inhiben la síntesis proteica a nivel del ribosoma de ciertas

bacterias Gram negativas y Gram positivas. Las drogas en este grupo están
estrechamente relacionadas y, con pocas excepciones, sólo la tetraciclina
puede requerir ser probada de rutina

- Quinolonas: Grupo de compuestos incluye a un número de agentes

estrechamente relacionados que funcionan primeramente por inhibición de
la actividad de la DNA girasa de muchas bacterias Gram negativas y Gram
positivas. Por algunas diferencias en el espectro se requiere probarlos
individualmente.

- Sulfanoaminas y trimetropin: Este grupo de compuestos abarca varios

agentes quimioterapéuticos con espectro similar de actividad resultante de
la inhibición del metabolismo bacteriano. Sulfisoxazole es la sulfonamida
más usada en el tratamiento de infecciones en el tracto urinario, y debe
probarse in vitro. Sulfometoxazole es usualmente probada en combinación
con Trimetoprim.

Los antimicrobianos son usados para pruebas de susceptibilidad en los

laboratorios. En las tablas de antimicrobianos sugeridos de la CLSI se indica las
drogas que deberían usarse de rutina en muchos laboratorios clínicos. La tabla
está dividida en columnas basadas en organismos específicos o grupos de

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organismos, y la variedad de drogas están indicadas por prioridad para realizar la
prueba.

Pauta para pruebas rutinarias de antimicrobianos

- Grupo A: Los agentes de este grupo se consideran apropiados para

incluirlos en la rutina. En el informe de rutina deben incluirse todos.
- Grupo B: agentes que son importantes clínicamente, particularmente para
infecciones nosocomiales. Deben ser informados sólo selectivamente,
cuando el organismo es resistente a agentes de la misma clase, en el
Grupo A.
- Grupo C: Comprende agentes antimicrobianos alternativos o
suplementarios. Son usados generalmente para tratamiento de pacientes
alérgicos a drogas primarias.
- Grupo U: Ciertos agentes antimicrobianos (por ej. Nitrofurantoina y algunas
quinolonas), que están limitadas a tratamiento de infecciones del tracto
urinario.
- Grupo O: (otros), incluye agentes que tienen indicación clínica para el
grupo de organismo pero no están indicados en los test de rutina.
- Grupo Inv: (Investigación), incluye agentes que se están investigando y
aún no han sido aprobados por la FDA.

En este práctico se realizó el control de calidad para las cepas E. coli ATCC 25922
y la cepa S.aureus ATCC 25923 con diferentes antimicrobianos (merepenem,
ampicilina sulbactam, cefoxtaxina, amikilina, eritromicina, oxacilina y penicilina).

Existen diferentes metodologías para identificar la susceptibilidad del

antimicrobiano, difusión, epsilometría y microdilución

- Difusión en disco: En este método se utiliza un disco que poseen una

cantidad específica de antimicrobiano. Este es aplicado a la superficie del
agar inoculado con el microorganismo. Este antimicrobiano genera una
zona de inhibición en la que la concentración del antimicrobiano inhibe el
crecimiento bacteriano.
- Epsilometría: es un método que combina los principios de la difusión en
disco y la dilución en agar en el estudio de la susceptibilidad in vitro. Se
compone de una tira sólida de un material inerte, con una gradiente
exponencial continua del antimicrobiano problema en la cara inferior, y una
escala de lectura en su cara superior. La gradiente obtenida cubre las
concentraciones adecuadas para realizar la CIM del antimicrobiano. La tira
se coloca sobre una placa inoculada, similar a un antibiograma por difusión,
y luego del período de incubación, se observa una elipse de inhibición cuyo
borde intersecta longitudinalmente la tira en una posición donde una
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 concentración específica del antimicrobiano causa la inhibición del
crecimiento bacteriano

- Micro-dilución: involucra pequeños volúmenes de caldo. La prueba se realiza en

microplacas de plástico estériles, cada pocillo debe contener 0,1 ml de caldo. Para
obtener las diluciones, se preparan en un volumen de por lo menos 10 ml y se coloca
0.1 (+/- 0.02) ml en cada uno de los pocillos mediante un dispositivo mecánico. Cada
microplaca debe incluir un pocillo de control de crecimiento (sin antibiótico), y un
control negativo (caldo sin inocular). Las microplacas, con las diluciones cargadas, se
deben sellar inmediatamente después de preparadas en una bolsa de plástico y
guardarse a -20º C hasta el momento de su utilización. Las microplacas con las
soluciones de antibiótico no deben ser guardadas en congeladores no frost y una vez
descongeladas, no debe volver a congelarse

