Sunteți pe pagina 1din 75

LUCRARI LABORATOR MICROBIOLOGIE SPECIALA

L.0. Protecţia muncii. Prezentare lucrări.


L.1. Tehnici de eșantionare, recoltare şi pregătire a
probelor pentru analiza microbiologică
Metode clasice de evaluare a principalelor grupe de
microorganisme de alterare din alimente
L.2. Determinarea numărului total de bacterii aerobe
mezofile
L.3. Determinarea numărului total de drojdii şi mucegaiuri
L.4. Determinarea bacteriilor sporulate aerobe şi anaerobe
L.5. Determinarea microorganismelor osmofile
L.6. Determinarea bacteriilor de putrefacţie
Metode rapide, clasice şi moderne de evaluare a calităţii
microbiologice a alimentelor
L.7. Proba reductazei
L.8. Metode bazate pe utilizarea Petrifilmelor
Tehnici de evaluare a microorganismelor indicatori sanitari
L.9. Bacterii coliforme. Coliformi fecali si Escherichia coli
Analiza bacteriilor care induc risc biologic în alimente
L.10. Determinarea numărului de bacterii Staphylococcus
aureus (coagulazo pozitivi)
L.11. Genul Listeria
L.12. Genul Bacillus. Genul Clostridium
L.13. Colocviu de laborator
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR

TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR


PENTRU ANALIZA MICROBIOLOGICĂ

1. Eșantionarea probelor
Pentru efectuarea analizelor microbiologice, probele de analizat trebuie să reflecte
condiţiile microbiologice existente în momentul recoltării și să reprezinte fidel lotul din care
provine. De modul în .care se face recoltarea și transportuI probelor la laborator depinde
de multe ori rezultatul analizei. De aceea, o etapă foarte importantă constă în stabilirea
eșantioanelor, a condiţiilor de recoltare a probelor și de transport în condiţii
corespunzătoare la laboratorul de analize.
În activitatea de prelevare a probelor există o terminologie generală, și anume:
! lotul - reprezintă cantitatea de produse cu aceleași caracteristici, realizate în
condiţii tehnologice uniforme, într-o şarjă, schimb de producţie sau într-o perioada
limitată de timp;
! elementul - este partea indivizibilă a lotului;
! eșantionul global - reprezintă probă formată prin mai multe prelevări din același lot;
! eșantionul redus - este fracțiunea reprezentativă dintr-un eșantion global;
! eșantionul de laborator - este fracțiunea din eșantionul global sau redus destinată
analizelor de laborator;
! prelevarea (recoltarea) - reprezintă tehnica de recoltare a unui eșantion elementar
dintr-un lot sau a unui element indivizibil.
Sunt posibile două tipuri de recoltare a eșantioanelor:
prelevarea elementelor cu defecte pentru a evidenţia cauza producerii
acestora;
prelevarea la întâmplare a unor elemente care aparţin unor condiţii normale
de producţie, pentru controlul calităţii microbiologice. În acest caz sunt aplicate
metode statistice, astfel încât eșantionul să fie statistic semnificativ.
Eşantioanele se aleg prin tragere la sorţi, după scheme prestabilite, pe baza tabelelor de
recoltare ce conţin numere echivalente numărului de probe din lot, dar dispuse la
întâmplare (tabelul 1). După numerotarea elementelor lotului, se corelează aceste numere
cu cele din tabel, şi, apoi, se prelevează probele corespunzătoare numerelor din tabel în
succesiunea stabilită de echipa de control. Astfel, pornind de la un punct şi într-o ordine
arbitrar aleasă se compune eşantionul cu elementele corespunzătoare. De exemplu, dacă
se doreşte ca dintr-un lot de 80 bucăţi să se preleveze la întâmplare 5 probe, se vor

Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR

preleva elementele corespunzătoare numerelor primei linii din tabel: 07; 59; 66; 63; 46
(valoarea 97 este exclusă pentru că nu există).
Tabelul 1. Exemplu de ordonare aleatorie a elementelor unui lot în vederea eşantionării
07 59 66 97 63 46 18 42 62 56 68 93 43 12 48 68 87
45 01 64 32 48 85 43 84 10 24 32 26 62 65 90 57 06
32 36 52 26 54 28 95 13 08 32 92 24 87 91 13 18 72
62 44 03 61 09 37 48 42 28 49 58 54 36 07 15 68 12
84 88 65 64 14 01 20 79 16 11 22 54 46 39 79 14 89
96 44 92 77 26 52 29 34 45 04 45 37 23 66 02 05 92
74 50 33 45 66 25 42 27 25 09 39 18 08 90 72 75 26
54 41 90 46 51 73 98 35 84 59 78 96 05 59 89 61 38
80 95 01 67 22 84 05 97 09 46 62 73 17 63 46 45 83
96 47 23 51 45 37 83 09 17 71 96 79 58 92 78 70 80
53 62 97 78 95 08 84 61 71 59 49 20 83 56 61 85 88
52 50 28 59 26 29 62 89 83 10 13 25 32 72 83 58 75
45 53 94 02 22 22 08 91 36 76 59 69 05 89 14 98 14
98 26 99 26 14 91 52 01 85 24 45 52 95 27 25 94 63
89 39 07 26 11 26 45 52 63 65 79 03 12 93 28 37 45

Alegerea elementelor pentru analiză (x) se poate stabili pe baza formulelor:

N
x= sau x = N
n
în care: N = numărul elementelor unui lot;
n = numărul eşantioanelor de prelevat.

După stabilirea valorii x se numerotează şi se asociază în grupe diferite elemente ale


lotului notate de la 1 la x. Se extrage din fiecare grupă elementul notat cu x.
Aceste tehnici sunt aplicabile atât loturilor de produse finite din depozite, cât şi pe fluxul de
fabricaţie sau în momentul livrării. Pe fluxul de fabricaţie prelevarea se efectuează, de
obicei, după terminarea unei etape de procesare.
Pentru a fi semnificativă, eşantionarea trebuie să fie realizată în timp, deoarece un
eşantion constituit exclusiv din elemente succesive este puţin reprezentativ pentru
ansamblul unei producţii sau al unui lot.
Frecvenţa prelevărilor şi a controlului depinde în general de nivelul producţiei, riscurile de
contaminare, sau de apariţia defectelor de fabricaţie. În cazul unei producţii mari, frecvenţa
prelevărilor va fi mai mare. Este de asemenea important să se efectueze analize ori de
câte ori au loc variaţii la nivelul fabricaţiei, generate de:
- schimbarea lotului de materie primă;
- fluctuaţiile generate de modificarea schimbului;
- modificări sau reparaţii ale utilajelor, ş.a.

Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR

Prelevările se efectuează pe elemente indivizibile (produse de dimensiuni mici, pachete


mici, cutii, ş.a.), din produse ambalate în vrac, sau părţi dintr-un element de dimensiuni
mari.
Pentru acest domeniu se recomandă analize în cadrul unui plan cu 2 sau 3 clase, fiecare
prelevare trebuie să fie compusă din 5 probe (n=5).

2. Tehnici de prelevare
De cele mai multe ori prelevările se efectuează pe elemente indivizibile (cutii de conserve,
sticle, produse de dimensiuni mici, pachete mici ş.a.). În alte cazuri, probele se recoltează
din produse în vrac sau parţi dintr-un element de dimensiuni mari.
Prelevările ce corespund primului caz sunt simple și nu necesită masuri de precauţie
suplimentare.
Condiţii generale de prelevare (recoltare)
Cantitatea de probă recoltată depinde de natura analizei și de planul de eşantionare.
Omogenizarea
Repartizarea microorganismelor în produsul analizat nu este întotdeauna omogenă, mai
ales în cazul produselor voluminoase sau cu structuri eterogene. În asemenea cazuri se
recomandă ca prelevările să se realizeze din mai multe zone. De aceea este foarte
important să se cunoască zonele cu riscuri mari de contaminare, sau se impune
omogenizarea produselor vrac înainte de prelevarea probelor.
Măsuri aseptice
Este absolut necesar să se evite contaminarea suplimentară a probelor în timpul recoltării
sau după această etapă. Pentru aceasta recipientele utilizate și instrumentele de recoltare
trebuie să fie sterile și protejate în ambalaje sterile.
Unele instrumente trebuie sterilizate la locul de recoltare.
Recoltarea produselor lichide
Se realizează apelând la diferite tehnici, în funcţie de natura produsului, de forma și
volumul recipientului. Înainte de recoltare se recomandă omogenizarea probei, care se
poate realiza manual, cu ajutorul unei baghete, sau cu ajutorul unui agitator mecanic steril,
precum și prin utilizarea sistemelor de omogenizare mecanică cu care sunt prevăzute
recipientele. În funcţie de volumul de produs ce trebuie recoltat se pot utiliza pipete sterile
sau instrumente speciale de recoltare (polonic steril sau flacon special). În cazul în care
recoltarea se face de la reţea, se flambează gura robinetului, se lasă ·să curgă o parte din
produs pentru a elimina microorganismele stagnante pe conductă și apoi se face
recoltarea propriu-zisă.
Recoltarea produselor solide
În funcţie de natura produsului, pentru recoltare se foloseşte scalpelul, sonda (de exemplu,
pentru brânză), pipeta tip harpon, etc.

Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR

Instrumentele trebuie să fie sterilizate.


În general, microorganismele de la suprafaţa produsului,.expusă contactului cu aerul, se
analizează prin metoda tamponului, iar cele din profunzime se analizează prin recoltare de
probe după ce s-a îndepărtat o porţiune de produs de la suprafaţă sau s-a cauterizat
suprafaţa cu ajutorul unei spatule încălzite la roşu. În cazul în care structura produselor
este neomogena semisolida sau semilichidă este absolut necesară omogenizarea
probelor.

3. Pregătirea probelor pentru analiză


Prepararea eşantionului presupune deschiderea aseptică a recipientelor închise (produse
ambalate, sticle, cutii de conserve), omogenizarea și pregătirea extractelor lichide (în cazul
produselor solide).
Etichetarea
O mare atenţie trebuie să se acorde etichetării eșantioanelor·. Eticheta trebuie să cuprindă
toate elementele necesare, și anume: numărul lotului, numărul de ordine, data, ora, locul
exact de unde s-a realizat recoltarea, modalitatea de recoltare (metoda eșantioanelor,
tehnica de recoltare ş.a.).
Stabilitatea eșantioanelor
Calitatea microbiologică a eşantionului nu trebuie să se modifice în intervalul de timp de la
recoltare până în momentul analizei. Principalii factori care influenţează stabilitatea sunt:
temperatura și durata de păstrare, protecţia fata de contaminările externe.
Omogenizarea și măcinarea
În cazul produselor lichide proba ca atare reprezintă suspensia iniţială . Pentru produsele
solide este necesară obţinerea şi standardizarea suspensiei iniţiale, prin stabilirea
raportului de diluţie (în general 1:10 sau 1:5) între proba de analizat şi lichidul de extracţie
(diluare). Astfel, în cazul produselor dense se procedează în două moduri:
- se cântăreşte în condiţii aseptice o cantitatea de produs (de exemplu 10g), direct
în sistemul de mărunţire, apoi se adaugă un volum cunoscut de lichid de diluţie (40
ml pentru diluţia 1/5; 90 ml pentru diluţia 1/10);
- se introduc în recipientul de mărunţire o cantitate aproximativă de probă şi se
cântăreşte tot ansamblul (tara recipientului fiind cunoscută), apoi se adaugă lichidul
de diluţie, în funcţie de cantitatea de probă.
În ambele cazuri concentraţia suspensiei iniţiale este perfect definită în raport cu produsul
de analizat. Astfel, x ml suspensie corespund la y g produs analizat. Rezultatele analizei
se raportează la 1 ml suspensie sau 1 g produs.
După cântărire în condiţii aseptice, probele constituite din produse solide sau eterogene
sunt omogenizate, în paralel cu extracţia microorganismelor în lichidul de diluţie, aplicând

Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR

diverse tratamente precum: mojarare manuală cu nisip steril sau bile de sticlă sau
mărunţire mecanică .
Pentru mojararea cu nisip steril sau bile de sticlă se utilizează un mojar care conţine 5-20
g nisip special, steril, sau bile din sticlă (Φ=0,5 mm). Mojararea se realizează manual în
apropierea becului Bunsen. Pe parcursul mărunţirii se adaugă 2-5 volume de apă sterilă.
Proba se lasă în repaus timp de 5 minute, apoi se colectează supernatantul într-un vas
steril. Această metodă nu este întotdeauna practică, dar este simplă şi nu necesită
aparatură specială.
Tehnicile moderne de omogenizare prevăd utilizarea sistemelor performante, care permit
menţinerea condiţiilor aseptice şi o bună eliberare a microorganismelor în lichidul de
extracţie. Pentru acest scop sunt comercializate diferite tipuri de omogenizatoare
peristaltice: Stomacker (Stomacker / Seward-Bioblock-OSI-Prolabo), Digi-system,
Ultraturax, Waring Biender/ Bioblock-OSI-Prolabo, etc.
În cazul utilizării omogenizatorului Stomacher proba de analizat (dimensionată, g) şi un
volum corespunzător de lichid de extracţie (diluţie) sunt introduse într-o pungă de plastic
sterilă (de unică folosinţă), care se închide ermetic şi se montează în aparat pentru
omogenizare, prin intermediul unor palete speciale. Pungile sterile din material plastic
trebuie să aibă o capacitate suficientă pentru a permite amestecarea corectă a probei cu o
cantitate echivalentă de lichid de diluare. În general, volumul recipientului trebuie să fie
egal cu aproape de două ori volumul probei plus volumul soluţiei de diluare.
Recent, a fost realizat un nou aparat, care funcţionează după un principiu similar cu
aparatul tip Stomacher, la care însă s-a îmbunătăţit tehnica de omogenizare prin vibraţii
(fig.1). Acest tratament (viteză vibratorie mare) oferă o eliberare a microorganismelor (în
general a bacteriilor) în lichidul de diluare similar cu cazul prelucrării probei în stomacher
(grad de similaritate a rezultatelor de 96%), însă asigură obţinerea unui extract clar cerinţă
impusă de analizele moderne precum: evaluarea cantitativă a microbiotei prin ATP
bioluminiscenţă, teste imunologice şi analize PCR (din limba engleză Polymerase Chain
Reaction) (Fung 1999).

Figura 1. Sisteme de omogenizarea tip Pulsifier


Pentru unt şi margarină protocolul de pregătire a probelor prevede o serie de etape
preliminare, particulare, în concordanţă prevederile impuse de unele normative (adaptare
după Tofan şi colab, 2002):

Pag 5
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EȘANTIONARE, RECOLTARE SI PREGĂTIRE A PROBELOR

1) Proba este topită pe baie de apă la 45oC şi omogenizată. Se prepară diluţia 1:10
prin prelevarea a 10 ml produs topit şi transferare într-un flacon de 200 ml, care conţine 90
ml soluţie Ringer ¼ cu 0,1% geloză, pentru stabilizarea emulsiei. Diluantul şi pipetele
trebuie să aibă temperatura de 45oC. Alte diluţii şi analizele microbiologice trebuie
realizate în următoarele 10 minute.
2) Se prelevează în condiţii aseptice 2,5 g produs, care sunt apoi transferate într-o
eprubetă de analiză conţinând 2,1 ml de soluţie Ringer ¼, şi se termostatează la 45oC
până la topire. După omogenizare, amestecul este menţinut pe baie de apă (la 45oC) până
la separarea celor două faze. Faza apoasă este utilizată pentru analiza microbiologică .
3) O cantitate de 50 g de probă se suspendă în 42 ml de soluţie 0,1 M tampon fosfat
(pH=7,5–8,0), apoi se termostatează la 40…45oC până la topire (timp de maximum 1 h, cu
agitare intermitentă ). Separarea fazelor este realizată în final prin centrifugare în condiţii
aseptice, timp de 1÷10 minute, la 2000-3500 rpm. Faza apoasă este utilizată pentru
examen microbiologic.
O altă îmbunătăţire a vizat tehnica de realizare a diluţiilor. Prin realizarea unui instrument
de dispersie (dispersor) este posibil transferul automat şi aseptic a unui volum cunoscut de
lichid de diluare pentru realizarea suspensiei iniţiale sau a diluţiilor decimale.
Astfel, cu ajutorul unui dispozitiv denumit DILUFLO pot transfera volume variabile de lichid
de diluţie, cuprinse între 0,1 ml şi 100 ml, direct în pungi sau vase sterile, în care s-a
introdus în prealabil aseptic proba de analiză .
Instrumentul poate fi programat pentru a realiza diluţii 1:10, 1:50, 1:100 sau orice raport de
diluţie, realizând transferul automat a unui volum corespunzător de lichid, în funcţie de
greutatea probei solide sau volumul probei lichide luate în analiză (fig. 2).

Figura 2. Sistem automat de realizare a suspensiei iniţiale


În general, condiţiile particulare de eşantionare şi pregătire a probelor de analiză sunt
precizate în standardele specifice pentru evaluarea calităţii microbiologie a fiecărui produs.
În absenţa unor standarde specifice disponibile, sau în cazuri speciale, metodologia se
adaptează la condiţiile specifice din laborator, cu respectarea regulilor generale de
analiză.

Pag 6
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE BACTERII AEROBE


MEZOFILE

DEFINIŢII
Microorganismele aerobe sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvoltă la suprafaţa
lichidelor, a mediilor solide.
Bacteriile mezofile reprezintă grupul majoritar cu temperaturi minime la 15-20°C,
temperaturi optime în intervalul 30 - 40°C și maximum la temperaturi peste 45°C

PRINCIPIUL DE DETERMINARE A NUMĂRULUI DE BACTERII AEROBE MEZOFILE


Numărul de bacterii aerobe mezofile se apreciază indirect, pe baza numărului de colonii
generate de celulele acestor microorganisme prezente în proba de analizat, care se
formează când proba sau o diluţie a acesteia vine în contact cu un mediu nutritiv, după
termostatare la 37°C, timp de 48 de ore.
Numărul de bacterii aerobe mezofile reprezintă un indicator valoros pentru aprecierea
calităţii generale şi a stabilităţii la păstrare a produselor alimentare.

