Effets du milieu de croissance, de la taille de l'inoculum et

du temps d'incubation sur la culture et l'isolement des

bactéries du sol
Résumé : Les sols sont habités par de nombreuses bactéries appartenant à des groupes
phylogénétiques mal étudiés car les représentants sont rarement isolés dans les études de
culture. L'échec de la culture de ces bactéries s'explique en partie par la faible fréquence à
laquelle les cellules bactériennes du sol forment des colonies visibles lorsqu'elles sont
inoculées sur un étalon milieu microbiologique, ce qui se traduit par des numérations viables
faibles. Nous avons étudié les effets de trois facteurs sur les Les chiffres, évalués en nombre
de CFU sur support solide, et sur les groupes phylogénétiques auxquels les Les bactéries
formant des colonies appartiennent. Ces facteurs étaient la taille de l'inoculum, le milieu de
croissance et la durée d'incubation. La diminution de la taille de l'inoculum a entraîné une
augmentation significative du nombre de cellules viables, mais ne semble pas avoir affecté la
formation de colonies par les membres de groupes rarement isolés. Certains milieux
traditionnellement utilisés pour les études microbiologiques du sol ont donné des numérations
viables faibles et n'ont pas entraîné l'isolement de membres de groupes rarement isolés. Les
nouveaux médias, en revanche, ont permis d'obtenir des numérations viables élevées et
d'isoler de nombreux membres de groupes rarement isolés, quelle que soit la taille de
l'inoculum. L'augmentation de la durée d'incubation jusqu'à 3 mois a permis le développement
de colonies visibles de membres de groupes rarement isolés, en conjonction avec l'utilisation
de milieux appropriés. Une fois isolées, les cultures pures de membres de groupes rarement
isolés ont mis plus de temps à former des colonies visibles que les membres de groupes
communément isolés. En utilisant ces nouveaux milieux et des temps d'incubation prolongés,
nous avons pu isoler de nombreux membres du phyla Acidobacteria (subdivisions 1, 2, 3 et
4), Gemmatimonadetes, Chloroflexi et Planctomycetes (y compris des représentants de la
lignée WPS-1 précédemment non cultivée) ainsi que des membres des sous-classes
Rubrobacteridae et Acidimicrobidae du phylum Actinobacteria.

INTRODUCTION

Les sols contiennent des groupes phylogénétiques de bactéries qui sont répartis dans le monde
entier et abondants en termes de contributions de les individus de ces groupes à l'ensemble
des communautés bactériennes du sol (3, 10, 23). Toutefois, jusqu'à récemment, aucun
représentant de nombreux de ces groupes étaient disponibles pour une étude détaillée en
raison de leur l'incapacité apparente à se développer dans ou sur des milieux de laboratoire.
Une partie des la raison en est que seuls quelques uns (souvent seulement environ 1%) des les
109 cellules bactériennes de chaque gramme de sol semblent capables de former colonies sur
des milieux de laboratoire (5, 14, 28). Cela signifie que de nombreux groupes de bactéries du
sol ne peuvent pas être facilement étudiés en raison de l'incapacité des microbiologistes à
cultiver des représentants en laboratoire. Certains isolats de ces groupes ont récemment été
cultivés en utilisant de nouveaux milieux de culture et des périodes d'incubation prolongées
pour augmenter le nombre de colonies formées et en sélectionnant des isolats à partir de
plaques ne recevant que de petits inocula et ne produisant qu'un petit nombre de colonies (12,
15, 24). Ces approches ont été choisies empiriquement dans des études antérieures. Parmi les
isolats obtenus figuraient de nombreux membres du phylum Acidobacteria ainsi que certains
membres des phyla Verrucomicrobia et Gemmatimonadetes et des sous-classes
Acidimicrobidae et Rubrobacteridae du phylum Actinobacteria (12, 15, 24). Ces groupes sont
très peu étudiés en raison de la rareté des représentants cultivés des sols. L'objectif de la
présente étude était d'étudier les effets du milieu de croissance, de la taille de l'inoculum, de la
densité des colonies et du temps d'incubation sur l'apparition de colonies de membres de ces
groupes de bactéries du sol mal étudiés sur des plaques de milieu de croissance solide
inoculées avec du sol.

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Les souches bactériennes. Pseudomonas aeruginosa 185 (ATCC 10145), Pseudomonas

fluorescens 192 (ATCC 13525), Bacillus megaterium 4R6259 (ATCC 9885), Bacillus subtilis
(ATCC 11774), Sphingomonas paucimobilis CL1/70 (ATCC 29837), Xanthomonas
campestris GB296, Chromobacterium violaceum MK (ATCC 12472), et Kocuria rhizophila
PCI 1001 (ATCC 9341) ont été obtenus de la collection du Département de microbiologie et
d'immunologie de l'Université de Melbourne. Ces cultures ont été maintenues sur une gélose
nutritive (voir ci-dessous) et utilisées pour tester la qualité des milieux de culture. Leur
identité a été confirmée par la comparaison de certaines parties de leurs gènes ARNr 16S,
après amplification et séquençage (voir ci-dessous), avec des séquences de GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov) par l'utilisation de Logiciel BLAST basé sur le web (1).

Cinquante isolats de notre collection de laboratoire ont été utilisés dans des expériences pour
déterminer la capacité des membres de différents groupes à s'épanouir dans une culture
différente les médias. Ceux-ci ont été isolés du sol du même site d'échantillonnage pendant
plusieurs enquêtes antérieures (12, 15, 24 ; C. A. Osborne et P. H. Janssen, non publié P.
Sangwan et P. H. Janssen, données non publiées) ou ont été isolées pendant la période cette
étude. Ces isolats étaient affiliés à neuf différents phylactères bactériens et ont été
sélectionnés de manière à ce que, tout au plus, deux d'entre eux proviennent d'un même
groupe familial (Tableau 1).