Materiales.
 Agar Müller-Hinton
 Tórulas estériles
 Pinzas
 Tubos tapa rosca NaCl 0,85% estéril
 Tubos de tapa rosca estériles
 Estándar McFarland 0,5%
 Agitador vortex
 Discos de antimicrobiano
 Placas de agar sangre con E.coli ATCC 25922 y S.aureus ATCC25923
 Cepas problemas (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis,
Escherichis coli, Klebsiells pneumonia, Enterobacter cloacae, Klebsiella

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 pneumoniae Blee +, E.coli Blee +, E.faecalis ATCC 29212, S. aureus MR y
E. faecalis VR)
 Tubos de caldo con agar Mueller-Hinton (CMH)
 Micro-placas fondo U
 Pipetas de vidrio estériles (1 ml, 5 ml y 10 ml)
 Pro-pipetas, pipetas Pasteur estériles y bulbos de gomas
 Micropipetas de 100ul y 1000ul
 Asas
 Gradillas
 Solución stock de vancomicina 5120 ug/ml

Procedimiento
Prueba de susceptibilidad antimicrobiana por difusión en agar :
1) A partir de las cepas de referencia ATCC se realizará la prueba de
susceptibilidad antimicrobiana y su control de calidad
2) Reunir el material
3) Seleccionar 3 a 4 colonias bien aisladas y del mismo tipo de morfología de
las cepas control. Se toca la colonia por arriba con un asa y el crecimiento
se transfiere a un tubo con 4 a 5 ml de un medio de cultivo adecuado.
4) Agitar en el Vortex
5) Ver si se alcanza la turbidez adecuada del estándar McFarland 0,5
comparándolo con este. Si esto no ocurre, agregar más colonias.
6) Esperar 15 minutos para ajustar la turbidez
7) Sumergir una tórula de algodón en la suspensión del inoculo.
8) Inocular la superficie de la placa del agar Müller-Hinton por rayado con la
tórula sobre toda la superficie.
9) Seleccionar los sensi-discos a utilizar y colocarlos en la superficie del agar
con una distancia aproximada de 2,4 cm (24mm). Presionarlos para
asegurar el contacto con la superficie del agar.
10) Colocar las placas en una estufa a 35°C.
11) Examinar cada placa después de 16 o 18 horas puestas en la centrifuga. Si
el organismo de prueba es un Staphylococcus spp. o Enterococcus spp., se
requieren 24 horas de incubación y luz transmitida (placa se mantiene hacia
la luz).
12) Medir los diámetros de los halos colocados en las placas (el margen se
toma desde el área en donde no se observa crecimiento)
13) Anotar resultados.
14) Seleccionar dos agar Müller-Hinton
6
 15) En uno de los dos agares seleccionar una cepa para el control de calidad
(E.coli ATCC 25922 y S.aureus ATCC25923) y en una de las cinco cepas
problemas disponibles
16) Reunir el material necesario y repetir los pasos 3, 4, 5, 6, 7 y 8.
17) Seleccionar 5 antimicrobianos para cada antibiograma según los criterios
establecidos.
18) Incubar las placas durante 16-18 hrs. A 35-37°C con una atmosfera
normal.
19) Medir el diámetro de los halos de inhibición. Evaluar resultados del control
de calidad.

Prueba de susceptibilidad por epsilometría:

20) Realizar esta prueba mediante tiras con gradientes de concentración.
21) Seleccionar una sepa problema
22) Reunir el material necesario
23) Sembrar en rayado y luego seleccionar 2 antimicrobianos disponibles.
24) Incubas durante 16 – 18 horas. A 35-37°C en atmosfera normal.
25)Realizar lectura de los halos de inhibición e interpretarlos

Prueba de susceptibilidad antimicrobiana por micro-dilución:

26) Preparar 5 ml de solución de trabajo de 128 ug/ml del antimicrobiano a
partir de la solución stock de 5120 ug/ml en CMH
27) Preparar un inoculo a partir de un cultivo fresco
28) Seleccionar las sepas que se usarán tanto en la prueba como control
29) Realizar una suspensión 0,5 McFarland de la bacteria en solución salina
estéril para obtener la concentración requerida de 1X108 UFC/ml
30) Realizar una dilución 1:100 a partir de la solución McFarland; adicione 0,05
de la suspensión a 4,95 ml de CMH
31) Ahora la concentración es de 10 6 UFC/ml. Cuando 50 ul de esta
suspensión se añaden a cada pocillo de la placa, la concentración final de
la bacteria sera de 5x104 UFC/ml
32) Adicionar 50 ul de la bacteria seleccionada a cada uno de los 12 pocillos.
En el pocillo 11 adicione solamente la bacteria y diluyente, esto servirá de
control de crecimiento. El volumen final en cada pocillo debe ser de 100 ul.
33) Las placas deben ser inoculadas dentro de los primero 15 min de la
estandarización del inoculo.
34) Incubar a 35°C durante 20-24 horas.
35) Interpretar los resultados.