MODUL DE LUCRU
Se iau două cutii Petri sterile. Cu o pipetă sterilă se introduc, în fiecare cutie, câte 1 cm2
probă de analizat, dacă produsul este lichid sau câte 1 cm2 diluţie iniţială, în cazul altor
produse. Se realizează apoi prima diluţie decimală a probei de analizat (10-1). Se repetă
aceste operaţii cu diluţiile următoare, folosind câte o nouă pipetă sterilă pentru fiecare
diluţie decimală.
Se toarnă în fiecare cutie Petri câte cca. 15 cm2 mediu PCA (Plate Count Agar) cu
temperatura de 45±5°C.
Mediile se uniformizează rapid în plăci, prin rotirea plăcilor în plan orizontal, apoi sunt
lăsate în repaus până se produce solidificarea lor.
Se notează pe capacul plăcilor numele probei, mediul utilizat, diluţia inoculată,
temperatura la care se va face termostatarea.
Plăcile ce conţin mediul solidificat se plasează cu capacul în jos, pentru 48 de ore, în
termostat cu temperatura de 37°C.

PARTICULARITĂŢI PRIVIND NUMĂRAREA COLONIILOR


După termostatare, se aleg pentru numărare plăcile care conţin un număr colonii cuprins
între 25 şi 250, acestea trebuie să fie repartizate pe o suprafaţă mai mare de 25% din
suprafaţa totală a mediului de cultură. Pentru numărare se poate adopta:

Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

numărarea manuală, cu ajutorul unui numărător electronic (care la atingerea fiecărei


colonii o contabilizează în memoria sa), pentru a evita erorile de numărare;
numărare automatizată, utilizând instrumente speciale de numărare, când se consumă
numai 10% din timp, comparativ cu numărarea manuală. Există totuşi şi unele limitări ale
acestui procedeu şi anume: pot să apară erori de numărare în cazul prezenţei în mediu a
unor impurităţi solide sau bule de gaz; nu se obţin rezultate bune când coloniile au
diametru mare şi sunt răspândite pe o suprafaţă mare etc.
La numărare pot fi întâlnite următoarele tipuri de colonii:
lanţuri de colonii, care aparţin unei singure surse (celule asociate, în perechi, lanţuri,
pachete etc.). În acest caz se va număra întregul lanţ ca o singură colonie;
colonii dezvoltate în filmul de apă dintre baza mediului de cultură şi suprafaţa capacului
inferior;
colonii dezvoltate în filmul de apă de la suprafaţa mediului cu agar.
Rezultatele se exprimă, după caz, în unităţi formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml
produs, astfel:
1) Plăcile din două diluţii succesive conţin 25÷250 colonii pe placă:

ufc / g (ml ) =
∑C
(n1 + 0,1 ⋅ n 2 ) ⋅ d

în care: ∑ C = suma coloniilor numărate în toate plăcile reţinute;


n1 = numărul de plăci reţinute din prima diluţie;
n2 = numărul de plăci reţinute din a doua diluţie succesivă;
d = factor de diluţie corespunzător primei diluţii
Rezultatele se exprimă printr-un număr de forma (1,0 ÷9,9)·10x, unde x este puterea
atribuită numărului 10.
Exemplu: Dacă la numărare au fost alese câte 2 plăci corespunzătoare diluţiilor a doua şi
a treia, iar numărul de colonii din cele 4 plăci reţinute este:
la prima diluţie reţinută, 10-2: 232 şi 244 colonii;
la a doua diluţie reţinută, 10-3: 33 şi 28 colonii.

ufc / g (ml ) =
∑C =
232 + 244 + 33 + 28
=
537
= 24409 ⇒ 2,4 ⋅ 10 4
( n1 + 0,1 ⋅ n2 ) ⋅ d [2 + (0,1 ⋅ 2)] ⋅ 10 −2
0,022
(prin rotunjire la două cifre semnificative*)

Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

* Exemplu:
ufc calculat ufc
estimat
12700 13000
12400 12000
15500 16000
14500 14000
Prin analiză statistică s-a stabilit că în 95% din cazuri limitele de încredere ale acestei
metode variază de ± 12% la ± 37% (pentru numărul total de microorganisme aerobe) şi
între ± 16% la ± 52%. În practică însă se pot obţine variaţii mai mari ce derivă din condiţiile
de analiză aplicate şi experienţa analistului.
2) Plăcile inoculate din două diluţii succesive conţin mai puţin 25 colonii. Se aplică
modul de calcul prezentat mai sus. Plăcile inoculate în paralel din proba de analizat (d = 1,
produse lichide) sau suspensia iniţială (d =10-1, produse solide), conţin mai puţin de 25
colonii:

ufc / g (ml ) =
∑C
2⋅d
Conform SR ISO 4833, pentru o abatere medie pătratică r2=0,95, intervalele de variaţie a
numărului posibil de ufc, pentru plăcile în care se dezvoltă mai puţin de 15 colonii, sunt
prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1. Limite de încredere pentru estimări în cazul unui număr de colonii sub baremul
minim
Număr de Interval posibil de Număr de Interval posibil de
colonii/placă variaţie a ufc colonii/placă variaţie a ufc
1 <1÷2 9 4÷14
2 <1÷4 10 4÷16
3 <1÷5 11 5÷18
4 1÷6 12 6÷19
5 2÷9 13 7÷20
6 2÷10 14 7÷21
7 2÷12 15 8÷23
8 3÷13

3) În plăcile inoculate în paralel din proba de analizat (d = 1, produse lichide) sau


suspensia iniţială (d =10-1, produse solide) nu s-a dezvoltat nici o colonie:
ufc/ml < 1 (produse lichide)
ufc/g < 1 ·10-1 (produse solide)

Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

4) Când plăcile conţin mai mult de 250 (sau 300) de colonii, numărarea se poate
realiza:

pe anumite sectoare delimitate ale suprafeţei plăcii ⇒ n = n ⋅ nr. sectoare


sec tor
delimitate (4, 8 sau 16)
pe o suprafaţă delimitată (pătrat) de 1 cm2, astfel: când numărul de colonii pe un pătrat
este mai mare de 10 se numără la întâmplare coloniile de pe 4 zone reprezentative, se
determină media aritmetică, apoi se raportează la suprafaţa totală a plăcii Petri; când
numărul de colonii distribuite pe un pătrat este mai mic decât se numără coloniile de pe 12
pătrăţele reprezentative, se determină media aritmetică, apoi se raportează la suprafaţa
totală a plăcii Petri.
5) Când numărul de colonii pe placă este foarte mare rezoluţia este imposibilă
numărarea, concentraţie de celule mult mai mare decât diluţia estimată.
6) Când se produce contaminarea accidentală sau se obţin rezultate neconcludente
rezoluţia este analiză efectuată necorespunzător.

Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

REZULTATE LUCRARE nr. __________


Nume______________________________
Grupa______________________________
Data_______________________________

DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE BACTERII AEROBE


MEZOFILE

1. Înregistraţi în tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (în


plăcile selectate pentru numărare)
Proba Nr. colonii/placă
Diluţia

1
2
3
4

2. Stabiliţi gradul de contaminare exprimat în unităţi formatoare


de colonii (ufc) per gram sau ml produs:

Proba 1 _______________

Proba 2 _______________

Proba 3 _______________

Proba 4 _______________
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE DROJDII SI MUCEGAIURI

DEFINIŢII
Drojdii – microorganisme eucariote, mono sau pluricelulare, care se reproduc asexuat
prin înmugurire sau, mai rar, prin sciziune. Unele drojdii se pot reproduce si sexuat
(meioză). Majoritatea drojdiilor sunt saprofite şi multe dintre ele au activitate
fermentativă.
Mucegaiuri – microorganisme eucariote, care prezintă organe de reproducere
diferenţiate. Sunt agenţii mucegăirii.
Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza (Anexa 1)

PRINCIPIUL METODEI
Prin această metodă, numărul de drojdii şi mucegaiuri se apreciază indirect, pe baza
coloniilor generate de celulele acestor microorganisme prezente în proba de analizat,
care se formează când proba sau o diluţie a acesteia vine în contact cu un mediu
nutritiv gelozat, după termostatare la 25°C timp de 72 de ore.

ECHIPAMENTE
 Omogenizator
 Balanţă analitică
 Termostat reglat la 25°C
 Baie de apă pentru fluidificarea mediului de cultură reglată la 45°C

MATERIALE ŞI STICLĂRIE
 25g produs alimentar
 225 ml 0.1% apa peptonată
 Cutii Petri Φ10 cm sterile
 Pipete de 1 cm3 şi 10 cm3 sterile
 Eprubete cu ser fiziologic steril, câte 9 cm3 per eprubetă
 Baloane cu ser fiziologic steril

Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

 Pungi sterile pentru omogenizarea probelor solide sau semisolide


 Numărător de colonii
Reactivi pentru determinare
Mediu de diluare: Soluţie ser fiziologic
Mediu de cultură: Anexa 2

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU


Se cântăresc 25 g proba produs alimentar, peste care se adaugă 225 ml apa
peptonată. Se omogenizează timp de 1 min.
Pentru diluarea probei se aplică schema de diluţie din figura 1.

Figura 1 Schema de lucru pentru realizarea diluţiilor si inocularea probelor


*Toate probele se realizează in duplicat.
Cu o pipetă sterilă se transferă în fiecare cutie Petri sterila, câte 1 cm2 probă de
analizat, dacă produsul este lichid sau câte 1 cm2 diluţie iniţială, în cazul altor produse.
Se realizează apoi prima diluţie decimală a probei de analizat (10-1). Se repetă aceste
operaţii cu diluţiile următoare, folosind câte o nouă pipetă sterilă pentru fiecare diluţie
decimală (Fig.1).
Se toarnă în fiecare cutie Petri câte cca. 15 cm2 mediu PCA (Plate Count Agar) cu
temperatura de 45±5°C.
Mediile se uniformizează rapid în plăci, prin rotirea plăcilor în plan orizontal, apoi sunt
lăsate în repaus până se produce solidificarea lor.
* Se notează pe capacul plăcilor numele probei, mediul utilizat, diluţia inoculată, temperatura la
care se va face termostatarea.

Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos, pentru 3-5 zile la
temperatura de 25-28°C.

REZULTATE
Se reţin cutiile care conţin 15…300 de colonii. Numărul de ufc de drojdii şi mucegaiuri
per ml sau gram de produs se calculează ca medie ponderată, cu formula următoare:

ufc / g (ml ) =
∑C
(n1 + 0,1 ⋅ n 2 ) ⋅ d

unde
ΣC – suma coloniilor numărate în toate cutiile reţinute;
n1 – numărul de cutii reţinute dintr-o diluţie
n2 – numărul de cutii reţinute din diluţia succesivă
d – factorul de diluţie corespunzător primei diluţii din care s-a realizat reţinerea
plăcilor.
Rezultatele calculate se rotunjesc la două cifre semnificative.
Se exprima gradul de contaminare printr-un număr cuprins între 1,0 şi 9,9 multiplicat cu
10x, unde x este puterea atribuită lui 10.
Dacă cele două cutii Petri, la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluţiei
iniţiale (alte produse) conţin mai puţin de 15 colonii, se face media aritmetică, m, a
coloniilor numărate în cele două cutii.
Rezultatul se exprima sub forma:
- număr de ufc de drojdii şi mucegaiuri estimat per ml:
NE=m (produse lichide)
- număr de ufc de drojdii şi mucegaiuri estimat per gram
NE=m·d-1 (alte produse), în care d este factorul de diluţie al diluţiei iniţiale (alte produse).
Dacă cele două cutii Petri , la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluţiei
iniţiale (alte produse) nu conţin nicio colonie, rezultatul se exprima sub forma:
- mai puţin de o ufc de drojdii sau mucegaiuri per ml (produse lichide);
- mai puţin de 1·d-1 ufc de drojdii sau mucegaiuri pe gram (alte produse)

Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA


ANALIZA

Nr.crt. Grupe de produse

1. Pâine şi produse de panificaţie

2. Produse lactate acide si brânzeturi

3. Carne şi produse din carne

4. Uleiuri, grăsimi şi seminţe oleaginoase

5. Fructe. Legume şi produse prelucrate

6. Băuturi alcoolice

7. Băuturi nealcoolice

8. Făinuri proteice, furaje , şroturi

9. Zahăr şi produse zaharoase

10. Cereale şi produse din cereale

11. Produse de cofetărie şi patiserie

12. Condimente, supe, sosuri, salate

Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 2

CONDIŢII DE CULTIVARE ŞI COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ PENTRU


NUMĂRAREA MICROORGANISMELOR

Condiţiile particulare de lucru conform prevederilor din normativele româneşti


adaptate la condiţiile ISO (SR ISO) sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1. Condiţii de cultivare pentru numărarea microorganismelor impuse de normativele


ISO

Grup de microorganisme Medii de cultură Condiţii de termostatare


Temperatură/timp
 Număr total de microorganisme - PCA 30ºC/72h ± 3h
aerobe, care se dezvoltă la
30ºC (bacterii, drojdii şi
mucegaiuri)
 Drojdii şi mucegaiuri - YGC 25ºC/5 zile
- OGA (OGYE)
Compoziţia mediilor de cultură recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii
de microorganisme este prezentată în tabelul 2.

Tabelul 2. Compoziţia mediilor de cultură recomandate pentru determinarea şi confirmarea


numărului de unităţi formatoare de colonii

Indicator microbiologic Compoziţie medii de cultură, g·l-1


Număr total de microorganisme PCA
(engl. Plate count agar1);
SMA- Standard methods agar2))
Triptonă ..................... 5,0g
Extract de drojdie ...... 2,5g
Glucoză anhidră .......... 1,0
Agar-agar ........ 12,0-18,0g
Apă până la .......... 1000ml
pH=7,2
Mediul este disponibil comercial.
Drojdii şi mucegaiuri YGC
(Extract de drojdie, glucoză, cloramfenicol agar )
Extract de drojdie ......... 5g
Glucoză ...................... 20g
Cloramfenicol ............ 0,1g

Pag 5
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Agar-agar ................... 15g


Apă până la .......... 1000 ml
pH=6,6

OGA (OGYE)
(Oxitetraciclina glucoză agar)
Extract de drojdie ......... 5g
Glucoză ...................... 20g
Agar-agar ................... 16g
Apă până la ........... 1000ml
pH=7,2
În momentul utilizării, în mediul fluidificat se
adaugă 100 ml soluţie 1mg/ml oxitetraciclină.
Geloză nutritivă (geloză alba)
Agar-agar ......................... 12…18g
Apă până la ...................... 1000 ml

Pag 6
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

REZULTATE LUCRARE __________


Nume______________________________
Grupa______________________________
Data_______________________________

DETERMINAREA NUMĂRULUI TOTAL DE DROJDII ŞI


MUCEGAIURI

1. Înregistraţi în tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (în


plăcile selectate pentru numărare)
Proba Nr. colonii/placă
Diluţia

1
2
3

2. Stabiliţi gradul de contaminare exprimat în unităţi formatoare


de colonii (ufc) per gram sau ml produs

Proba 1 _______________

Proba 2 _______________

Proba 3 _______________
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

DETERMINAREA BACTERIILOR SPORULATE AEROBE ŞI


ANAEROBE

DEFINIŢII
Bacteriile sporulate aerobe sunt bacterii care aparţin genului Bacillus. Sunt bacterii
Gram+, mobile, cu celule de forma cilindrica, cu dimensiuni diferite, cu capetele
drepte sau rotunjite, singulare sau asociate in unghiuri (Bacillus subtilis) sau lanţuri.
Sporii nu se colorează prin colorare Gram, sunt sferici sau ovali, cu diametru mai mic
sau egal decât al celulei, fiind poziţionaţi central sau terminal.
Bacteriile sporulate anaerobe sunt bacterii care aparţin genului Clostridium. Sunt
bacterii Gram+, mobile, cu celule de forma cilindrica cu dimensiuni mai mari decât
cele din genul Bacillus, singure sau in lanţuri, care formează endospori dispuşi
central sau terminal, care dau celulelor forma de suveică sau paleta.
Tipurile de produse alimentare pentru care se recomandă analiza sunt prezentate în
Anexa 1.

PRINCIPIUL METODEI
Determinarea microorganismelor sporulate aerobe şi anaerobe estimează numărul
microorganisme in stare sporulata prezente per g sau ml de produs.
Proba de analizat sau diluţii succesive se supun pasteurizării la 80°C timp de 10
minute, pentru a distruge toate formele vegetative , apoi se răceşte si se inoculează
in medii specifice, cultivarea realizându-se in condiţii particulare in condiţii aerobe
sau anaerobe.

MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE SPECIALE


1. Baie de apă reglabilă la 45°C şi la 80°C
2. Stomacher pH-metru.
3. Plăci Petri.
4. Termostat reglabil la 37°C
5. Anaerostat sau Recipient pentru cultivare in anaerobioza
6. Numărător de colonii
7. Reactivi si medii de cultura: mediu de diluare (apă peptonată), medii de
cultură: (Anexa 2),.

