INTRODUCCIÓN

La administración de drogas por vía oral se ha utilizado con mayor frecuencia en la clínica porque
tiene varias ventajas frente a otras vías de administración, como fácil de usar, alta seguridad, buen
cumplimiento del paciente y bajo costo. Por lo tanto, en el desarrollo de nuevas drogas, es muy
importante hacer muchas nuevas entidades químicas (NCEs) para ser una forma de dosificación
disponible oralmente. Sin embargo, la mayoría de las NCEs, que han sido descubiertas
recientemente, tienden que tienen características desventajosas para la administración oral, es
decir, una solubilidad en agua pobre, una baja permeabilidad de la membrana y un sustrato para
varios transportadores de drogas de efluentes. En particular, en los primeros descubrimientos de
drogas es importante estimar si cada NCE es reconocido por transportador de efluvios de drogas y
su permeabilidad intestinal está restringida.

En los transportadores de efluvios de drogas, la proteína resistente al cáncer de mama (BCRP;

ABCG2) se ha informado que el nivel de expresión en el intestino humano es igual o incluso
superior al de MDR1.1,2 La BCRP tiene un casete de unión de adenosina 5'-trifosfato (ATP) y seis
dominios transmembranales y es, por lo tanto, el llamado transportador medio ABC, que forma
homodímeros para obtener actividad funcional.3,4 Como los ratones Bcrp(-/-) eran desarrollado
por Schinkel y otros5 , muchos estudios in vivo utilizando Bcrp(-/-) se han llevado a cabo ratones
para evaluar el efecto de la BCRP en la absorción de las drogas6-8 . En la mayoría de estos
informes, la concentración plasmática sistémica de las drogas después de la administración oral se
comparó entre Ratones Bcrp (-/-) y ratones de tipo salvaje (WT). En el caso del sustrato BCRP su
biodisponibilidad (BA) en ratones Bcrp(-/-) tiende a ser mayor que en los ratones WT, porque el
Bcrp se expresa altamente en el hígado y riñón, relativamente alto expresado en el intestino
delgado.

Hemos evaluado la permeabilidad de la Caco-2 de varios BCRP y /o sustratos de glicoproteína P (P-

gp) y definió un cociente de absorción (AQ) para estimar la contribución específica de la BCRP a la
permeabilidad intestinal de los medicamentos. Este sistema de ensayo in vitro utilizando Caco-2
células para calcular el AQ podría ser un enfoque eficiente para estimar el absorción oral de las
NCEs, particularmente con respecto a la contribución de BCRP. Para demostrar esta expectativa, se
requiere investigar si la contribución estimada de la BCRP a la salud intestinal la permeabilidad del
estudio in vitro se correlaciona con el estudio in vivo.

En este estudio, evaluamos la contribución del BCRP, así como del P-gp, que es un transportador
de efluentes de drogas representativo, a la absorción intestinal de drogas utilizando un modelo
recirculatorio para el método de diferencia de concentración sanguínea portal-sistémica (P-S)
(Figura 1) en Bcrp(-/-) y Mdr1a/1b(-/-) ratones. Este método se desarrolló para evaluar por
separado la tasa y el grado de absorción del tracto gastrointestinal en el sistema portal y la
disposición de una droga en el cuerpo. Aquí aplicamos esto para varios compuestos del modelo, y
estimó el aparente local relación de absorción del tracto gastrointestinal en el sistema portal
(FaFg) en ratones WT, Bcrp(-/-), y Mdr1a/1b(-/-). Entonces, calculamos los valores de AQ in vivo
para la BCRP y P-gp, y las relaciones de contribución (R), que indican la contribución de la BCRP y la
P-gp en la absorción intestinal. Además, también evaluamos la correlación de AQ in vivo con AQ in
vitro obtenido de estudios de permeabilidad in vitro de Caco-2.
QUÍMICOS Y REACTIVOS