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Resultados
Prueba de susceptibilidad antimicrobiana por difusión en agar.
 Cepa control E.coli ATCC 25922

Antimicrobiano Contenido Diámetro Cumple Observaciones

disco del halo Sí No
(mm)
Merepenem (mem)
10 ug 30 
Grupo B
Ampicilina El halo debe
sulbactam (sam) 20 ug 33  estar entre 19 y
Grupo A 24 mm
El halo debe
Cefotaxima (ctx)
30 ug 20  estar entre 29 y
Grupo B
35 mm
Amikacina Grupo
30 ug 22 
B

 Cepa control S.aureus ATCC 25923

Contenido Diámetro del Cumple

Antimicrobiano Observaciones
disco halo (mm) Sí No
Eritromicina (e)
15 ug 30 
Grupo A
El halo debe
Oxaciclina (ox)
1 ug 32  estar entre 19 y
Grupo A
24 mm
Penicilina (P)
10 units 37 
Grupo A
El halo debe ser
Cefotaxima
30 ug 31  entre 23 a 29
(Fox) Grupo C
mm

 Control de calidad a elección: E.coli ATCC 25922

Antimicrobiano Contenido Diámetro Cumple Observaciones

disco del halo Sí No
(mm)
Merepenem (mem) 10 ug 30 

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 Grupo B
Ampicilina El halo debe
sulbactam (sam) 20 ug 33  estar entre 19 y
Grupo A 24 mm
El halo debe
Cefotaxima (ctx)
30 ug 20  estar entre 29 y
Grupo B
35 mm
Amikacina Grupo
30 ug 22 
B
El halo debe
Ampicilina (a) 10 ug 31  ser entre 16 y
22 mm

 Cepa Problema: E.coli blee +

Diámetro
Contenid Interpretación Observacio-
Antimicrobiano del halo
o disco S I R nes
(mm)
Amikacina (ak)
20 33 
Grupo B
Ampisilina (a)
10 25 
Geupo A
Ampicilina
sulbactam 20 26 
(sam) Grpupo B
Cefoxitina (kf)
30 25 
Grupo A
Gentamicina
10 27 
(cen) Grupo A

Prueba de susceptibilidad antimicrobiana por epsilommetría

 Cepa Kleibsiella pneumoniae

Interpretación
Antimicrobiano CIM ug/ml Observaciones
S I R

Ampicilina 65 ug/ml
 Sin crecimiento de
Cefotaxima _
halo de inhibición

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Prueba de susceptibilidad antimicrobiana por micro-dilución
 Cepa S.aureus MR: en los 12 pocillos hubo turbidez y precipitado de la
bacteria, pero la concentración de colonias precipitadas era mayor a
medida que aumentaban los números, es decir en el pocillo 1D había
menos precipitado de bacterias que en el pocillo 12D

Discusión
En la placa sembrada con E.coli, dos de los cuatro discos dieron resultados dentro
de lo esperado, el disco con merepenem que genero un halo de 30 mm y el disco
con amikacina que genero un halo de 22mm.Los otros dos discos, uno con
amikasina sulbactam y el otro con cefotaxima, generaron un halo de 33 mm y 20
mm respectivamente. Estos dos últimos antimicrobianos deberían haber generado
un halo entre 19 y 24 mm en el caso del seni-disco ampicilina salbactam, mientras
que el sensi-disco con cefotaxima debería haber generado un halo entre 29 y 35
mm.

Con respecto a la ampicilina, perteneciente el grupo de las penicilinas; a la

ampicilina-sulbactam que pertenece al grupo de la combinación de ß-lactamasa/
inhibidor de ß-lactamasa; a la cefotaxima del grupo de los cefemes y la
gentamicina y amikacina pertenecientes al grupo de los aminoglicosidos, podemos
afirmar que todos estos antimicrobianos son sensibles a la E.coli ATCC 25922 ya
que forman un halo mayor o igual al indicado por Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI) según cada antimicrobiano.

En la placa sembrada con S.aureus ATCC 25923 solo dos de los discos dieron
resultado dentro de lo esperado, el disco con eritromicina, que generó un halo de
30 mm y el disco con penicilina que generó un halo de 37mm. Los otros dos
discos, uno con oxaciclina y el otro con cefoxitina generaron un halo de 32mm y
31 mm respectivamente, siendo que el antimicrobiano oxaciclina debiera haber
generado un halo entre 18 y 24 mm y el antimicrobiano cefotaxima debería haber
generado un halo de 29 - 35 mm.