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU


Testul se efectuează în conformitate cu instrucţiunile de mai jos:

Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Manipularea eşantioanelor
În laborator, înainte de analiză, cu excepţia produselor alimentare care nu necesită
condiţii speciale de depozitare, probele se păstrează fie la frigider la temperatura de
0-5°C, fie congelate, în funcţie de natura produsului.
Prepararea mediilor de cultură
Se pregăteşte mediul Trypticase Soy Agar în cantităţi corespunzătoare şi se
sterilizează.
Se temperează mediul de cultură într-o baie de apă la temperatura de 45°C,
asigurându-se că nivelul apei este de 1 cm peste nivelul de mediu din eprubete.
Se curăţă zona de lucru cu un dezinfectant adecvat.
Se marchează în mod clar plăcile Petri cu numărul probei, diluţia şi data
termostatării.
Pregătirea diluţiilor
Se prepară un raport de diluţie de 1:10 a produsului alimentar, prin suspensionare a
de 10g (ml) produs în 90 ml apă peptonată. Probele se omogenizează:
- timpul de amestecare nu trebuie să depăşească 2.5 min, în scopul prevenirii
supraîncălzirii.
- în cazul produsele alimentare care au tendinţa de a spuma, este indicată
agitarea moderata.
- diluţiile se omogenizează prin menţinere pe vortex ( de 25 de ori, printr-un arc
de 30 cm, în aproximativ 7 sec).
Pentru fiecare probă de analizat, se pipetează 20-25 ml din diluţia 10-1 într-o
eprubetă sterilă. Se plasează eprubetele în baia de apă la 80°C. si se menţin timp de
20 de minute. După răcire se prepară diluţii (diluţii recomandate sunt de 10-1,10-2, şi
10-3).
Inocularea si termostatarea probelor
Cu o pipetă sterilă se transferă în fiecare placă Petri sterilă, câte 1 ml probă de
analizat.
Se toarnă în fiecare placă Petri câte cca. 15 ml mediu de cultură cu temperatura de
45±5°C.
Mediile se uniformizează rapid, prin rotirea plăcilor în plan orizontal, apoi sunt lăsate
în repaus până se produce solidificarea.
După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos.
Pentru bacteriile aerobe sporulate, plăcile se termostatează la 35oC ± 0.5oC timp
de 48 ± 2 ore.

Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pentru bacteriile anaerobe sporulate, plăcile se termostatează 35oC ± 0.5oC timp


de 48 ± 2 ore. într-un sistem anaerob de cultivare cum ar fi sistemul BBL Gaspack
(Anexa 3).
Numărarea coloniilor
Coloniile se numără imediat după perioada de termostatare.
Dacă este posibil, se selectează plăcile cu 20-200 colonii.

REZULTATE
Numărul de bacterii formatoare de spori per ml sau gram de produs se calculează cu
următoarea formula:
Plăcile din două diluţii succesive conţin 25÷250 colonii pe placă:

ufc / g (ml ) =
∑C
(n1 + 0,1 ⋅ n 2 ) ⋅ d

în care: ∑ C = suma coloniilor numărate în toate plăcile reţinute;


n1 = numărul de plăci reţinute din prima diluţie;
n2 = numărul de plăci reţinute din a doua diluţie succesivă;
d = factor de diluţie corespunzător primei diluţii
Rezultatele se exprimă printr-un număr de forma (1,0 ÷9,9)·10x, unde x este puterea
atribuită numărului 10.

Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

PROCEDURI PARTICULARE DE ANALIZA PENTRU ANUMITE GRUPE DE


PRODUSE ALIMENTARE

Bacterii sporulate aerobe mezofile din zahăr


Din proba de analizat se executa in condiţii aseptice diluţia 1/5 prin cântărire a 20g
zahăr şi dizolvarea în 80 ml apă sterilă.
Pentru inactivarea termică a formelor vegetative se face pasteurizarea prin
menţinerea diluţiei 1/5 pe baie de apă la 80°C, timp de 20 minute şi răcire în jet de
apă rece.
Din proba pasteurizată si răcită, cu o pipetă sterilă se transferă în fiecare placă Petri
sterilă, câte 1 ml probă de analizat. Se toarnă în fiecare placă Petri câte cca. 15 ml
mediu de cultură cu temperatura de 45±5°C.
Plăcile se termostatează la 32oC ± 1oC timp de 48 ± 3 ore.
Numărul de bacterii sporulate aerobe mezofile se raportează la 10 g zahăr.
Bacterii anaerobe sporulate din lapte
Se execută prin metoda Weinyirl în probe de lapte destinat fabricării brânzeturilor.
În 5 eprubete sterile ce conţin parafină (cca. 1ml in stare fluida) se introduc câte 5 ml
proba de analizat (lapte destinat fabricării brânzeturilor). După pasteurizare
(menţinere 10 minute la 80°C) şi termostatare 48 ore la 24-48°C se apreciază
eprubetele pozitive, în care s-a produs deplasarea dopului de parafină.
Interpretarea rezultatelor
Lapte calitate buna - Toate eprubetele sunt negative
Lapte calitate satisfăcătoare – 1 eprubeta pozitiva din 5
Lapte de calitate nesatisfăcătoare – 2 până la 5 eprubete pozitive.

Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA

Nr.crt. Grupe de produse

1. Făinuri

2. Lapte

3. Produse lactate acide şi brânzeturi

4. Carne şi produse din carne

5. Conserve alimentare

6. Zahăr şi produse zaharoase

7. Produse deshidratate

8. Condimente şi plante aromate

Pag 5
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 2
CONDIŢII DE CULTIVARE ŞI COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ PENTRU
NUMĂRAREA MICROORGANISMELOR

Compoziţia mediilor de cultură recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii de


microorganisme este prezentată în tabelul 2.

Tabelul 2. Compoziţia mediilor de cultură recomandate pentru determinarea şi confirmarea


numărului de unităţi formatoare de colonii

Indicator microbiologic Compoziţie medii de cultură, g/l


Bacterii sporulate aerobe BD Trypticase Soy Agar
Extract pancreatic de cazeină….15,0 g Clorură de sodiu …………5,0
Extract papaic de soia …………..5,0 Agar ………………….15,0
pH 7,3 ± 0,2*Ajustată şi/sau completată în funcţie de necesităţi
pentru a corespunde criteriilor de performanţă.
Bacillus cereus MYP
Mediu de bază ................. 90 ml
Soluţie polimixină B ......... 1,0ml
Emulsie de gălbenuş de ou10,0ml
Se lichefiază mediul de bază, se temperează la 50ºC, apoi se adaugă
aseptic celelalte componente.
Mediul de bază Soluţie de polimixină B
Extract de carne ..................1,0g Sulfat de polimixină B ...... 106 UI
Peptonă ............................10,0g Apă până la .....................100 ml
D-manitol ..........................10,0g
Clorură de sodiu ..............10,0g
Roşu de fenol ................. 0,025g
Agar-agar .................. 12g-18g 3)
Apă până la ................... 900 ml
pH=7,2, la 25ºC
Agar glucozat
Triptonă ............................10,0g Purpur de bromcrezol .... 0,015g
Extract de drojdie ...............1,5g Agar-agar ................... 12g-18g 3)
Glucoză .............................10,0g Apă până la .................. 1000 ml
Clorură de sodiu .................5,0g pH=7,0 (la 25ºC, după sterilizare)
Mediul Voges-Proskauer (VP)
Peptonă ..............................7,0g K2HPO4................................ 5,0g
Glucoză ...............................5,0g Apă până la .................. 1000 ml
Clorură de sodiu .................5,0g pH=7,0 (la 25ºC, după sterilizare)
Mediul cu nitrat
Peptonă ..............................5,0g Apă până la .................. 1000 ml
Extract de carne ..................3,0g pH=7,0 (la 25ºC, după sterilizare)
Azotat de potasiu................1,0g

Pag 6
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 3
SISTEME DE CULTIVARE IN ANAEROBIOZA

1. Sistemele GasPak sunt sisteme utilizate pentru crearea atmosferei


controlate (anaerobioza, microaerofilie, îmbogăţita in CO2).

Figura a. Sisteme anaerobioza (GASPACK)


Containerele sunt rezistente la şocuri si sistemul perfect de etanşeizare transforma
sistemele GasPak EZ in condiţii ideale de stocare si transport. Noua tehnologie,
bazata pe un sistem rectangular de termostatare, etanşeizare uşoară si rezistenţă la
şocuri, minimizează riscul apariţiei condensului, asigurând astfel o vizibilitate
perfecta a coloniilor bacteriene. Structura sistemului anaerob si indicatorii CO2
asigura metoda optima de obţinere a condiţiilor anaerobe.

2. Anaerostate sunt sisteme din care oxigenul a fost îndepărtat sau


înlocuit cu un amestec controlat de alte gaze.

Pag 7
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

REZULTATE LUCRARE __________


Nume______________________________
Grupa______________________________
Data_______________________________

DETERMINAREA BACTERIILOR SPORULATE AEROBE ŞI


ANAEROBE

1. Înregistraţi in tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (în


plăcile selectate pentru numărare)
Proba Nr. colonii/placă
Diluţia

1
Stabiliţi gradul de contaminare exprimat in unităţi formatoare de colonii
(ufc) per gram sau ml produs

Proba 1 _______________

2. Înregistraţi in tabelul de mai jos eprubete pozitive şi negative,


stabilind in funcţie de rezultatele obţinute calitatea probei
analizate
Proba Eprubetele testate
1 2 3 4 5
1

Proba 1 _______________
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

DETERMINAREA MICROORGANISMELOR OSMOFILE

PRINCIPIUL METODEI
Drojdiile, mucegaiurile şi bacteriile osmofile sunt microorganisme capabile să se
crească într-un mediu cu concentraţii ridicate de zahăr sau sare producând alterări care
conduc la modificarea calităţii senzoriale şi a valorii nutritive a alimentelor (Anexa 1).
Prin această metodă, numărul de microorganisme osmofile se apreciază prin examen
cultural indirect, pe baza coloniilor formate microorganismele prezente în proba de
analizat, sau o diluţie a acesteia, prin cultivare pe medii specifice solidificate,
suplimentate cu 10% zahar sau sare, după termostatare optimă.
Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza: zahăr şi produse
derivate, produse conservate prin adaos de zahar, lapte condensat, amestecuri de
sărare, saramuri şi produse conservate prin sărare.

MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE
1. Mediu de baza (Anexa 2):

• Pentru bacterii: dextroză, 110 g; Plate Count Agar 23.5 g, apă distilată,
1.000 ml.
• Pentru drojdii şi mucegaiuri: mediu hiperglucidic
2. Mediul de diluare:zaharoză sau NaCl 400 g; apă distilată 1000 ml.

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU


Pentru obţinerea diluţiilor decimale pot fi folosite două tehnici pentru orice tip de probă
luată în analiză. Numărul de diluţii depinde de calitatea microbiologica a probei luate in
analiza, şi anume:
Din proba de analizat se executa in condiţii aseptice diluţia 1/5, prin
transferul a 20g probă în 80 ml mediu de diluare. Aceasta reprezintă diluţia iniţială -
1:5 (proba martor). Se transferă aseptic 20 ml din proba martor în 80 ml mediu de
diluare, proba este astfel diluata cu un factor de diluare de 25.
Se cântăresc in condiţii aseptice 10 g probă de analiza şi se transfera în
90 ml mediu de diluare, obţinând diluţia întâi, din care se obţin alte diluţii decimale
prin diluare succesiva.

Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Cu o pipetă sterilă se transferă în 2 placi Petri in paralel, câte 1ml probă de analizat. Se
repartizează în fiecare cutie Petri câte cca. 15ml mediu de cultură fluidificat şi temperat
la temperatura de 45±5°C.
Mediile se uniformizează rapid în plăci, prin rotirea plăcilor în plan orizontal, apoi sunt
lăsate în repaus până se produce solidificarea lor1.
După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos in următoarele
condiţii:

A. Bacterii osmofile
Plăcile Petri se termostatează la 35-37°C timp de 48 ± 3 ore (2 zile). Se reţin plăcile
care conţin 25…250 de colonii. Se numără colonii formate, realizându-se media
aritmetică a plăcilor realizate în dublu exemplar şi se stabileşte numărul de unităţi
formatoare de colonii per ml sau gram de produs.
B. Drojdii şi mucegaiuri osmofile
Plăcile Petri se termostatează la 25-30°C timp de 72 h (3 zile). Daca coloniile formate
sunt de dimensiuni mici, se extinde perioada de termostatare la 96-120 h (4-5 zile). Se
numără colonii formate, realizându-se media aritmetică a plăcilor realizate în dublu
exemplar şi se stabileşte numărul de unităţi formatoare de colonii per ml sau gram de
produs.
Se înregistrează numărul de drojdii/mucegaiuri per ml sau gram de produs

REZULTATE
Numărul de microorganisme osmofile per ml sau gram de produs se calculează cu
următoarea formula:
ufc/g(ml) = n·d
unde
n este numărul mediu de colonii/placă
d este factorul de diluţie.
Se aplica aceeaşi formula de calcul ca şi la bacterii aerobe mezofile sau drojdii şi
mucegaiuri

1
Pe capacul plăcilor Petri se notează: denumirea şi numărul probei, mediul de cultura, diluţia din care se realizează
inocularea, temperatura la care se realizează termostatarea.

Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 1
MICROORGANISME OSMOFILE CONTAMINATE ALE PRODUSELOR
ALIMENTARE

aW min
Microorganism
Drojdii

Saccharomyces rouxii 0.62

Saccharomyces bailii 0.80

Saccharomyces cerevisiae 0.90

Debaryomyces 0.83

Bacterii
Genul Hallobacterium (H. salinarium, H. morrhnae)
Genul Hallococcus

Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 2

COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ

Tabelul 1. Compoziţia mediilor de cultură recomandate

Mediu de cultura/Denumire Compoziţie medii de cultură, g·l-1

PCA Triptonă ......................... 5,0g


(engl. Plate Count agar) Extract de drojdie .......... 2,5g
Glucoză anhidră ............... 1,0
Agar-agar ............. 12,0-18,0g
Apă până la .............. 1000ml
pH=7,2
Mediul este disponibil comercial.

Mediu hiperglucidic Extract de drojdie ........... 10g


Glucoză ......................200,0 g
Uree ..............................1,0 g
Agar-agar ............. 12,0-18,0g
Apă până la .............. 1000ml

Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

REZULTATE LUCRARE __________


Nume______________________________
Grupa______________________________
Data_______________________________

DETERMINAREA MICROORGANISMELOR OSMOFILE

1. Înregistraţi în tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (în


plăcile selectate pentru numărare)
Proba Nr. colonii/placă
Diluţia

1
2

2. Stabiliţi gradul de contaminare exprimat în unităţi formatoare


de colonii (ufc) per gram sau ml produs:

Proba 1 _______________

Proba 2 _______________
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

DETERMINAREA BACTERIILOR DE PUTREFACŢIE

PRINCIPIUL METODEI
Bacteriile de putrefacţie sunt microorganisme care produc hidroliza proteinelor de
origine animală până la produşi simpli, gaze, NH3, H2S, amine biogene, compuşi indolici.
Primele semne ale alterării prin putrefacţie sunt formarea de mucus, apariţia mirosului
neplăcut şi modificarea gustului.
Bacteriile de putrefacţie aparţin următoarelor genuri: Pseudomonas, Bacillus,
Enterobacter, Escherichia, Proteus, Clostridium etc.
Determinarea lor are la bază două principii:
I. Evidenţierea hidrolizei substratului de natură proteică, astfel se determină
bacteriile cazeinolitice (produc hidroliza cazeinei).
II. Evidenţierea produşilor finali ai hidrolizei proteinelor prin realizarea de teste
biochimice reunite in testul HIL (H - evidenţierea producerii de hidrogen
sulfurat; I - evidenţierea producerii de indol; L- capacitatea de a lichefia
gelatina)
Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza sunt: carnea,
preparatele din carne sau peşte, brânzeturile.

MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE1
1. Mediul de baza:Plate Count Agar cu 1% cazeină sau 10% lapte;
2. Mediul de diluare: apă peptonată;
3. Reactivi pentru testele biochimice: reactiv Erlich sau Kovacs, acetat de plumb.

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU


Se pregăteşte suspensia iniţială prin cântărirea a 10 g probă, peste care se adaugă 90
ml apă peptonată. Se omogenizează timp de 1 min.
a. determinarea bacteriilor cazeinolitice
Se realizează diluţii decimale. Prin tehnica culturală Koch se fac inoculări in mediu PCA
suplimentat cu 1% cazeină sau 10% lapte.

1
Anexa 1

Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Mediile se uniformizează rapid în plăci Petri sterile, prin rotirea plăcilor în plan orizontal,
apoi sunt lăsate în repaus până se produce solidificarea lor2.
După solidificarea mediului plăcile se termostatează cu capacul în jos, timp de 48h, la
temperatura de 37°C.
Bacteriile care prezintă capacitatea de a hidroliza cazeina vor prezenta în jurul coloniilor
o zonă clară incoloră comparativ cu restul mediului care este opac. Aceasta deoarece,
bacteriile cazeinolitice produc enzime proteolitice extracelulare care difuzează în
exteriorul coloniilor şi hidrolizează cazeina.

b. determinarea produşilor finali ai hidrolizei proteinelor - testul HIL


Testul H – evidenţiază prezenţa hidrogenului sulfurat, rezultat din proteoliza proteinelor
Se transferă 1ml suspensie iniţială într-o eprubetă cu 9 ml apă peptonată sterilă. Se
plasează deasupra lichidului o hârtie sterilă îmbibată în acetat de plumb. Proba se
termostatează la temperatura de 37˚C, timp de 48h. Proba este pozitivă dacă hârtia se
înnegreşte, ca urmare a formarii de sulfura de plumb, prin reacţia dintre acetatul de plumb
si H2S care se degaja.
Testul I – evidenţiază prezenţa indolului
Se transferă 1ml suspensie iniţială într-o eprubetă cu 9 ml apă peptonată sterilă. Proba se
termostatează la temperatura de 37˚C, timp de 48h, apoi se adăugă 1 ml reactiv Kovacs
sau Erlich. Proba se consideră pozitivă prin apariţia unui inel de culoare roşie la interfaţa
mediu-reactiv, care indică prezenţa indolului.
Testul L– evidenţiază bacteriile care lichefiază gelatina
Se recoltează cu ansa celule din suspensia iniţială şi se înţeapă un tub de gelatină într-o
eprubetă sterila. Se termostatează la temperatura de 20˚C, timp de 7 zile3.
Proba este pozitivă dacă se produce lichefierea parţială sau totală a tubului de gelatină.
REZULTATE
Stabilirea numărului de bacterii cu activitate cazeinolitică se aplica aceeaşi formula de
calcul utilizata pentru stabilirea numărului de unitatea formatoare de colonii (metoda
indirecta de numărare)

2
Se notează pe capacul plăcilor numele probei, mediul utilizat, diluţia inoculată, temperatura la care se va face termostatarea.
3Înainte de analiza, probele se menţin timp de 30 min la frigider

Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

ANEXA 1

COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ SI A REACTIVILOR UTILIZATI

Tabelul 1. Compoziţia mediilor de cultură recomandate

Mediu de cultura/Denumire Compoziţie medii de cultură, g·l-1

PCA Triptonă ......................... 5,0g


(engl. Plate count agar) Extract de drojdie .......... 2,5g
Glucoză anhidră ............... 1,0
Agar-agar ............. 12,0-18,0g
Apă până la .............. 1000ml
pH=7,2
Mediul este disponibil comercial.