 Cafeína
 Ciprofloxacino
 Nitrofurantoína
 Topotecan HCl
 Sulfasalazina

ESTUDIOS FARMACOCINÉTICOS

Todos los ratones fueron ayunados durante la noche con acceso libre al agua del grifo. En el
estudios de administración intravenosa, se administraron compuestos modelo a través de la vena
de la cola en dosis de 1 mg/kg (n = 3). Después de la administración, la sangre se recogió muestras
de la vena abdominal de los ratones anestesiados a las 0.083, 0.17, 0.5, 1, 2, 4 y 8 horas. En el
estudio de administración oral, ciprofloxacino, nitrofurantoína, topotecán y sulfasalazina se
administraron por sonda a una dosis de 1, 2, 1 y 5 mg/kg, respectivamente (n = 2). Tras la
administración, se tomaron muestras de sangre del portal y venas abdominales de los ratones
anestesiados a 0,083, 0,17, 0,5, 1, 2, 4, y 8 horas. Las muestras de plasma se separaron por
centrifugación a 14.000 g durante 10 minutos a 4°C y almacenado a -30°C hasta el análisis.

EVALUACIÓN DE LA CONTRIBUCIÓN DE LA BCRP SOBRE LA ABSORCIÓN ORAL DE LAS DROGAS

MODELO.

Evaluamos la contribución de la BCRP y la P-gp al sistema intestinal absorción de drogas modelo,

ciprofloxacina, nitrofurantoína, topotecán y sulfasalazina, por el método de diferencia P-S en WT,
Bcrp(-/-), y ratones Mdr1a/1b(-/-). Antes de los estudios de absorción in vivo, evaluamos
comparativamente las características de expresión de los efluentes transportadores, además de
BCRP y P-gp, y de la droga-metabolización y enzimas conjugadoras, que participan en la absorción
y el metabolismo de las drogas, en los ratones. Los niveles de expresión de ARNm del Mrp2 en el
intestino y Cyp3a11, Slut1a1, y Ugt1a1 en el intestino y el hígado no fueron significativamente
diferente entre los ratones WT, Bcrp (-/-), y Mdr1a/1b(-/-) (datos no mostrados). Además, también
determinamos el valor Rb del modelo drogas. Los valores de Rb medidos de todas las drogas
modelo fueron aproximadamente 1,0 (ciprofloxacino, 1,20 ± 0,10; nitrofurantoína, 1,18 ± 0,10;
topotecán, 0,94 ± 0,05; y sulfasalazina, 1,28 ± 0,03). Estos resultados indican que la distribución de
estas drogas en el plasma es casi igual a la de las células sanguíneas. Además, no hubo diferencias
en los valores de Rb entre los ratones WT, Bcrp(-/-) y Mdr1a/1b(-/-) (datos no mostrados).

CIPROFLOXACINO

También evaluamos la concentración plasmática de ciprofloxacino después de la administración

intravenosa y oral en WT, Bcrp(-/-), y Mdr1a/1b(-/-) ratones (Figura 3, Tabla 1). La concentración
plasmática portal de ciprofloxacino alcanzó el pico a los 10 minutos después de la administración
oral en cada uno de los ratones WT, Bcrp(-/-) y Mdr1a/1b(-/-). Estos perfiles muestran que la
ciprofloxacino se absorbe rápidamente desde la parte superior intestino delgado. Además, el
AUCpv y el AUCsys de ciprofloxacino después de la oralidad La administración en los ratones
Bcrp(-/-) fue casi la misma que la de los WT y la FaFg calculada fue también casi igual en ambos
ratones (50,6% en los ratones Bcrp(-/-) y 46,5% en los ratones WT). Además, no hubo diferencia en
valores de ka entre los ratones Bcrp (-/-) y los ratones WT (1,85 por hora y 1,63 por hora,
respectivamente). Estos resultados indican que la BCRP apenas afecta a la absorción intestinal de
ciprofloxacina.

En contraste, el AUCsys de ciprofloxacina después de la inyección intravenosa en los ratones Bcrp

(-/-) fue aproximadamente 1,5 veces más alto que en los ratones WT (1203 nmol/L-h vs 886 nM-h),
y el CLtot en los ratones Bcrp (-/-) fue más bajo Estos resultados sugieren que la BCRP está
involucrada en la eliminación de la ciprofloxacina en los ratones.

