Universidad de Los Andes

Facultad de Ingeniería
Escuela de Ingeniería Química
Departamento de Química Industrial y Aplicada
Laboratorio De Análisis Instrumental

PRACTICA N° 13: DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE CAFEÍNA

DE UNA MIESTRA PROBLEMA POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA
PRECISIÓN (HPLC)
Becerra María Fernanda, Díaz Hugo, Mora Katherine

RESUMEN

La cromatografía líquida de alta resolución es una técnica de separación y análisis

cuantitativo de una amplia variedad de mezclas, en particular la cromatografía en fase
reversa permite separar moléculas en base a su polaridad y utilizan alta presión para
mejorar la resolución y reducir los tiempos de separación. En la práctica se quiere hacer la
separación de una muestra de compuestos aromáticos que contiene fenol y cafeína mediante
una fase móvil de una mezcla de solventes agua:metanol por medio del método HPLC. Para
lograr la separación de los mismo se inyectó la muestra problema junto con la fase móvil
cuya proporción de agua:metanol es de 50:50. Mediante la relación de las áreas obtenidas
en los cromatogramas para el estándar y la muestra problema y la concentración conocida
de los analitos en los estándares, fue posible determinar las mismas concentraciones en la
muestra problema, dando como resultado valores de 93,709 ppm y 451,244 ppm para la
cafeína y el fenol respectivamente. Dicha separación se obtuvo principalmente debido a las
diferencias entre las moléculas y propiedades fisicoquímicas de los compuestos fenol y
cafeína que permiten la separación por cromatografía líquida.

INTRODUCCIÓN
En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase
estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas
características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta
presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades
y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas
o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de
retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la
composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a
ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad
identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria.
La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de
los compuestos dentro de la columna y reduce así su difusión dentro de la columna
mejorando la resolución de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el
metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el
ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos. [1]

Una mejora introducida a la técnica de HPLC descrita es la variación en la composición de

la fase móvil durante el análisis, conocida como elución en gradiente. Un gradiente normal
en una cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de
forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado varía en función de la
hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una
función de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la
fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos
más hidrofílicos eluirán a mayor concentración de agua, mientras que los compuestos más
hidrofóbicos eluirán a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta
realizar una serie de pruebas previas con tal de optimizar el gradiente de forma que permita
una buena separación de los compuestos. [1]
 Figura 1: Instrumental HPLC.

Los solventes más comúnmente empleados en Cromatografía Líquida son:

Hexano, Cloroformo, Cloruro De Metilo, Tetrahidrofurano, Acetonitrilo, Isopropanol,

Metanol, Agua.

Estos solventes están citados en orden de polaridad creciente con respecto a la adsorción en
gel de sílice. Una guía para seleccionar el solvente o mezcla de solventes para una
determinada separación, es la de las escalas de polaridades de los solventes.

El lenguaje común empleado en cromatografía utiliza algunos términos y símbolos

característicos de esta técnica instrumental; a continuación se dan los más utilizados,
indicando en los casos pertinentes su importancia operacional y la forma en que son
evaluados.

 Tiempo de retención (tr): Es el tiempo que la muestra permanece dentro de la

columna y se mide desde el momento en que la muestra se introduce en el sistema
hasta el momento en que se obtiene el punto máximo de la señal o pico. El tiempo
de retención es característico de la muestra, la columna, la fase móvil y la
temperatura. Por lo general se emplea como medida de tipo cualitativo y se expresa
en segundos.
  Tiempo muerto (to o tm): Es el tiempo requerido para eluir una muestra no retenida
en la columna y se determina midiendo el tiempo de retención de la fase móvil
misma, o bien de una muestra similar.

 Tiempo de retención ajustado (tr): Es la diferencia entre tr y to, es decir la medida

del tiempo que la muestra permanece retenida en el material de relleno de la
columna. Dicho de otra manera, tr es el tiempo total de permanencia en la columna,
to el tiempo que la muestra permanece en la fase móvil y, por lo tanto, tr es el
tiempo que la muestra permanece retenida en la fase estacionaria.

