METODE CROMATOGRAFICE DE ANALIZA

CROMATOGRAFIA-reprezinta o metoda de separare bazata pe repartitia diferentiata a

componentilor unui amestec de separate intre doua faze in contact si care se situeaza intr-un
raport de miscare relativ una fata de cealalta (definita prin termenii de faza stationara si faza
mobile).Separarea cromatografica este rezultatul unor procese repetate de sorbtie-desorbtie a
componentilor probei in faza stationara si faza mobila[26] Repartitia diferentiata a analitilor
intre cele doua faze aflate in contact este controlata prin constanta de distributie K, descrisa
prin raportul:K = CS/CM, unde Cs reprezinta concentratia analitului in faza stationara,iar C M
reprezinta concetratia analitului in faza mobila.

CLASIFICAREA METODELOR CROMATOGRAFICE DE ANALIZA - Metodele cromatografice se

clasifica dupa o serie de criterii: caracteristicile fizico-chimice ale proceselor sau sistemelor,
natura fazelor mobile si stationara, aspectele de ordin tehnic(dispunerea fazei stationare,
modul de deplasare a probei, parametrii de operare), tabelul 1
1.Cel mai utilizat criteriu de clasificare este natura sau starea de agregare a celor doua faze.
FAZA STATONARA poate sa fie solida sau lichida, in cel de al doilea caz lichidul fiind depus pe
un suport solid.fazele stationare lichide trebuie sa indeplineasca unele conditii speciale cum ar
fi volatilitatea foarte scazuta, miscibilitate redusa cu solventii uzuali,viscozitate ridicate pentru a
ramane pe un support in timp ce faza mobila curge prin coloana.
FAZA MIBILA poate fi un lichid(L), un gaz(G) sau un fluid supercritic(FS), nemiscibile cu faza
stationara. Daca faza mobile este un gaz vorbim de cromatografie de gaze(CG), daca este un
lichid de cromatografie de lichide(CL), iar daca este un fluid supercritic de cromatografie de
fluide in stare supercritical (CFS), fuidul supercritic este o substanta care se afla deasura
presiunii si temperaturii sale critice.

Tabelul 1. Clasificarea metodelor cromatografice in functie de natura fazelor intre analiti se

distribuie diferentiat
FAZA MOBILA FAZA STATIONARA DENUMIRE SIMBOL
gaz Solid Cromatografia de repartitie gaz-solid CGS
gaz Lichid Cromatografia de repartitie gaz-lichid CGL
lichid Lichid Cromatografia de repartitie lichid-lichid CLL
lichid Solid Cromatografia de repartitie lichid-solid CLS
Fluid supercritic Solid sau lichid Cromatografia de fluide in stare supercritica CFS
2.In functie de PROCESUL DE SEPARARE metodele cromatografice se impart in doua categorii :
-metode bazate pe afinitatea diferiat a componentilor(in care sunt incluse metodele de
repartitie, absorbtie, schimb ionic, afinitate); -metode bazate pe marimea diferita a
componentilor(ex: excluziunea sterica) 3.Considerand MODUL DE DEPLASARE a probei se pot
distinge urmatoarele tehnici: cromatografia prin elutie, prin dizlocare, frontala si cu goluri sau
vacante 4.In ceea ce priveste PARAMETRII DE OPERARE-temperatura coloanei si debitul
purtatorului-acestia pot fi constanti sau variabili, rezultand cromatografia izoterma, cu
temperatura programata(gradient de tempertatura) sau cu debit programat(gradient de
presiune).