Tabelul 2. Compoziţia soluţiilor si a reactivilor utilizaţi

Reactiv - Soluţie/Denumire Compoziţie medii de cultură, g·l-1

Apă peptonată Peptonă ....................... 10,0g


Apă până la .............. 1000ml

Soluţie de acetat de plumb Acetat de plumb .......... 10,0g


Apă până la ................ 100ml

Reactiv Kovacs p dimetilnanobenzaldehida…………..10,0g


HCl………………………………………………….25,0ml
Alcool amilic până la ……………………….100ml

Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE
MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

REZULTATE LUCRARE __________


Nume______________________________
Grupa______________________________
Data_______________________________

DETERMINAREA BACTERIILOR DE PUTREFACŢIE

1. Înregistraţi în tabelul de mai jos numărul de colonii/placă (în


plăcile selectate pentru numărare)
Proba Nr. colonii/placă
Diluţia

1
2
Stabiliţi gradul de contaminare exprimat in unităţi formatoare de colonii
(ufc) per gram sau ml produs

Proba 1 _______________

Proba 2 _______________

2. Înregistraţi in tabelul de mai jos probele pozitive şi negative, prin


aplicarea testului HIL
Proba Testul HIL
Testul H Testul I Testul L

1
2
Proba 1 _______________

Proba 2 _______________
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

PROBA REDUCTAZEI

PRINCIPIUL METODEI
Proba reductazei este o metodă indirectă de apreciere a numărului de microorganisme
vii dintr-un produs, in funcţie de corelaţia dintre gradul de contaminare si durata în care
se produce modificarea culorii unor indicatori redox (albastru de metilen şi resazurina),
sub acţiunea enzimelor din categoria reductaze sintetizate de celulele vii prezente în
produs. Indicatorii redox au in forma oxidata culoare albastru (in cazul albastrului de
metilen) si albastru violet (in cazul resazurinei), iar prin reducere (in prezenta
reductazelor) se transforma in leucoderivaţi incolori. Analiza se pretează cel mai bine
pentru evaluarea calităţii microbiologice a laptelui materie prima.
In funcţie de tipul indicatorului si concentraţia acestuia variază durata analizei si
culoarea probei, parametrii in funcţie de care se poate aprecia gradul de contaminare si
calitatea microbiologica a produsului. Astfel, in cazul utilizării albastrului de metilen,
iniţial, proba are culoarea albastru care in timp se transforma in incolor. Resazurina îşi
schimbă culoarea de la albastru la violet spre roz şi apoi incolor.

MATERIALE ŞI ECHIPAMENTE
1. Soluţie de albastru de metilen 1%
2. Soluţie de resazurină 0,05%

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU


a. Proba reductazei cu albastru de metilen
Pentru analiza laptelui, se transferă 20 ml lapte într-o eprubeta sterilă peste care se
adaugă 1 ml soluţie de albastru de metilen. Eprubeta se menţine în baie de apa
termostatată la temperatura de 38-40°C, astfel încât nivelul apei să fie superior probei.
Se fac notaţii asupra modificării culorii la intervale de 20, 60, 120, 180, 330 minute.
Există şi varianta rapida a acestei metode când se utilizează aceeaşi tehnică de lucru
utilizând următoarele cantităţi: 10 ml lapte şi 1 ml soluţie albastru de metilen, diluţie 1/10.
b. Proba reductazei cu resazurina
În eprubete sterile se transfera 10 ml lapte de analizat peste care se adaugă 1 ml
soluţie de resazurina 0,05%, apoi proba se termostatează la temperatura de 38-40°C,
urmărindu-se modificarea culorii in intervalul 20 şi 60 minute.

Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

REZULTATE
a. Proba reductazei cu albastru de metilen
Aprecierea calităţii laptelui se face in conformitate cu specificaţiile din tabelul 1.
Tabelul 1. Aprecierea calităţii laptelui în proba reductazică cu albastru de metilen

Durata decolorării probei, minute Număr bacterii per ml Calitatea laptelui Categoria

Metoda clasica Metoda rapida

5
330 180 5·10 Buna I

5 6
120-330 60-180 5·10 - 4·10 Satisfăcătoare II

6 6
20-120 8-60 4·10 – 20·10 Slaba III

6
20 8 20·10 Foarte slaba IV

b. Proba cu resazurina
In proba cu resazurina aprecierea calităţii laptelui si a gradului de contaminare se face
realizează in conformitate cu datele înscrise în tabelul 2.
Se apreciază că la temperaturi de 38-40°C, o capacitatea reductazică superioară o au
lactobacilii, streptococii şi bacteriile coliforme. Dacă probele se menţin la temperatura
de 22°C la reducere participă şi bacterii din genurile Achromobacter, Bacillus,
Enterococcus.

Tabelul 2 Aprecierea numărului de bacterii din proba de lapte

Timp de modificare a Culoare Număr de bacterii per Calitatea Categoria


culorii proba ml laptelui

5
După 1h Albastru 5·10 Buna I

5 6
După 1h Albastru violet 5·10 - 4·10 Satisfăcătoare II

6 6
După 1h Roşu-alb 4·10 – 20·10 Slaba III

6
După 20 min. Alb 20·10 Foarte slaba IV

Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

REZULTATE LUCRARE __________


Nume______________________________
Grupa______________________________
Data_______________________________

PROBA REDUCTAZEI

1. Înregistraţi în tabelele de mai jos variaţia culorii probelor


analizate, stabilind în funcţie de rezultatele obţinute calitatea
acestora
1.1. Proba reductazei cu albastru de metilen

Durata decolorării
PROBA probei, minute Număr bacterii per ml Calitatea laptelui
Metoda rapida
1.
2.

1.2. Proba reductazei cu resazurină

Timp de
Culoare Număr bacterii per Calitatea
PROBA modificare a
proba ml laptelui
culorii
1.
2.
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

METODE BAZATE PE UTILIZAREA PETRIFILMELOR

Metodele culturale sunt în prezent mult simplificate prin utilizarea unor sisteme
comerciale, denumite Petrifilme (în limba engleză, Petrifilms), în care mediul de cultură
specific (în general, un mediu selectiv), deshidratat, dar uşor rehidratabil este fixat sub
forma unui film (cu diametru şi grosime variabilă) pe un suport din carton plastifiat şi
acoperit cu o folie din plastic. Prin inocularea suspensiei de celule, lichidul hidratează
mediul şi prin termostatare este posibilă dezvoltarea microorganismelor.
Petrifilmele au fost concepute în vederea satisfacerii conceptelor sistemului HACCP
(analiza hazardului, punctele critice de control), care prevăd aplicarea unor măsuri
corective, pe tot parcursul procesului de producţie, fără ca acesta să stagneze, ceea ce
impune analiza unui număr mare de probe, cu obţinerea unor rezultate prompte şi în
scurt timp, obiective ce nu pot fi realizate prin aplicarea metodelor clasice de control
microbiologic (Bahrim, 2003).
Practica a demonstrat că Petrifilmele constituie sisteme eficiente de analiză
microbiologică, aplicabile mai ales pentru evaluarea calităţii materiilor prime şi controlul
în punctele critice pe parcursul procesării acestora, oferind numeroase avantaje, care
se regăsesc în reducerea timpului de analiză, reducerea costului analizei per probă,
creşterea numărului de probe analizate, asigurarea inocuităţii alimentelor şi
îmbunătăţirea substanţială a productivităţii (Jordano şi Medina, 1999).

Tehnica de utilizare a Petrifilmelor în analiza microbiologică este extrem de simplă şi


presupune parcurgerea următoarelor etape:
Se pregăteşte proba, conform metodologiei clasice, şi se diluează prin tehnica
diluţiilor decimale, până la o concentraţie de celule de aproximativ 104 celule per ml.
Se ridică filmul superior.

Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

Se inoculează 1 ml suspensie dintr-o diluţie corespunzătoare în centrul Petrifilmului


aşezat pe un suport special.

Se eliberează filmul superior, care se lasă să cadă liber.


Cu ajutorul dispozitivului de răspândire se presează uşor deasupra zonei inoculate
pentru distribuţia uniformă a celulelor din suspensie pe toată suprafaţa circulară a
mediului de cultură.

Se îndepărtează dispozitivul de răspândire şi se aşteaptă un minut pentru


solidificarea mediului.
Se termostatează (pachete de până la 20 Petrifilme) în condiţii optime, specifice
pentru dezvoltarea microorganismelor analizate, în funcţie de recomandările din
instrucţiunile de utilizare a Petrifilmului.

Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

Se realizează numărarea coloniilor (pragul optim de detecţie 25-250 colonii/petrifilm);


faptul ca pe suportul pentru mediu este imprimat un caroiaj care împarte suprafaţa
mediului în pătrate cu suprafaţa de 1cm2, uşurează mult numărarea.

Se calculează ufc/g (ml), similar cu metodele clasice.

Eficienţa oferită de utilizarea Petrifilmelor a condus la extinderea utilizării acestora


pentru evaluarea calităţii microbiologice a numeroase alimente, inclusiv în industria de
panificaţie pentru analiza făinii, a pastelor făinoase, a cerealelor şi a cerealelor pentru
micul dejun.
În tabelul 1 sunt prezentate tipurile de Petrifilme comerciale, existente pe piaţă şi
principalele lor caracteristici.

Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

Tabelul 1. Tipuri de Petrifilme comerciale (Bahrim, 2003b)1


Tip Petrifilm Grup de Condiţii de Particularităţi
microorganisme termostatare
analizate
PYM Drojdii şi 72-120 ore, • determinarea numărului total de drojdii şi mucegaiuri;
(Petrifilm mucegaiuri 25ºC • nu necesită adăugarea de antibiotice sau acid tartric.
yeast/mould)
PAC Bacterii aerobe 48 ± 2 ore, 30 ± • determinarea numărului total de bacterii aerobe;
(Petrifilm aerobic mezofile 1ºC • analiza este eficientă prin prezenţa unui indicator care
count) colorează coloniile în roşu.
PCC Bacterii coliforme 24 ± 2 ore, 35 ± • evidenţierea coliformilor totali;
(Petrifilm coliforms 1ºC sau 37 ± • analiza este înlesnită de prezenţa unui indicator ce
count) 1ºC colorează coloniile în roşu;
• filmul superior reţine gazele rezultate prin fermentaţia
substratului lactoză, cu apariţia specifică a bulelor de gaz
în jurul coloniilor.
PHSCC Bacterii coliforme 24 ± 2 ore, • evidenţierea bacteriilor coliforme la diluţii mari în
(Petrifilm high 32...35ºC probele de analizat (1-2 celule g-1);
sensivity coliforms • permite inocularea a 5 ml probă, sau diluţii ale
count) acesteia;
• evaluare similară ca şi în cazul utilizării Petrifilmelor
tip PCC.
P 2000 CC Bacterii coliforme 24 ± 2 ore, 35 ± • dezvoltarea rapidă a bacteriilor coliforme;
(Petrifilm rapid 1ºC • indicator de pH foarte sensibil, cu evidenţierea
coliforms count) producerii de acid, chiar de la începutul formării coloniilor;
• reducerea timpului de analiză prin asigurarea unei
creşteri accelerate;
• rezultate test prezumtiv în 6-14 h, cu confirmare în 18
-24 h.
PEC Escherichia coli 48 ± 2 ore, 35 ± • două teste în unul singur: evaluarea cantitativă a
(Petrifilm E. coli) 1ºC coliformilor fecali şi a lui E. coli;
sau • conţine indicator β-glucuronidază pentru evidenţierea
selectivă a tulpinilor de E. coli;
24 ± 2 ore, 42 ± • rezultate pozitive în 24 - 48 ore;
1ºC • înaltă selectivitate.
Petrifilm Kit HEC Escherichia coli 48 ± 2 ore, 35 ± • evidenţierea serotipurilor E. coli enteropatogene
tip 1ºC (O157: H7), care produc glucuronaze;
enterohemoragic sau • se bazează pe utilizarea membranei active ELISA,
24 ± 2 ore, 42 ± care se menţine 2 minute în contact cu Petrifilmul, iar
1ºC după 18 ore de termostatare testul pozitiv se evidenţiază
prin apariţia unor pete gri pe membrană.
Petrifilm Enterobacterii 24 ± 2 ore, 30 ± • evidenţierea bacteriilor din familia
Enterobacteriaceae 1ºC sau 37 ± Enterobacteriaceae;
1ºC • producerea de acid este pusă în evidenţă cu ajutorul
unui indicator de pH, ce virează în galben în mediu acid;
• evidenţierea formării de gaz prin fermentaţia
heterolactică a lactozei.
Petrifilm Staph Staphylococcus 24 ± 2 ore, 37 ± • evidenţierea selectivă a tulpinilor de Staphylococcus
Express Count aureus 15ºC aureus prin formarea de colonii de culoare roşu-violet;
System (Petrifilm • confirmarea prezenţei lui Staphylococcus aureus, cu
Staph Express ajutorul discului, care conţine albastru-toluidină-O, ce
Count Plate + facilitează developarea unei zone de culoare roz (reacţie
Petrifilm Staph DN-ază pozitivă), în jurul coloniilor specifice.
Express Disk)

1
|Anexa 1

Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

Garanţia utilizării Petrifilmelor este validată oficial de numeroase asociaţii de renume din
întreaga lume (tabelul 2). Validarea s-a realizat pe trei criterii de bază: reproductibilitate,
repetabilitate şi precizie.
Tabelul 2. Validarea oficială a utilizării Petrifilmelor pentru evaluarea calităţii microbiologice a
alimentelor
Organizaţia Produse pentru care s-a Indicator microbiologic
internaţională* realizat validarea
AOAC Majoritatea alimentelor Drojdii şi mucegaiuri
Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme şi Escherichia coli
Petrifilm seria 2000 (P 2000 CC) pentru
determinarea rapidă a bacteriilor coliforme
ANFOR Majoritatea alimentelor Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme şi Escherichia coli Petrifilm seria
2000 (P 2000 CC) pentru determinarea rapidă a
bacteriilor coliforme
Enterobacterii
NMKL Majoritatea alimentelor Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme şi Escherichia coli
VDIA Lapte şi produse lactate Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme
HPB Lapte şi produse lactate Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme
Alte alimente Drojdii şi mucegaiuri
Evaluarea calităţii mediului Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme şi Escherichia coli
Test Kit HEC
* AOAC – Association of Official Analytical Chemists (SUA); AFNOR – French Standardization Association (Franţa);
NMKL – Nordic Committee of Food Analysis; VDIA – Victorian Dairy Industry Authority (Australia);
HPB – Health Protection Branch, Compendium of Analytical

Analiza comparativă a fidelităţii evaluărilor cantitative, pentru patru indicatori


microbiologici: drojdii şi mucegaiuri, bacterii aerobe mezofile, bacterii coliforme şi
Escherichia coli, realizată pentru tipuri diferite de produse alimentare prin utilizarea
Petrifilmelor, în paralel cu tehnicile culturale clasice ce utilizează medii selective
(OGYE, PCA, VRBL, EMB), a evidenţiat că evaluările privind numărul total de drojdii şi
mucegaiuri au condus la rezultate inferioare, în variantele analizelor realizate cu
Petrifilme, comparativ cu metodele convenţionale.
Explicaţia constă probabil în existenţa unei suprafeţe insuficiente pentru creşterea
extinsă a coloniilor de mucegai, ceea ce conduce în multe cazuri la suprapunerea
coloniilor, generând erori în evaluarea corectă a unităţilor formatoare de colonii (ufc). De
remarcat este faptul că la Petrifilmele destinate evaluării drojdiilor şi mucegaiurilor,
suprafaţa mediului de cultură este de 30 cm2, comparativ cu 20 cm2, în cazul majorităţii
Petrifilmelor concepute pentru studiul bacteriilor (Jordano şi colab., 1995).

Pag 5
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

Evaluările statistice, realizate pe baza coeficienţilor de corelaţie şi a pantei ecuaţiilor de


regresie liniară, oferă certitudini privind fidelitatea rezultatelor pentru principalii indicatori
microbiologici şi recomandă utilizarea Petrifilmelor ca o alternativă la metodele
microbiologice convenţionale pentru controlul microbiologic, realizat atât pe faze de
fabricaţie, cât şi în cazul materiilor prime şi al produselor finite (tabelul 3).