Échantillonnage du sol. Des carottes de sol (100 mm de long, 25 mm de diamètre) ont été
prélevées par l'utilisation d'un carottier de sol provenant de l'enclos de contrôle L2 de l'Institut
de recherche laitière, Ellinbank, Victoria, Australie (38°14.55S, 145°56.11E). Les
caractéristiques du sol et le régime de gestion de l'enclos ont été décrits ailleurs (25, 27). Les
carottes de sol intactes ont été transportées au laboratoire dans des plateaux en aluminium
enfermés dans des sacs en polyéthylène à la température ambiante et ont été traités dans les 3
h suivant la collecte. Les dates de collecte étaient le 2 mars 2001 et le 5 avril 2001, et le 29
mai 2003. Sauf indication contraire, les expériences ont été réalisées avec des sols de la
dernière heure d'échantillonnage. Les 30 mm supérieurs de chaque carotte ont été jetés, et les
grosses racines et les pierres ont été retirées du reste, qui a ensuite été tamisé à travers un
tamis en laiton stérilisé en autoclave avec une ouverture de 2 mm (Endecotts Ltd., Londres,
Royaume-Uni), mélangé, et utilisé immédiatement pour des investigations microscopiques,
des déterminations de poids sec, ou des expériences de culture. Le nombre de cellules dans les
échantillons de sol mélangés a été déterminé par des comptages microscopiques de
préparations colorées avec du 4,6-diamidino-2-phénylindole plus de l'orange acridine (S. N.
Cairnduff et P. H. Janssen, données non publiées). Des aliquotes de produits fraîchement
tamisés Les sols ont été pesés avec précision, puis séchés à 105°C pendant 3 jours. Les
échantillons ont ensuite été repesés après avoir été laissés refroidir à température ambiante
dans un dessiccateur. Le facteur de conversion du poids frais en poids sec pour le sol a été
calculé, et tous les résultats sont exprimés par gramme de sol sec.

Les médias. Le milieu VL55 solidifié avec de la gellane et contenant différents substrats de
croissance a été préparé comme décrit par Joseph et al. (15). Ces substrats de croissance et
leurs concentrations finales dans le milieu solidifié étaient les suivants : 2 mM de N-acétyl-
glucosamine ; un mélange de D-glucose, D-galactose, D-xylose et Larabinose (0,5 mM
[chacun]) (15) ; un mélange de D-galacturonate, D-glucuronate, Lascorbate et D-gluconate
(0.5 mM [chacun]) (15) ; un mélange d'acétate, de benzoate, de L-lactate et de méthanol (0,5
mM [chacun]) (15) ; un mélange d'acides aminés (9) avec un ajout de 0.08 g de L-tryptophane
pour 100 ml de solution mère, ajouté à 10 ml de solution mère par litre de milieu ; 0,05 %
(p/vol) d'alginate de sodium ; 0,05 % (p/vol) de xanthane ; 0,05 % (p/vol) de pectine ; 0,05 %
(p/vol) de xylane (VXylG) ; et 0,05 % (p/vol) de carboxyméthylcellulose. Le milieu VL55
avec la gélose comme agent solidifiant et avec soit 0,05 % (p/vol) de xylan (milieu VXylA)
soit 10 mM de glucose (VGluA) comme substrat de croissance a été préparé comme décrit par
Sait et al. (24). Le glucose a été ajouté à partir d'une solution mère de 1M qui a été stérilisée
par filtration (filtre de 0,22 m de taille de pore). Un bouillon nutritif dilué, solidifié avec de la
gélose (DNBA) ou de la gellane (DNBG), a été préparé comme décrit par Janssen et al. (12).
La gélose à extraction à froid (CSEA), la gélose à solution saline de Winogradsky (WSA) et
Des géloses tryptone soja 10 fois diluées (0,1 TSA) ont été préparées selon la méthode décrite
par Joseph et al. (15). La gélose nutritive a été préparée avec 8 g de bouillon nutritif Difco
(BD Diagnostic Systems, Sparks, Md.) et 15 g d'agar bactériologique n°. 1 (Oxoid) par litre
d'eau distillée et avait un pH final d'environ 6,0. Tous les médias ont été utilisés dans des
boîtes de pétri en polystyrène de 90 mm de diamètre.

Expériences de culture. Un échantillon de sol fraîchement tamisé et pesé avec précision

(environ 1 g) a été dispersé dans 100 ml d'eau distillée stérile avant que des aliquotes de 1 ml
soient traitées par sonication comme décrit ailleurs (12). Ces 102 aliquotes diluées ont été
diluées en série à 103, 104, 105, 106 et 107 (12), et 200 l de chacune des trois dernières
dilutions ont été utilisés pour inoculer chacune des 3 ou 5 plaques répliques à chaque niveau
de dilution pour constituer un ensemble de comptage de 9 ou 15 plaques. Les inoculations ont
été étalées sur la surface du milieu contenant de l'agar ou de la gellane à l'aide de tiges
d'étalement en verre stériles. Trois ou sept séries de comptage ont été préparées sur chaque
milieu pour chaque échantillon de sol. Les 1 170 plaques ont toutes été incubées à 25°C dans
l'obscurité pendant 16 semaines dans des sacs en polyéthylène scellés (film de 40 m
l'épaisseur).

Le nombre de viables est exprimé par rapport au poids sec du sol. Les tailles d'inoculum
attendues (exprimées en nombre de cellules par plaque) ont été calculées à partir des comptes
totaux de cellules dans le sol déterminés au microscope, des dilutions effectuées et des
volumes d'inoculum dilués étalés sur les plaques. L'aptitude à la culture a été définie comme
le nombre de cellules viables exprimé en pourcentage du nombre total de cellules déterminé
au microscope pour l'échantillon utilisé dans cette expérience de culture particulière.

La formation des colonies a été surveillée en examinant des plaques après 3 jours, après 7
jours, puis à des intervalles de 7 jours supplémentaires en utilisant une lentille grossissante
avec un grossissement de 2. Lors de l'évaluation du taux de formation de colonies visibles, le
milieu de la semaine a été considéré comme le moment de la formation des colonies (1,5 jour
si les colonies sont apparues dans les 3 jours). Cependant, des résultats presque identiques ont
été obtenus si le début ou la fin de ces intervalles de temps était utilisé pour les calculs.