SCHEMA BLOC A UNUI CROMATOGRAF - Procesul cromatografic de separare se realizeaza prin

alternarea succesiva a starilorde echilibru si neechilibru generate de repartitia analitului intre
faze. Sistemul cromatografic evolueaza in sensul realizarii starii de echilibru la repartitie(este
atinsa constanta de distributie K, pentru fiecare dintre analiti). Starea de neechilibru, imediat
consecutiva starii e echilibru este generata prin miscarea fazei mobile.Elementele constructive
ale unui cromatrograf sunt prezentate schematic in fig. 1.

proba 3 5
11121 2 4 6

Fig.1-schema unui cromatograf

1-sursa de eluent; 2-injector; 3-coloana;4-detector; 5-termostat,6-inregistrator
1.Eluentul(faza mobila) are rolul de a transporta proba prin coloana cromatografica.
2.Injectorul asigura reproductibilitatea probei introduse in coloana. Eficienta separarii si
exactitatea rezultatelor depend de introducerea probei si deci constructia injectorului.
Injectoarele sunt diferite pentru cromatografia de gaze si cea de lichide .3.coloana
cromatografica cotine la un moment dat cele doua faze cromatografice si este locul unde se
realizeaza separarea componentelor probei. Din cauza interactiunii moleculelor cu faza
stationara, componentele din probaraman in urma eluentului in functie de diferentele care
exista intre constantele echilibrului de repartitie intre cele doua faze. Ca urmare se produce o
diferentiere a vitezelor lor de migrare si in final separarea.4.Scopul Detectorului este de a pune
in evidenta componentii ce parasesc coloana cromatografica antrenati de faza mobila.
Detectorul este piesa cea mai importanta a unui cromatograf dupa coloana cromatografica
.Exista 2 categori de detector : universali si specifici . Cei universali sunt sensibili la un nr. Mare
de componenti , iar cei specifici sunt sensibili numai la anumiti componenti .Un detector ideal
trebuie sa indeplineasca o serie de conditii : raspuns rapid in prezenta solutului ; stabilitate in
timpul functionarii ;un domeniu larg de raspuns linear ; sensibilitate inalta ; manipulare si
etalonare usoara . Detectorii pot fi diferentiali si integrali. Detectorii diferentiali masoara conc.
instantanee sau debitul de masa al solutului ce paraseste coloana cromatografica. Detectorii
integrali acumuleaza raspuns datorat componentilor probei , iar semnalul inregistrat ne indica
cantitatea totala care a parasit coloana cromatografica la un anumit moment. Raspunsul
detectorului este functie de unele schimbari in proprietatile fizice ale gazului ce paraseste
coloana cromatografica in prezenta componentilor probei. Aceste schimbari pot fi :
conductibilitate termica ;ionizare in flacara ; conductibilitate electrica ; ionizare sub influenta
radiatiei  . 5.Termostatul-asigura temp uniforma a intregului system prin care circula proba.
6.Inregistratorul-preia semnalele amplificate de circuitul detectorului , inscriind rezultatele
analizei sub forma cromatografica . Cromatografele moderne sunt conectate la un calculator ,
legat la randul sau la o imprimata care preia rolul de inregistrator.
Cromatograma- reprezinta rezultatul unei separari cromatograme si este generata de procesul
de detective a analitilor . in ordinea elutiei acestora(fig2.7.)Procesul de detect ie consta in
masurarea continua , in timp , a unei prop care caracterizeaza , dupa caz , totalitatea sau numai
specii de analiti separate in procesul cromatografic .Cromatograma reprezinta deci o
dependecnt functional reprezentabila intr-un system bidimensional de coordonate .Pe abscisa
ste reprezentat timpul scurs din momentul injectiei probei in sist romatografic si pana in
momentul elutiei ultimei specii de analiti ( cea mai puternica retinuta in faza stationara ). Pe
ordonata se va reprezenta proprietatea masurata.
3