Por otro lado, los valores FaFg y ka de ciprofloxacino después de la administración oral en ratones
Mdr1a/1b (-/-) fue mucho más alta que los de los ratones WT (75.0% vs 46.5% y 2.18 por hora vs
1.63 por hora, respectivamente). Además, el AUCsys en los ratones Mdr1a/1b (-/-) fue más alta
que la de los ratones WT (601 nmol/L-h vs 306 nmol/L-h), y el CLtot en los ratones Mdr1a/1b (-/-)
fue menor que en los ratones WT (2,33 L/h/kg vs 3,41 L/h/kg). Estos resultados sugieren que el p-
gp es involucrado tanto en la absorción intestinal como en el proceso de eliminación de
ciprofloxacino.

 NITROFURANTOÍNA

La curva de concentración plasmática-tiempo de la nitrofurantoína después de administración

intravenosa y oral en WT, Bcrp(-/-), y Mdr1a/1b(-/-) de ratones se muestra en la figura 4, y los
correspondientes parámetros farmacocinéticos se enumeran en el cuadro 2. Los parámetros FaFg
y ka los valores de nitrofurantoína después de la administración oral en ratones WT fueron 63,7%
y 5,8 por hora, respectivamente, lo que indica que la nitrofurantoína se absorbe bien en el
intestino. Además, los valores FaFg de la nitrofurantoína después de la administración oral en
ratones Bcrp(-/-) y Mdr1a/1b(-/-) fueron del 77,1% y el 75,2%, respectivamente. Los valores ka en
los ratones Bcrp(-/-) y Mdr1a/1b(-/-) fueron de 6,9 por hora y 7,2 por hora, respectivamente. Estos
valores FaFg y ka fueron más altos que los de los ratones WT. Además, el AUCpv y el AUCsys de la
nitrofurantoína después de la administración oral en los ratones Bcrp(-/-) (3414 nmol/L-h y 2557
nmol/L-h) y en los ratones Mdr1a/1b(-/-) (3182 nmol/L-h y 2345 nmol/L-h) eran aproximadamente
1,5 veces más altos que los en ratones WT (2545 nmol/L-h y 1835 nmol/L-h). Estos resultados
sugieren que tanto el BCRP como el p-gp están involucrados en la absorción intestinal de la
nitrofurantoína.

Por otra parte, no hubo diferencias significativas en los valores de AUCsys y CLtot entre los ratones
bcrp knockout (KO) y p-gp KO, lo que indica que el BCRP y el p-gp apenas afectan al proceso de
eliminación de la nitrofurantoína.

TOPOTECAN

También se investigaron los perfiles de concentración plasmática-tiempo del topotecán después

de su administración intravenosa y oral en ratones WT, Bcrp(-/-) y Mdr1a/1b(-/-) (figura 5, cuadro
3). El valor ka del topotecán en los ratones con TW fue de 3,18 por hora, lo que indica que el
topotecán se absorbe rápidamente desde la parte superior del intestino después de la
administración oral. Además, su BA en los ratones WT fue de aproximadamente el 37%, y esto es
similar al BA humano (40%).15,16 Los valores de AUCpv y AUCsys de topotecán después de la
administración oral en los ratones Bcrp(-/-) fueron aproximadamente tres veces más altos que los
de los ratones WT (1509 nmol/L-h vs 577 nmol/L-h y 1136 nmol/L-h vs 370 nmol/L-h,
respectivamente).

Además, el FaFg en los ratones Bcrp(-/-) era del 100%, que era mucho más alto que el de los
ratones WT (57%), y su valor ka era de 5,18 por hora. Estos resultados indican que la absorción
intestinal de topotecán en los ratones está dominada por la BCRP. El nivel más alto de AUCsys y el
valor de CLtot ligeramente inferior se observaron después de la inyección intravenosa de
topotecán en los ratones Bcrp(-/-), en comparación con los ratones WT. Estos resultados sugieren
que el BCRP también está involucrado en el proceso de eliminación del topotecán.

Por otra parte, no hubo diferencias en la farmacocinética del topotecán entre la administración
oral e intravenosa en ratones Mdr1a/1b(-/-), lo que indica que la p-gp no tiene ningún efecto en la
absorción y eliminación intestinal del topotecán.