Le test t de Student (bilatéral), l'analyse de la variance (ANOVA) et le test 2 ont été réalisés
avec le logiciel Excel 2001 (Microsoft Corp., Redmond, Wash.).

Identification des isolats. Les colonies ont été sélectionnées au hasard et sous-cultivées sur
VGluA, 0,1 TSA, WSA, CSEA ou DNBA. Des séquences partielles du gène ARNr 16S (400
nucléotides [nt]) ont été déterminées comme décrit par Joseph et al. (15). Les isolats ont été
identifiés en obtenant des séquences partielles du gène de l'ARNr 16S (401 à 1 452 nt) et en
utilisant ensuite BLAST pour comparer ces séquences à celles de la base de données
GenBank (24). Les critères d'identification utilisés étaient ceux décrits par Joseph et al. (15).
La nomenclature des groupements phylogénétiques et taxonomiques suit généralement celle
de Garrity et al. (8), sauf pour les subdivisions des phyla Acidobacteria et
Gemmatimonadetes, qui suivent les schémas de Hugenholtz et al. (10) et Zhang et al. (29),
respectivement, et les groupements de classe (subdivisions) des phylums Planctomycetes, qui
sont basés sur le schéma de Fuerst et al. (7). La subdivision WPS-1 du phylum
Planctomycetes était nommé par Nogales et al. (20). Pour simplifier le regroupement des
isolats, nous avons supposé une équivalence approximative des classes et des sous-classes de
sous-asile et avons utilisé les sous-classes du phylum Actinobacteria comme des
regroupements de sous-asile similaires. Les regroupements au niveau de la famille suivent le
schéma utilisé par Joseph et al. (15).

Numéros d'accession des nucléotides. Toutes les séquences partielles du gène ARNr 16S
obtenues dans cette étude ont été déposées dans la base de données GenBank sous les
numéros d'accession AY673167 à AY673424.

RESULTS

Nombre minimum de colonies par plaque. Nous avons effectué un comptage des bactéries
capables de former des colonies visibles dans les 12 semaines suivant l'inoculation. Les
échantillons de sol ont été dilués dans de l'eau, et des aliquotes de différentes dilutions ont été
plaquées sur différents milieux dans des ensembles de comptage avec trois (2001 échantillons
de sol) ou cinq (2003 échantillon de sol) plaques de réplication à chaque taille d'inoculum
(niveau de dilution). Comme prévu, le degré de variation du nombre de colonies entre les
plaques répliques d'un ensemble de comptage augmente lorsque le nombre moyen de colonies
sur ces trois ou cinq plaques diminue (Fig. 1A). Le coefficient de variation (écart-type divisé
par la moyenne) était relativement constant, avec une moyenne de 19,7 % pour les niveaux de
dilution dans les ensembles de comptage où le nombre moyen de colonies par plaque était de
40 (n 57 ensembles de trois ou cinq plaques). Les niveaux de dilution avec un nombre moyen
de colonies de < 40 par plaque avaient des coefficients de variation plus importants (moyenne
= 52% ; maximum = 173% ; n = 160) qui étaient également plus variables entre les différents
ensembles de comptage.

Effet de la taille de l'inoculum. La réduction du nombre de colonies prévue après 12

semaines d'incubation ne s'est pas produite lorsque des inoculums 10 fois plus petits ont été
utilisés. Au lieu de cela, il y a eu une réduction d'environ 5 fois (5,2 fois pour les expériences
de 2001 et 5,7 fois pour les expériences de 2003) du nombre de colonies pour chaque
réduction de 10 fois de la taille de l'inoculum. Le nombre moyen de colonies était donc deux
fois plus élevé que celui prévu par le nombre de colonies sur les plaques du même ensemble
de comptage, mais avec une Inoculum 10 fois plus grand (Fig. 1B). Ce n'est que lorsque le
nombre de colonies était très faible que cet effet était moins apparent (Fig. 1C). En
conséquence, les numérations viables sur tous les milieux étaient plus importantes lorsqu'un
inoculum plus dilué était utilisé pour calculer la numération viable, et ce résultat était
statistiquement significatif (P < 3 x 104 pour différents inoculums dans les tests t appariés et n
= 60 ensembles de comptage de trois niveaux de dilution chacun, avec trois répétitions par
niveau de dilution, pour les données de 2001 ; P < 4 x 104 et n = 42 ensembles de comptage
de trois niveaux de dilution chacun, avec cinq répétitions par niveau de dilution, pour les
données de 2003). La figure 2A montre l'augmentation des comptes viables (P < 5 x 106 pour
les comparaisons de niveaux de dilution successifs) avec la diminution de la taille des
inoculums pour trois milieux qui ont donné des comptes importants. Le comptage
microscopique par épifluorescence directe des cellules (au moins 30 champs pour chacun des
15 sous-échantillons de sol tamisé et mixte) a montré qu'il y avait 1,28 x 109 (écart-type [ET]
= 5,03 x 108) cellules par g de sol sec dans l'échantillon de sol utilisé pour cette expérience.
Cela nous a permis de calculer la taille moyenne attendue de l'inoculum pour chaque niveau
de dilution. La cultivabilité moyenne, qui est le nombre de CFU exprimé en pourcentage du
nombre de cellules dans l'inoculum, augmentait à mesure que la taille de l'inoculum diminuait
(tableau 2). La cinétique de développement des colonies n'était cependant pas différente selon
la taille de l'inoculum (Fig. 2B).

Sur la base de ces résultats, nous avons décidé de calculer des numérations viables à partir de
plaques à l'inoculum le plus dilué qui donnaient un minimum de 10 colonies par plaque, en
faisant la moyenne sur trois ou cinq plaques répliquées à ce niveau de dilution. Pour
surmonter la variabilité accrue de ces nombres de colonies, nous avons préparé plusieurs
ensembles de comptage pour chaque type de milieu.