12 4 5 Fig.2 Cromatograma
6

Momentul elutei unei specii de analit din sist cromatografic corespunde unei variatii a
raspunsului generat de sist de detectie , proportional cu masa sau conc compusului in cauza .Un
astfel de semnal produs de catre detector , in momentul evolutiei unui anumit compus , este
cunoscut sub numele de pic cromatografic . Picul cromatografic poate fi caract. prin 2 tipuri de
parametri :-calitativi (timpul de retentie absolut, timpul de retentie relativ , volumul de retentie
absolut , volumul de retentie relativ si factorul de capacitate ) si cantitativi ( aria si inaltimea
picului cromatografic ).
Timpul de retentie absolut (tR)-repre timpul scurs de la injectarea probei in sist cromatografic si
pana in momentul detectiei unui raspuns maxim , la elutia uneia din speciile separate .
Timpul de retentie relativ (tR)- corespunde timpului pe care o specie de analiti il petrece in faza
stationara .Diferenta dintre timpul de retentie absolute si timpul de retentie relativ corespunde
perioadei de timp pe care solutul a petrecut-o in faza mobila .Timpul necesar frontului de faza
mobile pt a parcurge coloana cromatografica se defineste ca fiind timpul mort (t M) .Ca definitie
alternativa , timpul mort poate fi considerat timpul de retentie absolute al unui compus care nu
se distribuie deloc in faza stationara (ct sa de distributie K fiind nula ). Se stabileste in acestmod
relatia : tR= tR + tM Marimilor tR respective tR li se pot asocia valorile VR si respective VR
,cunoscute sub numele de volum de retentie absolute , respectiv volum de retentie relative
.Retentia se masoara de obicei in unitati de timp , dar unitatile de volum sunt mai exacte
.Relatia dintre unitatea de timp si cea de volum se face prin intermediul debitului fazei mobile
(D). VR= tR*D . Factorul de capacitate (kI)- poate fi definit ca marime care indica de cate
ori timpul de repartitie a specie de analit in faza stationara este mai mare decat timpul cat
acesta se gaseste in faza mobile .kI=tR /tM=tR-tM /tM

Marimile ce caracterizeaza procesul de separare : Eficienta-separarii cromatografice se refera

la capacitatea sist cromatografic de a elua analitii supusi separarii sub forms unor picuri exrem
de inguste .Acest termen este corelat cu nr. de echilibre de repartitie intre faze , care se
realizeaza pe toata durata procesului de separare . Pt a caract acest proces se introduce
notiunea de taler teoretic ca fiind portiunea din coloana cromatografica in care se realizeaza un
proces elementar de repartitie la echilibru .Lungimea de coloana pt care o astfel de stare de
echilibru este atinsa poarta denumirea de inaltime a talerului teoretic (H). Intre lungimea totala
a coloanei cromatografice (L)si inaltimea talerului (H) se stabileste relatia : L=H*N , unde N
reprez nr talerelor teoretice ale unei coloane cromatografice ( este practic echivalent cu nr de
stari consecutive de echilibru pe parcursul separarii cromatografice in acea coloana ). Nr de
talere teoretice (N) poate fi calculate cu aj marimilor ce caract picul cromatografic .

N=tR2/2=16tR2/w2b=5.545tR2 /w20.5=4 t2R/W2i

Selectivitatea-separarii cromatografice reprez capacitatea sist cromatografic de a separa analiti