 SULFASALAZINA

El curso temporal de la concentración plasmática de sulfasalazina después de la administración

intravenosa y oral en ratones WT, Bcrp(-/-) y Mdr1a/1b(-/-) se muestra en la figura 6, y los
parámetros farmacocinéticos correspondientes figuran en el cuadro 4. Los valores de FaFg y BA en
los ratones WT se estimaron en 16,9% y 10,2%, respectivamente. Estos valores son casi similares a
los de FaFg y BA humanos (12% y < 15%, respectivamente).17-19 Estos resultados indican que la
absorción intestinal de sulfasalazina es extremadamente baja. Además, la t1/2 de sulfasalazina
después de la administración oral en ratones Bcrp(-/-) fue de 7 horas, que fue mucho más larga
que la de los ratones WT (1 hora). Además, la AUCpv y los valores de AUCsys en los ratones
Bcrp(-/-) fueron más de 130 veces más altos que los de los ratones WT (289 955 nmol/L-h vs 2204
nmol/L-h y 287 957 nmol/L-h vs 1943 nmol/L-h, respectivamente). Además, se estimó que la FaFg
en los ratones Bcrp(-/-) era de alrededor del 100%, lo que indica que la BCRP contribuye en gran
medida a la absorción intestinal de la sulfasalazina.

Sin embargo, el Tmáximo de sulfasalazina después de la administración oral en ratones Bcrp(-/-)

fue significativamente más tardío que en los ratones WT (2 horas frente a 0,5 horas). Además, el
CLtot después de la administración intravenosa en los ratones WT fue de 0,66 L/h/kg, mientras
que el de los ratones Bcrp(-/-) fue de 0,04 L/h/kg. Estos resultados indican que la BCRP también
influye fuertemente la eliminación de la sulfasalazina. Curiosamente, el plasma extrapolado La
concentración en el momento cero (C0) después de la inyección intravenosa de sulfasalazina en
ratones Bcrp(-/-) fue mayor que la de los ratones WT (18,1 μmol/L frente a 11,7 μmol/L). Además,
la fase de distribución en los ratones Bcrp(-/-) apenas se observó, y el Vdss fue bajo (0,19 L/kg). En
conjunto, se considera que los valores tardíos de tmáx y pequeños de Vdss causan el bajo valor ka
de la sulfasalazina, a pesar de que su valor FaFg era aproximadamente del 100%.

Por otra parte, el valor FaFg de la sulfasalazina en los ratones Mdr1a/1b(-/-) (FaFg: 30%) también
fue superior al de los ratones WT. Sin embargo, se considera que la influencia de la p-gp en la
absorción intestinal de la sulfasalazina no es tan alta en comparación con la BCRP. Además, los
valores de C0 y Vdss no fueron diferentes entre los ratones Mdr1a/1b(-/-) y ratones WT.

La sulfasalazina es degradada a sulfapiridina y ácido 5-aminosalicílico por las bacterias del intestino
grueso17. Aunque la sulfapiridina se absorbe bien en el intestino, su concentración plasmática en
los ratones Bcrp(-/-) era mucho menor que la de los ratones WT y Mdr1a/1b(-/-) (datos no
mostrados). Esto puede deberse a que la sulfasalazina se absorbe en gran medida en el intestino
sin degradarse en los ratones Bcrp(-/-), mientras que la sulfasalazina se degrada a sulfapiridina
debido a su bajo FaFg en el WT y Mdr1a/1b(-/-) en los ratones.

Resumimos los valores ka y calculamos los valores AQbcrp y AQP-gp de los medicamentos modelo
en el Cuadro 5. Los valores ka de los medicamentos modelo, excepto la sulfasalazina, fueron más
altos en los ratones Bcrp(-/-) y Mdr1a/1b(-/-) que en los ratones WT, lo que sugiere que estos
transportadores afectan a su absorción intestinal. Sin embargo, cada medicamento modelo
mostró un valor de AQ diferente, lo que implica que el grado de contribución de estos
transportadores difiere entre ellos. Aunque el topotecán mostró un valor de AQbcrp ligeramente
superior, de 0,35, otros fármacos mostraron valores bajos de AQbcrp y AQP-gp. Esto sugiere que
tanto el BCRP como la P-gp apenas afectan a la absorción intestinal de ciprofloxacina y
nitrofurantoína en los ratones. En la sulfasalazina, el valor de AQ no se pudo estimar porque el
valor ka era mucho más bajo en los ratones Bcrp(-/-) a pesar de que su valor FaFg era
significativamente más alto que en los ratones WT.