Sélection du substrat de croissance. Les numérations viables obtenues avec le milieu VL55,
avec la gellane comme agent solidifiant et avec chacun des 10 substrats de croissance ou
mélanges de substrats supplémentaires différents, ont varié de 5,0 x 107 à 6,3 x 108 UFC par
g de sol sec dans des ensembles de numération individuels après incubation pendant 12
semaines à 25°C. Les comptages viables obtenus à partir de deux carottes de sol différentes
(en mars et avril 2001) n'étaient pas significativement différents (P = 0,13 par un test t
apparié). Le choix du milieu de croissance a eu un effet détectable sur les comptages viables
obtenus (P = 7 x 104 par ANOVA de classification unique). Le nombre moyen le plus élevé a
été obtenu avec le xylan comme substrat de croissance (Fig. 3), et le xylan a donc été choisi
pour d'autres expériences.

Effet du temps et du milieu d'incubation sur le comptage viable. Les effets du temps
d'incubation et du choix du milieu ont été étudiés en déterminant le nombre de colonies qui
étaient visibles sur des plaques de six milieux différents à intervalles hebdomadaires. Les
numérations viables étaient significativement différentes entre les milieux, même après
seulement 1 semaine d'incubation (P = 7 x 107 par ANOVA de classification unique), et cela
a continué pendant les 12 semaines entières (à 12 semaines, P = 4 x 108). Les comptes avec
0,1 x TSA ont atteint leur maximum après 2 semaines d'incubation (Fig. 4), et au-delà d'une
semaine, l'augmentation des comptes viables avec le temps n'était pas statistiquement
significative (P = 0,75 par ANOVA à mesures répétées). L'utilisation de la CSEA et de la
WSA a entraîné une augmentation du nombre de colonies avec l'allongement de la durée
d'incubation (P = 3 x 103 et 7 x 104, respectivement, par ANOVA à mesures répétées pour
semaines 1 à 12), et les comptes finaux étaient plus élevés que ceux obtenus avec 0,1 x TSA
(P = 2 x 103 et 0,016, respectivement, par le test t de Student). Les milieux basés sur le VL55
avec le xylan comme substrat de croissance (VXylA et VXylG) et le DNBG ont donné des
comptes de colonies encore plus élevés (Fig. 4), et ceux-ci ont continué à augmenter pendant
la période d'incubation de 12 semaines (P < 6 x 105 par ANOVA à mesures répétées). Même
après 12 semaines, le nombre de colonies sur les deux milieux basés sur le milieu VL55 a
continué à augmenter. Les analyses qui suivent ont été réalisées avec des colonies
apparaissant dans les 12 premières semaines. Il n'y avait pas de support statistique pour les
différences entre les comptes obtenus sur DNBG, VXylA, et VXylG (P > 0,48 par le test t de
Student). Cependant, le VXylG (solidifié avec de la gellane) a donné des numérations qui
étaient 15 % plus élevées que lorsque le même milieu était utilisé avec la gélose comme agent
de solidification (VXylA). La culture après incubation pendant 12 semaines a varié d'une
moyenne de 1,5 % de la numération cellulaire totale déterminée au microscope sur 0,1 x TSA
à une moyenne de 15 % sur DNBG ou VXylG. Les milieux DNBG, VXylA et VXylG ont
tous donné des numérations viables plus élevées que les milieux 0,1 TSA, CSEA et WSA (P =
3 x 104 à 0,027 par des comparaisons de tests t entre les numérations sur chaque milieu).
L'augmentation continue du nombre de colonies avec des temps d'incubation prolongés au
cours de la période d'incubation de 12 semaines a également été observée avec tous les
milieux présentés sur la figure 3 qui étaient basés sur le milieu VL55 avec de la gellane
comme agent solidifiant mais avec différents substrats de croissance (données non
présentées).

Identités des isolats. Au total, 250 bactéries formant des colonies qui se sont développées sur
des plaques inoculées avec l'échantillon de sol à partir de mai 2003 ont été identifiées sur la
base de leurs séquences de gènes ARNr 16S. Parmi elles, 212 sont apparues au cours de la
première semaine, de la quatrième et de la cinquième semaine, et de la huitième semaine ou
plus tard sur des plaques qui ont reçu un inoculum prévu de 17,8 ou 178 cellules chacune.
Douze d'entre elles provenaient de six colonies mixtes qui ont été séparées avec succès en
deux cultures pures chacune. Les 38 autres colonies ont été choisies au hasard parmi celles
qui sont apparues au cours de la semaine 8 ou plus tard sur des plaques recevant un inoculum
prévu de 1 780 cellules chacune. Sur ces 250 isolats, 249 étaient affiliés à huit
embranchements bactériens (tableau 3). L'isolat restant, qui était phylogénétiquement affilié à
la famille des algues eucaryotes Trebouxiophyceae, a été identifié sur la base de la séquence
d'un gène ARNr 16S de ses plastides. Cet isolat n'a pas été inclus dans les analyses
ultérieures. Une liste de tous les isolats obtenus dans cette étude, détaillant leurs affiliations
phylogénétiques, les numéros d'accès GenBank de leurs séquences de gènes ARNr 16S, les
milieux d'isolement et les moments d'apparition des colonies, est disponible sur demande.

On a observé que certaines colonies se répandaient rapidement sur toute la plaque dans la
semaine suivant l'inoculation avec des aliquots de sol dilués. Elles se sont principalement
produites sur des plaques contenant 0,1 x TSA (sur 29 des 105 plaques) mais ont également
été observées sur du DNBG (sur 2 des 105 plaques) et du VXylG (sur 1 des 105 plaques).
Deux de ces colonies faisaient partie de la collection de 250 isolats, et toutes deux étaient
membres de la famille des Bacillaceae. Huit autres colonies en expansion qui ne faisaient pas
partie de la collection principale d'isolats ont été sélectionnées à partir des plaques. Cinq
d'entre elles étaient des membres de la famille Bacillaceae, deux étaient des membres de la
famille Flexibacteriaceae, et une était un membre de la famille Paenibacillaceae. Ces 10
isolats en propagation ont constamment présenté ce phénotype lorsqu'ils étaient sous-cultivés
sur 0,1 TSA (tous les 10), DNBA (8 sur 10), CSEA (5 sur 10), ou WSA (4 sur 9 ; un isolat ne
pouvait pas pousser sur ce milieu). Toutefois, seuls deux des neuf isolats ont présenté un
phénotype de dissémination lorsqu'ils ont été cultivés sur un milieu (VGluA) basé sur le VL55
(un isolat n'a pas pu se développer sur ce milieu).