cu proprietati extreme de asemanatoare si este descrisa prin factorul de separare , notat cu  .
Factorul de separare se refera la o pereche de analiti eluati consecutiv din coloana,reprezentati
in urma detectiei prin doua picuri adiacente. Daca =1, adica cei doi analiti au acelasi coeficienti
de distributie, ei nu pot fi separati si conditiile analitice trebuie modificate.
=K2/K1=k2I/k1I unde :K1 si K2 sunt coeficientii de repartitie(distributie) intre cele doua faze,
corespunzator celor doi analiti separati consecutive,1 si 2; iar K`1 si k`2 sunt factorii de capacitate
corespunzatori.
REZOLUTIA unei separari cromatografice este o masura mai explicita a gradului de separare a
doi compusi. Rezolutia cromatografica(R s) se defineste ca marimea ce caract global calitatea
separarii, fiind masurabila prin insasi parametrii care definesc picul cromatografic
RS=tR2-tR1/2*(1+2)Unde: tR1 si tR2 sunt timpii de retentie ai celor doi compusi; 1 si 2 repr
distributiile lor exprimate in unitati de timp. Daca Rs=1, aprox 94% din moleculele celor doi
compusi vecini sunt separate. Se considera ca separarea este totala atunci cand R s=1,5.
ANALIZA CALITATIVA SI CANTITATIVA IN CROMATOGRAFIE
ANALIZA CALITATIVA(IDENTIFICAREA SUBSTANTELOR SEPARATE) se realizeaza la iesirea din
coloana cu ajutorul detectorului. Cromatograma reprez succesiunea de picuri cromatografice
produsa de detector. Detectorul transforma o prop a compusilor da analizat in semnal electric,
proportional cu cantitatea de substanta. Identificarea componentilor corespunzatori picurilor
cromatografice se poate face in doua moduri:-prin compararea timpilor de retentie ai
componentilor cu al unor etaloane cunoscute in aceleasi conditii experimentale; aceasta
metoda nu asigura certitudinea identitatii unei substante;-prin retinerea componentilor eluati
pentru o analiza ulterioara prina alte tehnici analitice, cum ar fi spectometria in IR sau
spectometria de masa, contribuind astfel la cresterea procentelor de certitudine.
Daca pentru caract sunt utilizate datele de retentie este necesar sa se controleze cu grija
parametrii de curgere si de temperatura, deoarece comparatia dintre proba necunoscuta si
standard se face tocmai pe baza acestor date. Intrucat foarte multi compusi diferiti pot avea
acelasi timp(sau volum) de retentie este necesar sa se utilizeze mai multe coloane cu
selectivitati diferite.
Pentru ANALIZA CANTITATIVA este foarte important standardizarea conditiilor de lucru si
cunoasterea factorului de raspuns al detectorului pentru fiecare component determinat.
Analiza cantitativa consta in trei etape:-obtinerea comtogramei;
-masurarea maximelor(picurilor) sau a suprafetelor -interpretare rezultatelor
Suprafata integrate a unui pic este direct prop cu cantiatea de solut eluat. Se poate utilize si
inaltimea picului, dar rezultatele sunt mai putin precise. Masurarea suprafetei se face prin
urmatoarele metode:metoda triunghiului, metoda planimetrarii(care consta in determinarea
ariei cu ajutorul unui planimetru), metoda decuparii si cantaririi, integrarea electronica. Calculul
rezultatelor se poate face in mai multe moduri: normalizarea interna, standardizarea interna,
metoda adaosului standard.In cadrul metodei de normalizare comnpozitia procentuala este
determinate prin masurarea ariei fiecarui pic si impartirea ariilor individuale la toata aria totala.
Acest lucru presupune ca au fost eluate toate picurile probei si ca raspunsul detectorului este
acelasi pentru fiecare compus.

STANDARDIZAREA INTERNA consta in adugarea la proba de analizat, inainte de a fi analizata, a

unei cantitati cunoscute dintr-o substanta standard. Se determina apoi raportul dintre
suprafetele picurilor substantei standard si cele ale substantei de analizat, pe baza caruia se
poate determina cantiatea de substanta din proba. Ci=Ai*fi /AS*fs *CS
Unde: Ci este concentratia compusului de analizat ; Cs este concentratia standardului ; Ai este
aria corespunzatoare picului compusului de analizat; As este aria corespunzatoare picului
standard; fi , fs sunt factorii de raspuns ai detectorului pentru cele doua substante.
In cazul metodei adaosului standard se obtin cromatograme pentru proba ca atare si dupa ce s-
a adaugat in proba o cantiate cunoscuta din substanta de analizat.
Diferenta dintre suprafetele celor doua picuri cromatografice este suficienta pentru a
determina cantiatea initiala de substanta din proba . Ci=CS*Ai /A-Ai -unde A este aria obtinuta
dupa adaugarea cantitatii standard.