 Anchura de la base de las señales (Wb): Es la porción de línea base interceptada por
tangentes trazadas a ambos lados de una señal cromatográfica; asumiendo que la
forma de la señal es gausiana, esta anchura es aproximadamente igual a cuatro veces
el valor de o, o sea la dispersión de una distribución gausiana de valores. Este valor
de anchura se emplea en el cálculo de la resolución y eficiencia de los sistemas
cromatográficos.

 Coeficiente de distribución de reparto (K): El coeficiente de distribución es una

propiedad física fundamental de cada sustancia. Es característico de cada muestra y
del sistema de fase móvil y de fase estacionaria en consideración, y también es
función de la temperatura.

La cromatografía líquida es empleada en una gran diversidad de áreas como son: la

industria, ciencias básicas e investigación, ingeniería, medicina, farmacia, etc. Entre
algunos de los ejemplos de la diversidad de áreas de su aplicación pueden señalarse:

Contaminantes. Residuos productos sanitarios: substancias destinadas al diagnóstico,

prevención o tratamiento de las enfermedades, por su mal uso o abuso, a repercusiones
desfavorables para aquellos o para la salud pública. Pueden ser anabolizantes (estrógenos,
andrógenos, etc.), tireostáticos, antibióticos (cloranfenicol, tetraciclinas), sulfamidas
(bacteriostáticos), beta-agonistas (clembuterol) y plaguicidas (carbamatos, piretrinas,
herbicidas). [2]
Industria química. En el análisis de algunos productos como son los aromáticos
condensados, tenso-activos, propulsores, colorantes, etc. [2]

La experiencia tiene como objeto separar una serie de compuestos aromáticos (fenol y
cafeína) presentes en una muestra problema por cromatografía líquida de alta precisión,
además de determinar la concentración de cafeína en una muestra problema; estudiando las
condiciones de flujo y composición de la fase móvil que optimizan la separación de los
analitos en la columna cromatográfica.

METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Para realizar la experiencia se usó un Cromatógrafo de líquidos Agilent Technologies Serie

1200(Bomba cuaternaria, desgasificador en línea, detector de longitud de onda variable e
inyector manual), cuya fase estacionaria consta de una columna cromatografía Elipse XDB-
C18 de 150 x 4.6 mm dp: 5 μm. En primer lugar se realizó la preparación de la fase móvil
de composición (50:50) Metanol-Agua, y se procedió al acondicionamiento de la fase
móvil haciendo uso de un equipo de filtración al vacío para tal fin. Seguidamente se
preparó el patrón de la solución para el análisis contentivo de 310,4 g de Fenol y 64,4 mg
de Cafeína, que seguidamente se diluyeron para poder ser usadas en el cromatógrafo. Se
procedió luego al acondicionamiento del Cromatógrafo por parte del técnico del
laboratorio; una vez equilibrada la columna con la fase móvil se procedió a crear de la
secuencia de análisis en el software de manejo del cromatógrafo: ChemStation Plus.

Seguidamente se inyectó cada una de las muestras (estándares y muestra problema),

curando la inyectadora varias veces a fin de impedir la contaminación de las muestras
sucesivas, y finalmente se obtuvo los cromatogramas correspondientes.