Effet du temps et du milieu d'incubation sur les groupes cultivés. Nous avons comparé
l'apparition d'isolats de différents groupes phylogénétiques à différents moments. Pour faire
cette comparaison, nous avons divisé les 212 isolats des plaques terminales à croissance
positive des ensembles de comptage en deux catégories : (i) les isolats affiliés à des groupes
communément isolés qui sont bien représentés par des représentants en culture, c'est-à-dire les
membres de la sous-classe Actinobacteridae du phylum Actinobacteria et les membres des
phyla Proteobacteria (classes Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, et
Gammaproteobacteria), Bacteroidetes, et Firmicutes, et (ii) les isolats affiliés à d'autres
groupes qui ne sont que rarement isolés du sol (Tableau 3). Il s'agissait d'une séparation très
conservatrice, car de nombreux membres de la catégorie des personnes communément isolées
étaient affiliés à des familles peu étudiées, avec peu d'isolats déclarés. Par exemple, 14 (12%)
des 119 membres des Actinobacteridae et 11 (13%) des 86 membres des Proteobacteria
étaient des membres de familles encore non décrites (trois et quatre familles dans les
Actinobacteridae et les Proteobacteria, respectivement). Le nombre d'isolats appartenant à des
groupes rarement isolés a augmenté de 0 à 16% des isolats avec l'augmentation du temps
d'incubation (Tableau 4), et un test Q2 avec les données regroupées des six milieux a suggéré
que le temps d'incubation était un facteur significatif pour obtenir des isolats de ces groupes
(P = 7 x 103 par le test Q2). Le milieu a également influencé le nombre de membres de
groupes rarement isolés qui ont été isolés (tableau 5) (P = 2 x 103 par le test Q2). Aucun n'est
apparu dans les médias 0,1xTSA, WSA et CSEA. Lorsque seuls les résultats des trois milieux
sur lesquels les membres de groupes rarement isolés sont apparus ont été analysés, il n'y a pas
eu d'effet observable du milieu (P = 0,19 par le test Q2), mais le temps d'incubation a quand
même eu un effet significatif (P = 5 x 103 par le test Q2). Les membres de groupes rarement
isolés ont été isolés de ces trois médias pendant les périodes de 4 à 5 semaines et de 8 à 12
semaines (tableaux 4 et 5). Dix des 11 isolats du phylum Proteobacteria qui représentaient de
nouvelles familles sont apparus à la semaine 8 ou plus tard. Ce n'était pas le cas pour les 14
isolats de la sous-classe Actinobacteridae qui représentaient de nouvelles familles, un seul
étant apparu après la semaine 8.

Effet de la taille de l'inoculum sur les groupes phylogénétiques. Nous avons comparé
l'identité de colonies apparaissant tardivement (à partir de la semaine 8) sur des plaques de
différentes tailles d'inoculum, c'est-à-dire de différents niveaux de dilution (tableau 2).
Comme certains milieux n'ont pas produit de membres de groupes rarement isolés, cette
analyse a été limitée au comptage des ensembles créés avec du DNBG, du VXylA et du
VXylG. La taille de l'inoculum ne semble pas avoir d'effet sur l'isolement des membres de
groupes rarement isolés (P = 0,56 par le test Q2). Même sur les plaques recevant le plus grand
inoculum de sol (1 780 cellules/plaque prévues), nous avons isolé des membres des
Acidobactéries (11 isolats en quatre subdivisions), des Acidimicrobidés (1 isolat), des
Rubrobactériens (1 isolat), des Gemmatimonadètes (1 isolat) et des Planctomycètes (2
isolats). Au total, 36% de tous les isolats apparaissant sur ces supports à la semaine 8 ou plus
tard appartenaient à des groupes rarement isolés.

Effet du type de milieu et de la durée d'incubation sur le développement des colonies par
des cultures pures. Cinquante isolats ont été sélectionnés pour comparer leur capacité à se
développer sur différents milieux. Trente-deux d'entre eux appartenaient à la grande catégorie
des groupes communément isolés, et les 18 autres étaient membres de groupes rarement isolés
(tableau 1). Ces derniers ont été sélectionnés pour couvrir plusieurs phyla différents, de sorte
que deux membres au maximum d'un même groupe familial soient inclus. Une plus grande
proportion de bactéries affiliées à des groupes communément isolés a pu se développer sur
0,1xTSA, WSA et CSEA que celle des membres de groupes rarement isolés (tableau 6). Les
membres des deux groupes se sont bien développés sur VGluA et DNBA. Toutefois, les
membres de groupes rarement isolés ont connu une croissance nettement plus lente sur tous
les supports que les membres de groupes communément isolés (tableau 6). Pour tester la
qualité de ces milieux, nous avons testé huit souches de la collection du département de
microbiologie et d'immunologie de l'université de Melbourne, afin de déterminer leur capacité
à se développer sur les cinq milieux utilisés pour ces expériences. Les huit isolats ont produit
des colonies visibles sur les cinq milieux après 2,7 jours (ET = 1,9) d'incubation à 25°C en
moyenne.

