Sunteți pe pagina 1din 7

LP 13. Dozarea colesterolului total.

Dozarea enzimatică a fracţiunilor


de colesterol / 3 ore

1. Colesterol total
In plasma colesterolul este legat de diferite clase de lipoproteine. Astfel, din
colesterolul total, este legat de:
- LDL 60%
- HDL 20%
- VHDL 15%
- Chilomicroni 5%

O colesterolemie mare favorizeaza ateromatoza.


Dozarea colesterolului total si a celor doua fractiuni LDL-colesterol si HDL-colesterol
sunt teste screening pentru evaluarea gradului de ateroscleroza, hipertensiune arteriala,
cardiopatie ischemica si accident vascular cerebral sau pt. monitorizarea pacientilor cu
afectiuni coronariene.

Dozarea colesterolului total prin metoda enzlmatica colorimetrica

Principiul metodei:

Metoda enzimatica permite determinarea cantitativa si specifica a colesterolului total


din lichide biologice. Colesterolul si esterii colesterolului sunt eliberati din
lipoproteine sub actiunea colesterolesterazei, colesterol oxidazei si peroxidazei.

Colesterol oxidaza asigura si oxidarea colesterolului. Peroxidaza in prezenta fenolului


si a 4-aminoantipirinei (PAP) conduc la formarea produsului final, chinonimina (rosu),
direct proportional cu cantitatea de colesterol din proba.

Esteri de colesterol + H2O colesterol esteraza > colesterol + acizi grasi


Colesterol + O2 colesterol oxidaza > 3-colesten (colestenona) + H2O2
2 H202 + fenol + 4-aminoantipirina (PAP) peroxidaza > chinonimina (rosu)

Reactivi

REACTIVUL l
Tampon PIPES pH 6,9 (90 mmol/l); fenol (26 mmol/l);

REACTIVUL 2: colesterol esteraza (300 U/1); colesterol oxidaza (300 U/1);


peroxidaza (1250 U/I); 4-aminoantipirina (0,4 mmol/l).

STANDARD colesterol:colesterol 200 mg/dl, 2g/l, 5,17 mmol/l.


PREPARAREA REACTIVULUI DE LUCRU:
R1 se amesteca cu R2 in proportia consemnata de producator

NOTA:
transformarea mg in mmol:
200 mg/dl x 0,0258 = 5,17 mmol/l exprimat in unitati SI

STABILITATEA REACTIVILOR: Reactivii se pastreaza la + 2ºC... +8ºC Si au


stabilitate 60 zile, respectiv pana la data expirarii.

MATERIAL BIOLOGIC: ser sanguin, plasma heparinizata (nehemolizata).

TEHNICA DE LUCRU:

Se pipeteaza PROBELE (P), SI STANDARDUL (S) si un MARTOR (M). 1n


eprubete.
Se adauga reactivii conform tabelului:

STANDARD MARTOR
REACTIVI PROBA (P)
(S) (M)
Amestec reactivi (enzimatic-
1ml 1ml 1ml
culoare)
PROBA (ser) 10 μl - -
REACTIV 2 (standard) - 10 μl -
APA DISTILATA - - 10 μl

Se agita, se incubeaza 10 minute la 37ºC.

Se masoara extinctia probelor (EP) si a standardului (S) fata de martor (M) la


λ=546nm (sau λ=505 nm) in cuva de 1 cm. Culoarea este stabila timp de o ora.

CALCUL:
COLESTEROL (mmol/l)= (EP/ES) x conc. standard exprimata in mmol/l
(5,17mmol/l)
COLESTEROL (mg/dl)= (EP/ES) x conc. standard exprimata in mg/dl (200mg/dl)

VALORI NORMALE:
160 – 200 mg/dl

Colesterol total < 220 mg/dl; 150-220 mg/dl= 3,87 - 5,67 mmol/l
Suspiciune de dislipidemie = colesterol total 220-240 mg/dl
Hipercolesterolemie cu risc crescut >240 mg/dl
Metoda este liniara pana la 500 mg/dl (12,9 mmol/l).

Variatii patologice

Valori crescute hipercolesterolemie

- Hiperlipoproroteinemii primare
- Hipotiroidie
- Ateroscleroza
- Colestaza
- Sindrom nefrotic
- Anotrexie nervoasa
- Guta
- Diabet
- Alcoolism

Valori scazute – hipocolesterolemie

- Malabsorbtie
- Maldigestie
- Inanitie
- Carente alimentare
- Casexie
- Afectiuni hepatice, ciroze
- Hipertiroidie
- Hipo-alfa-lipoproteinemie

2. Dozarea enzimatica a fracţiunilor de colesterol / 2 ore


2.1. HDL-COLESTEROL - METODA ENZIMATICA COLORIMETRICA

PRINCIPIUL METODEI:

Fracțiunile de lipoproteine (chilomicroni, VLDL si LDL-colesterol) sunt precipitate cu


acid fosfowolframic si clorură de magneziu. Precipitatul se indepărtează prin
centrifugare.

Supernatantul, care conține HDL-colesterol solubil, (lipoproteine cu densitate


crescută) poate fi dozat prin metoda enzimatică de dozare a colesterolului.

REACTIVI

REACTIV DE PRECIPITARE:
Acid fosfowolframic (0,55 mmoUI) si clorura de magneziu (25 mmol/l).
REACTIV ENZIMATIC - CULOARE:
Tampon PIPES pH 6,7; fenol (24 mmol/l); cholat Na (0,5 mmol/l); colesterol esteraza
(200 U/I); colesterol oxidaza (300 U/l); peroxidaza (1250 U/I); 4-aminoantipirina
(0,5 mmol/l); azida de sodiu 0,1%.