RESULTADOS Y DISCUSION DE RESULTADOS

Al hacer transitar las soluciones por la columna cromatográfica de alta resolución
(estándares y muestra problema), es importante analizar la naturaleza química de los
analitos, de modo de poder predecir cuál de ellos quedará retenido por mayor tiempo en la
fase estacionaria. Observando más de cerca la estructura química del fenol, como se
muestra en la figura 2, podemos advertir que este es ligeramente polar, debido a la
presencia de un grupo hidroxilo en su estructura, así como aporta a dicha causa la presencia
de un anillo aromático, cuyos enlaces π poseen una importante reactividad, por lo que
poseerá la tendencia a ser afín a la fase móvil. Ahora bien, la cafeína, cuya estructura se
observa en la figura 3, posee gran cantidad de enlaces polares del tipo C-O y C-N; sin
embargo su complejidad referida al tamaño de dicha molécula, hace que ella posea un
mayor tiempo de retención dentro de la columna cromatográfica, dando como resultado que
el fenol sea el primer compuesto que se reporta en dicha columna, tal como se observa en la
tabla 1 y 2, referentes a los resultados obtenidos, tanto para los estándares como para la
muestra problema.

Figura 2. Estructura Química del Fenol.

Figura 3. Estructura Química de la Cafeína.

 Este método de análisis permite obtener, junto con los tiempos que cada uno de los analitos
presentes en una muestra en particular tarda en circular a través de la columna, diversos
parámetros que permiten caracterizar el análisis. Asimismo, es importante hacer notar que
las curvas obtenidas mediante los métodos cromatográficos pueden aproximarse con gran
precisión a una curva gaussiana, tal como se observa en las tablas de resultados.

Tabla 1: Parámetros característicos obtenidos mediante los cálculos pertinentes a la cromatografía en

columna de alta resolución para el estándar

Fase
MeOH:
Móvil
H2O 50:50
: Promedio
Flujo: 1
Pico
mL/min
Ancho de
Tiempo de banda
Tiempo de Factor de Desviació
Ancho Área Altura retención ajustado a
Retención % Área Capacida n estándar
(min) (mAU*s) (mAU) corregido una curva
(tr) (min) d (k') (σ)
(t'r) (min) Gaussiana
(min)
2645,0685 0,0092
1 2,041 0,0792 511,94017 48,5688 0,853 0,71829 0,0023
2
2800,9531 0,0342
2 3,463 0,1050 414,80943 51,4312 2,275 1,91498 0,0085
3
Área
ajustada a
%erro AEPT
una curva α N platos R
r (mm)
Gaussiana
(mAu*s)
2524,71790
1 4,55 10629,12
6 0,0107016 15,436120
0,3750916
2677,15099 7 2
2 4,42 17403,89
8
 Tabla 2: Parámetros característicos obtenidos mediante los cálculos pertinentes a la cromatografía en
columna de alta resolución para la muestra problema.

MeOH:
Fase H2O 50:50
Móvil: Promedio
Flujo: 1
mL/min
Ancho de
banda
Tiempo de
Tiempo de Factor de Desviación ajustado a
Ancho Área Altura retención
Retención % Área Capacidad estándar una curva
(min) (mAU*s) (mAU) corregido
(tr) (min) (k') (σ) Gaussiana
(t'r) (min)
(min)

1 2,041 0,0800 2403,25928 466,17934 48,54550 0,853 0,71801 0,0017 0,0069

2 3,462 0,1043 2547,27384 378,44955 51,45450 2,274 1,91442 0,0021 0,0083

Área
ajustada a
una curva %error α N platos AEPT (mm) R
Gaussiana
(mAu*s)

1 2308,330535 3,95 0,37505496 10405,5294

0,01069584 15,4241273
2 2431,372883 4,55 17642,7694

Relacionando el área obtenida en los picos cromatográficos obtenida de los estándares que
se analizaron con la concentración de cada uno de los analitos correspondientes fue posible
el determinar la concentración de cafeína y fenol en una muestra problema, dando como
resultado concentraciones medias de 93,709 ppm y 451,244 ppm respectivamente;
asimismo se muestra el resumen estadístico pertinente para el cálculo de las
concentraciones de los analitos respectivos en las tablas 3 y 4.