Tabelul 3. Evaluări statistice privind acurateţea analizelor microbiologice realizate cu Petrifilme,


comparativ cu metodele convenţionale (Jordano 1995, 1999)
Parametrul statistic Indicatorul microbiologic Petrifilme/ Metode culturale
clasice*
Coeficient de corelaţie Bacterii aerobe mezofile 0,897
Bacterii coliforme 0,861
Drojdii şi mucegaiuri 0,981
Panta ecuaţiei de Bacterii aerobe mezofile 0,599
regresie Bacterii coliforme 1,051
Drojdii şi mucegaiuri 0,998
* Valori medii pentru 5 probe în paralel (n = 5)

Datele obţinute, exprimate ca valori medii, stabilite prin calcul statistic (P > 0,05), pentru
cinci probe în paralel (n = 5), certifică fidelitatea şi acurateţea analizelor realizate cu
Petrifilme, amplificarea preciziei realizându-se prin asigurarea condiţiilor selective de
cultivare şi interpretare a rezultatelor, ceea ce permite evaluarea corectă şi distinctivă a
speciilor analizate (fig. 5).

1 2

3 4

Fig. 5. Dezvoltarea selectivă a microorganismelor în funcţie de natura Petrifilmelor


1 – drojdii şi mucegaiuri; 2 – bacterii aerobe mezofile; 3 – enterobacterii; 4 – bacterii coliforme/
Escherichia coli

Pag 6
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

În concluzie, implementarea utilizării Petrifilmelor în controlul calităţii microbiologice a


alimentelor oferă numeroase facilităţi care se reflectă în:
 uşurinţa în exploatare; analiza presupune parcurgerea a numai trei etape: inoculare,
termostatare şi evaluare cantitativă şi calitativă;
 simplitate în utilizare şi în interpretarea cu acurateţe a rezultatelor, prin crearea unor
condiţii selective de creştere şi de evaluare a microorganismelor testate. Evaluările
cantitative sunt facilitate, chiar în cazul dezvoltării unui număr mare de colonii, prin
caroiajul tipărit pe filmul inferior, care delimitează suprafeţe de 1 ml;
 reducerea semnificativă a costului manoperei per analiză;
 reducerea la jumătate a timpului necesar pentru realizarea analizelor
microbiologice, cu impact pozitiv asupra: controlului eficient al punctelor critice,
optimizării strategiilor de control, creşterii numărului de analize efectuate, eficientizării
procesării, îmbunătăţirii calităţii şi asigurării inocuităţii produselor finite;
 impact pozitiv asupra organizării laboratorului de microbiologie, prin eliminarea
operaţiilor de pregătire şi sterilizare a mediilor de cultură şi a ustensilelor de laborator,
impuse de metodele convenţionale de analiză microbiologică;
 riscuri reduse pentru mediul înconjurător după utilizare; volum redus de produse
reziduale la finalul analizei care pot fi uşor anihilate pin incinerare;
 economie de spaţiu la transport, păstrare şi termostatare (un pachet de 50 de
Petrifilme ocupă un spaţiu similar cu cel ocupat de 2 plăci Petri clasice);
 valabilitate prelungită (mai mult de un an, prin menţinere la 4ºC).
Practica a demonstrat că există şi unele limitări în utilizarea Petrifilmelor generate de
(Williams şi Busta, 1999b):
capacitatea unor microorganisme de a produce hidroliza agentului de
solidificare, ceea ce conduce la răspândirea şi suprapunerea coloniilor;
unii compuşi din alimente (acizi, săruri etc.) pot exercita efect inhibitor asupra
dezvoltării coloniilor în cazul utilizării Petrifilmelor, comparativ cu tehnicile clasice.
Studii efectuate în 85 de companii producătoare de alimente, privind eficienţa
economică a tehnicilor de evaluare a calităţii microbiologice, au demonstrat că
manopera se reflectă în proporţie de 70,7 % în costul tot al analizelor, iar prin utilizarea
Petrifilmelor se pot economisi anual 99-400 ore, timp ce poate fi valorificat pentru
elaborarea de programe eficiente pentru evaluarea calităţii şi creşterea numărului de
analize (Jordano, 1999).

Pag 7
MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A
CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

ANEXA 1
Tipuri de Petrifilme comerciale
Tip Petrifilm/ Grup de Exemple Tip Petrifilm/ Grup Exemple
microorganisme analizate de microorganisme
analizate

Petrifilm yeast/mould Petrifilm high


sensivity coliforms
Drojdii şi mucegaiuri
count)
Bacterii coliforme

Petrifilm aerobic count Petrifilm rapid


coliforms count
Bacterii aerobe mezofile
Bacterii coliforme

Petrifilm coliforms count Petrifilm E. coli


Bacterii coliforme Escherichia coli

Petrifilm E. coli / Coliform Petrifilm


count plate Enterobacteriaceae
Bacterii coliforme şi E. coli Enterobacterii

Petrifilm Staph Express Petrifilm


Count System (Petrifilm Environmental
Staph Express Count Plate Listeria plate
+ Petrifilm Staph Express
Listeria
Disk)
Staphylococcus aureus

Pag 8
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI

BACTERII COLIFORME.
COLIFORMI FECALI SI ESCHERICHIA COLI

Bacteriile coliforme conform definiţiei ISO sunt bacterii Gram negative nesporulate,
oxidazo-negative, aerobe sau facultativ anaerobe, ce pot să se înmulţească în prezenţa
sărurilor biliare (care inhibă dezvoltarea bacteriilor Gram pozitive sau a altor agenţi cu
proprietăţi echivalente), capabile de a produce fermentaţia heterolactică a lactozei cu
producere de acid lactic şi gaze, in timp de 48 ore si la temperaturi de 35-37°C.
Grupul bacteriilor coliforme cuprinde speciile: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloaceae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter
freundii, Citrobacter diversum, Citrobacter amalonatica
Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza sunt: lapte şi
produse lactate, carne şi produse din carne, peşte şi produse din peşte, băuturi
alcoolice, băuturi nealcoolice, produse de cofetărie şi patiserie

PRINCIPIU METODEI
Metoda pentru determinarea bacteriilor coliforme include trei etape diferite de analiza
concretizate in: testul prezumtiv, testul de confirmare şi testul complet, bazate pe
capacitatea bacteriilor de a fermenta lactoza cu producere de acid lactic, CO2, H2, în
timp de 48 ore la 35°C.
Testul prezumtiv constă in inocularea probei în mediu nutritiv cu lactoză. Aprecierea
probelor pozitive se face fie în funcţie de prezenţa gazelor acumulate în tubul Durham,
fie ca urmare a scăderii pH-ului prin acumularea de acid lactic.
Testul de confirmare constă in transferul si inocularea din eprubetele pozitive ale
testului prezumtiv in medii selective care favorizează dezvoltarea bacteriilor coliforme
de origine fecala.
Testul complet permite identificarea speciilor grupului bacteriilor coliforme şi se bazează
pe testarea unor proprietăţi biochimice caracteristice.
Din grupul bacteriilor coliforme specia Escherichia coli, este indicatorul care certifica o
contaminare fecală recentă.

MODUL DE LUCRU
 DETECTIA COLIFORMILOR TOTALI
Analiza se efectuează în două etape, după cum urmează:
1. Etapa de îmbogăţire (testul prezumtiv) are rolul de a previziona prezenţa
bacteriilor coliforme şi multiplicarea acestora, dacă sunt în concentraţii reduse, în
vederea evidenţierii lor facile în etapa următoare.

Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI

2. Etapa de confirmare certifică prezenţa bacteriilor coliforme prin cultivare în


condiţii selective specifice.
Pornind direct de la eşantionul de analiză (în cazul unui produs lichid) sau de la
suspensia iniţială (10-1) (în cazul unui produs solid), în funcţie de gradul de contaminare
presupus se pot adopta două modalităţi de evaluare. Astfel, se pot folosi pentru
inoculare câte 10 ml de probă (pentru probele cu grad de contaminare mai redus)
utilizând mediu selectiv de îmbogăţire dublu concentrat, sau câte 1 ml de probă prin
inoculare în mediu selectiv de îmbogăţire simplu concentrat. Pentru acest din urmă caz,
se inoculează serii de câte trei eprubete în paralel pentru şi pentru următoarele diluţii
succesive: 10-1, 10-2,…..ş.a.
Probele inoculate se termostatează la temperatura de 37°C, timp de 24-48 h. Se
înregistrează eprubetele pozitive (mediu tulbure, bule de gaz în plutitor), iar eprubetele
negative sunt din nou termostatate timp de 24 h şi se înregistrează din nou eprubetele
pozitive.
Pentru confirmare, din eprubetele pozitive se recoltează câte o ansă şi se inoculează
eprubete cu bulion lactoză bilă verde briliant; după termostatare la temperatura de
37°C, timp de 48 h, în condiţiile în care se produc gaze în plutitor, tulburare, si virajul
culorii indicatorului verde briliant de la verde la galben, se confirma ca în produsul
analizat sunt prezente bacteriile coliforme (fig. 1).
 EVIDENTIEREA PREZENTEI BACTERIILE COLIFORME DE ORIGINE
FECALA
Testul constă în transferul cu o ansă a probelor din eprubetele pozitive ale testului
prezumtiv, în eprubete cu mediu E.C. şi termostatare la temperatura de 45.5°C, timp de
24 de ore.
 CERTIFICAREA PREZENTEI SPECIEI Escherichia coli
Din eprubetele pozitive ce conţin mediu E.C., după termostatare la temperatura de
45.5°C, timp de 24 de ore, se fac trasări aplicând metode scarificate pe suprafaţa
mediului Levine cu agar, repartizat în plăci pentru a obţine colonii distincte. Se
termostatează apoi la temperatura de 35°C, timp de 18-24 de ore.
Din coloniile caracteristice se fac inoculări pentru testele biochimice denumite generic
IMViC*, care permit diferenţierea a lui E. coli de Enterobacter aerogenes.
*I – producere de indol din triptofan
M – reacţia faţă de roşu de metil
V – reacţia Vages Proskauer de producere a acetoinei
C – utilizarea citratului.
Diferenţiere intre specii se face pe baza proprietarilor dopa cum urmează :
Specii I M V C Mobilitate
Escherichia coli + + - - +
Enterobacter - - + + -
aerogenes

Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI

Suspensie iniţială (produs solid)


Eşantion de analiză (produs lichid)
-2 -3
Etapa de 10
- 10 /10
1 -2
îmbogăţire /10

10 ml 10 ml 10 1 ml 1 ml 1 ml Idem Idem
ml
+ + + + + +
10 ml 10 ml 10 10 10 ml 10
1) 1) 2)
Mîdc Mîdc ml ml Mîsc ml
1) 2) 2)
Mîdc Mîsc Mîsc

Termostatare 24h Termostatare 48h4) Idem Idem

Etapa de
confirmare
+* + -

10 ml 10 ml 10 10 10 ml Idem Idem
3)
BLBV BLBV ml ml BLBV
BLBV BLBV

Termostatare 48h ± Termostatare


2h 4) 48h ± 2h 4)

Interpretarea +** + - +** - Idem Idem


rezultatelor
Calculul MPN

Fig. 1. Schema de lucru pentru evaluarea cantitativă a bacteriilor coliforme prin tehnica
numărului probabil
Legendă:
1)
Mediu selectiv de îmbogăţire dublu concentrat (Mîdc) + tub Durham
2)
Mediu selectiv de îmbogăţire simplu concentrat (Mîsc) + tub Durham
3)
Mediu selectiv de confirmare + tub Durham
4)
Temperatura de termostatare poate fi 30ºC, 35ºC sau 37ºC şi este stabilită în funcţie de scopul analizei şi anume: scop
tehnologic sau evaluarea riscului privind siguranţa alimentară; în anumite cazuri testul pozitiv poate fi evidenţiat şi după o
perioadă de termostatare de 24 h ± 2h
* Probă pozitivă: modificarea turbidităţii; reducerea pH-ului; acumularea de gaz în tubul Durham
** Probă pozitivă: modificarea turbidităţii; virajul culorii mediului din verde în galben; acumularea de gaz în tubul Durham

Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI

CALCULUL ŞI INTERPRETAREA REZULTATELOR


Folosind, metoda titrului, in funcţie de numărul eprubetelor pozitive se stabileşte cifra
caracteristica si din tabelul lui Mac Cready (tabel 1), corespunzător cifrei caracteristice
si numărul de eprubete inoculate in paralel, se determina numărul probabil de coliformi
(MPN)
Pentru a calcula numărul probabil de coliformi/cm3 probă, valoarea din tabel se
înmulţeşte cu factorul de diluţie corespunzător primei cifre din cifra caracteristică.
Tabel Mac Cready
Cifra Număr probabil Cifra Număr probabil Cifra Număr probabil
caracteristica de caracteristică de caracteristica de
microorganisme microorganisme microorganisme
000 0.0 201 1.4 302 6.5
001 0.3 202 2.0 310 4.5
010 0.3 210 1.5 311 7.5
011 0.6 211 2.0 312 11.5
020 0.6 212 3.0 313 16.0
100 0.4 220 2.0 320 9.5
101 0.7 221 3.0 321 15.0
102 1.1 222 3.5 322 20.0
110 0.7 223 4.0 323 30.0
111 1.1 230 3.0 330 25.0
120 1.1 231 3.5 331 45.0
121 1.5 232 4.0 332 110
130 1.6 300 2.5 333 140
200 0.9 301 4.0

Interpretarea rezultatelor
Pentru fiecare eşantion examinat se reţin trei diluţii consecutive, care, după caz,
corespund uneia dintre situaţiile următoare:
1) Cel puţin o diluţie prezintă trei eprubete pozitive. Se alege diluţia cea mai mare
(adică cea care corespunde celei mai mici concentraţii de eşantion inoculat) care
prezintă trei eprubete pozitive, şi încă două diluţii succesive. Dacă schema de diluţie
adoptată este necorespunzătoare, adică nu există diluţii la care să se fi înregistrat şi
probe negative, se aleg cele mai mari trei diluţii succesive din serie (adică cele care au
cea mai scăzută concentraţie de probă inoculată).
2) Nu există cazuri e să prezinte trei eprubete pozitive. Cazul 1 nu poate fi aplicat.
Se aleg cele mai mari trei diluţii succesive din serie (adică cele care au cea mai
scăzută concentraţie de probă inoculată), care conţin cel puţin un răspuns pozitiv.
3) Cazuri particulare. În toate cazurile în care mai mult de una dintre cele trei diluţii
de la pct. 1) şi 2) nu prezintă eprubete pozitive (adică cea în care s-a inoculat cea mai
mare cantitate de probă) şi cele două diluţii consecutive mai mici (adică cele în care
concentraţiile de probă inoculată sunt de 10 şi respectiv 100 de ori mai mici decât în
prima diluţie aleasă), excluzând cazul în care se înregistrează probe pozitive, doar la
prima diluţie preparată, pornind de la eşantion. În acest ultim caz, se vor reţine primele
trei diluţii, chiar dacă seria include două diluţii care nu prezintă nici o probă pozitivă.

Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI

Calcul MPN1
Pentru a stabili MPN/g sau ml probă se recomandă utilizarea aproximaţiei
propusă de Thomas, stabilită prin formula:
P
MPN / g (ml ) =
(N + T ) 12
în care: P – numărul de eprubete pozitive;
N – cantitatea de probă inoculată în probele negative, g sau ml
T – cantitatea totală de probă luată în analiză (inoculată în toate seturile de
probe realizate în paralel), g sau ml
Pentru fiecare analiză trebuie să se decidă categoria de rezultate acceptată,
adică 1, 1 şi 2, sau 1, 2 şi 3. Astfel, gradul de contaminare va corespunde cu MPN
calculat, conform specificaţiilor din tabelul 1.
Tabelul 1. Măsuri privind interpretarea şi acceptabilitatea rezultatelor analizei

Categoria Definiţie
1 Rezultatul este unul din cele care au cea mai mare şansă de a fi obţinute.
Şansa de a obţine acest rezultat (care este mai puţin probabil decât cel mai puţin
probabil) este de cel mult 5% în această categorie.
2 Rezultatul este unul din cele care au cea mai mică şansă de a fi obţinute, chiar
decât cel mai puţin probabil din categoria 1.
Există şansa de cel mult 1% de a obţine un rezultat mai puţin probabil decât cel mai
puţin probabil în această categorie.
3 Rezultatul este unul dintre cele care au cea mai mică şansă de a fi obţinute, chiar
decât cel mai puţin probabil din categoria 2.
Există şansa de cel mult 0,1% de a obţine un rezultat care este mai puţin probabil
decât cel mai puţin probabil în această categorie.
0 Rezultatul este unul dintre cele care au cea mai mică şansă de a fi obţinute, chiar
decât cel mai puţin probabil din categoria 3.
Nu există decât o şansă de 0,1% de a obţine un rezultat în această categorie, fără
erori de analiză
După alegerea setului de trei diluţii reprezentative pentru stabilirea MPN, care,
conform uneia din situaţiile de mai sus, sunt acceptabile din punct de vedere statistic.
Acceptabilitatea depinde totodată de numărul de eşantioane analizate şi de decizia de a
accepta sau refuza rezultatele din categoria 2.
Un exemplu de alegere a diluţiilor pentru calculul valorii MPN este prezentat în
tabelul 2.
Acceptarea rezultatelor va ţine seama de categoria impusă. Astfel, atunci când
sunt acceptate numai rezultate numai din categoria 1, combinaţia 221 nu poate fi

1
numărul cel mai probabil (MPN)

Pag 5
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI

reţinută decât dacă au fost examinate 10 probe în paralel (din lotul considerat). În cazul
când sunt acceptate mai puţin probabile (din categoria 2), combinaţia 221 va fi reţinută
în cazul în care au fost examinate 2, 3 sau 5 probe în paralel. Dacă combinaţia 221 este
rezultatul unei singure analize, acesta nu poate constitui o bază pentru stabilirea MPN.