DISCUSSION

Choix des médias. Un large éventail de supports différents a été utilisé pour estimer la taille
de la communauté bactérienne du sol et pour isoler les représentants de cette communauté (2,
14, 21). Toutefois, on sait depuis longtemps que le nombre de bactéries capables de former
des colonies sur des milieux microbiologiques ne représente généralement qu'une petite partie
du nombre total de bactéries présentes dans le sol (5, 14, 28). En outre, l'avènement des
technologies d'écologie moléculaire a révélé la présence de nombreux groupes de bactéries
nouvelles dans le sol, mettant en évidence l'inadéquation des méthodes de culture pour l'étude
générale des bactéries du sol (3, 10, 23). Récemment, l'utilisation de milieux non traditionnels
a permis d'isoler les membres de certains de ces groupes auparavant non cultivés (12, 15, 24).
L'un de ces milieux, le milieu VL55, a été formulé pour imiter les faibles concentrations
d'ions inorganiques dans les sols, avec des concentrations accrues d'ions ammonium et
phosphate pour permettre la formation d'une biomasse suffisante pour produire des colonies
visibles. Le pH a été ajusté au pH du sol au site étudié (27). Pour cette étude, nous avons testé
l'effet d'une gamme de substrats de croissance dans ce milieu basal. Sur la base des résultats,
nous avons choisi le xylan comme substrat de croissance pour d'autres car elle a donné les
chiffres moyens les plus élevés dans cette étude. Le Xylan a également été utilisé avec succès
comme substrat de croissance pour l'isolement des représentants de groupes peu étudiés de
bactéries dans des études antérieures (15, 24). Nous avons comparé ce milieu et le DNBG, qui
a également été utilisé avec succès dans une étude antérieure (12), avec trois milieux qui sont
plus couramment utilisés pour la culture des bactéries du sol, à savoir le CSEA, le WSA et le
0,1xTSA.

Effet de la taille de l'inoculum. Des études antérieures ont signalé à plusieurs reprises que
des inoculums plus petits entraînent des taux de viabilité plus élevés (4, 11, 13, 14, 21). Dans
nos expériences, la dilution de l'inoculum a entraîné une multiplication par deux du nombre
final de cellules viables pour chaque diminution de 10 fois la taille de l'inoculum. Nous avons
observé une augmentation de la variabilité, mesurée par le coefficient de variation, à mesure
que la taille de l'inoculum diminuait, ce qui est prévisible. Ainsi, la précision des comptages
viables diminuait au fur et à mesure que le nombre de colonies sur chaque plaque diminuait.
Nous pensons cependant que l'augmentation générale des comptes viables avec la diminution
de la taille des inoculums était réelle car elle s'est produite de manière constante sur un grand
nombre d'ensembles de comptage. Il est clair que les plages standard acceptables de nombres
de colonies sur une plaque qui sont généralement utilisées pour déterminer les comptes
viables (20 à 200, 25 à 250, ou 30 à 300 [6, 16, 22]) sont inappropriées pour les expériences
avec le sol, car les comptes dans ces plages sont clairement sous-estimés en raison des
comptes déprimés obtenus avec de grands inocula. Cela est probablement dû à l'inhibition de
la croissance de certaines espèces par d'autres lorsque les colonies sont trop rapprochées ou à
l'épuisement des nutriments par les colonies à croissance rapide, de sorte que les colonies à
croissance lente n'atteignent pas une taille détectable. Il a été observé que l'utilisation de
plaques plus grandes surmonte en partie cet effet d'encombrement (4). La variabilité entre les
répliques augmentait de façon spectaculaire lorsque des colonies plus petites étaient utilisées
pour calculer les comptes viables. Le choix du nombre de colonies à utiliser pour déterminer
le compte viable est devenu un compromis entre une reproductibilité accrue à >40 colonies
par plaque (90 mm de diamètre) et une augmentation du compte viable lorsque des plaques de
<40 colonies étaient utilisées. Nous avons décidé de calculer les numérations viables à partir
de plaques ayant la plus petite taille d'inoculum et produisant un minimum de 10 colonies par
plaque, en faisant la moyenne de toutes les plaques reproduites à cette taille d'inoculum
(niveau de dilution) dans un ensemble de numération. Pour surmonter l'augmentation de la
variabilité associée, nous avons répété chaque expérience de comptage jusqu'à sept fois (avec
trois ou cinq plaques de réplication pour chacune des trois tailles d'inoculum).

Nous nous attendions à voir des différences dans la cinétique de formation des colonies pour
les différentes tailles d'inoculum, mais ce ne fut pas le cas. On s'attendait à ce que le
développement rapide d'un plus grand nombre de colonies à croissance rapide sur des plaques
avec des inoculums plus grands empêche l'apparition de colonies à croissance plus lente en
raison d'effets inhibiteurs ou compétitifs. L'effet d'entassement sur les plaques comportant un
plus grand nombre de colonies n'a pas non plus affecté la proportion de membres de groupes
rarement isolés. Ces organismes ont formé des colonies visibles à la fin de la période
d'incubation (voir ci-dessous). Si on les empêchait de former des colonies visibles sur des
plaques encombrées, les membres de groupes isolés en commun, dont la croissance est tout
aussi lente, étaient inhibés dans une mesure similaire. Les membres des deux groupes seraient
alors isolés dans des proportions similaires, quelle que soit la taille de l'inoculum. Indeed,
there is no reason to assume that slow growth is restricted to members of the rarely isolated
groups, and we found that members of new families of Proteobacteria are also slow growing
(unpublished data).

Effet du milieu. Nous avons constaté que 0,1xTSA était le plus pauvre des six milieux que
nous avons étudiés en détail pour obtenir des groupes bactériens rarement isolés. Aucun isolat
appartenant à des groupes rarement isolés n'a été obtenu sur ce milieu dans cette étude, bien
qu'un membre du phylum Acidobacteria ait été isolé sur ce milieu (18). Ce milieu a également
permis l'expression d'un phénotype de dissémination de sorte que quelques colonies isolées,
principalement des membres de la famille des Bacillaceae, ont rapidement couvert la majeure
partie ou la totalité de la surface de la plaque. La CSEA et la WSA ont également été des
choix médiocres, ce qui a entraîné une faible culturabilité et l'absence d'isolats affiliés à des
groupes rarement isolés. Les médias 0.1xTSA, CSEA et WSA n'ont pas non plus soutenu la
croissance d'autant d'isolats de culture pure de membres de groupes rarement isolés que les
autres médias, mais ils ont été de très bons médias pour la croissance de cultures pures de
membres de groupes communément isolés.