Tabla 3: Parámetros estadísticos en la determinación de la concentración de cafeína en la muestra problema

Concentración de Cafeína (ppm)

Parámetro Valor
93,709489
Media 1
 0,4348619
Error típico 1
93,463424
Mediana 2
Moda #N/A
0,7532029
Desviación estándar 3
Varianza de la 0,5673146
muestra 5
Curtosis #¡DIV/0!
Coeficiente de
asimetría 1,3132101
1,4448580
Rango 8
93,110092
Mínimo 5
94,554950
Máximo 6
281,12846
Suma 7
Cuenta 3
Nivel de
confianza(95,0%) 1,8710598
91,838429
Limite inferior 3
95,580548
Limite superior 9

Tabla 4: Parámetros estadísticos en la determinación de la concentración de fenol en la muestra problema

Concentración de Fenol (ppm)

Parámetro Valor
Media 451,24429
Error típico 1,81644596
Mediana 449,744959
Moda #N/A
Desviación estándar 3,14617668
Varianza de la muestra 9,89842773
Curtosis #¡DIV/0!
Coeficiente de
asimetría 1,65747451
Rango 5,73146805
Mínimo 449,128222
Máximo 454,85969
Suma 1353,73287
Cuenta 3
Nivel de
confianza(95,0%) 7,81553615
Limite inferior 443,428754
 Limite superior 459,059827

Es importante resaltar la similitud observada en los porcentajes de área ocupados por cada
uno de los picos cromatográficos para los analitos, tanto en el estándar como en la muestra
problema, por lo cual se infiere que dichas concentraciones son cercanas entre sí. Por
último, es relevante la amplia aplicabilidad de este método de análisis en lo referente a la
determinación de compuestos orgánicos, ya que con la adecuada selección de las fases
estacionaria y móvil, las condiciones de flujo y la proporción de los compuestos presentes
en la fase móvil y una correcta selección de las variaciones a realizar durante el transcurso
de la cromatografía, permitirán obtener un análisis optimizado para su posterior estudio.

CONCLUSIONES

 Se pueden separar compuestos aromáticos, tales fenol y cafeína, de una muestra por
medio de cromatografía liquida de alta precisión (HPLC).
 La separación de los analitos por cromatografía HPLC puede optimizarse mediante
la variación del flujo y la composición de la fase móvil, según las propiedades
fisicoquímicas de la fase móvil y la fase estacionaria.
 Las diferencias entre las moléculas y propiedades fisicoquímicas de los compuestos
fenol y cafeína permiten la separación por cromatografía reversa.
 Las áreas obtenidas a través de la cromatografía de alta resolución, se puede
aproximar en gran medida a las derivadas mediante su aproximación a una curva
gaussiana.
 Se obtuvo la concentración de cafeína y fenol en una muestra problema mediante la
aplicación de la cromatografía en columna de alta resolución, dando como resultado
valores de 93,709 ppm y 451,244 ppm respectivamente

BIBLIOGRAFÍA
[1] Cromatografía líquida de alta eficacia. Extraído desde
https://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_l%C3%ADquida_de_alta_eficacia
Fecha de consulta: 12 de Abril de 2019.

[2] El Universitario. (2014). Taller de HPLC y sus aplicaciones. Extraído desde

http://eluniversitario.net/taller-de-cromatografia-liquida-de-alta-eficacia-hplc-y-sus-
aplicaciones-en-el-campo-24-de-noviembre-de-2014/ Fecha de consulta: 12 de Abril de
2019.

ANEXOS

Figura 4. Cromatografías obtenidas para el estándar con una fase móvil de MeOH: H2O (50:50) y un
flujo de 1ml/min
Figura 5. Cromatografías obtenidas para la muestra con una fase móvil de MeOH: H2O (50:50) y un
flujo de 1ml/min

Figura 6: Aproximación del área obtenida para el fenol presente en la muestra problema en la
cromatografía a una curva gaussiana
Figura 7: Aproximación del área obtenida para la cafeína presente en la muestra problema en la
cromatografía a una curva gaussiana