STANDARD: HDL colesterol (40 mg/dl).

MATERIAL BIOLOGIC: ser sanguin, plasma heparinizata (nehemolizata).

TEHNICA DE LUCRU:

Separarea fractiilor de lipoproteine


Se pipeteaza probele in eprubete de centrifuga, la care se adauga reactiv RP conform
tabel:

REACTIVI PROBA
PROBA - ser sanguin 500 μl
Reactiv de precipitare (RP) 1000 μl

- Se agita, se incubeaza 10 minute la temperatura camerei;


- Se centrifugheaza 20 minute la 4000 rpm.
- Se separa supernatantul clar si se determina concentratia de HDL-
colesterol din supernatant.

Reactia de culoare
Se pipeteaza conform tabel:

REACTIVI Proba Standard Martor


Reactiv colesterol 1ml 1ml 1ml
Proba 20 μl - -
Standard - 20 μl -
Apa distilata - - 20 μl

Se agita, se incubeaza 5 minute la 370C.


Se masoara extincția probei (EP) și standardului (ES) față de martor (EM) la λ=505
nm in cuve de 1 cm.

CALCUL:
HDL-COLESTEROL(mmol/l) = (EP/ES) x conc. standard (exprimat in mmol/l)
HDL-COLESTEROL(mg/dl) = (EP/ES) x conc. standard (exprimat in mg/dl)
VALORI NORMALE:
HDL-COLESTEROL FEMEI: 46-65 mg/dl;
BARBATI: 35-55 mg/dl

Valori cu risc crescut < 45 mg/dl (FEMEI); <35 mg/dl (BARBATI)


Scaderea concentratiei de HDL-colesterol se asociaza cu cresterea riscului aterogen.

NOTA:
Determinarea colesterolului total, HDL-colesterolului și a trigliceridelor permit
evaluarea concentratiei de LDL-colesterol prin formula FRlEDWALDS:

LDL-colesterol = [(colesterol total) - (Trigliceride/5 )] - (HDLcolesterol) mg/dl


Sau:
LDL-colesterol = [(colesterol total) -. ( Trigliceride/2,2 )] -(HDL- colesterol) mmol/l

HDL-col Risc scazut Normal Risc crescut

Barbati >55 mg/dl 35 - 55 mg/dl <35 mg/dl

Femei >65 mg/dl 45 – 65 mg/dl <45 mg/dl

Legătura intre perturbarea metabolismului lipidic si ateroscleroză:

Valori pt. colesterol >240 mg/dl si TG >150 mg/dl sau lipide totale >800 mg/dl
reprezintă factori de risc pentru ateroscleroză, alături de valorile de risc
prezentate in tabelul de mai sus.

2.2. Determinarea LDL-colesterol prin metoda enzimatic -


colorimetrică
Principiul metodei
Lipoproteinele cu densitate joasă (LDL) precipită cu anumiți compuși de polimeri, iar
precipitatul se poate solubiliza cu o soluție de citrat-clorură de sodiu.
LDL colesterolul se determină enzimatic prin metoda de dozare a colesterolului.

Reactivi

R1 reactiv de precipitare
R2 reactiv solubilizant pt LDL
Standard colesterol: colesterol liber si esterificat 1mmol/l sau 387 mg/l

Proba

Ser
Plasma recoltata pe EDTA

Tehnica de lucru

Separarea fractiei LDL-colesterol


Intr-o eprubeta de centrifuga se pipeteaza 1 ml reactiv de pp R1.
Se lasa 5 min la rece (2-80C) apoi se centrifugheaza la 4000 RPM

Solubilizarea fractiei LDL-colesterol


Se decanteaza supernatantul.

Peste pp se toarna 500 μl de R2 si se face determinarea din solutia astfel obtinuta.

Determinarea LDL-colesterol

Se pregatesc 3 eprubete P, S, M

Se pipeteaza in eprubete astfel:

REACTIVI Proba Standard Martor


Proba, fractie LDL 100 μl - -
Standard - 100 μl -
Apa distilata - - 100 μl
Reactiv colesterol 1ml 1ml 1ml

Dupa agitare si incubare 5 min la 370C, se citeste Ep si Es fata de martor la lungimea


de unda de 500 nm in cuve de 1 cm.
Calcul

Cp = Ep / Es x Cs

Rezultatul se inmulțește cu 10 datorită diluării probei prin precipitare și dizolvare.

Metoda Friedewald
Este o formula de calcul a LDL-colesterol pe baza valorilor obținute pt colesterol total,
HDL-colesterol si trigliceride.

LDL-colesterol = Colesterol total – TG/5 – HDL-colesterol

Risc scazut Normal Risc crescut


LDL-col <130 mg/dl 130-160 mg/dl >160 mg/dl
Neconcordanța între manifestările clinice și examenele de laborator:

- Exista hiperlipemie la pacienti clinic sanatosi – considerati in stadiu


incipient de ateroscleroza;
- Nu orice hiperlipemie evolueaza spre ateroscleroza;
- Este ateroscleroza fara lipemie la persoane varstnice, cand hiperlipemiile
regreseaza si leziunile vasculare anterior instalate dau manifestari clinice;
- Lipidele serice tind sa scada ulterior unui infarct miocardic acut.