Luego, calculamos el valor de la tasa de contribución (R) sobre la absorción intestinal utilizando los
valores de FaFg en cada ratón (Tabla 6). La ciprofloxacina y la nitrofurantoína mostraron valores
bajos de Rbcrp y Rp-gp, lo que indica que la contribución tanto de la BCRP como de la P-gp a su
absorción intestinal sería poca. Por otra parte, el topotecán y la sulfasalazina mostraron un Rbcrp
relativamente alto en contraste con un Rpgp bajo. Estos resultados indican que el BCRP actúa
principalmente como una barrera para su absorción intestinal.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En este estudio, definimos el valor R para estimar la contribución cuantitativa de la BCRP y la P-gp
a la absorción intestinal de los fármacos, por el método de la diferencia P-S en ratones WT,
Bcrp(-/-) y Mdr1a/1b(-/-). Además, mostramos la estrecha relación entre el valor R in vivo y el
valor AQ in vitro. Moriwaki y otros han determinado los parámetros farmacocinéticos, incluidos
AUC, FaFg y BA, de varios fármacos por el método de la diferencia P-S en ratas, y han demostrado
que esos parámetros pueden definirse más estrictamente que los de los modelos simplificados.
Además, los parámetros farmacocinéticos de las drogas evaluadas por el método de la diferencia
P-S estaban en buena consonancia con los valores experimentales obtenidos de otros modelos de
recirculación, como el método de canulación de los conductos biliares. Además, el método de la
diferencia P-S puede definir la farmacocinética de las drogas sobre una base fisiológica sin una
variabilidad experimental significativa. Basándose en estos Por razones, usamos el método de la
diferencia P-S aquí para determinar la absorción de drogas.

En la ciprofloxacina, la P-gp, no la BCRP, probablemente contribuya principalmente a su absorción

intestinal (figura 3, tablas 1 y 5). Sin embargo, su valor FaFg era de alrededor de 0,5 en los ratones
con TW, y se ha informado de que el BA oral de la ciprofloxacina en el ser humano es de alrededor
del 70%22 . Además, los presentes resultados sugieren la participación de la BCRP y la P-gp en el
proceso de eliminación de la ciprofloxacina. Ando y otros han informado de que la depuración de
la excreción biliar y la relación de concentración renal/plasmática de la ciprofloxacina son
aproximadamente tres veces mayores en los ratones Bcrp(-/-) que en los ratones WT, lo que indica
la contribución de la BCRP tanto a la excreción biliar como a la secreción tubular. Sin embargo, la
principal vía de eliminación de la ciprofloxacina es la excreción urinaria en los seres humanos, y se
ha informado de que la BCRP no se expresa en el riñón humano. Por lo tanto, es concebible que la
interacción medicamentosa en la BCRP no se produzca a través del proceso de eliminación.

Entonces, se sugiere que tanto la BCRP como la P-gp afectan la absorción intestinal de la
nitrofurantoína en los ratones (Figura 4, Tablas 2 y 5). Sin embargo, su contribución a la absorción
intestinal podría ser ignorada porque la nitrofurantoína mostró un alto valor FaFg en los ratones
con TW y no hay informes clínicos sobre la implicación de la P-gp en su absorción.