Tabelul 2. Stabilirea valorii MPN în funcţie de diagrama probelor pozitive (adaptare după SR
ISO 4831, 1992)
2)
Exemplu Numărul de eprubete pozitive corespunzător seturilor de trei MPN
eprubete termostatate, corespunzând următoarelor cantităţi
1)
de eşantion inoculate în fiecare eprubetă
-1 -2 -3
Produs 10 ml 1ml 10 ml 10 ml 10 ml MPN/ml MPN/g
lichid
-1 -2 -3 -4
Alt produs 1g 10 g 10 g 10 g 10 g
1 3 3 2 1 0 1,5·101 1,5·102
2 3 3 3 0 2,4·101 2,4·102
3 2 2 1 1 0 7,4 7,4·10
4 3 3 0 0 0 2,4 2,4·10
5 2 2 0 1 1 2,1·10-1 2,1
1)
Seria (combinaţia) de eprubete aleasă
2)
Conform datelor din tabelele întocmite pe baze statistice

Pag 6
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI

ANEXA 1
COMPOZIŢIA MEDIILOR DE CULTURĂ

Denumirea Compoziţie Instrucţiuni de pregătire


Etapa mediului
Etapa de Bulion- Mediu dublu concentrat: Se dizolvă componentele sau mediul
îmbogăţire triptonă Triptonă ............................... 40,0g comercial în apă, încălzind dacă este
şi lauril sulfat Lactoză ................................ 10,0g nevoie.
K2HPO4 ................................ 5,5 g Se ajustează pH-ul dacă este nevoie.
(mediul KH2HPO4 ............................. 5,5 g Se repartizează câte 10 ml de mediu
selectiv de NaCl..................................... 10,0g dublu concentrat în eprubete mari
îmbogăţire) Lauril sulfat de sodiu ............. 0,2g (20mm x 200mm), fără tub Durham.
Apă .................... până la 1000 ml Se repartizează câte 10 ml de mediu
pH=6,8; la temperatura de 25ºC simplu concentrat în eprubete mici
(după sterilizare) (16mm x 160mm), cu tub Durham.
Mediu simplu concentrat Se sterilizează în autoclav la 121ºC,
Triptonă ............................... 20,0g timp de 15 minute.
Lactoză .................................. 5,0g Tuburile Durham nu trebuie să conţină
K2HPO4 ............................... 2,75g bule de aer după sterilizare.
KH2HPO4 ............................ 2,75g
NaCl....................................... 5,0g
Lauril sulfat de sodiu ............. 0,1g
Apă .................... până la 1000 ml
pH=6,8; la temperatura de 25ºC
(după sterilizare)
Etapa de Bulion Peptonă ............................... 10,0g Se dizolvă componentele sau mediul
confirmare lactozat cu Lactoză ................................ 10,0g comercial în apă, încălzind dacă este
bilă şi verde Bilă....................................... 20,0g nevoie.
briliant Verde briliant ................... 0,0133g Se ajustează pH-ul dacă este nevoie.
(BLBV) Apă ...................... până la 1000ml Se repartizează câte 10 ml de mediu
pH=7,2; la temperatura de 25ºC în eprubete mici (16mm x 160mm), cu
(mediul de (după sterilizare) tub Durham. Se sterilizează în
confirmare) autoclav la 121ºC, timp de 15 minute.
Tuburile Durham nu trebuie să conţină
bule de aer după sterilizare.
Mediu Levine Peptonă ............................... 10,0g Se sterilizează în autoclav la 121ºC,
Lactoză ................................ 10,0g timp de 15 minute.
K2HPO4 .................................. 2,0g
Eozină .................................. 0,4g
Albastru de metilen........... 65,0mg
Geloză ................................ 15,0g
Apă ...................... până la 1000ml
pH=7.1;
Mediu EC Triptoză .............................. 20,0g Se sterilizează în autoclav la 121ºC,
(mediul Lactoză .................................. 5,0g timp de 15 minute.
selectiv Săruri biliare .......................... 1,5g Se repartizează câte 10 ml de mediu
confirmare) Fosfat dipotasic ..................... 4,0g în eprubete mici, cu tub Durham.
Fosfat monopotasic ............... 1,5g
Clorură de sodiu .................... 5,0g
Apă ...................... până la 1000ml
pH=6.9;

Pag 7
MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI
SANITARI

REZULTATE LUCRARE __________


Nume______________________________
Grupa______________________________
Data_______________________________

BACTERII COLIFORME.
COLIFORMI FECALI SI Escherichia coli

1. Înregistraţi in tabelul de mai jos probele pozitive:


a. Etapa de îmbogăţire (testul prezumtiv)

Proba
Diluţia

1
2

b. Etapa de confirmare

Proba
Diluţia

1
2

Stabiliţi gradul de contaminare exprimat in numărul probabil de bacterii coliforme/cm3


probă:

Proba 1 _______________________

Proba 2 _______________________
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

DETERMINAREA NUMĂRULUI DE BACTERII Staphylococcus aureus


(COAGULAZO POZITIVI)

Staphylococcus aureus (stafilococi coagulazo-pozitivi) - bacterii care formează


colonii caracteristice şi/sau necaracteristice la suprafaţa unui mediu de cultură selectiv
şi care dau o reacţie puternic coagulază pozitiv.
Prezenta procedură de lucru stabileşte modul de evidenţiere şi numărare a stafilococilor
coagulazo-pozitivi din produsele alimentare (Anexa 1).

PRINCIPIUL METODEI
Prin această metodă, numărul de bacterii aparţinând speciei Staphylococcus aureus se
apreciază indirect, pe baza numărului de colonii generate de celulele acestei bacterii
prezente în proba de analizat, care se formează când proba sau o diluţie a acesteia
vine în contact cu un mediu nutritiv gelozat (inoculat în două probe în paralel), după
termostatare la temperatura de 35°C sau 37°C, timp de 24-48 de ore.

MATERIALE ŞI STICLĂRIA PENTRU DETERMINARE


 Plăci Petri Φ10 cm sterile;
 Pipete de 1 cm3 sterile;
 Eprubete sterile;
 Eprubete cu câte 10 ml mediu Baird-Parker cu geloză;
 Eprubete cu câte 10 ml bulion inimă-creier steril;
 Baloane cu ser fiziologic steril;
 Ansă cu buclă cu diametrul de 3 mm;
 Pungi sterile pentru omogenizarea probelor solide sau semisolide;
 Numărător de colonii.

MEDII DE CULTURĂ ŞI REACTIVI PENTRU DETERMINARE


Mediile de cultură utilizate pentru determinare sunt (Anexa 2):
 Mediu cu geloză Baird-Parker
 Bulion de inimă-creier
 Plasmă de iepure

Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Cerinţe:
 Apa folosită trebuie să fie distilată sau demineralizată, lipsită de substanţe care
să inhibe dezvoltarea celulelor de Staphylococcus aureus în condiţiile analizei;
 Reactivii chimici utilizaţi trebuie să fie de calitate recunoscută;
 Pentru prepararea soluţiilor de diluare şi a mediilor de cultură se vor utiliza
componente de bază deshidratate sau medii comerciale deshidratate;
 Pentru emulsia de gălbenuş de ou se recomandă utilizarea unui preparat
comercial, respectând cu stricteţe instrucţiunile fabricantului.

MODUL DE LUCRU
Pentru evidenţierea bacteriilor Staphylococcus aureus se fac inoculări în mediul Baird-
Parker cu geloză, prin metoda încorporării în mediul nutritiv. Din probele lichide se pot
realiza diluţii decimale direct în eprubete, în timp ce pentru probele solide sau
semisolide se realizează o omogenizare şi suspendare în ser fiziologic steril.
Se cântăresc în condiţii aseptice 10 g din produsul de analizat, folosind drept suport o
pungă sterilă. Se adaugă 90 cm3 ser fiziologic steril, se închide punga şi se introduce în
omogenizator. Se omogenizează timp de 1 min în treapta a doua, după care se
continuă diluarea în eprubetele cu ser fiziologic steril.
Inoculările se fac din 3 diluţii succesive ale probei, alese convenabil, în funcţie de gradul
presupus de contaminare a probei. Pentru fiecare din diluţiile alese, se inoculează câte
1 cm3 în câte două plăci Petri. Pentru a obţine colonii uniform repartizate, după turnarea
în plăci a mediului fluidificat şi răcit la 47±1°C, se omogenizează conţinutul cutiei Petri
prin mişcări de rotaţie executate în plan orizontal, după care se lasă în repaus până la
solidificare totală.
După inoculare, probele sunt termostatate timp de 24-48 de ore la temperaturi de 35±
1°C sau la 37±1°C, apoi se marchează pe reversul mediului coloniile caracteristice. Se
continuă termostatarea la temperatura de 35± 1°C sau la 37±1°C, timp de încă 22-24
de ore şi se marchează toate coloniile caracteristice; se marchează şi coloniile
necaracteristice eventual prezente. Se reţin pentru numărare plăcile Petri care conţin
între 15-150 colonii caracteristice şi/sau necaracteristice.
Prin numărare se stabileşte numărul de ufc (unităţi formatoare de colonii) care
reprezintă numărul prezumtiv de bacterii ale speciei Staphylococcus aureus, prezente
în proba de analizat.
Din fiecare placă Petri se aleg pentru confirmare cinci colonii caracteristice şi/sau
necaracteristice (după caz).

Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Pentru confirmarea prin proba coagulazei se procedează astfel: din fiecare colonie
reţinută se prelevează biomasă cu ajutorul unei anse sterile şi se inoculează în câte o
eprubetă ce conţine 10 ml bulion inimă-creier. Probele inoculate se termostatează la
37±0,5°C, timp de 18-24 de ore. Se amestecă în eprubete sterile 0,1 ml cultură
recoltată în condiţii sterile 0,3 ml plasmă de iepure şi se termostatează la temperaturi de
35-37°C, timp de 1-6 ore.
Se consideră că reacţia este pozitivă când coagulul ocupă mai mult de trei pătrimi din
volumul ocupat iniţial de lichid.
Pentru control, se adaugă 0,1 ml bulion inimă-creier steril în 0,3 ml plasmă de iepure şi
termostatează în condiţii similare cu probele de analizat. Plasma din eprubeta martor nu
trebuie să prezinte semne de coagulare.

INTERPRETAREA REZULTATELOR
În interpretarea rezultatelor se vor ţine cont de următoarele recomandări:
- coloniile caracteristice sunt negre, strălucitoare şi convexe, diametrul de 1..1,5
mm, după 24 de ore de termostatare, şi de 1,5-2,5 mm, după 48 de ore de
termostatare, şi sunt înconjurate de o zonă clară sau parţial opacă;
- coloniile necaracteristice au caractere culturale asemănătoare, dar sunt lipsite
de zonă clară; coloniile necaracteristice sunt constituite adesea de tulpini de
Staphylococcus aureus care contaminează produsele lactate;
- dacă la o diluţie predomină un tip de colonii, iar la o diluţie diferită predomină alt
tip de colonii, se reţin plăcile corespunzătoare ambelor diluţii.
Pot fi întâlnite următoarele situaţii:
1) Dacă cel puţin 80% dintre coloniile selecţionate sunt coagulazo-pozitiv se ia ca
număr prezumtiv de Staphylococcus aureus, numărul de ufc obţinut prin numărarea
coloniilor selectate pentru numărare.
2) În toate celelalte cazuri, numărul se calculează pornind de la procentul de
Staphylococcus aureus prezumtiv, care sunt coagulazo-pozitiv.
Calculul pentru determinarea bacteriilor Staphylococcus aureus prin numărare
Pentru plăcile care conţin între 15 şi 150 de colonii caracteristice şi/sau necaracteristice
pentru două diluţii consecutive, numărul de ufc de Staphylococcus aureus se calculează
media aritmetică a valorilor obţinute, exceptând cazul când raportul dintre valoarea cea
mai mare şi valoarea cea mai mică este mai mare decât 2; în acest caz se reţine ca
rezultat valoarea cea mai mică. Dacă în plăcile Petri alese pentru numărare sunt

Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

prezente colonii caracteristice şi/sau necaracteristice, aceste colonii se numără


separate. Se adună mediile obţinute din coloniile caracteristice şi/sau necaracteristice,
luând în considerare, pentru fiecare, factorul de diluţie.
Nu se reţin decât două cifre semnificative, procedând după cum urmează:
- dacă numărul este mai mic de 100, se rotunjeşte la cel mai apropiat multiplu de 5;
- dacă numărul este mai mare de 100 şi se termină cu 5, se rotunjeşte la cel mai
apropiat multiplu de 20;
- dacă numărul este mai mare de 100 şi nu se termină cu 5, se rotunjeşte la cel mai
apropiat multiplu de 10
Pentru a obţine ufc/ml produs lichid sau ufc/g produs solid, după caz, se multiplică
valoarea obţinuta anterior cu inversul volumului inoculului şi apoi cu inversul diluţiei
eşantionului analizat.
Rezultatul se exprimă printr-un număr cuprins între 1,0 şi 9,9 multiplicat cu 10n, unde n
este puterea corespunzătoare.
Pentru o estimare a numerelor mici, se face o medie din numărul coloniilor confirmate,
caracteristice şi necaracteristice şi se rotunjeşte la numărul întreg următor cel mai
apropiat.
Dacă numărul mediu al coloniilor confirmate este mai mic de 15, rezultatul se exprimă
sub forma:
a) pentru produse lichide:
- mai puţin de 15x ne Staphylococcus aureus per mililitru; unde ne = 1/volum de
inocul
b) pentru alte tipuri de produse:
- mai puţin de 15x Ne Staphylococcus aureus per gram; unde
Ne = 1/volum de inocul x 1/diluţia eşantionului analizat
c) estimarea numerelor mici în produsele lichide:
- m x ne Staphylococcus aureus per mililitru; unde m = numărul de colonii confirmate
d) estimarea numerelor mici în alte tipuri de produse:
- m x Ne Staphylococcus aureus per gram; unde m = numărul de colonii confirmate
Limitele de încredere ale estimărilor de numere mici sunt prezentate în tabelul de mai
jos. Limitele de încredere cu o probabilitate de 95% din estimările de numere mici
(variantele c) şi d)), atunci când numărul mediu de colonii confirmate în două plăci Petri

Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

inoculate cu eşantionul de analiză sau o diluţie a acestuia este mai mic de 15 ufc sunt
prezentate în tabelul de mai jos:
Limite de încredere pentru estimări de numere mici
Staphylococcus aureus Limita de încredere la nivelul de 95%
ufc/ml sau ufc/g inferioară superioară
1 <1 2
2 <1 4
3 <1 5
4 1 6
6 2 9
7 2 12
8 3 13
9 4 14
10 4 16
11 5 18
12 6 19
13 7 20
14 7 21
15 8 23
Dacă nu există nici o colonie confirmată rezultatul se exprimă sub forma:
a) pentru produse lichide:
- - mai puţin de 1 x ne Staphylococcus aureus per mililitru
b) pentru alte tipuri de produse:
- - mai puţin de 1 x Ne Staphylococcus aureus per gram

Pag 5
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE ALIMENTE

1. Pâine şi produse de panificaţie


2. Lapte şi produse lactate
3. Carne şi produse din carne
4. Peşte şi produse din peşte
5. Uleiuri şi grăsimi
6. Ouă şi produse pe bază de ou
7. Zahăr şi produse zaharoase
8. Fructe. Legume şi produse prelucrate
9. Băuturi alcoolice
10. Băuturi nealcoolice
11. Produse de cofetărie şi patiserie
12. Produse de catering
13. Semipreparate
14. Cereale şi produse din cereale
15. Condimente, supe, sosuri, salate
16. Îngheţate
17. Alimente cu destinaţie specială
18. Alte alimente

Pag 6
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

ANEXA 2
Prepararea mediilor de cultură şi a reactivilor pentru determinare

1. Mediul cu geloză Baird-Parker


Compoziţie:
Mediu de bază ................................................. 90 ml
Soluţie telurit de potasiu ..................................... 1ml
Soluţie piruvat de sodiu .................................. 5,0 ml
Emulsie de gălbenuş de ou ............................ 5,0 ml
Preparare: Se solubilizează mediul de bază, apoi se răceşte la circa 50°C pe baia de apă. Se adaugă
celelalte componente, omogenizând cu grijă după fiecare adaos.

1.1. Mediu de bază


Compoziţie:
Triptonă ........................................................... 10,0g
Extract de drojdie .............................................. 1,0g
Extract de carne ................................................ 5,0g
Glicină ............................................................. 12,0g
Clorură de litiu ................................................... 5,0g
Agar-agar ..................................................... 12-20g
Apă .............................................................. 1000 ml
şi dacă este necesar:
Soluţie de sulfamezatină .............................. 27,5 ml
Preparare: Se dizolvă componentele sau mediul gelozat comercial în apă distilată prin încălzire până la
fierbere. Dacă este necesar, se adaugă 27,5 ml soluţie de sulfamezatină (sulfadimidină, INN). Se
ajustează pH-ul astfel încât, după sterilizare, acesta să fie 7,2 la temperatura de 25°C. Se repartizează
mediul câte 10 de ml în eprubete. Se sterilizează mediul la 121°C, timp de 15 minute. Mediul poate fi
conservat timp de 1 lună, la temperaturi de 0°C-.5°C.

Soluţie de sulfamezatină (sulfadimidină, INN) se foloseşte numai în cazul în care se suspectă prezenţa
bacteriilor din genul Proteus).
Compoziţie:
Sulfamezatină ..............................................................0,2g
Soluţie hidroxid de sodiu 0,1M .................................... 10ml
Apă ............................................................................ 100ml
Preparare: Se dizolvă sulfmezatina în soluţie de hidroxid de sodiu. Se completează volumul până la 100
ml cu apă.