Le DNBG et les médias basés sur le milieu VL55 ont permis d'obtenir des comptes viables
plus élevés et ont permis le développement de colonies visibles de membres de groupes
rarement isolés. Très peu de colonies de propagation ont été observées sur ces plaques, et le
phénotype de propagation n'a pas été exprimé sur les milieux basés sur la VL55 par la plupart
des isolats qui se sont propagés sur d'autres milieux. Nous avons constaté que l'utilisation de
la gellane comme agent solidifiant avec le milieu VL55 donnait des comptes viables plus
élevés que l'utilisation de l'agar comme agent solidifiant, en accord avec une constatation
antérieure comparant ces deux agents gélifiants dans des expériences avec la DNBG et la
DNBA (12). Cette conclusion n'a pas été étayée par des tests statistiques des données, mais
cela peut être dû au fait que nous avons tenté de détecter de petites différences dans les
ensembles de données à forte variabilité. L'utilisation de l'agar comme agent de solidification
ne semble pas avoir entraîné d'inhibition de la croissance des membres de groupes rarement
isolés, ce qui concorde avec les conclusions d'une étude antérieure (24).
Jensen (13) a déclaré que pour qu'un milieu soit adapté à la plaque compte, il doit remplir les
quatre conditions suivantes autant que possible. Premièrement, sa composition doit être
normalisée de manière à qu'il puisse être reproduit avec une précision suffisante partout et à
tout moment. Dans cette étude, seule la CSEA n'a pas rempli cette puisqu'il contient un extrait
de sol dérivé du site. Olsen et Bakken (21) ont cependant montré que les médias de la CSEA
ont préparé avec des extraits de différents sols a donné des résultats pratiquement identiques
de colonies, ce qui pourrait ne pas éliminer la CSEA en tant que moyen. Deuxièmement, le
support doit permettre le développement d'un éventail aussi large que possible des bactéries
présentes, qui était vrai pour le VXylA, le VXylG et le DNBG. Troisièmement, le milieu doit
permettre la croissance la plus faible possible de micro-organismes non bactériens
indésirables, tels que les champignons. Le nombre de colonies de champignons était faible et
à peu près le même pour les six milieux (données non présentées). Enfin, la croissance des
colonies en expansion doit être supprimée. Dans l'ensemble, les milieux basés sur le milieu
VL55 ou le DNB semblent répondre le mieux aux critères de Jensen.

Effet du temps d'incubation. Il est bien connu que l'augmentation du temps d'incubation
entraîne une augmentation des comptes viables (12, 13, 14, 26, 28), en particulier sur les
milieux à faible concentration en nutriments (14). Cependant, les temps d'incubation de l'ordre
de plusieurs mois sont n'est que rarement utilisé, et les temps d'incubation sont généralement
dans la de 1 semaine à 1 mois (14, 22, 28). Incubation prolongée semblent être importantes,
car les membres de groupes rarement isolés les groupes sont apparus principalement après une
incubation de 2 mois sur des milieux appropriés inoculés de terre. Cela suggère que les
membres de ces groupes ont une croissance particulièrement lente ou ont des périodes de
latence très longues. Les cultures pures de membres de ces groupes ont également une
croissance lente et mettent beaucoup plus de temps à produire des colonies visibles que les
cultures pures de membres de groupes communément isolés. Les membres de groupes
rarement isolés peuvent être capables de se développer plus rapidement une fois que les
milieux et les conditions de croissance ont été optimisées, mais nous suggérons qu'ils ne se
développeront pas, en général, aussi rapidement que les bactéries du sol communément
étudiées.

Identités des isolats. De nombreux isolats provenant de groupes communément isolés étaient
affiliés à des groupes familiaux qui ont peu de représentants en culture, mais ont été détectés
dans les sols en tant que gènes ARNr 16S. En outre, il a été possible d'isoler des membres de
groupes bactériens qui étaient auparavant étiquetés comme non cultivables, comme nous
l'avons constaté dans des enquêtes précédentes (12, 15, 24). Dans cette étude, des isolats du
phylum Acidobacteria représentant quatre des huit subdivisions définies par Hugenholtz et al.
(10) ont été cultivées. Certains d'entre eux appartiennent à de nouvelles familles distinctes de
ceux qui étaient auparavant isolés (15). Nous avons également isolé les membres des sous-
classes mal étudiées Acidimicrobidae et Rubrobacteridae du phylum Actinobacteria.

Trois des isolats du phylum Planctomycetes n'avaient qu'un rapport lointain avec les
représentants cultivés de ce groupe. L'un d'entre eux était affilié à la subdivision "Gemmatae"
mais n'avait qu'une parenté lointaine avec des membres du genre Gemmata. Il était plutôt
apparenté à un groupe de bactéries qui n'étaient auparavant connues que grâce aux gènes
d'ARNr 16S détectés dans le sol (17). Les deux autres étaient membres de la lignée WPS-1 du
phylum Planctomycetes, un groupe de classe qui n'était auparavant connu que par les gènes
d'ARNr 16S du sol (20 ; L. Schoenborn et P. H. Janssen, données non publiées) et d'autres
habitats. Ces deux isolats, ainsi qu'un troisième provenant d'une autre étude réalisée dans
notre laboratoire (P. Sangwan et P. H. Janssen, données non publiées), sont les premiers
représentants cultivés connus de ce groupe.

Un membre du phylum Gemmatimonadetes a été cultivé. À ce jour, ce phylum est représenté

par un isolat d'une espèce nommée, Gemmatimonas aurantiaca (29), et par trois isolats
provenant du site du sol d'Ellinbank (15). Nous avons également cultivé un isolat qui
représente le premier membre cultivé d'une nouvelle subdivision du phylum Chloroflexi qui
n'est affilié à aucune des subdivisions reconnues (10 ; P. Hugenholtz, communication
personnelle).