Por otro lado, la absorción intestinal del topotecán fue altamente afectada por la BCRP (Figura 5,
Cuadros 3 y 5), aunque se ha informado de que la distribución del topotecán está restringida por la
P-gp, en lugar de la BCRP, en el cerebro. Se ha informado de que la excreción urinaria es la
principal vía de eliminación del topotecán en los ratones y en los seres humanos. Por otra parte,
Jonker y otros han demostrado que el GF120918, un inhibidor de la BCRP, disminuye la excreción
biliar del topotecán después de la administración intravenosa, mientras que su excreción urinaria
apenas se ve afectada por el GF120918. Teniendo en cuenta estas conclusiones, es concebible que
la participación del BCRP en la excreción biliar del topotecán dé lugar a su menor CLtot en los
ratones Bcrp(-/-) KO. En estudios clínicos en humanos, se ha demostrado que el topotecán
muestra un BA deficiente después de la administración oral (alrededor del 40%), y apenas se
metaboliza.

Sin embargo, se ha informado de que el BA del topotecán aumenta significativamente hasta el

100% cuando se coadministra GF120918 por vía oral. Además, Sparreboom y otros han
demostrado que el BA oral del topotecán es 1,3 veces más alto en los pacientes que son
heterocigotos para la variante del polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) de la BCRP que en los
pacientes con la BCRP normal. En conjunto, el BCRP actuaría como una barrera para la absorción
oral del topotecán en el ser humano.

Al igual que el topotecán, la absorción intestinal de la sulfasalazina fue altamente influenciado por
la BCRP, en lugar de la P-gp (Figura 6, Tabla 3 y 5). Curiosamente, la Vdss más pequeña se observó
en los ratones Bcrp(-/-) que en los ratones WT, a pesar de que se supone que la Vdss se hace más
alta en los ratones Bcrp(-/-) que en los ratones WT porque la BCRP se expresa en varios tejidos.
Estos resultados concuerdan con las conclusiones anteriores comunicadas por Karibe y otros y Liao
y otros. Dado que Zaher y otros han confirmado que la fijación de la proteína plasmática de la
sulfasalazina es la misma tanto en los ratones WT como en los Bcrp(-/-),34 la fijación de la proteína
no estaría relacionada con el pequeño valor de Vdss en los ratones Bcrp(-/-). También se ha
informado de un fenómeno similar en otros compuestos, y es necesario seguir investigando para
aclarar este hecho. En un estudio realizado en seres humanos, se ha informado de que el valor de
AUC de la sulfasalazina después de la administración oral en pacientes que son la variante
heterocigótica para el SNP del BCRP es aproximadamente dos veces mayor que el de los pacientes
con el BCRP normal. Dado que no hay diferencias en la eliminación de la sulfasalazina entre esos
pacientes, la BCRP afectaría la absorción oral de la sulfasalazina no sólo en los ratones sino
también en los seres humanos.

Así pues, hemos revelado que los parámetros farmacocinéticos in vivo del topotecán y la
sulfasalazina, que mostraban un valor de Rbcrp relativamente alto, podrían muy bien reflejar la
situación humana. Por lo tanto, finalmente comparamos los valores de Rbcrp in vivo con los
valores de AQ in vitro obtenidos de los estudios de permeabilidad de Caco-2 (Figura 7, cuadro 7).
La ciprofloxacina y la nitrofurantoína, que mostraron un bajo valor de Rbcrp in vivo, mostraron
bajos valores de AQBCRP in vitro. En cambio, el topotecán y la sulfasalazina, que se ha demostrado
que influyeron en gran medida en su absorción oral por el BCRP en el ser humano, mostraron
tanto Rbcrp in vivo como AQBCRP in vitro de más de 0,4. Sin embargo, sus valores absolutos eran
diferentes en cada droga, lo que sugiere que la propiedad de reconocimiento del sustrato de El
BCRP difiere entre los ratones y los humanos. Por otro lado, in vitro El valor del AQBCRP del
topotecán era comparable al valor del AQBCRP humano estimado a partir de los datos clínicos
(0,61 vs 0,58).

En conclusión, demostramos que la predicción exacta de la contribución de la BCRP en la

absorción de drogas en el intestino humano podría lograrse utilizando la AQBCRP in vitro calculada
a partir de los estudios de permeabilidad de la Caco-2. Se necesita una mayor investigación
utilizando otros sustratos de BCRP con diversas afinidades para demostrar la validez de nuestra
predicción. Sin embargo, nuestras observaciones actuales hacen una valiosa contribución a la
construcción de una base de datos para la predicción precisa de la absorción de drogas en el
intestino humano.