1.2. Soluţie de telurit


Compoziţie:
Telurit de potasiu (trioxotelurat dipotasic) ....................1,0g
Apă ........................................................................... 100ml
Preparare: Se dizolvă teluritul de potasiu în apă, încălzind cât mai puţin posibil. Se sterilizează prin
filtrare. Soluţia poate fi conservată mai multe luni la temperaturi de 0°C-.5°C.

1.3. Soluţie de piruvat de sodiu


Compoziţie:
Piruvat de sodiu .........................................................20,0g
Apă ............................................................................ 100ml

Pag 7
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Preparare: Se dizolvă piruvatul de sodiu într-un volum de apă. Se completează cu apă până la volum
final. Se sterilizează prin filtrare. Soluţia poate fi conservată maxim o lună la temperaturi de 0°C-5°C.

1.4. Emulsie de gălbenuş de ou (cu o concentraţie de circa 20%)


Este recomandată utilizarea preparatului comercial. În lipsa preparatului comercial emulsia se va prepara
respectând cu stricteţe următoarea reţetă: Se folosesc două ouă proaspete de găină şi se separă
gălbenuşurile de albuşuri. Se amestecă gălbenuşurile cu un volum de apă egal cu de patru ori volumul
lor. Se încălzeşte amestecul pe baia de apă reglată la temperatura de 45±5°C apoi se menţine la
temperatura de 0°C-5°C, timp de 18-24 de ore. Se lasă să se decanteze, apoi lichidul supernatant se
sterilizează prin filtrare. Emulsia poate fi conservată maxim 72 de ore, la temperaturi de 0°C-.5°C.

2. Bulion de inimă-creier
Compoziţie:
Peptonă ............................................................................................ 10g
Extract deshidratat din creier de viţel ............................................ 12,5g
Extract deshidratat de inimă de bou ............................................... 5,0g
Glucoză ........................................................................................... 2,0g
Clorură de sodiu .............................................................................. 5,0g
Ortofosfat disodic (Na2HPO4) .......................................................... 2,5g
Apă ............................................................................................ 1000 ml
Preparare: Se dizolvă componentele sau mediul complet în apă, aducând la fierbere. Se ajustează pH-ul
astfel încât, după sterilizare, acesta să fie 7,4 la temperatura de 25°C. Se repartizează mediul de cultură,
câte 10 ml, în eprubete. Se sterilizează mediul la temperatura de 121°C, timp de 20 de minute. Mediul
poate fi conservat timp de mai multe luni la temperatura de 0°C-.5°C.

3. Plasmă de iepure
Se foloseşte plasmă de iepure deshidratată din comerţ, care se rehidratează conform instrucţiunilor
fabricantului. Se adaugă o soluţie de EDTA (acid etilen-diamino-tetra acetic) (plasma oxalată sau
heparinizată nu necesita EDTA), astfel încât să se obţină o concentraţie de 0,1% EDTA în plasma
rehidratată.
Se poate utiliza plasmă de iepure proaspătă sterilă şi apă sterilă, în raport de 1:3. Înainte de a fi utilizat,
fiecare lot de plasmă trebuie controlat cu tulpini de Staphylococcus aureus slab şi intens pozitive, precum
şi cu tulpini de stafilococi coagulazo-negativi.

Pag 8
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

GENUL LISTERIA

Genul Listeria cuprinde 7 specii, dintre care cea mai importantă este L.
monocytogenes.

TEHNICI DE ÎMBOGĂŢIRE

Îmbogăţirea se poate realiza cu o metodă la rece (metoda Gray), metodă bazată pe


caracterul psihrofil. Produsul de analizat este menţinut la temperatura de 4°C (eventual în
tampon PBS) sau preîmbogăţit într-un bulion cu triptoză la temperatura de 4°C. Se utilizează
apoi (făcându-se eventual prelevări la timpi diferiţi) un bulion de îmbogăţire care conţine
ramnoză, albastru de metilen, acid nalidixic, polimixină B şi acriflavină. Acest mediu se
termostatează timp de 2 zile la temperatura de 25°C, apoi se realizează o repicare pe mediul
de izolare. Se poate utiliza şi un bulion cu acridină sau mediul de îmbogăţire Feindt, care
conţine acridină (tripaflavină) şi tiocianat de potasiu.

Alte medii permit să se efectueze o îmbogăţire la temperatură clasică de 30-37°C. Bulionul de


îmbogăţire pentru Listeria (LEB) permite evidenţierea bacteriei Listeria monocytogenes:
Cicloheximida, acidul nalidixic şi acriflavina sunt agenţii selectivi ai mediului. Mediul este
termostatat timp de 24-48 h la temperatura de 30°C.

Bulioanele de îmbogăţire pentru Listeria, UVM I, II se bazează pe aceiaşi agenţi selectivi:


acriflavina (12 mg/l pentru UVM I şi 25 mg/l pentru UVM II) şi acid nalidixic. Esculina
(hidrolizată de Listeria) este în acest mediu un agent de diferenţiere. Îmbogăţirea se
realizează de obicei în două etape: se termostatează mai întâi, timp de 4 h, pe UVM I, se
izolează şi se retermostatează timp de 24 h la temperatura de 30°C, se reizolează şi se face
repicarea pe UVM II. După o perioada de 24 h la temperatura de 30°C se face o ultimă izolare
(pe geloza Oxford sau PALCAM).

Bulionul Fraser este un mediu asemănător mediului UVM, dar conţine clorura de litiu şi citrat
de fier. Înnegrirea mediului indică posibila prezenţă a bacteriilor din genul Listeria.

TEHNICI DE IZOLARE

Izolarea bacteriei Listeria monocytogenes se realizează adesea pe geloza Oxford sau


PALCAM.

Geloza Oxford conţine amidon, esculină şi citrat de fier. Selecţia se datorează clorurii de litiu
Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

şi amestecului de inhibitori CCCFA (cicloheximidă, colistină, cefotetan, fosfomicină,


acriflavină). După o perioadă de termostatare de 24-48 h la temperatura de 37°C, Listeria
monocytogenes formează colonii verde-oliv cu halou negru. Adaosul de CCCFA poate fi
înlocuit de un amestec de colistină şi moxalactam.

Geloza PALCAM conţine glucoză, amidon, manitol, esculină şi citrat de fier. Selecţia este
datorată prezenţei clorurii de litiu şi inhibitorilor: ceftazidină, polimixină şi acriflavină. După o
perioadă de termostatare de 24 h la temperatura de 37°C, Listeria monocytogenes formează
colonii verde-oliv cu halou negru. Aceste medii sunt foarte selective, dar pe ele pot creşte
stafilococi şi enterococi (colonii galbene datorate fermentaţiei manitolului din mediul
PALCAM). Se pot utiliza şi alte medii:

 geloză Mac Bride cu feniletanol şi cicloheximidă;

 geloză cu sânge suplimentată cu acid nalidixic, polimixină şi ramnoză;

 geloză Despierre, geloză cu sânge sau geloză Columbia sau tripticază soia conţinând
acid nalidixic, polimixina şi ramnoză;

 geloză nutritivă cu acridină şi acid nalidixic, care conţine în plus tiamină;

 geloză LCA (geloză inima-creier conţinând clorura de litiu, glicină şi ceftazidină).

TEHNICI DE IDENTIFICARE

Identificarea este realizată după repicare timp de 24 h la temperatura de 35-37°C pe o geloză


TSYEA. Pe acest mediu coloniile sunt mici (1-2 mm), translucide şi cu margini neregulate.
Folosind un fascicul luminos oblic (lumină albă; unghi 45°) coloniile apar albăstrui şi
granuloase (testul de iluminare Henry).

Bacteriile din genul Listeria sunt bacili mobili, aero-anaerobi, catalazo +, oxidazo -.
Principalele caractere biochimice studiate pentru identificarea genului sunt: VP (+), RM(+),
indol (-), urează (-), H2S (-) etc. Geloza cu esculină este inoculată prin înţepare şi
termostatată timp de 48 h la temperatura de 37°C. Speciile genului Listeria şi, în particular, L.
monocytogenes, dau un răspuns pozitiv (culoare neagră).

Caracterul hemolitic este studiat cu testul Camp. Tulpinile de studiat se inoculează prin
metoda striilor pe o geloză cu sânge de oaie şi, perpendicular pe aceştia, se inoculează o
tulpină de S. aureus şi de Rhodococcus equi. L. monocytogenes şi L. seeligeri produc
hemoliza β cu S. aureus, în timp ce L. ivanovii produce hemoliza cu R. equi.

Pentru identificare rapidă se pot utiliza următoarele teste: API Listeria (Biomerieux), ID32
(Biomerieux), Micro ID (AES), sistemul VITEK Biomerieux (VITEK GPI), etc.

Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Pentru detectarea şi identificarea speciilor genului Listeria se folosesc şi metode imunologice:

 imuno-analiza ELFA (Vidas Biomerieux): identificarea genului Listeria şi L.


monocytogenes

 kit-ul TECRA (3M) de detectare imunologica prin microplăci pentru Listeria;

 imunofluorescenţă cu anticorpi fluorescenţi (Difco) poli Listeria;

 Liste Test (AES): îmbogăţire prin captură imunomagnetică şi confirmare


imunoenzimatică după izolarea în placă Petri şi replicare pe membrană (numărare în
24h);

 Listeria Micro ID Listeria (Organon-Technika);

 Kit Transia utilizând microplăci (ELISA sistem "sandwich");

 Listeria Tek Elisa (Sistem Organon Technika/AES);

 Clearview Listeria test (Unipath);

 Assurance IA pentru Listeria (Biocontrol).

În tabelul 1 sunt prezentate caracteristicile bacteriilor din genul Listeria.

Tabelul 1 Caracteristicile bacteriilor incluse în genul Listeria


monocytogenes

L. welshimeri
L. seeligeri
L. innocua

L. ivanovii

L. murrayi

Caracteristica
L. grayi

L.

β-hemoliză - - + + - + -
Testul Camp (S. aureus) - - - + - + -
Testul Camp (R. equi) - - + - - - -
Nitrat reductază - - - - + V V
Amidon + - - - + N N
Ramnoză - V - + V - V
Xiloză - - + - - + +
Manitol + - - - - - -
Hipurat - + + + V V

V - Variabil
N - Nedeterminat

Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

GENUL BACILLUS

Bacillus cereus

Bacteriile aparţinând genului Bacillus sunt bacterii Gram+, mobile, cu celule de formă
cilindrică, cu dimensiuni diferite, cu capetele drepte sau rotunjite, singulare sau asociate în
unghiuri (Bacillus subtilis) sau lanţuri. Sporii nu se colorează prin colorare Gram, sunt
sferici sau ovali, cu diametru mai mic sau egal decât al celulei, fiind poziţionaţi central sau
terminal.

Aptitudinea de a sporula poate fi pusă în evidenţa prin testul termorezistenţei (10 min la
temperatura de 80°C). Bacteriile genului Bacillus sunt catalazo+, aerobe sau anaerobe. Se
clasifică în funcţie de morfologia sporului studiat prin examen microscopic sau în funcţie
de mai multe criterii, care includ caracterul respirator sau fermentativ, termofilia, etc.

Dacă se ţine cont de forma şi dispunerea sporului, se disting următoarele grupe:


grupa 1: spori ovali nedeformanţi, cu perete subţire (ex. Bacillus subtilis);
grupa 2: spori ovali deformanţi cu perete subţire (B. stearothermophilus şi B.
polymyxa);
grupul 3: spori sferici deformanţi (B. pasteurii, B. sphaericus), grup subdivizat în 6
subgrupe.
Dacă se consideră ansamblul caracterelor, după Priest, se definesc următoarele grupe:
grupa I sau grupa B. polymyxa: specii cu spori de tip 2, metabolism facultative
anaerob cu fermentaţie acidă (include B. alvei, B. circulans, B. macerans etc.);
grupa II sau grupa B. subtilis: specii cu spori de tip 1, metabolism aerob cu
fermentaţie acidă;
grupa III sau grupa B. brevis: specii cu spori de tip 2, metabolism strict aerob;
grupa IV sau grupa B. sphaericus: specii cu spori de tip 3;
grupa V sau grupa Bacillus thermophilus: specii cu spori de tip 2 (include B.
coagulans, B. stearothermophilus).

TEHNICI DE IZOLARE

Izolarea şi numărarea bacteriilor sporulate aerobe se pot aplica fie formelor sporulate
singure, fie ansamblului de forme vegetative şi sporulate, astfel încât, de multe ori se
realizează doar izolarea sau numărarea.

Principiul de selecţie al formelor sporulate este bazat pe proprietăţile de termo-rezistenţă ale


sporilor şi pe caracterul aerob sau aero-anaerob al celulelor vegetative.

Proba plasată într-o eprubeta este supusă unei încălziri de 10 min pe baie de apă, la o

Pag 1
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

temperatură de 70-80°C. Aceasta serveşte apoi la efectuarea unei serii de diluţii destinate
numărării bacteriilor pe mediu cu geloză, în plăci Petri. În unele cazuri particulare tratamentul
termic se poate face prin menţinere timp de 10 min la temperatura de 100°C. În acest caz,
sporii supravieţuitori corespund speciilor termorezistente.

Mediul de izolare şi de numărare al bacteriilor sporulate aerobe selectate prin tratament termic
nu trebuie să fie specific, deoarece, practic, sporii de bacterii din genul Bacillus, care au
rezistat tratamentului termic şi pot apoi să se dezvolte în condiţii aerobe, nu mai au concurenţi.
În continuare, este necesar să se utilizeze un mediu bogat, care să favorizeze germinarea
sporilor. Uneori, sporii manifestă fenomenul de repaus, ceea ce generează o întârziere a
dezvoltării lor. Fenomenul este limitat prin adăugarea în mediu a amidonului, compus care
poseda proprietăţi de stimulare a germinării şi de detoxificare.

Pentru numărare sau izolare pe mediu solid, cel mai frecvent folosite sunt geloza
glucozată conţinând BCP sau laptele gelozat, aceste două medii fiind îmbogăţite cu 0.2%
amidon solubil. Geloza nutritivă obişnuită cu gălbenuş de ou permite diferenţierea
speciilor lecitinazo + şi -. Termostatarea diferenţiată a mediilor permite selecţionarea
următoarelor grupe de bacili: bacili mezofili (termostatare la temperatura de 30°C) şi bacili
termofili (termostatare la temperatura de 55°C).

Numărarea în mediu lichid pe bulion glucozat cu BCP sau bulion TSB (bulion triptonă soia)
este mai puţin specifică, fiind urmarea unui anumit grad de anaerobioză care poate să
existe la baza eprubetelor.

Pentru numărarea formelor vegetative (numărare realizată pentru anumite specii) trebuie
să facă apel la medii mai selective sau de diferenţiere.

! Mossel a descris un mediu de izolare pentru Bacillus cereus, care este bazat pe
prezenţa manitolului, clorurii de sodiu, roşului de fenol, gălbenuşului de ou şi polimixinei.
Coloniile de Bacillus cereus sunt rugoase, uscate, roz (manitol -) şi înconjurate de un
halou albicios (produşi de hidroliză insolubili formaţi pornind de la lecitină). Alte medii se
bazează pe un principiu asemănător (geloză manitol - gălbenuş de ou - polimixina MYP).
Mediul PEMBA (polimixina - gălbenuş de ou - manitol - albastru de bromtimol - agar),
mediu selectiv pentru B. cereus, poate fi şi el utilizat: B. cereus formează colonii albastre,
dantelate, înconjurate de un precipitat de gălbenuş de ou. Mediul Reuter conţine piruvat,
tiocianat, actidionă şi gălbenuş de ou.

TEHNICI DE IDENTIFICARE
Capacitatea de sporulare

Bacilii sunt caracterizaţi prin capacitatea de sporulare şi prin producere de catalază.


Prezenţa sporilor poate fi pusă în evidenţă direct prin examinare microscopică a unui frotiu
colorat prin metoda Gram. Aceştia se prezintă sub forma de particule endocelulare,
sferice sau ovale, necolorate şi alunecoase. În toate cazurile poate fi realizată o colorare
Pag 2
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

specifică. Capacitatea de sporulare poate fi pusă în evidenţă şi prin testul de


termorezistenţă: o cultura în vârstă de 3-10 zile, inoculată pe un bulion nutritiv obişnuit
conţinând 0.004% sulfat de mangan (agent ce favorizează sporularea), este supusă timp
de 10 min la încălzire pe baie de apă la temperatura de 80°C. Cultura este apoi inoculată
prin înţepare pe un bulion nutritiv şi termostatată la temperatura de 30°C, timp de 2-3 zile sau
mai mult. Dacă există dezvoltare microbiană, se presupune că a existat sporulare, doar câteva
specii rare nesporulate sunt capabile să reziste acestor condiţii; aceasta presupunere
trebuie confirmată întotdeauna printr-un examen microscopic, eventual cu o colorare
specifică. Diverse alte medii favorizează sporularea: mediul Duncan şi Strong, mediul Ellner,
mediul Schaeffer, mediul glucozat obţinut cu carne fiartă, mediul SEC, etc.