Conclusions. Le système que nous avons étudié est un sol limoneux argileux krasnozem sous
un pâturage mixte de ray-grass et de trèfle qui est géré selon un régime de fertilisation et de
pâturage qui peut être considéré comme proche de la norme du district (19). Nous attribuons
notre succès dans l'isolement des membres de groupes rarement isolés aux méthodes utilisées
plutôt qu'aux propriétés inhabituelles de ce système de sol. L'isolement réussi de membres de
groupes de bactéries largement répandues et communes dans les sols du monde entier semble
être le résultat de l'utilisation de milieux appropriés et de temps d'incubation prolongés. Nous
avons utilisé cette approche de manière empirique dans des études antérieures (12, 15, 24).
Cette étude démontre l'importance du choix du milieu et du temps d'incubation sur la réussite
de l'isolement de représentants de groupes de bactéries du sol numériquement abondants mais
rarement isolés.

TABLEAU 1. Isolats utilisés pour des expériences visant à déterminer la capacité des
membres de différents groupes à se développer sur différents milieux de culture.

TABLEAU 2. Effet de la taille de l'inoculum sur la cultivabilité après incubation pendant 12

semaines et sur le nombre de bactéries affiliées à des groupes rarement isolés qui ont formé
des colonies à la semaine 8 ou plus tard sur des plaques de DNBG, VXylA et VxylG.

TABLEAU 3. Affiliations phylogénétiques de 250 isolats cultivés à partir du sol pour cette
étude.

TABLEAU 4. Isolats de bactéries ayant formé des colonies visibles à différents moments sur
les plaques terminales des ensembles de comptage inoculés avec de la terre.

TABLEAU 5. Isolats de bactéries qui ont formé des colonies visibles sur les plaques
terminales des ensembles de comptage avec différents milieux inoculés avec de la terre.

TABLEAU 6. Capacité de croissance des cultures et temps nécessaire pour que les colonies
apparaissent sur différents milieux pour des cultures pures de bactéries du sol provenant de
groupes communément isolés et rarement isolés a.
FIG. 1. (A) Variabilité du nombre de colonies de réplicats dans les ensembles de comptage
par rapport au nombre moyen de colonies par plaque pour chaque ensemble de comptage. La
variabilité est exprimée par le coefficient de variation (SD/moyenne) pour les réplicats (trois
ou cinq) à une taille d'inoculum quelconque au sein d'un ensemble de comptage. (B)
Comparaison du nombre de colonies sur des plaques inoculées avec des suspensions de sol
avec des différences de 10 fois la taille de l'inoculum. Le nombre de colonies sur les plaques
avec l'inoculum le plus grand est porté sur l'axe des x, et le nombre de colonies sur les plaques
correspondantes avec un inoculum 10 fois plus petit dans le même ensemble de comptage est
porté sur l'axe des y. La ligne diagonale représente la relation attendue entre le nombre de
colonies qui se forment sur les plaques, en supposant une réduction du nombre de colonies par
un inoculum dix fois plus petit. (C) Agrandissement des données de la partie inférieure
gauche vide du panneau B. Symboles pour tous les panneaux : , données des expériences
réalisées en 2001, chaque point de tous les panneaux représentant le résultat de trois plaques
de réplique à chaque niveau de dilution ; , données des expériences réalisées en 2003,
chaque point représentant le résultat de cinq plaques de réplique à chaque niveau de dilution.

FIG. 2. (A) Dénombrements viables à différentes tailles d'inoculum (niveaux de dilution) pour
trois milieux différents après 12 semaines d'incubation. Symboles : , DNBG ; , VXylA ;
, VXylG. Chaque point représente la moyenne de cinq plaques reproduites. La ligne
horizontale épaisse indique la moyenne, et les lignes verticales indiquent un écart-type par
rapport à la moyenne. (B) Augmentation des comptes viables avec le temps d'incubation à
trois tailles d'inoculum différentes. , inoculum de 1 780 cellules par plaque ; ■, inoculum de
178 cellules par plaque ; , inoculum de 17,8 cellules par plaque. Les données sont des
résultats regroupés obtenus avec DNBG, VXylA et VXylG. Les résultats de chaque série de
comptage ont été calculés en pourcentage du comptage de 12 semaines pour cette série de
comptage, et chaque point représente la moyenne de trois supports, chacun étant utilisé pour
sept séries de comptage, chacune étant à son tour composée de cinq plaques répliques. Par
souci de clarté, les erreurs types ne sont pas indiquées ; l'erreur type moyenne pour tous les
points était de 12,3 % des valeurs tracées.

FIG. 3. Dénombrement moyen des viables après 12 semaines de croissance sur un milieu
VL55 avec différents substrats de croissance. Chaque barre pleine représente la moyenne de
trois ensembles de comptage préparés à partir de l'échantillon de sol de mars 2001 et de trois
ensembles de comptage préparés à partir de l'échantillon de sol d'avril 2001. Les barres
d'erreur indiquent les erreurs types. Abréviations : CMC, carboxyméthylcellulose ; NAG, N-
acétyl-glucosamine ; AA, mélange d'acides aminés ; GGAG, mélange de D-galacturonate, D-
glucuronate acide, L-ascorbate et D-gluconate ; GGXA, mélange de D-glucose, D-galactose,
D-xylose et Larabinose ; ABLM, mélange d'acétate, de benzoate, de L-lactate et de méthanol.

FIG. 4. Augmentation des comptes viables sur différents milieux avec des temps d'incubation
croissants. Symboles : , 0,1xTSA ; ■, WSA ; , CSEA ; ,VXylG ; , VXylA ; ,
DNBG. Chaque point représente la moyenne de sept expériences, chacune d'entre elles
comprenant cinq plaques de réplication. Par souci de clarté, les erreurs standard ne sont pas
indiquées ; l'erreur standard moyenne de tous les points était de 14,5 % des valeurs tracées.