Con respecto al halo generado por la eritromicina podemos decir que es un

macrólido sensible a S.auresu ya que su halo generado es ≥ 23mm.

El antimicrobiano oxaciclina, perteneciente a las penicilinas es sensible a S.aureus

ya que el halo formado es ≥ a 22mm.

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La penicilina resulta ser sensible a S.aureus, pero se realice la prueba para
detectar la producción de B-lactamasas de los estafilococos para los cuales la CIM
de penicilina es ≥ 29 mm antes de informar sobre el aislado como sensibles a
penicilina. Podemos decir que para las infecciones graves que requieren
tratamiento con penicilina, los laboratorios deben realizar la prueba de MIC y
prueba B-lactamasa en todos los aislamientos posteriores de la misma paciente.

El antimicrobiano Cefotaxima es sensible a S.aureus ya que posee un diámetro de

halo ≥ 22mm. Este antimicrobiano se utiliza como sustituto a la oxicilina.

Con respecto a la Placa que posee el control de calidad a elección: E.coli ATCC
25922, dos de los 5 resultados fueron los esperados. Meropenem que generó un
halo de 30mm, y la amikacina que generó un halo de 22mm. Las otras 3 cepas,
ampicilia, ampicilina-sulbactam y cefotaxima generaron un halo de 31mm, 33mm
y 20mm respectivamente. Estos últimos resultados según el CLSI no están dentro
del rango control para la cepa elegida.

Los resultados de los antimicrobianos utilizados en la cepa problema E.coli Blee +

resultaron ser todos sensibles. Esto debido a que generaron un halo mayor a los
que indica el CLSI y este los categoriza como sensibles.

En la prueba de susceptibilidad por epsilometría para K.pneumoniae Blee+, que

para ambos antimicrobianos utilizados, esta bacteria es resistente ya que es una
ß-lactamasas de espectro extendido, es decir enzimas derivadas de las familias
TEM y SHV, codificadas en plásmidos que han sustituido 1 a 3 aminoacidos
cercanos al sitio activo confiriendo resistencia a aztreonam, cefotaxima y
ceftazimida (5)

Para la prueba por micro-dilución podríamos suponer que el antimicrobiano tuvo

algún problema al ser preparado, o la sepa bacteriana no estaba en el mejor
estado, ya que lo esperado era que en alguno de los pocillos o en ninguno de
estos, no se encontrara turbidez ni precipitado de las bacterias, ya que la sepa era
meticilina resistente.

Conclusión
Tanto para la cepa S.aureus ATTC 25923, la cepa E.coli ATCC 25922 (control y
control de calidad a elección) y la cepa problema E.coli Blee +, podemos concluir
que todos los antimicrobianos utilizados en este control de calidad, son sensibles,
ya que generan un halo mayor o igual al que se debe formar según lo indicado por
la CLSI. Esto significa que una infección causada por esta cepa puede ser tratada
con la dosis del antimicrobiano utilizado en el control de calidad.

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En el caso de la K.pneumoniae Blee+, es resistente a debido a que poseen
enzimas de las familias TEM y SHV.

Para la prueba de susceptibilidad por micro-dilución, los resultados no fueron los

esperados, suponemos que fue por la preparación del antimicrobiano o por algún
problema en la sepa.

Bibliografía
1) Prat, S. & General, S. B. (2006). Prueba de susceptibilidad antimicrobiana
por difusión en agar. Gobierno de Chile, Ministerio de Salud, Instituto de
Salud Pública de Chile.
2) Ximena Lazcano, Roberto Flores. (2014). Guía de actividades prácticas.
Microbiología I. Chile: Universidad San Sebastián.

3) Clinical and Laboratory Standards Instituted. (2013). M100-S23

Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twenty-third
informational supplement. Wayne, PA 19087. USA: west valley road.
4) Joaquín Bermejo, Blanca Bencomo, Nora Arnesi, Patricia Lesnaberes,
Noemí Borda y Rodolfo Notario. (2006). High relationship between
ciprofloxacin use and prevalence of ESBL Klebsiella pneumoniae. Revista
chilena de infectología, 4, 316-320.
5) Andrade V, Grupo de Resistencia Bacteriana, Silva J. Caracterización de
Klebsiella pneumoniae productora de la β-lactamasa SHV-5, en una unidad
de cuidados intensivos. Salud Publica Mex 2004;46:524-528

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