Pentru caracterizarea sporilor sunt utilizate mai multe colorări specifice, dintre care citam doar
două:

metoda Moeller modificată - preparatul uscat este fixat în alcool. Frotiul se


acoperă cu câteva picături de acid cromic 5%. După 10 min de contact şi după o spălare
abundenta cu apă, lama este acoperită cu fucsina şi este încălzită uşor la flacăra unui
bec Bunsen, până la evaporare. Operaţia de colorare se repetă de doua ori. Frotiul este
apoi decolorat cu alcool absolut, apoi cu acid clorhidric 1/3, după care este spălat cu apă.
Frotiul este apoi recolorat cu câteva picături de albastru de metilen diluat timp de 30 s.
După spălare, lama este uscată şi conservată. Sporii sunt coloraţi în roşu şi corpul
bacterian în albastru;

metoda Bartholomew şi Mittwer - frotiul fixat termic (20 de treceri ale lamei prin
flacără) este colorat timp de 10 min cu ajutorul unei soluţii apoase, saturate, de verde
malahit, apoi spălat rapid, timp de 10 min, cu apă rece. Frotiul este recolorat cu safranină
25% timp de 15 min, apoi este spălat rapid cu apă, uscat şi examinat. Sporii sunt coloraţi
în verde, iar corpul bacterian în roşu. Această metodă este mai practică, dar este mai
puţin sigură decât precedenta.

Caractere fiziologice

În afara de prezenţa şi morfologia sporului, identificarea se bazează pe următoarele


caractere (termostatarea are loc la temperatura de 30°C timp de 24 h sau mai mult):

termorezistenta sporilor - după cultivare pe un mediu de sporulare, se compară


numărul sporilor care rezistă la un tratament de 10 min la temperatura de 80°C şi la un
tratament de 5 min la temperatura de 95°C. Se spune că sporii sunt termorezistenţi dacă se
observă o diferenţa mai mică de două reducţii decimale (∆ Iog10N < 2); când sunt sensibile,
diferenţa depăşeşte 5 (∆ log10N > 5);

tipul respirator - este studiat prin inocularea unei geloze profunde VF sau pe
mediu glucozat în anaerobioză. Acest test constă în inocularea unui bulion cu extract de
drojdie şi glucoza (YG) dintr-o eprubetă, după regenerare. Suprafaţa mediului se acoperă
cu un strat de parafină lichidă. După termostatare se observa dezvoltarea.

Pag 3
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

fermentarea glucidelor - studiul fermentării glucidelor este bine să se realizeze


pe un mediu gelozat pentru studiul fermentaţiilor, specific bacteriilor. Acest mediu nu
conţine peptonă (mediu semisintetic). După introducerea glucidului (0.5%) în mediile
fluidificate, eprubetele sunt aşezate în poziţie semi-înclinată. După solidificarea mediilor,
acestea sunt inoculate prin striere şi prin înţepare în zona centrala. Utilizarea glucidelor
se manifesta prin virajul culorii indicatorului. Glucidele testate sunt glucoza, arabinoza,
xiloza şi eventual lactoza, manitolul, ramnoza, celobioza şi zaharoza. De asemenea,
este posibil să se utilizeze bulion nutritiv adiţionat cu 0.004% roşu de fenol în care se
introduce un tub Durham. Acest ultim test permite studierea acidifierii şi producerii de
gaz.

acidificare pe mediul glucoza amoniu - un mediu conţinând glucoza, amoniu ca


singură sursa de azot şi un indicator de pH (mediu Knigh şi Proom) este inoculat,
termostatat şi examinat;

întârzierea creşterii ca urmare a prezentei glucozei - pe mediul peptonat,


prezenţa glucozei inhibă parţial creşterea anumitor specii. Două medii cu geloză nutritivă
obişnuită, unul cu glucoză (1%), altul fără glucoză, se repartizează în plăci Petri, după
care se inoculează prin înţepare şi se incubează. Se observă diferenţele dintre culturi;

hidroliza cazeinei - este pusă în evidenţa în mod clasic pe geloză cu lapte;

hidroliza gelatinei - se studiază printr-o metodă clasică (Frazier);

hidroliza lecitinei - este studiată în mod clasic, prin inocularea unei geloze
nutritive obişnuite cu gălbenuş de ou (10%) sau pe mediu McLung. Acest mediu
termostatat în anaerobioză permite diferenţierea bacteriilor Bacillus şi Clostridium prin
reacţia LV legată de haloul caracteristic obţinut: tulpinile LV+ formează precipitat şi o zonă
luminoasă (reacţia Nagler la lecito-vitelina);

hidroliza amidonului - este pusă în evidenţă, în mod clasic, pe geloză nutritivă


obişnuită conţinând 10 g/l amidon solubil, în plăci Petri;

producerea de acetoină (test Voges Paskauer: VP) - este evidenţiată prin


reacţia O'Meara după o perioadă de 2-10 zile de cultivare pe mediul Smith;

comportamentul faţa de temperatură, pH şi clorura de sodiu – acest studiu


este realizat pe bulion nutritiv sau geloză nutritivă obişnuită. Culturile sunt testate la
temperatura de 60°C, pH 6 şi la temperatura de 65°C, pH 7, în prezenţa a 10% clorură de
sodiu;

alte testări: cultivare pe lapte turnesolat; producere de indol; reducere de nitraţi;


utilizarea citratului; evidenţierea ureazei.

Aceste ultime teste sunt realizate cu medii şi metode clasice.

Pag 4
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

GENUL CLOSTRIDIUM

Clostridium perfringes

Bacteriile aparţinând genului Clostridium sunt bacterii Gram +, mobile, cu celule de formă
cilindrică cu dimensiuni mai mari decât cele din genul Bacillus, singure sau în lanţuri, care
formează endospori dispuşi central sau terminal, care dau celulelor formă de suveică sau
paletă.

Reprezentanţii genului Clostridium sunt catalazo - şi sunt strict anaerobi. Totuşi, câteva
specii rare sunt aero-tolerante.

TEHNICI DE IZOLARE

Tehnici generale

Bacteriile sporulate anaerobe sunt cultivate pe medii foarte reducătoare, cum ar fi mediul
VL sau VF (lichid sau semi-solid) sau chiar pe medii lichide protejate de oxigenul din aer
printr-un strat de parafină: mediu Rosenow simplu sau cisteinat, eventual adiţionat cu
amidon, sau mediu RCM (Reinforced Clostridium Medium sau mediul Hirch şi Grinsted).
Acest ultim mediu este folosit ca diluant pentru operaţia de numărare.

Principiul de izolare şi numărare al bacteriilor din genul Clostridium este foarte apropiat de cel
indicat pentru bacteriile genului Bacillus. În afara de termorezistenţa sporilor, selecţia este
bazată pe cultivarea în anaerobioza strictă (sau în mediu foarte reducător). Sunt utilizate
tehnicile clasice de cultivare în anaerobioză: condiţiile de anaerobioză trebuie respectate
atât pentru cultivări, cât şi pentru diluări. Temperatura de termostatare variază între 30 şi
37°C, în cazuri particulare fiind mai mare.

Pentru numărare se utilizează fie tehnica pe mediu lichid sau solid în eprubetă,
folosind un mediu reducător sau protejat de parafină, fie tehnica de numărare pe mediu
solid în plăci Petri, termostatate în anaerobioză. Aceasta ultima metodă este preferabilă,
deoarece facilitează prelevarea coloniilor izolate pentru studiile ulterioare.

Selecţia formelor sporulate este realizata prin încălzire timp de 10 min la temperatura de
80°C. Când termorezistenţa sporilor este scăzută sau când se doreşte să se tină cont de
celulele vegetative, nu este posibilă utilizarea acestei tehnici. În acest caz, va trebui să se
folosească medii conţinând compuşi inhibitori specifici, permiţând astfel dezvoltarea
speciilor de Clostridium (de ex. antibioticele). Sporii tuturor speciilor de Clostridium pot fi
Pag 5
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

izolaţi şi număraţi după încălzirea necesară realizării selecţiei, prin inoculare în mediul
RCM gelozat (geloză Hirch şi Grinsted) adiţionat cu amidon şi repartizat în eprubete sau
plăci Petri (în acest caz, termostatarea trebuie să aibă loc obligatoriu în mediu anaerob).

Pentru numărări în medii lichide se poate utiliza mediul Rosenow sau alte medii lichide
enunţate mai sus.

Izolări specifice

Există medii de izolare relativ specifice pentru grupele de Clostridium, adaptate sporilor şi,
uneori, celulelor vegetative.

Sporii de Clostridium sulfito-reductori pot fi izolaţi şi număraţi utilizând medii conţinând


sulfit. Cea mai bună concentrate de sulfit pe care trebuie să o conţină mediul este de
0.05%, însa ea elimină unele specii sulfito-sensibile. Mediul Wilson Blair pentru Clostridium
permite punerea în evidenţă a sulfito-reductorilor, care formează colonii negre. Metoda
este aplicată după realizarea pasteurizării. După inocularea mediului fluidificat şi
omogenizare prin răsturnare, eprubeta este răcita imediat, prin imersie în apă rece, şi
termostatată la o temperatura de 37°C, timp de 24-48 h. Pentru aceasta numărare este
posibil să se utilizeze geloză VF sulfit.

Există medii bazate pe acelaşi principiu, care sunt specifice pentru Clostridium perfringens
şi care, prin compoziţia lor chimică, permit evitarea pasteurizării şi selecţionarea deodată
a formelor vegetative şi a sporilor. Este vorba de mediul TSN Marshall cu neomicina şi
polimixină, care este termostatat la temperatura de 46°C, mediul SPS Angelotti cu
polimixină şi sulfadiazină, care este termostatat la temperatura de 37°C, sau de mediul
TSC triptoză - sulfit - cicloserină, care este termostatat la temperatura de 46°C.
Termostatarea se efectuează în anaerobioză (eventual, cu îmbogăţire de CO2):
coloniile colorate în negru sunt colonii prezumtive de Clostridium perfringens. Se poate
confirma apartenenţa la specie prin teste simple: nitrat reductazo +, lactozo+, gelatino+.
Confirmarea se poate face repicând coloniile pe geloza Willis şi Hobbs cu ou, plasată
într-o placă Petri, pe a cărei jumătate din suprafaţă se depun câteva picături de ser anti -
Clostridium perfringens (6000 unităţi/ml). Coloniile care nu se vor dezvolta pe mediul
adiţionat cu toxine sunt desigur Clostridium perfringens.

TEHNICI DE IDENTIFICARE
Identificarea lui Clostridium este bazată pe studiul morfologiei sporilor şi caracterelor
biochimice. Termostatarea are loc obligatoriu în mediu reducător sau în anaerobioză, în
general la o temperatura de 30-37°C timp de 24-48 h. Unele specii trebuie termostatate la
temperaturi superioare. Nu mai precizam că aceasta cultură trebuie să aibă loc în
anaerobioză, deoarece acest fapt nu mai este necesar, ca urmare a puterii reducătoare a
mediului utilizat. Mediile studiate sunt inoculate pornind de la o cultură pe mediu lichid
reducător, de exemplu bulion VL sau VF , conţinând cistină (sau pe mediu Rosenow).

Pag 6
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Acţiunea pe mediu Rosenow

Acesta este un mediu lichid reducător recomandat pentru cultivarea bacteriilor anaerobe.
Conţine, printre altele, peptonă, glucoză, un indicator colorat, un fragment redus de creier şi
o bucăţică de marmura albă. După o regenerare de 15 min realizată pe baie de apă la
fierbere şi răcire, mediul este inoculat şi acoperit cu un strat de parafină sterilă, care asigură
anaerobioza. După o termostatare de 24 h sau mai mult, examinarea acestui mediu
permite studierea următoarelor caracteristici:

fermentaţia glucozei se indică prin virajul indicatorului de la roz la roşu: acest viraj
trebuie să fie observat la începutul cultivării. Virajul indicatorului la verde indică
prezenţa bacteriilor reducătoare;

producerea de gaz se indică prin deplasarea dopului de parafină;

puterea reducătoare se manifestă prin decolorarea mediului.

Mobilitatea

Mobilitatea este observată între lamă şi lamelă, pornind de la o prelevare efectuată din
mediul Rosenow. Prelevarea trebuie efectuată la formarea biomasei de celule, iar
examinarea trebuie realizată rapid, deoarece contactul cu aerul inhibă rapid mobilitatea.

Morfologia sporului

Morfologia sporului este studiată prin examen microscopic pe un frotiu colorat Gram sau
prin colorarea specifică a sporilor. Examenul poate fi realizat pornind de la o cultură mai
veche obţinută în mediul Rosenow. Sporularea nu intervine în toate mediile. Sporii nu se
formează uneori decât pe medii uşor alcaline. Unele bacterii sporulează greu în mediu
artificial: este cazul lui Clostridium perfringens care trebuie cultivat pe ser din carne de cal
cu 0.5% extract de came şi 0.1% sulfat de magneziu.

Hidroliza gelatinei

Hidroliza gelatinei este studiată utilizând un disc de gelatină Kohn cu cărbune, care se
plasează pe mediul Rosenow. După termostatare, degradarea gelatinei este indicată de
eliberarea particulelor de cărbune. Anaerobioza se obţine cu ajutorul unui strat de parafină.
Se poate efectua experimentul şi într-o placa Petri, în anaerobioză, folosind geloza
Columbia îmbogăţită cu albumină serică bovină.

Acţiunea asupra laptelui cu cisteină

Cultivarea este realizată în eprubete cu lapte cisteinizat după regenerare. Nu este


absolut necesar să se parafineze eprubetele. După termostatare, se examinează aspectul
laptelui şi se remarcă următoarele: coagulare (+/-); retracţia coagulului (+/-); coagul alveolar
(+/-); peptonizarea eventuală a coagulului; peptonizarea fără coagulare.

Pag 7
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Studiul fermentaţiei glucidelor

Acest studiu este realizat cu ajutorul medii lor VL, VF sau TY semisolide. Mediul este
regenerat înainte de folosire şi se completează cu unul din următoarele glucide, adăugate în
proporţie de 1%: maltoză, lactoză, zaharoză, manitol, xiloză, glicerol, amidon şi eventual
alţi compuşi. Nu este necesară parafinarea acestui mediu reducător, cu condiţia ca el să
aibă o suprafaţă de contact cu aerul extrem de redusă (eprubetă mică). După 24 h sau
mai mult de termostatare la temperatura de 37°C, se introduc în mediul de cultură 10
picături dint-un indicator de pH, pentru a sesiza dacă exista aciditate sau nu. Cu
indicatorul universal Prolabo, acidifierea este indicată de virajul în roşu al mediului, când
cantitatea de acid este mare, sau în galben, când cantitatea produsă este mică. Este
recomandat să se inoculeze şi o eprubetă fără glucid, ca martor.

Producerea indolului

Este pusă în evidenţă prin cultivarea pe mediu VL sau VF semisolid în eprubete, apoi prin
caracterizare cu reactivul Kovacs sau Ehrlich. Inocularea mediului este realizată în masă,
după regenerare, dar fără amestecare, astfel încât inoculul să rămână pe fundul eprubetei,
sau prin înţepare centrală profundă.

Producerea hidrogenului sulfurat şi evidenţierea caracterului sulfito-reducător

Producerea de H2S este pusă în evidenţă pe mediul VL (sau VF) semisolid sau solid,
îmbogăţit cu 0.2 g/l sulfat feros şi cu 0.3 g/l hiposulfit de sodiu. Producerea hidrogenului
sulfurat provoacă înnegrirea mediului. Se pot utiliza geloze "sulfit" sau "sulfit-fier".

Caracterul hemolitic

Caracterul hemolitic este determinat prin inocularea pe suprafaţa unui mediu solid îmbogăţit
cu 10% sânge de oaie sau de cal defibrinat sau cu citrat, care este apoi termostatat, în
anaerobioză, la temperatura de 37°C.

Producerea acetoinei

Acetoina este evidenţiată după cultivare pe mediu lichid VL (sau VF) prin reacţia Voges
Proskauer. Pe mediul gelatina-lactoză, după 24 h de termostatare la temperatura de 37°C,
prezenţa gazului, acidifierea (îngălbenirea) şi lichefierea gelatinei sunt puse în evidenţă
pentru C. perfringens.

TEHNICI DE EVIDENŢIERE A TOXINELOR


Enterotoxina de Clostridium perfringens

Enterotoxina produsă de Clostridium perfringens (CPE) poate fi pusă în evidenţa prin


aglutinare pasivă pe reversul particulelor de latex: PET-RPLA (Oxoid).

Pag 8
MICROBIOLOGIE SPECIALA - ANALIZA BACTERIILOR CARE INDUC RISC BIOLOGIC IN ALIMENTE

Există o metodă indirectă de detectare a enterotoxinei de Clostridium perfringens (tip A)


prin titrarea α-hemolizinei (toxina α sau fosfolipază C). Aceasta toxină este stabilă la frig şi
rezistentă în condiţiile în care celulele mor (congelare). Concentraţia se poate considera
direct proporţională cu numărul de bacterii producătoare.

Se mojarează, timp de 2 min, 5 g de aliment în 100 ml de tampon HEPES. După


centrifugare timp de 10 min la 20 000 rpm la temperatura de 5°C, supernatantul este
filtrat (pori de 0.45 µrn) apoi dializat faţă de polietilenglicol 20 000. Dializatul este diluat
binar în proporţie de 1/256 în clorura de sodiu 0.85%. Se realizează un martor prin
amestecarea a 0.25 ml de dializat, 0.25 ml de clorură de sodiu 0.85% şi 0.1 ml antitoxina α.
Hemoliza este pusă în evidenţă pe o geloză cu sânge, în care se fac decupaje de 3 mm
diametru. Din fiecare eşantion se introduce o cantitate mică în decupaje şi după 24 h de
termostatare la temperatura de 35°C, se examinează apoi hemoliza: martorul îmbogăţit
cu antitoxina a trebuie să fie negativ. Se poate evidenţia activitatea lecitinazei pe
eşantioanele rămase, adăugând un volum de gălbenuş de ou (în clorura de sodiu 0.85%).
După 20 min de centrifugare la 14 000 rpm la temperatura de 5°C şi filtrarea supernatantului,
activitatea lecitinazei se manifestă prin limpezirea mediului (martorul îmbogăţit cu antitoxina
α dă o reacţie negativă).

Pag 9