Roxana Dimian - TIM

Multifocal plane microscopy

Microscopia plană multifocală (MUM) sau microscopia multiplă sau microscopia biplană
este o formă de microscopie care permite urmărirea dinamicii 3D în celulele vii la o rezoluție
temporală și spațială ridicata prin imaginea diferitelor planuri focale din specimen. În această
metoda, lumina colectată de la eșantion de către o lentilă este împărțită în două căi. În fiecare
cale, lumina divizată este focalizată pe un detector care este plasat la o anumita distanta. În
acest fel, fiecare detector imaginează un plan distinct în cadrul eșantionului. [1]
Prima configurație dezvoltată de MUM a fost capabilă să imagineze două planuri distincte din
eșantion. Cu toate acestea, configurarea poate fi modificată pentru a imagina mai mult de
două planuri prin împărțirea suplimentară a luminii în fiecare cale de lumină și focalizarea
acesteia pe detectoarele amplasate la distanțe specifice. [2]
O altă tehnică numită microscopie multifocus (MFM) folosește optica difractiva Fourier
pentru a imagina până la 25 de planuri focale. [3]
În prezent, sunt implementate configurațiile MUM care pot imagina până la patru planuri
distincte. [4]

Schema unui microscop multifocal:

Proiectarea convențională a microscopului este bine adaptată pentru vizualizarea dinamicii
celulare rapide în două dimensiuni, cum ar fi, în planul focalizării. Cu toate acestea, celulele
sunt obiecte tridimensionale. Dacă dinamica nu este restrânsă la un singur plan focal,
tehnologia convențională de microscopie cu un singur plan este inadecvată pentru studiile
detaliate ale dinamicii intracelulare rapide în trei dimensiuni. Abordările clasice bazate pe
schimbarea planului focal nu sunt adesea eficiente în astfel de situații, deoarece dispozitivele
de focalizare sunt relativ lente în comparație cu dinamica intracelulară. În plus, planul focal
poate fi frecvent la locul si la momentul nepotrivit si astfel se vor omite aspecte importante
ale evenimentelor dinamice. [5]

Implementarea – MUM poate fi implementat în orice microscop standard.

În MUM, imaginile sursei punctuale sunt achiziționate simultan la diferite niveluri de
focalizare. Aceste imagini oferă informații suplimentare care pot fi utilizate pentru a
constrânge poziția z a sursei punctului.
Pentru o configurație MUM cu două planuri, măsura de localizare 3D prevede o precizie
constantă mult mai bună decât cea a unui microscop convențional pentru o serie de valori z,
mai ales atunci când sursa punctului este aproape de planul de focalizare. [6]

Dual objective multifocal plane microscopy (dMUM)

În prezent, experimentele de urmărire a particulelor sunt de obicei efectuate cu ajutorul unui
microscop inversat, în care o singură lentilă iluminează eșantionul și, de asemenea, colectează
semnalul de fluorescență din acesta. Deși emisia de fluorescență din eșantion are loc în toate
direcțiile (adică deasupra și sub eșantion), utilizarea unei singure lentile în aceste configurații
ale microscopului duce la colectarea luminii dintr-o singură parte a eșantionului. Astfel, chiar
și în cele mai bune condiții imagistice, microscoapele convenționale colectează doar o
fracțiune dintre fotonii emiși de eșantion.
Pentru a rezolva această problemă, se poate utiliza o configurație a microscopului care
folosește două lentile opuse. Această configurație se numește microscopie plană multifocală
cu obiectiv dublu (dMUM). [7]

Bibliografie

[1] P. Prabhat, S. Ram, E. Ward și R. Ober, „Simultaneous imaging of different focal planes
in fluorescence microscopy for the study of cellular dynamics in three dimension,” 2004.

[2] M. Badieirostami, M. Lew, M. Thompson și W. Moerner, „Three-dimensional

localization precision of the double-helix point spread function versus astigmatism and
biplane,” 2010.

[3] S. Abrahamsson, M. McQuilken, S. B. Mehta, A. Verma, J. Larsch, R. Ilic, R.

Heintzmann, C. I. Bargmann și A. S. Gladfelter, „MultiFocus Polarization Microscope
(MF-PolScope) for 3D polarization imaging of up to 25 focal planes simultaneously,”
2015.

[4] P. A. Dalgarno, H. I. C. Dalgarno, A. Putoud, R. Lambert, L. Paterson, D. C. Logan, D.

P. Towers, R. J. Warburton și A. H. Greenaway, „Multiplane imaging and three
dimensional nanoscale particle tracking in biological microscopy,” 2010.

[5] „MUM - Ward Ober Lab,” UT Southwestern, 2012.

[6] S. Ram, J. Chao, P. Prabhat, E. S. Ward și R. J. Ober, „A novel approach to determining

the three-dimensional location of microscopic objects with applications to 3D particle
tracking,” 2007.

[7] S. Ram, P. Prabhat, E. S. Ward și R. J. Ober, „Improved single particle localization

accuracy with dual objective multifocal plane microscopy,” 2009.